CN114053217A - 一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Exendin‑4‑Fc融合蛋白注射制剂及制备方法，所述注射制剂包括Exendin‑4‑Fc融合蛋白0.28‑0.35％(w/v)、表面活性剂0.01％‑0.05％(w/v)、稳定剂1.8‑5.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒，所述注射制剂的pH为7.0‑7.7。本发明所述的Exendin‑4‑Fc融合蛋白注射制剂无防腐剂、无色至淡黄色、澄清至微乳光的液体，在较长的时间内仍能维持融合蛋白的物理和化学稳定性，有效延长了储存期；本发明提供的Exendin‑4‑Fc融合蛋白注射制剂中融合蛋白含量、pH均较高，可减少用药频率，减少低pH对血管的刺激性，适合血管注射，减轻了患者高频率、依赖性注射胰岛素等降糖针剂的痛苦，患者用药的顺应性好。

Description

一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽类似物技术领域，特别涉及一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病是由于体内胰岛素分泌缺陷或其生物学作用障碍所导致的，以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病。在糖尿病患者中Ⅱ型糖尿病占比90％以上，其主要病理表现为胰岛素抵抗和由胰岛素细胞功能失调所致的胰岛素分泌相对不足，形成持久的高血糖，并可产生多种致命性并发症。
治疗Ⅱ型糖尿病的药物包括促进胰岛素分泌的药物(如磺酰脲类降糖药)、增加外周组织摄取和利用葡萄糖的药物(双胍类降糖药)。其中促进胰岛素分泌的药物仍是治疗Ⅱ型糖尿病的主要药物，通过与β细胞表面特异性受体的相互作用刺激胰岛素分泌，但应用时仍可能发生低血糖。此外，据报道20％的Ⅱ型糖尿病患者在开始治疗时就出现磺脲类药物原发性失效。而增加外周组织摄取和利用葡萄糖的药物主要作用于胰外组织，促进细胞利用葡萄糖，减少糖的生成，促进糖代谢。目前应用最广的是二甲双胍及其缓释剂，可有效改善胰岛素敏感性并降低血糖；但若加大剂量使用时，易引起消化道的不良反应，因此孕妇与肝肾功能不全者不宜使用。而胰岛素增敏剂(如噻唑烷二酮类降糖药、葡萄糖苷酶抑制剂和胰高血糖素受体拮抗剂)能改善肝脏、脂肪组织等对胰岛素的敏感性，抑制肝脏的糖异生，但也会引起胃肠道不适。虽然上述药物在降低血糖水平方面具良好疗效，但仍存在在降低高血糖方面不能维持长期疗效、对胰腺细胞功能衰减这一糖尿病的根本病因缺乏靶向作用以及不良反应显著等诸多问题。英国糖尿病前瞻性研究(U KProspective Diabets Study,UK PDS)显示，约25％的Ⅱ型糖尿病患者从口服降糖药转到胰岛素治疗或联合胰岛素治疗，但胰岛素拮抗易造成胰岛素作用不敏感，日剂量增加及长期使用可能产生高胰岛素血症、增加心血管病风险等不足。
近年来胰高血糖素样肽1(GLP-1)和Exendin-4具有在高血糖时促进胰岛素分泌，而在血糖正常时不发挥作用的特性，不仅可使初治的Ⅱ型糖尿病患者血糖恢复正常，而且对磺脲类药物治疗失效者也有降血糖作用，成为糖尿病治疗研究的热点。Exendin-4是由美洲希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液腺分泌的39个氨基酸组成的多肽，是胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的类似物，能以葡萄糖浓度依赖方式分泌胰岛素降低血糖水平，刺激胰岛β细胞再生，诱导前胰岛素基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌，进而有效降低血糖浓度；在血糖较低时则无此作用，故不会引起低血糖。还可以抑制餐后胰高血糖素的产生、延迟胃排空、抑制食欲等。Exendin-4的半衰期为9.57小时，成药后(如埃塞那肽)一天仍需注射两次，为减少注射次数，延长Exendin-4疗效，需制备长效Exendin-4药物。Exendin-4-Fc融合蛋白在保留Exendin-4分子生物活性的同时，还可以延长药物在体内的半衰期，降低药物的免疫原性，同时具备一些抗体的性质。
和大多数蛋白质药物一样，Exendin-4-Fc融合蛋白具有不稳定性，其高级结构非常脆弱，容易发生结构变化，如变性、聚集和沉淀等，会经历多种化学和物理降解，难以长期保存。另一方面，Exendin-4-Fc融合蛋白的降解或聚集会对用药安全带来不确定性，特别是一些蛋白变形聚集会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。通常采用冻干粉针剂的方法来保存蛋白质药物，以延长保质期。但是，冻干粉针剂在使用前必须先用溶液溶解，且蛋白活性无法保证，使用繁琐，病人使用不方便，甚至会出现安全性问题。目前现有的注射剂存在保存期短、蛋白药物稳定性差，辅料成分多，药品质量难控制且需要频繁注射等不足；如申请号201811310774.9的中国专利公开了一种含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其中的活性成分含量偏低，需要频繁注射；辅料用量大，成分复杂，不利于产品质量控制和生产，同时渗透压高，使用时容易引起患者不适；且上述注射剂随着Exendin-4Fc融合蛋白添加量的增加，注射制剂不稳定，若能有效解决以上问题具有巨大的市场潜力。
发明内容
