CN114057720A

CN114057720A - 一种靶向p2x7r的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的应用

Info

Publication number: CN114057720A
Application number: CN202111517782.2A
Authority: CN
Inventors: 陶金辉; 李晓玲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114057720B

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种靶向P2X7R的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的应用。通过对P2X7R蛋白和化合物库中小分子进行预处理，经虚拟对接后，分析结合模式获得本发明的小分子抑制剂。本发明筛选获得的靶向P2X7R的小分子抑制剂特异性高，安全性好，没有任何毒性，副作用低，能够应用于结肠癌的防治。

Description

一种靶向P2X7R的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种靶向P2X7R的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的应用。

背景技术

结肠癌是一种较为常见的消化道恶性肿瘤，多发生于直肠与结肠的交界处，向多个内脏器官、组织侵犯，对患者身体造成较为严重的损伤，致死率较高。因此，揭示结肠癌发生、发展、侵袭和转移的分子机制，以及寻找新的标记物来靶向结肠癌的治疗具有重要意义。这些步骤将提高结肠癌治疗预后，降低疾病死亡率。

嘌呤受体P2X配体门控的离子通道7(P2X7R)是ATP门控的离子通道受体，在不同类型的细胞中均有表达，有助于调节炎症、细胞增殖和凋亡、代谢和吞噬作用。在人类癌症中P2X7R的异常表达已得到确定，包括胃癌、神经内分泌癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌和脑癌等。此外，多项研究表明P2X7R表达的增加与包括结直肠癌在内的多种肿瘤疾病预后恶化相关。虽然P2X7R在癌症生长和代谢中的作用尚不完全清楚，研究发现P2X7R参与几个肿瘤发生的关键途径和过程，并且P2X7R介导的炎症机制在癌细胞分裂和肿瘤侵袭中起关键作用。因此，P2X7R有望成为结肠癌治疗的新靶点，其抑制剂可能促进新一代抗肿瘤药物的开发，但是目前尚没有关于拮抗P2X7R治疗结肠癌的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向P2X7R的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的用途。

本发明的第一个方面，提供一种靶向P2X7R的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂的结构式如式I所示：

本发明的第二个方面，提供所述的靶向P2X7R的小分子抑制剂在制备治疗结肠癌的药物中的用途。

本发明的第三个方面，提供一种治疗结肠癌的药物，所述药物的活性成分为所述的小分子抑制剂。

进一步的，所述药物还包括药用辅料。

更进一步的，所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的靶向P2X7R的小分子抑制剂特异性高，安全性好，没有任何毒性，副作用低，具有开发与P2X7R信号通路相关疾病的靶向药的巨大潜力。

2、本发明提供的靶向P2X7R的小分子抑制剂能够在体内有效抑制肿瘤细胞的生长，具有研发为结肠癌治疗药物的巨大前景，为后续临床试验奠定基础，为临床治疗提供新的思路与方法。

附图说明

图1为本发明中小分子抑制剂与P2X7R蛋白的对接构象图。

图2为本发明中小分子抑制剂与P2X7R蛋白的对接结构结合模式图。

图3为本发明中小分子抑制剂的结构式。

图4为本发明中小分子抑制剂对ATP诱导转染野生型人P2X7R的HEK-293T细胞的通道功能影响效果图。

图5为本发明中小分子抑制剂对细胞活力的影响。

图6为本发明中小分子抑制剂对人结肠癌细胞SW620荷瘤后肿瘤影响。

图7为本发明中小分子抑制剂治疗前后裸鼠体重变化。

图8为本发明中小分子抑制剂治疗前后肿瘤体积变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：靶向P2X7R的小分子抑制剂的筛选

