CN114054113B - 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 - Google Patents
无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114054113B CN114054113B CN202210045698.3A CN202210045698A CN114054113B CN 114054113 B CN114054113 B CN 114054113B CN 202210045698 A CN202210045698 A CN 202210045698A CN 114054113 B CN114054113 B CN 114054113B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- substrate
- micro
- channel
- inlet
- optical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 104
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 82
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000003075 superhydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 73
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 15
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 claims description 14
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 13
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 239000012774 insulation material Substances 0.000 claims description 5
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 4
- 238000009434 installation Methods 0.000 claims description 4
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004965 Silica aerogel Substances 0.000 claims description 3
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 claims description 3
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 claims description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 claims 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims 1
- 239000000565 sealant Substances 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000009413 insulation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009795 derivation Methods 0.000 abstract 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000011994 cellular protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 229920000052 poly(p-xylylene) Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/1023—Microstructural devices for non-optical measurement
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1024—Counting particles by non-optical means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
Abstract
本发明提供一种无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置，包括可相互配合形成至少一个微流道的第一基底和第二基底，其中第一基底和第二基底上分别具备用以经所述相互配合而形成所述至少一个微流道的第一流道壁和第二流道壁，所述第一流道壁和第二流道壁具有超疏水/疏水隔热材料层或由超疏水/疏水隔热材料形成，或者所述疏水隔热材料形成在第一流道壁和第二流道壁周围的第一基底和第二基底材料中。实现了样品的隔热检测和无残留导出，使得光学检测装置的获得多视角下的方便定位。当入口加热装置、红外测温接口的引入装置中，又能实现试剂和样品的温控功能。为多种微流道生化实验需求提供了方便的材料设置和特有的反应条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞计数成像装置,尤其涉及一种无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置,属于微流道装置领域。
背景技术
目前市场上图像法细胞计数仪多采用一次性的塑料计数板，成本高，一次性使用，大量产生难以消解的白色塑料垃圾，对环境带来很大破坏，不符合国家碳中和的要求。高昂的一次性耗材使用成本也浪费了实验室大量的科研资金。本发明的可重复使用的细胞计数成像样品台，可以无限制重复使用，避免了白色塑料污染，也可以每年节省近亿元耗材费用。
考虑到微流道内壁与样品的相互作用，可能在实验之后存在试剂、样品、意外引入的杂质等的残留，从而即便在肉眼可见情况下，也难以发现细微的未除干净的部位，这对精细实验结果要求的实验来说无疑是产生一定程度影响的。现有的方法就是无论是否肉眼可识别残留，都在实验结束或者存在中间过程实验的中间阶段都会引入清洗剂用于清除这一可能的影响，因而实验效率不高，试剂耗费增加。
在一些实验中通常需要利用微流道内壁本身作为载体，为进行诸如免疫反应和材料吸附性等实验，需要在微流道内引入合适的衬底材料（如固相载体、磁性载体、生物抗体等）以捕获样品中的目标分析物，或者在新兴的细胞分泌蛋白检测的压印免疫反应技术中，需要微流道能够分别以相互配合形成微流道的两个基底而形成。因此传统的微流道一体化形成的技术难以满足这些实验需求。
另一方面，在实验中往往有需要满足一定的温度条件下进行，需要外界环境温度维持（37℃）。然而实际在微流道中容易发生热耗散，从而使得温度并非在目标范围内，对于某些对温度稳定性要求高实验来说是需要考虑的问题。因此不但需要具备测温的设备还需要防止热耗散的措施，以同时保证进入微流道内部的流体试剂或样品能够始终维持在一定温度范围内。
在光学成像和光谱检测或者一些需要获得微流体的流速场分布的特殊需求的场合中，现有技术几乎无一例外地采用外加照明和探测器配置在微流道装置周围，这就造成了一方面光照在流道板材中的能量损耗，从而造成激发强度的损失，对于微弱信号的检测是不利的。另一方面需要重新调整照明和探测位置，使得实验过程效率低和复杂化。
发明内容
为了解决上述一系列问题，本发明考虑如下方案，打破传统一体化设置微流道的思路，在采用二片式整体结构基础上，在微流道内壁设置一层隔热疏水层，并且在微流道入口处设置阀门和加热装置以及供测温的接口，在微流道至少一处设置供照明和光信号探测的接口。
本发明的微流道包括且不局限于笔直或曲折的管状通道，或具有多个反应微腔的结构，本发明的材料除疏水隔热材料之外可以是指任何实验所需要的材料，包括无机材料、有机材料、生物材料，材料可以是固体或分子或分子的结合或络合体。
根据上述的方案，本发明提供一种无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置，包括可相互配合形成至少一个微流道的第一基底和第二基底，其中第一基底和第二基底上分别具备用以经所述相互配合而形成所述至少一个微流道的第一流道壁和第二流道壁；所述第一流道壁和第二流道壁具有超疏水/疏水隔热材料层，或者所述第一流道壁和第二流道壁由超疏水/疏水隔热材料形成，或者所述隔热材料形成在第一流道壁和第二流道壁周围的第一基底和第二基底材料中；其中，所述至少一个微流道包括微流控阀门区段、检测区段、排出区段。以此实现无残留保温功能。
进一步地，所述第一基底包括有与所述至少一个微流道一一对应并且相沟通的至少一个入口、与所述至少一个入口一一对应的至少一个测温接口、所述微流控阀门、至少一个第一光学接口；其中，所述至少一个测温接口中的每一个靠近各自对应的所述入口的端部与所述入口内壁之间具有预设壁厚。
所述第二基底包括在所述相互配合之后与所述至少一个入口相对应沟通的入口区段，以及与所述至少一个第一光学接口一一对应的至少一个第二光学接口。由此解决了测温以及光学成像和光谱检测的免调试方便接入问题。
优先地，所述预设壁厚为0.5-2mm，所述第一基底和第二基底经所述相互配合而相贴合的面上都设置密封材料，或者相贴合的面上通过粘接（如粘接剂或容易分开的密封粘接手段）形成所述相互配合的状态，由此实现第一基底和第二基底可拆卸连接。
可以理解的是，由于密封的需要而引入预设壁厚，因此测温产生了因热传导滞后的误差，从而根据预设壁厚以及壁材的热传导系数，试剂或样品体积，加热区的几何尺寸，能够在测出初始试剂或样品温度之后补偿计算出任意时刻液温。
所述第一光学接口和第二光学接口具有直接供照明发射端或探测器的接收端抵靠或连接而分别将光入射到微流道中和接受微流道透射的光的目的。或者如后文进一步说明的能够连接其他配件（如光纤光传导配件）以实现该目的。
可选地，所述至少第一光学接口的构造方式为多个第一光学接口，其中一个是具有与第一基底可拆卸连接的有豁口的第一透明罩，剩余的分布在至少一个微流道的各区段中。其中所述豁口用于定位成套光学检测装置的光信号口（可以是照明装置发射端或探测器的接收端），所述第一透明罩用于提供所有区段的整体视场的照明范围或来自所有区段的整体视场的光学信号的接受范围，此时第二光学接口以与第二基底可拆卸连接且具有豁口的第二透明罩来构造，使得所述第一透明罩与所述第一透明罩一一对应。其中所述成套光学检测装置包括照明装置、探测器，或者，包括了照明装置、探测器之外还包括透镜、平面镜、分光镜、棱镜、滤波器、光阑中的至少一者。
