CN114018674A - 一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液及其应用，特点是该染色液为将罗丹明B和EDC溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液，罗丹明B的浓度为7mM，EDC浓度为1M，其染色方法具体步骤如下：将固定后的膨胀生物组织置于水凝胶单体溶液中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液中70℃浸泡24小时，随即置于90℃浸泡24小时后清洗的步骤；室温下将样品浸泡于染色液中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品清洗的步骤；最后进行细胞核染色和三维成像，优点是能极大地降低染色成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种染色液，尤其是涉及一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液及其应用。
背景技术
对生物组织开展三维成像，由于其相较传统二维成像具有更高信息量，正逐渐成为研究组织病理学的新型手段。膨胀显微技术是从2015年起发展的超分辨显微技术，此方法通过将生物样品中的蛋白质锚定在可膨胀的水凝胶中，将样品物理胀大(每个维度膨胀4倍左右)后从而实现成像分辨率的提高。膨胀显微技术具有不受限于复杂光学仪器的独特优势。同时，在膨胀过程中通过蛋白质变性和磷脂去除达到组织透明化的目的。
2020年，Edward Boyden实验组[Yu CJ,et al.(2020)Expansion microscopy ofC.elegans.eLife 9]、Joshua Vaughan实验组[Mao C,et al.(2020)Feature-richcovalent stains for super-resolution and cleared tissue fluorescencemicroscopy.Science advances 6(22):eaba4542]和Joerg Bewersdorf实验组[M'Saad O&Bewersdorf J(2020)Light microscopy of proteins in their ultrastructuralcontext.Nat Commun 11(1):3850]使用带荧光分子的N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称NHS酯)对膨胀后的细胞和组织切片进行共价键染色，结合荧光显微镜成像，清晰展示了各类组织解剖结构(如肾组织中的肾小球和肾小管、肠组织中的绒毛和淋巴管、肝组织中的肝血窦、睾丸组织中的生精小管等)和亚细胞结构(如线粒体、核仁、核孔等)。相比于传统的组织染色方法(如苏木素-依红染色)，该方法的不同点在于它使染料以共价键方式结合到组织中，而不是以物理方式吸附在组织中。因而该方法具有染色信号更强、染料不脱落且染料光谱范围可自由选择等优势，对研究组织形态学病变带来重大裨益。现有的带荧光分子的NHS酯染色方法的主要缺点是染色所需染料成本较高。对一块5mm×5mm×5mm大小的组织染色，一般需要4mL染料溶液(染料分子浓度为0.5mM)，以罗丹明NHS酯染料为例，需耗费约101元人民币(表1)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能极大地降低成本的用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液，所述的染色液为将罗丹明B和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述的罗丹明B的浓度为7mM，所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为1M。
上述用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液进行染色的方法，具体步骤如下：
(1)组织取材：将大小为3-5mm3的生物组织块置于质量浓度为4％的多聚甲醛和20％丙烯酰胺中固定1天；
(2)组织样品的膨胀透明化处理：将固定后的组织置于水凝胶单体溶液中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液中70℃浸泡24小时，随即置于90℃浸泡24小时后，将样品放入PBS缓冲液和0.1％Triton X-100中清洗4小时；
(3)共价键荧光染色：室温下将样品浸泡于染色液中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中室温清洗4小时；
(4)细胞核染色：将样品置于含20μM Sytox Green染料的PBS溶液中室温浸泡24小时；
(5)三维成像：将样品充分浸泡于质量浓度为60％的蔗糖水溶液中，然后放入样品仓中，利用光片显微镜对样品进行三维成像。
优选的，所述的水凝胶单体溶液的质量浓度配方如下：20％丙烯酰胺，0.05％甲叉双丙烯酰胺，4％多聚甲醛，10％丙烯酸钠和0.1％VA-044聚合物引发剂，溶剂为磷酸盐缓冲液。运用此水凝胶溶液能实现4倍左右的膨胀倍数。