初步筛选靶向P2X7R小分子变构抑制剂

虚拟筛选使用商业软件Schordinger软件的Glide模块进行。首先，我们从PBD数据库中下载P2X7R晶体5U1X，蛋白的处理采用Glide蛋白预处理流程中的加氢→去水→蛋白结构优化。小分子的虚拟筛选采用陶素化学提供的虚拟筛选小分子库(个数200万+)，然后交由上海宇道生物技术有限公司操作，移除其中包含PAINS结构的分子，最终进行对接计算的分子个数为180万+。然后我们使用薛定谔中的LigPrep模块(Epik模式)对小分子进行预处理和构象生成。格点文件由F108为中心选取，选取其周围18埃的残基作为对接口袋。使用Glide进行对接获取对接构象，其对接打分为：-9.33985，其对接构象(图1)，对小分子抑制剂与P2X7R蛋白的结合模式进行分析(图2)，结合模式分析提示，小分子抑制剂与ASP，LYS之间形成了氢键作用。

按照上述方法继续筛选，筛选打分在前2000名的小分子。然后对这2000个小分子再使用XP精度(最高精度对接)筛选出其中排名在前30名的小分子，分析其结合模式，最终得到的可进行对接的小分子抑制剂，该小分子抑制剂编号为Z1514785417，以下或称为Z1514785417，所述的小分子抑制剂的结构式如图3所示。

所述小分子抑制剂的分子组成为：

CCC＝1N＝CSC1NC(＝O)NC(C)C2COC＝3C＝CC＝CC23。

结合图2分析的具体结果记录于表1-表4中。

表1疏水相互作用

表2氢键相互作用

表3π-堆积作用

表4π-阳离子相互作用

实施例2：Z1514785417对ATP诱导转染野生型P2X7R的HEK-293T细胞的通道功能的影响

(1)构建过表达P27XR慢病毒载体：

h-P2RX7(野生型)过表达慢病毒载体均由上海汉恒生物科技有限公司直接合成。主要流程：选择慢病毒载体，并进行设计目的片段PCR引物，包括上游引物LV-h-P2RX7-E/B-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物LV-h-P2RX7-E/B-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；选用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行酶切载体，琼脂糖凝胶回收得到纯化的线性化载体；根据设计的引物进行目的片段PCR，琼脂糖凝胶回收得到正确大小的目的片段；将线性化载体和目的片段按照同源重组或者T4连接的方法进行连接；转化感受态DH5a，菌液涂板，培养12-16h；挑选单克隆行进菌落验证；选择菌落验证正确的阳性克隆进行测序；测序正确的克隆样品进行质粒抽提，获得过表达P27XR慢病毒载体。

LV-h-P2RX7-E/B-F(SEQ ID NO.1)：5′-TAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGCCGGCCTGCTGCAGC-3′。

LV-h-P2RX7-E/B-R(SEQ ID NO.2)：5′-TCACTTAAGCTTGGTACCGAGGATCCGTAAGGACTCTTGAAGCCACTGT-3′。

(2)建立过表达野生型P2X7R的HEK-293T细胞：

取培养生长良好的HEK-293T细胞，于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时(2*10⁵细胞/孔)。转染过表达P27XR慢病毒载体，于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时。转染24小时后添加Z1514785417(10，50μM)孵育30分钟，对照孔添加等体积的DMSO孵育30分钟，收集HEK-293T细胞。

吸取每孔的细胞，洗涤一次，并在37℃下重悬于含KCl的0.5ml HEPES缓冲培养基中，用流式管收集。

(3)添加溴化乙锭，刺激前和后检测HEK-293T对溴化乙锭摄取：

在每管中添加溴化乙锭(25μM)，用CytoFlex流式细胞仪收集细胞，每秒1000个细胞数，每个样本5秒收集一次，收集40秒，之后加入ATP(1.0mM)。每秒收集1000个细胞数，每个样本5秒收集一次，共收集5分钟；

(4)Z1514785417对ATP活化的通道功能的抑制作用：

使用CytExpert软件对样本数据进行分析，读取每个样本平均荧光强度值，并对应时间作图。对比ATP加入后HEK-293T对溴化乙锭摄取变化。

结果如图4所示，将细胞对溴化乙锭的摄取量作为检测ATP诱导下P2X7R孔通道开放功能强弱的方法。加入Z1514785417(购买于上海陶术生物科技有限公司，ID：Z1514785417)后，转染了hP2X7R的293T细胞对ATP诱导下溴化乙锭的摄取功能减弱，呈剂量依赖性发挥作用。

