CN114018884A - 一种用于检测d-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于检测D‑阿洛酮糖的试剂盒及检测方法，涉及检测技术领域。该试剂盒包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ以及试剂Ⅴ。其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D‑阿洛酮糖。利用该试剂盒可在30分钟内完成96样本的检测，能够快速、准确地反映出样品中D‑阿洛酮糖的浓度或含量。利用该试剂盒在检测过程中不受D‑果糖及其他单糖等干扰物的影响，可应用于检测KEase酶促反应过程中D‑果糖至D‑阿洛酮糖的转化量以及筛选KEase酶变体。利用该试剂盒的检测过程中无需使用大型仪器设备，可显著降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法。
背景技术
阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，只存在于少数植物和某些细菌中，含量极低。随着肥胖和糖尿病等代谢综合征的发病率在世界范围内迅速增加，营养(功能性食品)和健康问题越来越受到关注。D-阿洛酮糖因具有控血糖、保护胰岛、抗氧化等诸多功效，已逐渐成为制药、保健和食品工业的研究热点。
然而，D-阿洛糖的应用受到其稀缺性的限制。从自然资源中提取D-阿洛酮糖生产不现实，会消耗大量资源，增加生产成本，破坏环境。另一方面D-阿洛酮糖的化学合成很困难，会产生有毒副产品，不适合用于食品。因此，简单、低成本、安全的阿洛酮糖生产工艺已成为阿洛酮糖商业化的主要研究方向。目前，酶法合成D-阿洛酮糖目前已成为领域内首选的合成方法。已经筛选并鉴定的酮糖3-差向异构酶(ketose-3-epimerase，KEase)至少有20种，包括：D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase)、D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)和L-核酮糖3-差向异构酶(LREase)等。但其中大多数的酶对D-果糖的催化活性较低且热稳定性较差，这大大的限制了生物酶法生产D-阿洛酮糖的工业实际应用。因此，新酶的挖掘以及酶的分子改造以获得高活性高热稳定性酶分子已成为科学研究领域和工业实际应用迫切需要解决的首要问题。对新酶的挖掘以及酶分子的改造的关键是建立方法使得能够快速有效地从大型酶数据库或酶突变体库中识别出改良的酶分子。目前定量分析D-阿洛酮糖的方法主要为色谱法，包括：薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，其中最常用的是高效液相色谱。这些方法虽然准确，但不适合对D-阿洛酮糖的高通量分析，而且由于测定过程需要消耗大量时间和成本过高，不允许对在酶定向进化筛选运动中所产生的大规模变异体库进行高通量筛选。因此，开发一种高效、灵敏且适合高通量筛选的试剂及检测方法来定量检测样品中D-阿洛酮糖的浓度(含量)并筛选酮糖3-差向异构酶是当前迫切需要的。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法，具有高效高通量、高灵敏度、不易受其他糖类分子干扰的特点。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本申请实施例提供一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂Ⅴ；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D-阿洛酮糖，试剂Ⅴ为NADH荧光标定检测试剂。
在本发明的一些实施例中，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的浓度为0-0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM。
在本发明的一些实施例中，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH2PO4 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na2HPO4 0.3～2.0mg/mL。
另一方面，本申请实施例提供一种利用上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)将试剂Ⅰ的pH调至6.5～10，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液；
2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同D-阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中D-阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；
3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL，加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
4)根据步骤3)反应前每个样品的D-阿洛酮糖浓度以及标准值与每个样品在反应后相对荧光值差值作D-阿洛酮糖浓度与相对荧光值差值的标准曲线，同时将获得的相对荧光值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间；
5)用试剂Ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，将混合液分别与稀释后的各样品等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应完的样品混合液各取出50μL加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖的样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
6)计算标准值与每个样品在反应后的相对荧光值差值，当有标准值与样品的相对荧光值差值未处于步骤4)获得的参考区间内时，则可根据相对荧光单位参照步骤4)获得的标准曲线计算得到样品对应的D-阿洛酮糖浓度，最后根据步骤5)中样品对应的稀释梯度或倍数换算即可得到待测样品中D-阿洛酮糖的浓度；如果所有标准值与样品的相对荧光差值均不在步骤4)获得的参考区间内，则需重新执行步骤5)，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释后的样品相对荧光值差值单位处于步骤4)获得的参考区间内。
