CN114010843B - 水苏碱的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物的新的应用技术领域，具体而言，涉及水苏碱新的应用。水苏碱在制备治疗骨缺损的药物中的应用。本发明实施例提供一种水苏碱的新的应用，其能够有效促进成骨细胞分化，继而促进骨再生，实现骨修复，继而能够实现骨缺损的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及药物的新的应用技术领域，具体而言，涉及水苏碱新的应用。
背景技术
由于创伤、肿瘤、感染及先天性异常造成的骨缺损是现在临床工作中所面临的常见问题，并且随着社会老龄化的进展，对于骨缺损治疗的需求也将增加。自体骨移植、同种异体骨移植是常用的骨缺损治疗方法，但都存在着现阶段难以克服的局限性。
现有骨缺损修复方案不能提供令人满意的修复效果，使得替代途径的开发成为研究热点。骨髓间充质干细胞来源广泛，获取相对简单，且具有良好的成骨潜力，近年来基于使用骨髓间充质干细胞来修复骨缺损的研究方兴未艾，然而如何充分激发骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能仍然有待进一步的研究。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供水苏碱新的应用。本发明实施例提供一种水苏碱的新的应用，其能够有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，继而促进骨再生，实现骨修复，为骨缺损的治疗提供了一种潜在的新的治疗方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种水苏碱在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
在可选的实施方式中，所述药物中所述水苏碱存在的形式是经过水苏碱培养的细胞被明胶类物质包埋。
在可选的实施方式中，所述明胶类物质包括甲基丙烯酰化明胶。
在可选的实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶为甲基丙烯酰化明胶-60。
在可选的实施方式中，所述药物中所述水苏碱存在的形式是经过水苏碱培养的细胞被甲基丙烯酰化明胶-60包埋。
在可选的实施方式中，被所述甲基丙烯酰化明胶-60包埋的经过水苏碱培养的细胞按照下述方法制备：将甲基丙烯酰化明胶与光引发剂混合，然后将2者形成的混合物和经过水苏碱培养的细胞混匀后在光照射条件下进行交联固化；
优选地，被所述甲基丙烯酰化明胶-60包埋的经过水苏碱培养的细胞按照下述方法制备：将所述甲基丙烯酰化明胶和所述光引发剂在溶液中混合形成混合溶液，而后再将经过水苏碱培养的细胞与所述混合溶液混匀，接着，在光照射条件下进行交联固化。
在可选的实施方式中，交联固化的条件：光源的激发波长为405nm，照射时间为15秒，所述混合溶液中甲基丙烯酰化明胶与光引发剂的质量体积比为5％，所述光引发剂为LAP溶解在1xPBS液体中形成的物质，2者的质量体积比为0.25％。
在可选的实施方式中，所述药物为促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物；
优选地，所述药物为促进骨再生的药物。
第二方面，本发明提供一种水苏碱在制备骨修复材料中的用途。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种水苏碱新的应用，该水苏碱能够有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，继而促进骨再生，实现骨修复，继而能够实现骨缺损的治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的7d的ALP染色实验结果图；
图2为本发明实验例1提供的14d的ARS染色实验结果图；
图3为本发明实验例1提供的成骨基因的免疫荧光染色结果图；
图4为本发明实验例1提供的成骨标志蛋白7d western blotting实验结果图；
图5为本发明实验例2提供的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
水苏碱是从益母草(或中药“木易草”)叶中提取的，是主要的生物活性成分，相对分子质量为179.5，分子式为C7H15NO2，是最简单的吡咯生物碱，其结构式如下所示:
鉴于此本发明实施例提供一种水苏碱的新的应用，包括用于制备治疗骨缺损的药物。
本发明实施例提供一种包埋有水苏碱培养后的BMSCs的明胶的制备方法，包括：