图4中：Control：转染了hP2X7R的293T细胞对ATP诱导下溴化乙锭的摄取；

Z1514785417(10μM):转染了hP2X7R的293T细胞，加入Z1514785417(10μM)孵育后，对ATP诱导下溴化乙锭的摄取；

Z1514785417(50μM):转染了hP2X7R的293T细胞，加入Z1514785417(50μM)孵育后，对ATP诱导下溴化乙锭的摄取。

实验方法：流式细胞术。

横坐标：摄取时间。

纵坐标：溴化乙锭的平均荧光强度。

实施例3：Z1514785417对SW620细胞生长活力的影响

(1)采用CCK8法研究Z1514785417对SW620细胞生长活力的检测，实验分组如下：

空白组1：DMEM培养液；

空白组2：DMEM培养液+Z1514785417(1μM，10μM，50μM)；

对照组：SW620细胞悬液(5*10⁴细胞/孔)；

药物组：SW620细胞悬液+Z1514785417(1μM，10μM，50μM)；

接种于96孔板，每组均分为三个孔中，100μL/孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24小时。

(2)每孔加入10μL CCK-8溶液。

(3)将培养板放在培养箱内孵育2小时。

(4)用酶标仪检测450nm处的吸光度。

(5)计算24小时的细胞活力＝((药物孔-空白孔2)/(对照孔-空白孔1))*100％。

(6)按照上述方法，进行48小时，72小时的细胞活力检测。

结果如图5所示，结果表明：Z1514785417对SW620细胞生长活力呈剂量依赖性的抑制。

实施例4：Z1514785417对荷瘤小鼠人结肠癌细胞生长的影响

(1)5周龄的BALB/c裸鼠，置于无菌的特殊条件下饲养。裸鼠随机分为2组，对照组(生理盐水)、Z1514785417组(2.5mg/kg)，每组4只。将SW620细胞密度调整为1*10⁷个/ml，100ul细胞悬液注射到裸鼠右侧下背部。

分别从造瘤第5天起每隔一天腹腔注射Z1514785417(2.5mg/kg)、等体积的生理盐水，观察裸鼠肿瘤生长情况。注射后每4天观察一次动物健康状况，记录小鼠体重，测量肿瘤大小，根据公式计算肿瘤体积；体积＝1/2*肿瘤长*肿瘤宽*肿瘤宽。

(2)在药物注射后第14天，对所有小鼠实施二氧化碳安乐死法(放入动物至安乐死箱内，每分钟替换箱容积20％的速度灌注CO₂于箱内，观察确定动物无呼吸，关闭CO₂，观察2-3分钟，确定动物死亡)。按照以下公式计算抑瘤率：

抑瘤率＝(对照组平均体积-Z1514785417组平均体积)/对照组平均体积×100％。

结果如图6-8所示，结果显示，Z1514785417组的肿瘤体积较对照组明显减小，裸鼠体重明显提高，经计算Z1514785417组治疗12天后抑瘤率为70％，由该结果可知，Z1514785417能够在体内有效抑制肿瘤细胞的生长，表明Z1514785417具有研发为结肠癌治疗药物的巨大前景，为后续临床试验奠定基础，为临床治疗提供新的思路与方法。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 陶金辉，李晓玲

<120> 一种靶向P2X7R的小分子抑制剂及其在治疗结肠癌中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagaggatct atttccggtg aattcgccac catgccggcc tgctgcagc 49

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcacttaagc ttggtaccga ggatccgtaa ggactcttga agccactgt 49

Claims

1.一种靶向P2X7R的小分子抑制剂，其特征在于，所述小分子抑制剂的结构式如式I所示：

2.权利要求1所述的靶向P2X7R的小分子抑制剂在制备治疗结肠癌的药物中的用途。

3.一种治疗结肠癌的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1所述的小分子抑制剂。

4.根据权利要求3所述的一种治疗结肠癌的药物，其特征在于，所述药物还包括药用辅料。

5.根据权利要求4所述的一种治疗结肠癌的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。