可选地，所述至少第一光学接口的构造方式为一个第一光学接口，是与第一基底可拆卸连接的有豁口的第一透明罩，此时第二光学接口以与第二基底可拆卸连接且同样具有豁口的第二透明罩来构造，使得所述第二透明罩与所述第一透明罩相对应。
进一步地，所述至少第一光学接口分布在微流控阀门区段、检测区段、排出区段中的至少一者，当所述至少第一光学接口在检测区段有分布时，优选分布至少一个，更优选地，所述分布至少一个中的所述分布方式为等距分布。
进一步地，所述排出区段包括具有在所述检测区段流出口处外延坡度的下沉式结构，以及沟通所述下沉式结构的水平区段。该下沉式结构能够帮助流体充分排出检测区而不产生回流而扰乱流场，从而影响反应中分析物或试剂成分的浓度分布的不稳定。
进一步地，所述第一基底和第二基底由耐腐蚀，耐磨损，高硬度透明材料形成，所述第一基底和第二基底由无机玻璃、石英、有机玻璃中至少一者形成，或者是其他任何耐腐蚀、耐磨损高硬度透明材料；在一个实施例中，所述第一基底和第二基底中的一者由聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一者形成，另一者由无机玻璃、石英、有机玻璃中至少一者形成。
进一步地，所述第一流道壁和第二流道壁还可以采用超疏水/超疏水涂层包被，疏水涂层材料包括但不限于等任何可超疏水或疏水材料。
可选地，微流道可以为密闭涉及或开合设计，密闭设计的微流道可连接真空抽气装置，以利用真空抽气装置采用负压等模式抽走残留样品，第一流道壁和第二流道壁上的疏水/超疏水涂层可以保证样品及水分在真空抽气装置进行负压抽气时，样品可以完全流出微流道而不会残留在微流道内；在微流道开合设计模式下，疏水/超疏水表面用柔软的纸/布即可擦拭干净样品和水分，从而确保无样品残留，因此该样品台可以长期反复使用。
进一步地，所述疏水隔热材料包括聚四氟乙烯、聚对二甲苯、透明二氧化硅气凝胶中的至少一者或者其他任何超疏水/疏水材料。
进一步地，第一基底的平均厚度（边缘最大厚度和最小厚度算术平均值）为大于3mm，第二基底的平均厚度为大于1mm，以考虑测温接口和光学接口的安装空间。经过所述相互配合后，所述至少一个微流道的高度为0-1000um，当所述微流道为多个时，多个所述微流道的高度至少有两者相同，或者都不相同。
进一步地，所述至少一个入口的内径为1-10mm。
进一步地，所述检测区段为多段式结构，宽度有一段或多段宽度变窄部分，变窄模式包括线性和非线性中的至少一种。宽度变窄设计可进一步消除废液的回流，避免二次污染。
优选地，所述至少一个第一光学接口在每一变窄部分分布一个。
进一步地，所述微流控阀门区段安装微流控阀门，所述微流控阀门为闸刀阀门、或微流控电磁阀门。
可选地，所述多功能细胞计数成像样品台装置还包括连接排出区段的排液管，与所述至少一个入口可拆卸连接的入口加热装置，以及红外测温仪。其中所述入口加热装置包括具有供试剂或样品分别加入和流出的开孔和出口的加热区、环绕加热区内壁的加热圈、控制器。
所述控制器控制加热圈工作，接受插入测温接口的红外测温仪探头的信号，并通过分析实时获得温度值，当温度值超过温度预设最低容许值时则控制加热圈停止工作。
优选地，所述排液管由无机玻璃、石英、有机玻璃中至少一者组成。
可选地，所述多功能细胞计数成像样品台装置中所述至少一个第一光学和所述至少一个第二学接口分别具有贯穿所述第一流道壁和第二流道壁的贯穿孔，并且可拆卸连接光纤光传导配件。其中，还包括密封所有贯穿孔的与基底材料同质的至少一个拆卸堵件，所述拆卸堵件向微流道的一端或可拆卸堵件整体由所述疏水隔热材料形成。可以至少实施当单独使用第一透明罩和第二透明罩时用于封堵各个贯穿孔。
其中，还包括密封所有贯穿孔的与基底材料同质的至少一个可拆卸堵件，所述可拆卸堵件向微流道的一端或可拆卸堵件整体由所述疏水隔热材料形成。当单独使用第一透明罩和第二透明罩时用于封堵各个贯穿孔。
优选地，所述光纤光传导配件一端为密封所述贯穿孔的第一端，使得照明光能够从所述第一端入射微流道或微流道的透射光能够入射进入第一端，而第二端连接相应的照明装置发射端或探测器的接收端，这样发射端光信号直接作用于微流体上而减少了光信号的损失。由于目前光纤的损耗已经降低到了0.15dB/km以下，因此对于厘米或分米或若干米级别的光纤长度损耗也是在10-3dB甚至10-4dB以下数量级的，完全能够满足一定弱信号的测量需求。
本发明还提供一种利用无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置使用方法，包括：
S1将第一基底和第二基底经配合而形成所述至少一个微流道，保证微流控阀门为关闭状态，其中所述第一基底和/或第二基底的第一流道壁和第二流道壁上能够设置试验所需要的材料；
S2将第一基底和第二基底的边缘通过夹紧装置夹紧固定，并根据实验需要选择装置进行如下安装步骤：安装可拆卸堵件封堵各光学接口，并分别安装第一透明罩和第二透明罩于第一基底和第二基底；
S3将成套光学检测装置中的照明装置和探测器分别抵靠或固定在第一光学接口和第二光学接口，或者抵靠或固定在第一和第二透明罩的豁口处而定位；
S4向至少一个入口加入试剂和/或样本，打开微流控阀门，通过照明装置和探测器动态捕捉至少一个微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