在本发明的一些实施例中，所述步骤1)获得的混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM；所述步骤2)中，试剂Ⅳ经梯度或倍数稀释得到的稀释溶液组中，D-阿洛酮糖的浓度在0～0.4μM的浓度范围内分布；所述步骤3)及步骤5)中，试剂Ⅲ的添加量应满足：每毫升反应体系中核糖醇脱氢酶的含量不低于0.1mg。
本发明的有益效果在于：
1)操作简单、检测快捷，相比现有定量检测方法，本发明检测时间更短，可在30分钟内完成96样本的检测，能够灵敏、准确、快速的反映出样品中D-阿洛酮糖的浓度或含量。
2)在独有的线性范围内具有良好的精密度和准确度，不受D-果糖及其他单糖等干扰物的影响，可应用于检测KEase酶促反应过程中D-果糖至D-阿洛酮糖的转化量以及筛选KEase酶变体。
3)本发明在检测过程中无需使用大型仪器设备，显著降低了检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中采用本发明试剂盒得到的D-阿洛酮糖浓度与相对荧光差值ΔRFU(×103)的标准曲线；
图2为实施例2获得的重组表达菌(细胞)的菌液量与相对荧光差值ΔRFU"(×103)的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明技术方案及效果做进一步说明。
实施例1
样品中D-阿洛酮糖的浓度测定：
在本实施例中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，其组成为：NaCl 3.0～10.0mg/mL，KCl0.05～1.0mg/mL，Na2HPO4 0.3～2.0mg/mL，KH2PO4 0.01～0.5mg/mL；试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的NADH，其中NADH的浓度为50mg/mL；试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5mg/mL；试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的浓度为5mg/mL。
1)将试剂Ⅰ的pH调至8.0，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液，混合液中NADH的浓度为2.0μM，本实施例采用Infinite M200 Pro多功能酶标仪进行相对荧光值检测。
2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅴ进行倍数稀释，得到一组具有不同D-阿洛酮糖浓度的稀释溶液，其中D-阿洛酮糖浓度的从小到大依次为：0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μM。
3)在微孔板(96或384孔板)中分别加入50μL由步骤2)获得的不同浓度的稀释溶液，之后再向每种稀释溶液中加入50μL由步骤1)获得的混合液,向每个孔中加入2μL试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的稀释溶液混合液各取出50μL分别加到新的孔中，加入100μL试剂Ⅴ，37℃反应30min后采用Infinite M200 Pro多功能酶标仪检测每个孔在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM的D-阿洛酮糖的样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值。
4)根据步骤3)中每个样品在反应前的D-阿洛酮糖浓度以及标准值与每个样品相对荧光值差值ΔRFU(×103)作D-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值的标准曲线，结果如图1及表1所示，同时将获得的相对荧光值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间，根据表1，本实施例的参考区间为[0,23.912×103]，进一步地，根据标准曲线拟合得到的D-阿洛酮糖浓度及含量的计算公式分别为：
X＝[(Y-301.4)/59308]×稀释倍数，R2＝0.9834
X＝[(Y-301.4)/59308]×稀释倍数×V，R2＝0.9834
以上两个公式中，Y为相对荧光值差值ΔRFU(×103)，X为待测样品的D-阿洛酮糖的含量，V为待测样品体积。
表1一定浓度范围内的D-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值的对应关系
5)将适量D-阿洛酮糖溶于PBS缓冲液中，配制成具有一定D-阿洛酮糖浓度的溶液作为待测样品。用试剂Ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，在本实施例中采用稀释倍数为100、101、102、103、104、105，得到一组(6个梯度)待测样品的稀释溶液，各取50μL加入到微孔板(96或384孔板)中，再分别加入50μL由步骤1)获得的混合液，向每个孔中加入2μL试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应完的样品混合液各取出50μL分别加到新的孔中，加入100μL试剂Ⅴ，检测每个孔在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值。
6)计算步骤5)标准值与各稀释样品在反应后的相对荧光值差值ΔRFU'，其中稀释倍数为100的样品吸光度值差值ΔRFU为5.23×103，处于参考区间[0,23.912×103]内，以该吸光度值差值参照步骤4)获得的标准曲线或计算公式，得到待测样品中D-阿洛酮糖浓度0.096mg/mL。如果步骤5)所有稀释样品的吸光度值差值均不在参考区间[0,23.912×103]内，则需重新执行步骤5)，对待测样品进行稀释以及稀释样品反应前、后的吸光度值测定，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释样品的吸光度值差值处于上述参考区间内。
实施例2
对KEase酶促反应中D-阿洛酮糖浓度的测定：
本实施例所用的试剂盒与实施例1相同，使用前将试剂Ⅰ的pH调至7.4，将试剂Ⅱ用试剂Ⅰ进行稀释至NADH的浓度为2.0mg/mL。