生物制药在生产、运输、储备和使用过程中会经历各种破坏条件，如高温、光照和冻融等。为了确保药品的安全，必须能够保持药品结构的完整性，特别是高级结构的完整。生物制药的多聚体和不溶性微粒是引起生物药物免疫反应的关键因素。生物药物的外观也是一个非常重要的指标。各国药典规定生物药物必须不含可见异物，因为生物药物中不溶性微粒的存在与否以及含量的多少直接关系到生物药物的安全性，它们被认为是造成生物药物免疫反应的最主要因素之一。SEC-HPLC是一种利用凝胶孔隙的孔径大小与分析样品的尺寸大小的相对关系而进行分离的分析方法。样品中分子量较大的分子由于不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，因此最先从柱中被流动相洗脱出来。而分子量较小的分子可以进入凝胶空洞，在柱中受到更强的滞留，不易被洗脱出来，从而达到不同大小的溶质分子的分离。对于生物药的分析主要用于测量多聚体的含量，主要体现在单体含量的减少和多聚体的增加。DSF是一种更加高级的差示荧光扫描技术。该技术通过检测色氨酸自发荧光的微小变化来进行蛋白质稳定性的研究。蛋白质中的色氨酸荧光强度与它们周围的环境息息相关，因此，可以通过检测色氨酸的荧光变化，实现在无需标记的情况下评估蛋白质的化学和热稳定性。
有鉴于此，本发明旨在通过SEC-HPLC、DSF研究不同条件下样品的稳定性，提出一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂及其制备方法，以解决Exendin-4-Fc融合蛋白的药物组合物在长期贮存过程中易形成聚集物和不溶性微粒的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，所述注射制剂包括Exendin-4-Fc融合蛋白0.25-0.35％(w/v)、表面活性剂0.01％-0.05％(w/v)、稳定剂1.8-5.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒，所述注射制剂的pH为7.0-7.7。其中Exendin-4-FC融合蛋白质的范围为约2.5mg/ml至3.5mg/ml之间，优选2.8mg/ml至3.2mg/ml之间，更优选3mg/ml。作为优选，所述注射制剂的pH为7.2-7.7。
进一步的，所述pH调剂剂为柠檬酸钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、醋酸钠-醋酸、Tris-HCl、柠檬酸-磷酸氢二钠、醋酸-磷酸氢二钠中的任意一种。所述调剂剂不与融合蛋白Exendin-4-Fc本身发生作用，能提供稳定的中性或偏碱性环境，使制剂的pH始终维持在7.0－7.7。优选的，所述pH调节剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，保持制剂pH为7.0-7.5或柠檬酸-磷酸氢二钠，保持制剂pH为6.5-7.5；
更进一步的，所述pH调剂剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。
进一步的，所述注射制剂中pH调节剂的浓度为2-10mM，上述pH调节剂与血液具有良好的生理学相容性，注射引起的血管刺激性小，患者用药的顺应性好；同时在该浓度及pH下与表面活性剂、稳定剂配合，融合蛋白浓度高、稳定性更优，能有效减少注射次数、便于储存。作为本发明的一个示例，所述pH调节剂浓度可以是2mM或5mM或10mM或50mM。
进一步的，所述注射制剂的pH为7.2-7.7，例如7.2、7.3、7.5、7.7等等。、
进一步的，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407中的至少一种。表面活性剂能够增加Exendin-4Fc融合蛋白的溶解性，通过减少融合蛋白之间、融合蛋白与西林瓶之间的表面张力和系统自由能以提高制剂的稳定性，优选的，所述表面活性剂为吐温-20或泊洛沙姆-188；其浓度可以是0.01％或0.02％或0.03％或0.04％或0.05％。
进一步的，稳定剂为NaCl、Na2SO4、甘露醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸中的至少一种。所述稳定剂的浓度可以是100mM、200mM、300mM。优选的，所述稳定剂为浓度为290mM的甘露醇，能够与稳定剂、pH调剂剂配合，使注射制剂具有与血浆相当的渗透压，减少注射疼痛感和/或缓解部分患者用药后引起肠胃道不良反应；同时保持Exendin-4-Fc融合蛋白的空间结构的稳定，显著延长Exendin-4Fc融合蛋白的保存期，药效稳定。
进一步的，所述溶媒为注射用水或注射盐水。当用注射盐水代替注射用水时，应考虑注射盐水对渗透压的影响，适当的减少甘露醇等渗透压调节剂的用量。
相对于现有技术，本发明所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂具有以下优势：
(1)本发明提供的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂为无防腐剂、无色至淡黄色、澄清至微乳光的液体，在较长的时间内仍能维持融合蛋白的物理和化学稳定性，有效延长了储存期；
(2)本发明提供的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂中融合蛋白含量、pH均较高，可减少用药频率，减少对低pH对血管的刺激性，适合血管注射，减轻了患者高频率、依赖性注射胰岛素等降糖针剂的痛苦，患者用药的顺应性好。