优选的，所述的蛋白质变性溶液配方如下：50mM三羟甲基氨基甲烷，200mM十二烷基硫酸纳和200mM氯化钠，溶液pH为9.0，溶剂为去离子水。
优选的，所述的光片显微镜选择5倍物镜，激发光波长为561nm和488nm，三维图像中每个像素大小取为2.54μm×2.54μm×3.00μm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液，染色所需原料廉价，染色过程只需一步操作，无需预先合成特定结构的荧光分子。该染色方法与膨胀显微成像结合，能实现对mm3尺度组织的全景式扫描成像，同时达到单细胞分辨率，对研究组织内各类细胞的病变具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明的共价键染色化学反应原理图。罗丹明B分子与EDC反应后可以与组织内的氨基结合形成共价键；
图2为本发明对膨胀肺组织染色的效果图。对一块3mm×3mm×3mm大小的小鼠肺组织膨胀后对其进行本发明的共价键染色和细胞核染色，并进行双色成像。三维成像效果图：(a)共价键通道信号、(b)细胞核通道信号。三维数据中第546层二维切面图：(c)共价键通道信号、(d)细胞核通道信号。该切面局部区域的放大图：(e)共价键通道信号、(f)细胞核通道信号；
图3为本发明对膨胀肾组织染色的效果图。对一块3mm×3mm×3mm大小的小鼠肾脏组织膨胀后对其进行本发明的共价键染色和细胞核染色，并进行双色成像。三维成像效果图：(a)共价键通道信号、(b)细胞核通道信号。三维数据中第445层二维切面图：(c)共价键通道信号、(d)细胞核通道信号。该切面局部区域的放大图：(e)共价键通道信号、(f)细胞核通道信号；
图4为本发明在肾脏病理中的实际应用。正常小鼠和缺血再灌注的小鼠肾脏通过膨胀、共价键染色和三维成像，(a)(b)三维成像图。(c)(d)为各自体积内的一层二维切面。(e)(f)代表通过对该切面内信号强度设定阈值将其二值化后的结果(白色代表1，黑色代表0)；(g)为进一步计算所得肾小管占据空间比例。它是通过计算二值化后肾小管所占体积与总空间体积的比值求得，误差棒代表各层切面所求得空间比例的标准差。正常和缺血再灌注的结果呈现显著差异，t检验的p值为10-18。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本发明对膨胀后的小鼠肺组织进行染色和三维成像。
(1)组织取材：将大小为3mm×3mm×3mm的小鼠肺组织块置于质量浓度为4％的多聚甲醛和20％丙烯酰胺中固定1天；
(2)组织样品的膨胀透明化处理：将固定后的组织置于水凝胶单体溶液(各成分质量浓度如下20％丙烯酰胺，0.05％甲叉双丙烯酰胺，4％多聚甲醛，10％丙烯酸钠，0.1％VA-044聚合物引发剂，溶剂为磷酸盐缓冲液)中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷，200mM十二烷基硫酸纳，200mM氯化钠，pH 9.0)中70℃24小时，随即置于90℃24小时后，将样品放入PBS缓冲液和0.1％Triton X-100中清洗4小时；
(3)共价键荧光染色：室温下将样品浸泡于染色液(配方为7mM罗丹明B，1M EDC，溶剂为pH为7.4的PBS缓冲液)中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中室温清洗4小时；如图1所示，将罗丹明B和EDC配成溶液与膨胀后的生物组织混合，可使罗丹明B与生物组织内大量的氨基形成酰胺键，从而实现对生物组织荧光标记的效果。
(4)细胞核染色：将样品置于含20μM Sytox Green染料的PBS溶液中室温浸泡24小时；
(5)三维成像：将样品充分浸泡于质量浓度为60％的蔗糖水溶液中，然后放入样品仓中，利用光片显微镜对样品进行三维成像，选择5倍物镜，激发光波长为561nm和488nm。成像效果如图2所示，清晰展示了肺组织内部的各类解剖结构，如肺泡、支气管等，且细胞核通道能清晰分辨单细胞。
实施例2
本发明对膨胀后的小鼠肾脏组织进行染色和三维成像。
(1)组织取材：将大小为3mm×3mm×3mm的小鼠肾脏组织块置于质量浓度为4％的多聚甲醛和20％丙烯酰胺中固定1天；
(2)组织样品的膨胀透明化处理：将固定后的组织置于水凝胶单体溶液(各成分质量浓度如下20％丙烯酰胺，0.05％甲叉双丙烯酰胺，4％多聚甲醛，10％丙烯酸钠，0.1％VA-044聚合物引发剂，溶剂为磷酸盐缓冲液)中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷，200mM十二烷基硫酸纳，200mM氯化钠)中70℃24小时，随即置于90℃24小时后，将样品放入PBS缓冲液和0.1％Triton X-100中清洗4小时；
(3)共价键荧光染色：室温下将样品浸泡于染色液(配方为7mM罗丹明B，1M EDC，溶剂为磷酸盐缓冲液)中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中室温清洗4小时；
(4)细胞核染色：将样品置于含20μM Sytox Green染料的PBS溶液中室温浸泡24小时；