1)根据球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(AgDAEase，可催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖)基因序列采用化学转化法将全基因合成的AgDAE-pET-28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过硫酸卡那霉素抗性平板筛选转化子，构建大肠杆菌AgDAEase重组表达菌。
2)挑取重组AgDAEase重组表达菌单菌落接种于5mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃、220r/min振荡培养至菌的OD600达到0.6～0.8时加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16℃、100r/min诱导表达16～18h。诱导表达后进行菌体的离心收集，收集到的菌体用0.8％的生理盐水清洗两次后再用5mL试剂Ⅰ重悬菌体。
3)分别取0、50、100、200、300、400μL重悬的菌液置于48孔板中，之后每孔分别加入终浓度为1mM的MgCl2和10mg/L的D-果糖，最后用试剂Ⅰ将每个孔中的菌液补齐至500μL，于60℃催化反应5～60分钟，之后置于沸水中终止反应。
4)反应后的样品用试剂Ⅰ分别梯度稀释40000倍，之后取出50μL样品稀释液分别加到新的孔中，加入50μL稀释后的试剂Ⅱ(其NADH的浓度为2μM)；向每个孔中加入2μL试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL分别加到新的孔中，加入100μL试剂Ⅴ，检测每个孔在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值。
5)计算菌液添加量为0μL反应体系与每个孔的反应体系相对荧光值差值ΔRFU"(×103)，以步骤3)添加的菌液量为横坐标，以每个孔样品的ΔRFU"为纵坐标得到如图2所示的标准曲线，根据标准曲线拟合得到的关系式如下：
Y＝46523X-206.26，R2＝0.9982
式中，Y为相对荧光值差值ΔRFU"(×103)，X为重组表达菌菌液量。表2为吸光度值差值相对荧光值差值ΔRFU"(×103)与重组表达菌菌液量的对应关系。从以上结果可以看出随着添加的AgDAE重组表达菌液量的增大，ΔRFU"(×103)会相应减小，并且二者呈线性变化趋势，由于反应体系中酶的含量是随着菌液添加量的升高而增加，对应的ΔRFU"(×103)越小，且表现出良好的线性关系(R2＝0.9982)，说明本发明所述试剂盒可以很准确的应用于KEase的高通量筛选，用于筛选催化活性更高的酶分子或酶分子变体。
表2菌液添加量与吸光度值差值的对应关系
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂Ⅴ；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D-阿洛酮糖，试剂Ⅴ为NADH荧光标定检测试剂。
2.根据权利要求1所述的用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的浓度为0-0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH2PO4 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na2HPO4 0.3～2.0mg/mL。
4.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将试剂Ⅰ的pH调至6.5～10，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液；
2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同D-阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中D-阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；
3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL，加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
4)根据步骤3)反应前每个样品的D-阿洛酮糖浓度以及标准值与每个样品在反应后相对荧光值差值作D-阿洛酮糖浓度与相对荧光值差值的标准曲线，同时将获得的相对荧光值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间；
5)用试剂Ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，将混合液分别与稀释后的各样品等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应完的样品混合液各取出50μL加入适量试剂Ⅴ，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖的样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
6)计算标准值与每个样品在反应后的相对荧光值差值，当有标准值与样品的相对荧光值差值未处于步骤4)获得的参考区间内时，则可根据相对荧光单位参照步骤4)获得的标准曲线计算得到样品对应的D-阿洛酮糖浓度，最后根据步骤5)中样品对应的稀释梯度或倍数换算即可得到待测样品中D-阿洛酮糖的浓度；如果所有标准值与样品的相对荧光差值均不在步骤4)获得的参考区间内，则需重新执行步骤5)，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释后的样品相对荧光值差值单位处于步骤4)获得的参考区间内。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)获得的混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0-0.4μM；所述步骤2)中，试剂Ⅳ经梯度或倍数稀释得到的稀释溶液组中，D-阿洛酮糖的浓度在0～0.4μM的浓度范围内分布；所述步骤3)及步骤5)中，试剂Ⅲ的添加量应满足：每毫升反应体系中核糖醇脱氢酶的含量不低于0.1mg。
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