当所述第一流道壁和第二流道壁具有贯穿孔时，步骤S2在夹紧固定第一基底和第二基底的边缘之后包括将所述光纤光传导配件的第一端封堵至少一个第一光学接口和至少一个第二光学接口；而步骤S3则为将所述光纤光传导配件的第二端连接相应的照明装置发射端或探测器的接收端。
可选地，当步骤S1中所述第一基底的第一流道壁设置试验所需要的材料时，所述第一基底由玻璃、石英、有机玻璃中至少一者形成，所述第二基底由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一者形成，并且在步骤S4为向至少一个入口加入样本，并加入试剂，经过预设时间之后按压第一基底的检测区段以使得第一流道壁上设置试验所需要的材料与第二基底的第二流道壁上的物质相互作用，并通过照明装置和探测器动态捕捉至少一个微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
可选地，当选择对试剂和/或样品加热时，在步骤S4包括获取试剂和/或样品的初始温度，将红外测温探头插入测温接口，安装入口加热装置到所述测温接口对应的一个入口，接着向该入口加入试剂和/或样本至液位在加热区离开开孔三分之二整体加热区高度以下时，触发控制器开始控制加热圈工作，红外测温探头实时监测温度，在监测温度到达预设温度范围下限时，触发控制器控制加热圈停止工作，此时打开微流控阀门，通过照明装置和探测器动态捕捉相应微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
本发明提供的无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置具有以下有益效果：
1. 在微流道内壁超疏水/疏水隔热材料的引入使得试剂和样品无残留，且因隔热而获得反应温度保持的效果。
2. 入口加热装置、红外测温接口的引入实现了试剂和样品的温控功能，光学接口的引入使得光学检测装置的获得多视角下（全流程视场或局部视场）的方便定位。
3. 两片配合安装的设计结构为多种微流道生化实验需求提供了方便的材料设置和特有的反应条件的可能。
4. 本发明的样品台通过宽窄设计的微流道可阻止样品废液回流及样品残留。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1示出了四微流道的无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置的顶视图示意图；
图2示出了本发明实施例1的未配合呈分开的第一和第二基底结构左视图示意图；其中第二基底上安装了石英排液管3；
图3示出了本发明实施例1中第一基底1和安装了石英排液管3的第二基底2配合形成的多功能细胞计数成像样品台装置左视图示意图；其中a为闸刀式微流控阀门开启时，b为闸刀式微流控阀门关闭时，c闸刀式微流控阀门关闭之后安装拆卸堵件6，d安装第一透明罩和第二透明罩以及入口加热装置并连接红外测温仪，e加热试剂或样品时，f加热完毕开启闸刀式微流控阀门，g本发明实施例3的安装光纤光传导配件时的实验方式；
图4示出了入口加热装置结构示意图；
图5示出了本发明实施例3中的光纤光传导配件的一个结构示意图；
其中附图标记，1第一基底，11第一流道壁，12入口，13，测温接口，14闸刀式微流控阀门，15第一光学接口，16第一透明罩，161第一透明罩豁口,2第二基底，21第二流道壁，22入口区段,25第二光学接口，26第二透明罩，261第二透明罩豁口，3石英排液管，4入口加热装置，41加热区，42加热圈，43具有外螺纹的管状体，44控制器，5红外测温仪，51主机，52探头，6可拆卸堵件，7照明装置，8探测器，9光纤光传导配件，91第一端，92第二端，93光纤线缆，94第一光学透镜，95第而光学透镜,A微流控阀门区段,B检测区段,C排出区段，D预设壁厚，N移液管。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
如图1所示为本发明的一个四微流道的无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置的顶视图，包括如图2所示的可相互配合形成如图1所示的四微流道的第一基底1和第二基底2，其中第一基底1和第二基底2都为有机玻璃材质，上分别具备用以经所述相互配合而形成所述四微流道的第一流道壁11和第二流道壁21，所述第一流道壁和第二流道壁具有透明二氧化硅气凝胶层，其中，每个微流道都包括微流控阀门区段A、检测区段B、排出区段C(图1)。检测区段B（500μm高）为三段渐变窄的流道组成，最宽段为图1中微流道上游对向箭头所示部分，中游段为等腰梯形收窄段，下游段为图1对向箭头所示最窄的流道区段，其边缘和等腰梯形腰之间形成150°钝角。所述第一基底1和第二基底2经所述相互配合而相贴合的面上都设置玻璃胶薄层或双面胶以密封。参见图1，微流控阀门区段A、检测区段B、排出区段C整体宽度非均一，检测区段B的宽度也非均一，具体地，检测区段B的宽度大于微流控阀门区段A和排出区段C的宽度，且检测区段B自连接微流控阀门区段A的连接处向所述排出区段C的连接处呈宽窄设计，变窄模式可以是线性，也可以是非线性，宽度变窄设计可阻止样品废液回流及样品残留，从而使得多功能细胞计数成像样品台装置可重复使用。当然，微流道不限于图1所示形状，其还可以包括微流芯片，毛细管，平板，凹板等。