(3)本发明提供的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂中辅料成分简单，质量稳定可控。
本发明还提供了一种制备所述Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂得制备方法，包括：按比例称取处方量的表面活性剂、稳定剂、pH调节剂和溶媒；在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂并调pH至预设值，加入稳定剂，搅拌10-15min至完全溶解，作为溶液A；取部分溶液A并加入表面活性剂至浓度为80-120g/L，搅拌5-10min至澄清，作为溶液B；将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C(≥4mg/ml)，根据注射制剂的终浓度计算溶液A、B、C的用量，按比例将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。其中超滤使用的膜包规格为0.1m2、10KD，流速为50rpm(使用泵为WATSON MARLOW的520S)，进口压力≤1bar。通过检测超滤换液时透过液的pH和电导率确认换液是否完成；透过液pH为溶液A的pH±0.05，透过液电导率为溶液A电导率±0.2mS/cm，同时达到这两个条件即为换液完成。超滤换液时使用溶液A的量一般为≥6倍*纯化转交样品量；使用膜包超滤换液法较透析法速率快，使用溶液少，换液彻底。所述制备方法具有与上述注射制剂相同的有益效果，在此不再进行赘述。
所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。例如，用于治疗患有糖尿病和肥胖症以及多种其它病症或障碍的患者。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、吐温-20的DOE实验主效应分析图；
图2为磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、吐温-20的DOE实验等值线图；
图3为磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、泊洛沙姆-188的DOE实验主效应分析图；
图4为磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、泊洛沙姆-188的DOE等值线图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
Figure BDA0002614393490000051
制备方法：(1)按比例称取处方量的泊洛沙姆-188、甘露醇、一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂——一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.6，加入稳定剂-甘露醇，搅拌15min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入泊洛沙姆-188至浓度为100g/L，搅拌10min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按量将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装；
实施例2
Figure BDA0002614393490000052
Figure BDA0002614393490000061
制备方法：(1)按比例称取处方量的泊洛沙姆-188、甘露醇、一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂——一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.7，加入稳定剂-甘露醇，搅拌10min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入泊洛沙姆-188至浓度为100g/L，搅拌5min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按量将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装；
实施例3
Figure BDA0002614393490000062
制备方法：(1)按比例称取处方量的吐温-20、甘露醇、一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂——一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.7，加入稳定剂-甘露醇，搅拌12min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入吐温-20至浓度为80g/L，搅拌5min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按量将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。
实施例4
Figure BDA0002614393490000063
