CN114034753A - 一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，包括如下步骤：将样品溶液进行毛细管电泳，电泳条件为：未涂层石英毛细管有效检测长度48‑60cm；检测波长为190‑225nm；分离电压为25‑30kV；温度为20‑25℃；压力0.5‑0.8psi进样3‑5s，运行缓冲液为25‑50mmol/L硼砂缓冲液与20‑25mmol/L柠檬酸钠缓冲液；运行时间为30‑35min，得到指纹图谱。本发明所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法通过“W”形的三联差异峰作为鉴别卵孢长根菇不同子实体出菇表型的关键指示峰，为后期卵孢长根菇野生驯化和杂交育种后的出菇菌种的筛选和鉴定提供新的方法。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，尤其是涉及一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法。
背景技术
现有技术中关于食用菌指纹图谱测定方法比较常用的是液相色谱方法，但是该方法需要用到色谱柱需要经常的维护，成本高，并且全程使用有机溶剂，在测定过程中溶剂挥发会影响操作者的健康，测定结束后的有机废液也需要特殊处理，但排放的过程也会有污染。本发明提供的卵孢长根菇毛细管电泳出菇表型鉴别测定方法，毛细管运行过程中不需要有机溶剂，缓冲液为无机盐溶液，没有挥发性可以减少有机溶剂的污染，对人和环境都比较友好。
液相色谱需要的上样量比较大，且样品处理比较复杂，若样品的粘稠度过高经常堵塞色谱柱。而有的食用菌野生的资源采集的样本量比较少，经常达不到液相色谱的上样条件，这样对食用菌品种的有效成分的测定就不全面。
毛细管电泳技术(HPCE)源自传统电泳技术，是传统电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，在医药，食品等一些活性物质的测定上发挥出一定的作用；毛细管电泳一次进样量是微克级别，一般食用菌都可以达到，对于一些比较珍贵的样本可行性更高。
卵孢长根菇是可人工栽培的珍稀菌类，目前，已成为我国可商业化栽培的食用菌之一，有的冠之以“黑鸡枞”的商品名称上市销售，以提高售价。在研究中发现卵孢长根菇子实体形态一种近球形，无绒毛，颜色浅；另一种子实体形态细长，有绒毛，颜色深。有关利用毛细管电泳技术鉴别卵孢长根菇出菇表型的研究与应用报道较少。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，包括如下步骤：将样品溶液进行毛细管电泳，电泳条件为：未涂层石英毛细管有效检测长度48-60cm；检测波长为190-225nm；分离电压为25-30kV；温度为20-25℃；压力0.5-0.8psi进样3-5s，运行缓冲液为20-25mmol/L硼砂缓冲液与20-25mmol/L柠檬酸钠缓冲液；运行时间为30-35min，得到指纹图谱。
进一步，所述的样品溶液的处理方法如下：将不同出菇表型的卵孢长根菇活化后进行培养，将得到的菌丝体进行过滤、冲洗、烘干、粉碎后得到菌粉，在菌粉中加入15-30倍量的超纯水，超声、过滤后得到一次上清液，在得到的菌渣中加入15-30倍量的超纯水进行超声提取得到二次上清液，将上清液合并膜过滤后得到样品溶液。
进一步，所述的培养步骤的培养基为PDA培养基，温度为22-25℃，140-160r/min摇床培养7-9d。
进一步，所述的超声步骤的时间为20-30min；所述的超声提取的时间为15-30min；所述的膜过滤步骤采用0.22μm孔径的水系滤膜。
进一步，所述的卵孢长根菇HPCE指纹图谱包括9个特征峰，1-9号特征峰的保留时间分别为8.829-9.088min，11.804-12.233min，13.346-14.163min，13.887-14.779min，15.950-17.175min，16.758-17.467min，17.375-21.567min，22.208-23.058min，23.767-24.958min。
进一步，所述的卵孢长根菇的球形子实体与细长形子实体的HPCE指纹图谱的差异在于：所述的卵孢长根菇的球形子实体的HPCE指纹图谱中16-19min的特征峰为“W”形的三联差异峰。
对其进行了DNA分子鉴定均为卵孢长根菇。对收集的有代表性的5种长根菇进行毛细管电泳分析，得到的结果与DNA和形态鉴定一致，发现一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇子实体表型的方法。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法通过“W”形的三联差异峰作为鉴别卵孢长根菇不同子实体出菇表型的关键指示峰，为后期卵孢长根菇野生驯化和杂交育种后的出菇菌种的筛选和鉴定提供新的方法。