如图1和2所示，第一基底1还包括有与所述四微流道一一对应并且相沟通四个入口12，与所述四个入口12一一对应的四个测温接口13，微流控阀门14，具有贯穿所述第一流道壁11中最宽段的贯穿孔的四个第一光学接口15。尽管未全部示出，但仍在图1中示意性地展示了在微流控阀门区段A中设置的闸刀型微流控阀门14，如图2中的一个最宽段的第一光学接口15。其中，所述四个测温接口13中的每一个靠近各自对应的入口12的端部与所对应的入口内壁之间具有预设壁厚D，在本实施例中D=1mm。
第二基底2还包括与所述四个入口12在所述相互配合之后相对应沟通的入口区段22，以及与所述四个第一光学接口15一一对应的具有贯穿所述第二流道壁21的贯穿孔的四个第二光学接口25。本实施例中，第二基底2上安装了石英排液管3。如图2中，示例性地展示了第一基底1和第二基底2分别可拆卸地安装了分别具有豁口161和261的第一透明罩16和第二透明罩26（在图3中已经拆除以显示其可拆卸性），分别能够安装定位成套光学检测装置的照明装置7和探测器8（如图3中d所示）。
实施例2
图3中a为图2中的第一基底1和安装了石英排液管3的第二基底2配合而由玻璃胶薄层或双面胶密封贴合形成了一个多功能细胞计数成像样品台装置。其中圈出的闸刀型微流控阀门14为打开状态，在图3所示的b中闸刀型微流控阀门14即为关闭状态，并且圈出了排出区段的下沉式结构，以及显示了安装了排液管3的沟通所述下沉式结构的水平区段。
如图3中c所示，在四个第一光学接口15以及与之一一对应的四个第二光学接口25上使用带有螺纹的可拆卸堵件6（即螺栓）配合密封圈，以与光学接口内螺纹耦合旋入方式对微流道检测区段B的最宽段进行封堵，保持阀门为关闭状态。
如图3的d中又重新安装上了第一透明罩16和第二透明罩26，同时在其中一个入口12（图1左起第二个）上还安装了入口加热装置4并与红外测温仪5连接。在豁口安装定位成套光学检测装置的照明装置7和探测器8。在图3所示的e中红外测温仪5探头51插入了测温接口13。
对于具体连接和插入，先参见图4所示，入口加热装置4包括了具有供试剂或样品分别加入和流出的开孔和出口（出口最下端设置有图中未示出的密封圈）的加热区41、环绕在加热区41内壁的加热圈42、控制器44。本实施例中加热区41下部还设置有具有外螺纹的管状体43,能够与入口12外周的环形空槽内壁螺纹耦合旋入密封连接（图未示）。所述控制器44控制加热圈42工作，接受插入测温接口13的红外测温仪探头52的信号，并通过分析实时获得温度值，当温度值超过温度预设最低容许值时则控制加热圈42停止工作。
再如图3中d所示，红外测温仪5包括了主机51和探头52，主机51和探头52通过光纤线缆连接。主机51的信号输出端通过线缆与入口加热装置4的控制器44电连接。其中显示了探头52插入测温接口13的方向，当插入至预设壁位置时完成探头52的安装状态（如图3中e所示）。
在完成试剂和/或样品加热后，则如图3中f所示打开闸门让试剂和/或样品流入微流道中，使用照明装置7对流体照射，探测器8接受透射光而捕获到实时的图像或光谱。并传送至上位机（图未示）进行显示和计算得到实时细胞计数结果或样品的荧光分布图像。
实施例3
本实施例与实施例2不同的在于，不安装第一透明罩16和第二透明罩26而采用两个光纤光传导配件9的第一端分别密封连接第一光学接口15和第二光学接口25（同可拆卸堵件6密封连接方式一致，并采用密封材料密封）。如图3中g所示照明装置7和探测器8分别连接各自的光纤光传导配件9的第二端，从而使得照明装置7发出的照射光透过光纤光传导配件9入射微流道内部，而透射光再次经过第二光学接口25密封连接的光纤光传导配件9而在其第二端被探测器8接受成像或接收到光谱信息。
图5为光纤光传导配件9的结构示意图，其包括内置第一光学透镜94的第一端91，内置第二光学透镜95的第二端，以及连接第一端91和第二端95的光纤线缆93。优选地，在第二光学接口密封连接的光纤光传导配件9中，所述第一光学透镜94包括双扩束镜，所述第二光学透镜95为4f系统。
实施例4
本实施例利用实施例2的无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置进行细胞计数的方法：
S1将第一基底1和第二基底2经配合而形成四个微流道，保证闸刀式微流控阀门14为关闭状态；
S2将第一基底1和第二基底2的边缘通过夹紧装置夹紧固定，安装可拆卸堵件6封堵各光学接口，并分别安装第一透明罩16和第二透明罩26于第一基底1和第二基底2；
S3将成套光学检测装置中的照明装置7和探测器8分别抵靠在第一二光学接口15和第二光学接口25而定位；
S4向一个入口12加入细胞悬浮液样本，并打开微流控阀门14，通过照明装置7照射最宽段。探测器8捕捉一个微流道中的一个图像以完成细胞计数。
实施例5
本实施例利用实施例3的装置在步骤S3将所述光纤光传导配件的第二端连接相应的照明装置发射端或探测器的接收端。
在步骤S4包括获取细胞样品的初始温度为20℃，将红外测温探头52插入测温接口，安装入口加热装置4到所述一个入口12，接着如图4所示，利用移液器的移液管N插入加热区41的开孔向一个入口12加入样品至加热区41一半高度时，触发控制器44开始控制加热圈43工作，红外测温探头52实时监测温度，在3-5秒之后监测温度到达预设温度范围30℃时，触发控制器控制加热圈停止工作，此时试探性采用探头52检测加热区41为35℃，处于目标温度37℃±2℃范围内，并打开微流控阀门14，通过照明装置7照射最宽段。探测器8捕捉一个微流道中的一个图像以完成细胞计数。
实施例6