Figure BDA0002614393490000071
制备方法：(1)按比例称取处方量的吐温-20、甘露醇、柠檬酸、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂——柠檬酸、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.3，加入稳定剂-甘露醇，搅拌10min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入吐温-20至浓度为100g/L，搅拌7min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按比例将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。
实施例5
Figure BDA0002614393490000072
制备方法：(1)按比例称取处方量的泊洛沙姆-188、甘露醇、柠檬酸、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，加入pH调节剂——柠檬酸、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.5，加入稳定剂-甘露醇，搅拌10min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入泊洛沙姆-188至浓度为100g/L，搅拌7min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按比例将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。
实施例6
Figure BDA0002614393490000073
Figure BDA0002614393490000081
制备方法：(1)按比例称取处方量的吐温-20、甘露醇、一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠和注射用水；(2)在配置容器中加入注射用水，按比例加入pH调节剂——一水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠并调pH至7.2，加入稳定剂-甘露醇，搅拌10min至完全溶解，作为溶液A；(3)取部分溶液A，加入吐温-20至浓度为100g/L，搅拌7min，作为溶液B；(4)将使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至溶液A，作为溶液C；(5)按比例将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。
对比例1
采用申请号2018113110774.9中实施例11的技术方案制备含有Exendin-4-Fc融合蛋白的注射制剂。
对比例2
采用对比例1的制备方法，唯一区别在于，Exendin-4-Fc融合蛋白用量为0.3％。
对比例3
采用实施例5的制备方法，唯一区别点在于，所述Exendin-4-Fc融合蛋白浓度为4mg/ml。
发明人前期通过单因素优化实验，对pH调节剂种类、pH及浓度、添加剂种类、浓度进行了初步研究，选择具有潜力的组分进行DOE实验。
实验例1缓冲液的筛选、优化
用不同种类、浓度的pH调节剂溶解2.8mg/ml的Exendin-4-FC融合蛋白，采用0.22μm滤膜过滤制备好的Exendin-4-FC融合蛋白溶液，将其分装至2mL西林瓶中，55℃下储存24h后通过SEC-HPLC检测分析单体含量变化，并采用DSF分析热稳定性，其中SEC-HPLC流动相为：0.15M磷酸盐溶液：乙腈＝850：150；流速：0.50ml/min；检测波长：280nm；DSF检测时加热温度区间为20℃～95℃，加热速率为1℃/min；结果见表1、表2。
表1 pH调节剂种类及溶液pH对稳定性的影响
Figure BDA0002614393490000082
Figure BDA0002614393490000091
综合SEC-HPLC和DSF两种检测结果，二者较为一致，缓冲液筛选范围定为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH7.0-7.5和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH6.5-7.5。
表2 pH调节剂浓度对稳定性的影响
Figure BDA0002614393490000092
Figure BDA0002614393490000101
注：“——”表示该条件未检测
综合DSF及SEC结果，确定缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH7.5附近，或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH7.0-7.5附近，浓度在10mM左右。
实验例2不同pH注射制剂的DOE实验
根据发明人前期实验结果，按pH调节剂浓度10mM，制备不同pH的注射制剂(其中Exendin-4-FC融合蛋白浓度2.8mg/ml)，经0.22μm滤膜过滤、分装至2mL西林瓶中，通过SEC-HPLC检测样品在55℃下放置24h后单体含量，结果见表1、表2；此外，以pH调节剂浓度5mM，甘露醇选取与人体血液渗透压范围(285～310mOmol/kg)接近的浓度(290mM)，制备不同pH的注射制剂，其余条件同上，同样检测样品在55℃下放置24h后单体含量，结果见表3、表4。