首先，将水苏碱与成骨培养基混合形成混合培养基，其中，水苏碱的浓度为150-220μM，例如，可以为150μM、160μM、170μM、180μM、 190μM、200μM、210μM以及220μM等150-220μM之间的任意数值。
而后将骨髓间充质干细胞用加了水苏碱的成骨培养基培养，而后分离得到经过水苏碱培养的细胞。
需要说明的是：培养骨髓间充质干细胞的条件、分离得到经过水苏碱培养的细胞的步骤和条件等均为现有常规条件，此处不再进行详述。
将LAP与缓冲溶液(例如PBS溶液)混合，将GelMA加入上述混合液避光加热溶解形成混合溶液，而后将上述经过水苏碱培养的细胞加入上述混合溶液进行行重悬，而后光照交联，使得上述经过水苏碱培养的细胞被包埋于GelMA内。其中，混合溶液中甲基丙烯酰化明胶与光引发剂的质量体积比为5％，所述光引发剂为LAP溶解在1xPBS液体中形成的物质，2者的质量体积比为0.25％。
实例1体外实验
1)从液氮中取出冻存P5以前的BMSC，迅速将冻存管放入37℃水浴中快速融解。
2)配平后以500g离心5min，吸掉上清，加入1ml大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基重悬细胞。
3)将细胞均匀铺到T25培养瓶中，8字振动培养皿使细胞均匀分布，补齐培养基至5ml，5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。
4)待细胞融合度至80％-90％后去除完全培养基，吸取适量PBS溶液加入培养瓶中，轻轻振荡后弃去，重复一次；
5)加入1.5ml 0.25％胰蛋白酶，转动培养瓶，使其湿润整个表面细胞层， 37℃下消化1-2分钟，直至细胞皱缩变圆；
6)加入等量的完全培养基终止消化，吸取瓶中培养液反复冲壁上的细胞层，至全部冲下，轻轻吹打，混匀成细胞悬液；
7)将细胞收集到15ml无菌离心管中，拧紧盖子，封口胶封口，配平后 1000rpm 离心5min；
8)倒去上清液取细胞沉淀，将细胞沉淀分为两组，分别为对照组和实验组；
9)向对照组和实验组沉淀中加入5ml完全培养基重悬，吸出少许重悬液后进行细胞计数，然后按照10000个细胞/孔吸入相应重悬液至12孔板中，每孔补齐1ml液体，8字振动培养皿使细胞均匀分布，补齐培养基至 5ml，5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。
10)细胞融合度达到50％-70％后将空白对照组和实验组的培养液除去，分别换成新的成骨培养基和含有浓度为200μm的水苏碱的成骨培养基各 5ml，培养7天，每3天分别换新的成骨培养基和含有浓度为200μm的水苏碱的成骨培养基。
其中，完全培养基的组分是体积分数89.1％的α，9.9％的血清以及1％的双抗。成骨培养基组分为10％FBS、0.1％抗坏血酸、1％β-甘油磷酸、0.2％地塞米松、0.2％青霉素-链霉素和OriCellTM基础培养基。光引发剂为LAP，即苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。
检测方法：用ALP染色、ARS染色、免疫荧光染色以及Western Blotting 实验分别对实验组和对照组的12孔板进行检测。
实验结果参见图1-图4，图1为7d定量ALP染色实验结果图，图2为 14d半定量ARS染色实验结果图；图3为成骨基因的免疫荧光染色；图4 为成骨标志蛋白7d westernblotting实验结果图。
根据图1-图4可知，相比成骨培养基培养的BMSCs对照组，本实验方案在成骨培养基中加入水苏碱后培养的BMSCs在q-PCR中成骨相关基因Runx-2,Osterix,Osteopontin高表达；Western Blotting实验中成骨相关的蛋白质标志物RUNX2蛋白质表达升高；ALP染色实验显示碱性磷酸酶活性增强；ARS染色实验表明成骨产物钙结节量增加。结合这些结果可以看到，水苏碱促进了BMSCs的成骨分化。
实验例2动物实验
实验方法：
1)从液氮中取出冻存P5以前的BMSC，迅速将冻存管放入37℃水浴中快速融解。
2)配平后以500g离心5min，吸掉上清，加入1ml大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基重悬细胞。
3)将细胞均匀铺到T25培养瓶中，8字振动培养皿使细胞均匀分布，补齐培养基至5ml，5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。
4)待细胞融合度至50％-70％后去除完全培养基，分别向T25中加入成骨培养基与含有浓度为200μm的水苏碱的成骨培养基各5ml,加成骨培养基T25记为对照组，含水苏碱的T25记为实验组，此后每3天分别换一次液，培养7天；