本发明所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法在毛细管运行过程中不需要有机溶剂，缓冲液为无机盐溶液，没有挥发性可以减少有机溶剂的污染，对人和环境都比较友好。
食用菌野生的资源采集的样本量比较少，经常达不到液相色谱的上样条件，这样对食用菌品种的有效成分的测定就不全面。本发明所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法可以减少这一现象。毛细管电泳一次进样量是微克级别，一般食用菌都可以达到，对于一些比较珍贵的样本可行性更高。
附图说明
图1为本发明实施例1-5所述的卵孢长根菇的指纹图谱；
图2为本发明实施例6-10所述的卵孢长根菇的指纹图谱；
图3为本发明实施例1-5所述的卵孢长根菇的成分3D图谱：3-A为H1，3-B为H2，3-C为H3，3-D为H4，3-E为H5；
图4为本发明实施例6-10所述的卵孢长根菇的成分3D图谱：4-A为H6，4-B为H7，4-C为H8，4-D为H9，4-E为H10；
图5为本发明实施例1-5所述的卵孢长根菇的聚类分析结果；
图6为本发明实施例所述的卵孢长根菇的近柱状子实体的结构图；
图7为本发明实施例所述的卵孢长根菇的近球形子实体的结构图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所使用的仪器与设备具体如下：
P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司)；精密p H计(北京泰亚赛福科技发展有限责任公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HZQ-QX全温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；干热消毒箱(上海精宏实验设备有限公司)；A11高速粉碎机(德国IKA集团)；CascadaTM实验室超纯水系统(Pall corporation)微孔滤膜(孔径0.22μm，津隆设备有限公司)。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，包括如下步骤：
(1)样品溶液处理：将卵孢长根菇(产地福建，子实体形态近柱形，子实体深褐色，有绒毛，菌褶、菌肉均白色)活化后接种于PDA液体培养基中，22℃，160r/min摇床培养7-9d。将双层纱布过滤后，用双蒸水冲洗菌丝体2-3次，烘干粉碎后得到的菌粉按照1:15加超纯水，超声30min，过滤后取上清液，在菌渣中再加15倍的超纯水超声提取30min，两次的上清液合并。用0.22μm孔径的水系滤膜滤过后待用。
(2)电泳条件：未涂层石英毛细管有效检测长度48cm；检测波长为225nm；分离电压为30kV；温度为20℃；压力0.5psi进样5s，运行缓冲液为25mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；25mmol/L柠檬酸钠缓冲液；运行时间为30min，得到的指纹图谱如图1中H1所示。
实施例2
与实施例1不同之处在于：卵孢长根菇的产地辽宁，子实体形态近柱形，子实体深褐色，有绒毛，菌褶、菌肉均白色；指纹图谱如图1中H2所示。
实施例3
与实施例1不同之处在于：卵孢长根菇的产地辽宁，子实体形态近球形，子实体浅褐色，无绒毛，近光滑，菌褶、菌肉均白色；指纹图谱如图1中H3所示。
实施例4
与实施例1不同之处在于：卵孢长根菇的产地福建，子实体形态近柱形，子实体深褐色，有绒毛，菌褶、菌肉均白色；指纹图谱如图1中H4所示。
实施例5
与实施例1不同之处在于：卵孢长根菇的产地河南，子实体形态近球形，子实体浅褐色，无绒毛，近光滑，菌褶、菌肉均白色；指纹图谱如图1中H5所示。
实施例6
与实施例1不同之处在于：运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；柠檬酸钠缓冲液20mmol/L；指纹图谱如图1中H6所示。
实施例7
与实施例2不同之处在于：运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；柠檬酸钠缓冲液20mmol/L；指纹图谱如图1中H7所示。
实施例8
与实施例2不同之处在于：运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；柠檬酸钠缓冲液20mmol/L；指纹图谱如图1中H8所示。
实施例9
与实施例2不同之处在于：运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；柠檬酸钠缓冲液20mmol/L；指纹图谱如图1中H9所示。
实施例10
与实施例2不同之处在于：运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.5)；柠檬酸钠缓冲液20mmol/L；指纹图谱如图1中H10所示。