表3 10mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠为pH调节剂下不同pH的DOE实验
Figure BDA0002614393490000102
表4 10mM磷酸氢二钠-柠檬酸为pH调节剂下不同pH的DOE实验
Figure BDA0002614393490000103
Figure BDA0002614393490000111
根据上述实验结果可知，磷酸氢二钠-柠檬酸作为缓冲液，聚集体含量更少。对该DOE实验结果分别进行主效应分析。(1)如图1、图2，对10mM磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、吐温-20进行主效应分析，发现：影响较大的为pH和甘露醇含量；其中pH7.3-7.5的单体含量均值最高；随着甘露醇浓度提高，单体含量均值逐渐升高，因此在测定范围内，甘露醇浓度越高越好；吐温20含量对单体含量均值影响不大，不同浓度下无明显变化，实验条件下单体含量最高为97.44％。(2)如图3、图4，对10mM磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、泊洛沙姆-188进行主效应分析，发现：影响较大的为甘露醇含量和pH，其中pH7.0-7.5最佳，甘露醇浓度越高越好，泊洛沙姆-188含量影响不大，实验条件下单体含量最高为97.46％。
表5 5mM不同pH调节剂的DOE实验数据
Figure BDA0002614393490000112
Figure BDA0002614393490000121
对该DOE实验结果分别进行主效应分析。(1)对5mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、甘露醇、吐温-20或泊洛沙姆-188进行主效应分析，影响较大的为pH和表面活性剂含量；其中pH7.7最佳，吐温-20含量0.03％最佳或泊洛沙姆-188含量0.05％最佳。(2)对5mM磷酸氢二钠-柠檬酸、甘露醇、吐温-20或泊洛沙姆-188进行主效应分析，在pH7.3、吐温-20含量为0.03％或pH7.5、泊洛沙姆-188含量为0.03％时最佳。
由表3、表5可知，当磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度从10mM降至5mM，单体稳定性显著增强。由表4、表5可知，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度从10mM降至5mM，单体含量并没有显著提高，推测可能不同的缓冲盐(磷酸盐缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)的盐浓度对样品单体含量的影响有所差异。
实验例3Exendin-4-FC融合蛋白浓度的DOE实验
在实验例1中，注射制剂中的融合蛋白浓度为1mg/mL，用吐温-20代表了吐温类代表物，以泊洛沙姆-188作为代表考察对象。为后续实际使用方便，需研究不同蛋白浓度样品的稳定性。本实验中用吐温-80替代吐温-20，或泊洛沙姆-407替代泊洛沙姆-188进行研究，以考察两类表面活性剂组合的稳定效果。
实验分组见下表，每个样品中的稳定剂均为浓度290mM的甘露醇，制备的样品经0.22μm滤膜过滤、分装至2mL西林瓶中，储存于40℃加速条件下5周，采用SEC-HPLC检测随着储存时间延长单体含量的变化进行分析。
表6不同组方在加速实验条件下稳定性数据
Figure BDA0002614393490000122
Figure BDA0002614393490000131
Figure BDA0002614393490000141
根据表6可知，当融合蛋白浓度为较高时，2-5mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠作为Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂的pH调节剂效果最优。
实验例4pH对稳定性的影响
分别制备pH7.2和pH7.7的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，组方为：2mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、290mM甘露醇、0.03％吐温-20，Exendin-4-Fc融合蛋白3mg/ml，将样品置于37℃、25℃、2-8℃下放置一定时间，定期取样检测单体纯度，结果见表7-9。
表7 37℃不同pH下样品的稳定性数据
Figure BDA0002614393490000142
表8 25℃不同pH下样品的稳定性数据
Figure BDA0002614393490000143
Figure BDA0002614393490000151
表9 2-8℃不同pH下样品的稳定性数据
Figure BDA0002614393490000152
由表7-9可知，重组Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂(pH7.2)在高温加速(37℃)、加速(25℃)和长期(2-8℃)条件放置的稳定性优于pH7.7。进一步的，