5)培养7天后，每瓶对照组和实验组分别加入适量PBS转动清洗，而后重复清洗一次，然后向每瓶空白对照组或实验组中加入1.5ml 0.25％胰蛋白酶，转动培养瓶，使其湿润整个表面细胞层，37℃下消化1-2分钟，直至细胞皱缩变圆；加入5倍的完全培养基终止消化，吸取瓶中培养液反复冲壁上的细胞层，至全部冲下，轻轻吹打，混匀成细胞悬液；将细胞收集到 15ml无菌离心管中，拧紧盖子，封口胶封口，配平后1000rpm离心5min；倒去上清液分别取细胞沉淀。
6)将对照组和实验组沉淀分别和5％的未光固化交联的光引发剂- GelMA混合物混匀(每1百万细胞与1ml混合物混匀)后，吸入至96孔板中，每孔50-100ul，405nm光固化15秒形成凝胶；
7)将适量完全培养基加入96孔板中覆盖凝胶，37℃培养箱中放置5分钟，清洗样本，去除培养基；
8)分别向对照组和实验中加入新的成骨培养基和含有浓度为200μm 的水苏碱的成骨培养基各150ul，培养1天，为进一步观察细胞和材料的结合情况做准备。
9)取部分凝胶进行分别进行活死染色和ALP染色，剩余凝胶放置于96 孔板中准备植入颅骨缺损处。
10)溶液2％戊巴比妥钠40ml/kg腹腔注射麻醉，固定大鼠头部，头部碘消毒，正中切开皮肤5-8mm，用带直径5mm钻头电钻在头颅造成直径圆形缺损，缺损为颅骨全层缺损，但不伤硬脑膜，在钻孔过程中需要用无菌生理盐水清洗以降温。
11)第1组大鼠不做处理，直接用5-0丝线缝合皮下层，消毒后用1# 丝线缝合皮肤。术后保温直到大鼠苏醒，术后连续三天注射青霉素40万单位，即为空白对照组。第2组大鼠将甲基丙烯酰化明胶-60，放入5mm颅骨缺损中后再重复上述缝合步骤，即为对照组1。第3组大鼠将经过7天成骨培养基培养的BMSC和材料形成的凝胶放入5mm颅骨缺损后再重复上述缝合步骤，即为对照组2。第4组大鼠将经过含200μM水苏碱成骨培养基培养的BMSC和材料形成的凝胶放入5mm颅骨缺损后再重复上述缝合步骤，即为实验组。
12)在术后第四周收取大鼠颅骨样本，采用micro-CT。
micro-CT分析结果见图5。
根据图5可知，空白组颅骨缺损几乎无骨再生修复，对照组1大鼠颅骨缺损亦无明显的骨再生修复，对照组2大鼠颅骨缺损有少量的骨再生修复，而实验组大鼠骨再生修复明显；实验表明本发明实施例提供的水苏碱，特别是水苏碱被明胶类物质包埋后能促进大鼠颅骨缺损的愈合。
综上实验表明，水苏碱能刺激BMSC成骨向分化，为骨缺损的治疗提供了新的可能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种水苏碱在制备治疗骨缺损的药物中的应用，所述药物中所述水苏碱存在的形式是经过水苏碱培养的细胞被明胶类物质包埋；所述明胶类物质包括甲基丙烯酰化明胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶为甲基丙烯酰化明胶-60。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中所述水苏碱存在的形式是经过水苏碱培养的细胞被甲基丙烯酰化明胶-60包埋。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，被所述甲基丙烯酰化明胶-60包埋的经过水苏碱培养的细胞按照下述方法制备：先将甲基丙烯酰化明胶与光引发剂混合，然后将2者形成的混合物和经过水苏碱培养的细胞混匀后在光照射条件下进行交联固化。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，被所述甲基丙烯酰化明胶-60包埋的经过水苏碱培养的细胞按照下述方法制备：将所述甲基丙烯酰化明胶和所述光引发剂在溶液中混合形成混合溶液，而后再将经过水苏碱培养的细胞与混合溶液混匀，最后在光照射条件下进行交联固化。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，交联固化的条件：光源的激发波长为405nm，照射时间为15秒，所述混合溶液中甲基丙烯酰化明胶与光引发剂的质量体积比为5%，所述光引发剂为LAP溶解在1xPBS液体中形成的物质，2者的质量体积比为0.25%。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为促进骨再生的药物。
9.一种水苏碱在制备骨修复材料中的用途，所述骨修复材料中所述水苏碱存在的形式是经过水苏碱培养的细胞被明胶类物质包埋；所述明胶类物质包括甲基丙烯酰化明胶。
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