(5)三维成像：将样品充分浸泡于质量浓度为60％的蔗糖水溶液中，然后放入样品仓中，利用光片显微镜对样品进行三维成像，选择5倍物镜，激发光波长为561nm和488nm。成像效果如图3所示，清晰展示了肾脏组织内部的各类解剖结构，如肾小管、肾小球等，且细胞核通道能清晰分辨单细胞。
实施例3
缺血再灌注小鼠肾脏组织的膨胀透明化、染色和三维成像。
(1)组织取材：小鼠经缺血再灌注后6小时取材。将小鼠肾脏切成3mm×3mm×3mm的组织块，并置于4％多聚甲醛和20％丙烯酰胺中固定1天。对照组为正常小鼠；
(2)组织样品的膨胀透明化处理：将固定后的组织置于水凝胶单体溶液(各成分质量浓度如下20％丙烯酰胺，0.05％甲叉双丙烯酰胺，4％多聚甲醛，10％丙烯酸钠，0.1％VA-044聚合物引发剂，溶剂为磷酸盐缓冲液)中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷，200mM十二烷基硫酸纳，200mM氯化钠)中70℃24小时，随即置于90℃24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中清洗4小时；
(3)共价键荧光染色：室温下将样品浸泡于染色液(包含7mM罗丹明B，1M EDC，溶剂为磷酸盐缓冲液)中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中室温清洗4小时；
(4)三维成像：将样品充分浸泡于质量浓度为60％的蔗糖水溶液中，然后放入样品仓中，利用光片显微镜对样品进行三维成像，选择5倍物镜，激发光波长为561nm。成像结果如图4所示。图4为正常和缺血再灌注病变小鼠肾脏的对比实验，旨在通过三维成像准确地评估缺血再灌注对肾小管的损伤程度。经过三维成像、信号强度阈值分析和统计得出，缺血再灌注小鼠肾脏内肾小管所占空间比例较正常小鼠明显减少，从82％降到69％。因此本发明可用于从三维定量检测生物组织内的形态学病理变化。
综上所述，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)和罗丹明B染料混合后对组织进行染色，能极大地降低成本。对一块5mm×5mm×5mm大小的组织染色耗费约1.2元人民币(表1)，仅为NHS酯方法成本的1/84，因此适用于大规模地运用于大组织的共价键染色。染色后的组织可通过共聚焦显微镜、双光子显微镜或光片显微镜等进行三维成像。
表1染色成本计算
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液，其特征在于：所述的染色液为将罗丹明B和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液，其特征在于：所述的罗丹明B的浓度为7mM，所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为1M。
3.一种利用权利要求1-2中任一项所述的用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液进行染色的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)组织取材：将大小为3-5mm3的膨胀生物组织块置于质量浓度为4％的多聚甲醛和20％丙烯酰胺中固定1天；
(2)组织样品的膨胀透明化处理：将固定后的组织置于水凝胶单体溶液中4℃浸泡1天，然后将水凝胶和组织置于50℃聚合成胶4小时，将成胶后的组织置于蛋白质变性溶液中70℃浸泡24小时，随即置于90℃浸泡24小时后，将样品放入PBS缓冲液和0.1％Triton X-100中清洗4小时；
(3)共价键荧光染色：室温下将样品浸泡于染色液中振荡48小时，随后将样品置于蛋白质变性溶液中70℃清洗24小时，之后将样品放入PBS溶液和0.1％Triton X-100中室温清洗4小时；
(4)细胞核染色：将样品置于含20μM Sytox Green染料的PBS溶液中室温浸泡24小时；
(5)三维成像：将样品充分浸泡于质量浓度为60％的蔗糖水溶液中，然后放入样品仓中，利用光片显微镜对样品进行三维成像。
4.根据权利要求3所述的一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液进行染色的方法，其特征在于所述的水凝胶单体溶液的质量浓度配方如下：20％丙烯酰胺，0.05％甲叉双丙烯酰胺，4％多聚甲醛，10％丙烯酸钠和0.1％VA-044聚合物引发剂，溶剂为磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求3所述的一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液进行染色的方法，其特征在于所述的蛋白质变性溶液配方如下：50mM三羟甲基氨基甲烷，200mM十二烷基硫酸纳和200mM氯化钠，溶液pH为9.0，溶剂为去离子水。
6.根据权利要求3所述的一种用于膨胀生物组织共价键荧光染色的染色液进行染色的方法，其特征在于：所述的光片显微镜选择5倍物镜，激发光波长为561nm和488nm，三维图像中每个像素大小取为2.54μm×2.54μm×3.00μm。
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