步骤S1中所述第一基底1的第一流道壁11设置荧光标记抗体，所述第一基底由有机玻璃形成，所述第二基底2替换为由聚二甲基硅氧烷形成，并且在步骤S4为中向四个入口12加入四种不同的细胞样本，并加入营养液，经过24h培养时间之后，按压第一基底1的检测区段B以使得第一流道壁11上荧光标记抗体与第二基底2的第二流道壁21上的各细胞分泌的蛋白质特异性免疫结合，并通过照明装置7照射细胞和探测器8动态捕捉四个微流道中的四个图像和四个光谱,用以分析细胞蛋白质代谢作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：在本发明的精神和原则之内，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案脱离本发明的保护范围。
Claims (17)
1.无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置，其特征在于，包括可相互配合形成至少一个微流道的第一基底和第二基底，其中第一基底和第二基底上分别具备用以经所述相互配合而形成所述至少一个微流道的第一流道壁和第二流道壁；
所述第一流道壁和第二流道壁具有超疏水或疏水隔热材料层，或者所述第一流道壁和第二流道壁由超疏水或疏水隔热材料形成，或者所述隔热材料形成在第一流道壁和第二流道壁周围的第一基底和第二基底材料中；其中，所述至少一个微流道包括微流控阀门区段、检测区段、排出区段，所述微流控阀门区段安装微流控阀门；所述疏水隔热材料包括透明二氧化硅气凝胶；
所述第一基底包括有与所述至少一个微流道一一对应并且相沟通的至少一个入口、与所述至少一个入口一一对应的至少一个测温接口、所述微流控阀门、至少一个第一光学接口；其中，所述至少一个测温接口中的每一个靠近各自对应的所述入口的端部与所述入口内壁之间具有预设壁厚；所述第二基底包括在所述相互配合之后与所述至少一个入口相对应沟通的入口区段，以及与所述至少一个第一光学接口一一对应的至少一个第二光学接口；所述第一光学接口和第二光学接口用于直接供成套光学检测装置中的照明装置发射端或探测器的接收端抵靠或连接而分别将光入射到微流道中和接受微流道透射的光；所述预设壁厚为0.5-2mm，所述至少一个第一光学接口分布在微流控阀门区段、检测区段、排出区段中的至少一者；当所述至少一个第一光学接口在检测区段有分布时，优选分布至少一个；
所述装置还包括连接排出区段的排液管、与所述至少一个入口可拆卸连接的入口加热装置以及红外测温仪；所述入口加热装置包括具有供试剂或样品分别加入和流出的开孔和出口的加热区、环绕加热区内壁的加热圈、控制器；所述控制器控制加热圈工作，接受插入测温接口的红外测温仪探头的信号，并通过分析实时获得温度值，当温度值超过温度预设最低容许值时则控制加热圈停止工作；
所述第一光学接口是与第一基底可拆卸连接的有豁口的第一透明罩；
所述豁口用于定位所述成套光学检测装置的光信号口，所述第一透明罩用于提供所有区段的整体视场的照明范围或来自所有区段的整体视场的光学信号的接受范围，此时第二光学接口以与第二基底可拆卸连接且同样具有豁口的第二透明罩来构造，所述第二透明罩与所述第一透明罩相对应。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述分布至少一个中的所述分布方式为等距分布。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述第一基底和第二基底经所述相互配合而相贴合的面上都设置密封材料，或者相贴合的面上通过粘接形成所述相互配合的状态。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述排出区段包括具有在所述检测区段流出口处外延坡度的下沉式结构，以及沟通所述下沉式结构的水平区段。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第一基底和第二基底由耐腐蚀，耐磨损，高硬度透明材料形成。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述第一基底和所述第二基底由无机玻璃、石英、有机玻璃中至少一者形成。
7.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，第一基底的平均厚度为大于3mm，第二基底的平均厚度为大于1mm；
当所述微流道为多个时，多个所述微流道的高度至少有两者相同或者都不相同；
所述至少一个入口的内径为1-10mm。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测区段为多段式结构，宽度有一段或多段宽度变窄部分，变窄模式包括线性和非线性中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述至少一个第一光学接口在每一变窄部分分布一个。
10.根据权利要求1或2项所述的装置，其特征在于，所述微流控阀门为闸刀阀门或微流控电磁阀门。
11.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述排液管由无机玻璃、石英、有机玻璃中至少一者组成。
12.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，其中，所述至少一个第一光学和所述至少一个第二光学接口分别具有贯穿所述第一流道壁和第二流道壁的贯穿孔，并且可拆卸连接光纤光传导配件；