由于该实验未设计低于pH7.2的样品的稳定性，因此制备pH为6.2、6.7、7.2的注射制剂，组方为2mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、290mM甘露醇、0.03％吐温-20，Exendin-4-Fc融合蛋白3mg/ml，置于40℃和25℃下不同时间取样，用SEC-HPLC测单体纯度，结果见表10、11。
表10制备不同pH的注射制剂在40℃下稳定性数据
Figure BDA0002614393490000153
Figure BDA0002614393490000161
表11制备不同pH的注射制剂在25℃下稳定性数据
Figure BDA0002614393490000162
Figure BDA0002614393490000171
由上表可知，制备的注射制剂在pH为7.2时，样品的稳定性最优。
实验例5——稳定性
取实施例1-6及对比例1、2制备的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，在2-8℃，相对湿度55％下放置，进行溶液稳定性测定，分别于0、3、6、9月取样，观察外观并采用HPLC进行Exendin-4-Fc融合蛋白、及杂质含量测定，其中外观及HPLC均为本领域常用方法，在此不再进行赘述。
表12不同放置时间下Exendin-4-Fc融合蛋白的含量变化
Figure BDA0002614393490000172
表13不同放置时间下溶液中总杂的含量变化
Figure BDA0002614393490000173
表14不同放置时间下溶液中外观变化
Figure BDA0002614393490000174
由表11-14可知，在低温下放置9个月后，对比例1-3中Exendin-4-Fc融合蛋白降解明显(主要含量下降、杂质含量增加)，而本申请制备的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂中Exendin-4-Fc融合蛋白变化极小，十分稳定。同时，实施例1、实施例6、对比例2可知，当降低Exendin-4-Fc融合蛋白浓度时，显然制备的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂也是稳定的；当提高Exendin-4-Fc融合蛋白浓度时(如对比例2)，显然注射用量减少，患者更易接受，但此时注射制剂稳定性更加重要，极易产生杂质；与对比例1相比，对比例3在提高融合蛋白浓度后，稳定性更差。本申请通过创造性的优化配方，辅料用量少，搭配合理，注射制剂的稳定性也有所提高，更加安全可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述注射制剂包括Exendin-4-Fc融合蛋白0.28-0.35％(w/v)、表面活性剂0.01％-0.05％(w/v)、稳定剂1.8-5.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒，所述注射制剂的pH为7.0-7.7。
2.根据权利要求1所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述pH调剂剂为柠檬酸钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、醋酸钠-醋酸、Tris-HCl、柠檬酸-磷酸氢二钠、醋酸-磷酸氢二钠中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述pH调剂剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。
4.根据权利要求3所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述注射制剂中磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的浓度为2-10mM。
5.根据权利要求4所述的的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述注射制剂的pH为7.2-7.7。
6.根据权利要求1所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述稳定剂为NaCl、Na2SO4、甘露醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂，其特征在于，所述溶媒为注射用水。
9.一种制备如权利要求1-8任一项所述Exendin-4-Fc融合蛋白注射制剂的制备方法，其特征在于，包括：
(1)按比例称取处方量的表面活性剂、稳定剂、pH调节剂和溶媒；
(2)在配置容器中加入溶媒、pH调节剂使制剂pH至预设值，加入稳定剂，搅拌10-15min至完全溶解，作为溶液A；
(3)取部分溶液A并加入表面活性剂至浓度为80-120g/L，搅拌5-10min，作为溶液B；
(4)使用超滤法将纯化转交的样品超滤换液至部分溶液A中，作为溶液C，按比例将溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，通N2灌装。
10.权利要求1-8任一项所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白注射制剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。
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