实施例1-5通过对5种不同产地、不同品种、不同保存时间的卵孢长根菇建立了HPCE指纹图谱，通过分析比较，确定了个共有9个特征峰，时间分别是8.829-9.088min，11.804-12.233min，13.346-14.163min，13.887-14.779min，15.950-17.175min，16.758-17.467min，17.375-21.567min，22.208-23.058min，23.767-24.958min这些共有特征峰构成了卵孢长根菇的指纹特征，可作为卵孢长根菇的标准指纹图谱。
通过图谱可知，H1，H2，H4在峰种类和数量上比较一致，而H3和H5在图谱中可以归为一类，并且发现14.475min,15.950,16.758min有个比较与其他品种相异“W”形的三头特征峰。可以以此为鉴定卵孢长根菇不同子实体出菇表型的关键指示峰。
将卵孢长根菇连续进样5次，考察色谱峰保留时间的一致性，记录出峰时间和峰面积，计算样品出峰时间RSD为0.85-1.26％；峰面积的RSD为0.15％-6.88％，这表明该方法的精密度良好。
分别在0,4,8,10小时不同的时间点进行检测，以主要峰面积计算，考察样品的稳定性。出峰时间RSD为0.768-2.88％；峰面积RSD为1.28％-9.71％。这表明样品在10小时内是稳定的。
利用相对峰面积行系统聚类分析。采用平均组间联接法，以夹角余弦为测度进行聚类分析。结果表明(图3)：各类间的距离映射到0～25H3和H5之间的距离最近，首先聚为一类；其次聚为一类是H1和H4，它们之间距离与H2距离相似。也可聚为一类。
通过卵孢长根菇“W”型三联差异峰，将5种卵孢长根菇分别两大类，对这两类菌进行栽培实验确定表型差异，结果表明，H1,H2和H4子实体(图4)形态细长，有绒毛，颜色深。而H3和H5(图5)子实体形态近球形，无绒毛，颜色浅。未来可以将卵孢长根菇菌丝成分中“W”型三联差异峰作为判定不同出菇表型的一个新的手段。
实施例1-5与实施例6-10表明，浓度分别为20mmol/L与25mmol/L的运行缓冲液均能鉴定不同表型性状的卵孢长根菇，但是，浓度为25mmol/L的运行缓冲液的“W”峰型更加明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：包括如下步骤：将样品溶液进行毛细管电泳，电泳条件为：未涂层石英毛细管有效检测长度48-60cm；检测波长为190-225nm；分离电压为25-30kV；温度为20-25℃；压力0.5-0.8psi进样3-5s，运行缓冲液为20-25mmol/L硼砂缓冲液与20-25mmol/L柠檬酸钠缓冲液；运行时间为30-35min，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的样品溶液的处理方法如下：将不同出菇表型的卵孢长根菇活化后进行培养，将得到的菌丝体进行过滤、冲洗、烘干、粉碎后得到菌粉，在菌粉中加入15-30倍量的超纯水，超声、过滤后得到一次上清液，在得到的菌渣中加入15-30倍量的超纯水进行超声提取得到二次上清液，将上清液合并膜过滤后得到样品溶液。
3.根据权利要求2所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的培养步骤的培养基为PDA培养基，温度为22-25℃，140-160r/min摇床培养7-9d。
4.根据权利要求2所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的超声步骤的时间为20-30min；所述的超声提取的时间为15-30min；所述的膜过滤步骤采用0.22μm孔径的水系滤膜。
5.根据权利要求1所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的硼砂缓冲液的pH值为9.2-9.5。
6.根据权利要求1所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的卵孢长根菇HPCE指纹图谱包括9个特征峰，1-9号特征峰的保留时间分别为8.829-9.088min，11.804-12.233min，13.346-14.163min，13.887-14.779min，15.950-17.175min，16.758-17.467min，17.375-21.567min，22.208-23.058min，23.767-24.958min。
7.根据权利要求6所述的基于高效毛细管电泳鉴别卵孢长根菇出菇表型的方法，其特征在于：所述的卵孢长根菇的球形子实体与细长形子实体的HPCE指纹图谱的差异在于：所述的卵孢长根菇的球形子实体的HPCE指纹图谱中16-19min的特征峰为“W”形的三联差异峰。
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