其中，所述装置还包括密封所有贯穿孔的与基底材料同质的至少一个可拆卸堵件，所述可拆卸堵件向微流道的一端或可拆卸堵件整体由所述疏水隔热材料形成，当单独使用第一透明罩和第二透明罩时用于封堵各个贯穿孔。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述光纤光传导配件一端为密封所述贯穿孔的第一端，使得照明光能够从所述第一端入射微流道或微流道的透射光能够入射进入第一端，而第二端连接相应的照明装置发射端或探测器的接收端。
14.如权利要求13所述的无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像样品台装置使用方法，其特征在于，包括：
S1将第一基底和第二基底经配合而形成所述至少一个微流道，保证微流控阀门为关闭状态，其中所述第一基底和/或第二基底的第一流道壁和第二流道壁上能够设置试验所需要的材料；
S2将第一基底和第二基底的边缘通过夹紧装置夹紧固定，并根据实验需要选择所述装置进行如下安装步骤：安装可拆卸堵件封堵各光学接口，并分别安装第一透明罩和第二透明罩于第一基底和第二基底；
S3将成套光学检测装置中的照明装置和探测器分别抵靠或固定在第一光学接口和第二光学接口，或者抵靠或固定在第一和第二透明罩的豁口处而定位；
S4向至少一个入口加入试剂和/或样本，打开微流控阀门，通过照明装置和探测器动态捕捉至少一个微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
15.根据权利要求14所述的使用方法，其特征在于，当所述第一流道壁和第二流道壁具有贯穿孔时，步骤S2在夹紧固定第一基底和第二基底的边缘之后包括将所述光纤光传导配件的第一端封堵至少一个第一光学接口和至少一个第二光学接口；而步骤S3则为将所述光纤光传导配件的第二端连接相应的照明装置发射端或探测器的接收端。
16.根据权利要求14所述的使用方法，其特征在于，当步骤S1中所述第一基底的第一流道壁设置试验所需要的材料时，所述第一基底由玻璃、石英、有机玻璃中至少一者形成，所述第二基底由聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一者形成，并且在步骤S4为向至少一个入口加入样本，并加入试剂，经过预设时间之后按压第一基底的检测区段以使得第一流道壁上设置试验所需要的材料与第二基底的第二流道壁上的物质相互作用，并通过照明装置和探测器动态捕捉至少一个微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
17.根据权利要求14所述的使用方法，其特征在于，当选择对试剂和/或样品加热时，在步骤S4包括获取试剂和/或样品的初始温度，将红外测温探头插入测温接口，安装入口加热装置到所述测温接口对应的一个入口；
接着向该入口加入试剂和/或样本至液位在加热区离开开孔三分之二整体加热区高度以下时，触发控制器开始控制加热圈工作，红外测温探头实时监测温度；
在监测温度到达预设温度范围下限时，触发控制器控制加热圈停止工作，此时打开微流控阀门，通过照明装置和探测器动态捕捉相应微流道中的至少一个图像和/或至少一个光谱用以完成分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210045698.3A CN114054113B (zh) | 2022-01-16 | 2022-01-16 | 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210045698.3A CN114054113B (zh) | 2022-01-16 | 2022-01-16 | 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114054113A CN114054113A (zh) | 2022-02-18 |
| CN114054113B true CN114054113B (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=80230942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210045698.3A Active CN114054113B (zh) | 2022-01-16 | 2022-01-16 | 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114054113B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114839133B (zh) * | 2022-04-06 | 2023-07-21 | 高分(北京)生物科技有限公司 | 细胞成像计数装置 |
| CN114923839B (zh) * | 2022-07-18 | 2022-10-28 | 高分(北京)生物科技有限公司 | 全自动超高通量细胞成像计数仪及样品检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102220228A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-10-19 | 北京工业大学 | 聚合酶链式反应器及实时光学阵列检测装置 |
| CN111157729A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 上海新微技术研发中心有限公司 | 基于cmos图像传感的光波导微流体检测系统 |
| CN111157734A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 上海新微技术研发中心有限公司 | 基于cmos图像传感的光栅波导微流体检测系统 |
| AU2020104154A4 (en) * | 2020-12-17 | 2021-03-04 | Xi’an International University | A Microfluidic Biochip Detection Device, Preparation Method and Detection Method |
-
2022
- 2022-01-16 CN CN202210045698.3A patent/CN114054113B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114054113A (zh) | 2022-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114054113B (zh) | 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 | |
| Rosenauer et al. | Miniaturized flow cytometer with 3D hydrodynamic particle focusing and integrated optical elements applying silicon photodiodes | |
| RU2195653C2 (ru) | Анализатор | |
| EP2308995B1 (en) | Heat exchanging, optically interrogated chemical reaction assembly | |
| US20090051912A1 (en) | Modular Microfluidic Flow Cytometer and Method Applications | |
| US7569382B2 (en) | Disposable reactor module and detection system | |
| CN106140338B (zh) | 微流控芯片系统及应用该系统进行等温扩增与检测的方法 | |
| EP3779439A1 (en) | Micro-fluidic chip and analysis instrument having same | |
| US7545490B1 (en) | Microscope flow cell apparatus for raman analysis of a liquid | |
| WO2007021812A1 (en) | Microfluidic apparatus and method for sample preparation and analysis | |
| WO2007021810A2 (en) | Microfluidic methods and apparatuses for fluid mixing and valving | |
| WO2007021811A2 (en) | Microfluid based apparatus and method for thermal regulation and noise reduction | |
| US20090146380A1 (en) | Methods and apparatuses for generating a seal between a conduit and a reservoir well | |
| CN111808744A (zh) | 一种便携式全自动核酸恒温扩增检测仪 | |
| CN1987420A (zh) | 一种对单一颗粒物进行多功能检测的微流控芯片装置 | |
| US20090142198A1 (en) | Apparatus and method for handling fluids at nano-scale rates | |
| CN217351378U (zh) | 无样品残留隔热可重复使用的多功能细胞计数成像装置 | |
| CN111239096A (zh) | 一种集成微流控与拉曼光谱检测的结构模块 | |
| JP2005518936A (ja) | マイクロコンポーネント接続システム | |
| JPWO2018105404A1 (ja) | 反応処理装置 | |
| CN116381220A (zh) | 电化学免疫传感微流控检测卡盒 | |
| WO2022193641A1 (zh) | 一种具有气泡增亮结构的微流控离子检测芯片及其检测方法 | |
| CN112899140B (zh) | 一种用于水体多参数检测的微流控芯片 | |
| Kassanos et al. | Development and characterization of a PCB-based microfluidic Y-channel | |
| CN113358622A (zh) | 基于荧光标记和微流控芯片的病毒核酸检测系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |