CN114008192A - 人调节t细胞的无珠离体扩增 - Google Patents
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Abstract
本公开文本总体上涉及用于过继细胞疗法的调节T细胞(Treg)的制造。特定地，本公开文本涉及用于离体扩增Treg的简化方法。以此方式产生的Treg适用于多种免疫治疗方案。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月30日提交的美国临时申请号62/841,215的权益，所述申请的公开内容通过引用以其整体特此并入。
关于联邦政府资助研发的声明
无。
技术领域
本公开文本总体上涉及用于过继细胞疗法的调节T细胞(Treg)的制造。特定地，本公开文本涉及用于离体扩增Treg的简化方法。以此方式产生的Treg适用于多种免疫治疗方案。
背景技术
调节T细胞(Treg)是外周血淋巴细胞的小子群体，并且对于控制耐受性、炎症和免疫系统稳态至关重要。已经观察到与不受控制的炎症和多种自身免疫性疾病相关的Treg缺陷。因此，正在开发Treg作为过继细胞疗法用于治疗自身免疫性和炎性疾病、骨髓移植后的移植物抗宿主病以及实体器官移植物的排斥(Bluestone和Tang,Science,362:154-155,2018)。
制造Treg用于临床前实验和临床试验的当前方法是多种多样的(Ruchs等人,Frontiers in Immunol,8:1844,2018)。大多数方法依赖于使用开发用于扩增常规CD4+T细胞和CD8+T细胞的过程对纯化的Treg的强抗原或促分裂刺激。特定地，这些过程使用针对固定在珠、人工抗原呈递细胞或聚合支架上的CD3和CD28的抗体，其强烈激活Treg以驱使所述细胞在IL-2的支持下增殖。在这些非天然体外条件下，Treg具有丧失其身份和功能的风险。因此，本领域对制造Treg的方法存在需要，所述方法导致始终稳健的Treg扩增，而对Treg身份和功能没有负面影响。另外，开发用于Treg扩增的简化的适应性方案是可取的，以降低细胞制造过程的复杂性，并且使得能更好地进行过程自动化，同时维持起始细胞群体的Treg表型。
发明内容
本公开文本总体上涉及用于过继细胞疗法的调节T细胞(Treg)的制造。特定地，本公开文本涉及用于离体扩增Treg的简化方法。以此方式产生的Treg适用于多种免疫治疗方案。
附图说明
图1提供描绘与实施例1中描述的本公开文本的无珠方案相比，使用涉及与磁珠缀合的抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg的扩增程度的图表。缩写如下：BF1＝涉及抗CD28SA Ab和IL-2的方案；BF2＝涉及抗CD28SA Ab、IL-2和IL-6的方案；BF3＝涉及抗CD28SA Ab、IL-2和TNF-α的方案；以及BF4＝涉及抗CD28SA Ab、IL-2、IL-6和TNF-α的方案。
图2提供描绘Treg谱系标记FOXP3、HELIOS和CD27在使用实施例1中描述的本公开文本的无珠方案产生的人Treg上的表达水平的图表。在第14天收获Treg。缩写如针对图1所述。
图3提供描绘Treg谱系标记FOXP3、HELIOS、CD62L和CD27在使用实施例1中描述的本公开文本的无珠方案产生的人Treg上的表达水平的流式细胞术直方图。在第14天收获Treg。缩写如针对图1所述。
图4提供描绘Treg谱系标记HELIOS和CD27在使用实施例1中描述的本公开文本的无珠方案产生的人Treg上的表达水平的流式细胞术直方图。在第14天收获Treg。缩写如针对图1所述。
图5提供描绘与本公开文本的BF4方案相比，使用涉及磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg的扩增程度的图表。在第14天收获Treg。
图6提供描绘与本公开文本的BF4方案相比，Treg谱系标记FOXP3和HELIOS在使用涉及磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg上的表达水平的流式细胞术直方图。在第14天收获Treg。
图7提供描绘与本公开文本的BF4方案相比，Treg谱系标记HELIOS和CD27在使用涉及磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg上的表达水平的流式细胞术直方图。在第14天收获Treg。
图8A和图8B分别提供描绘与本公开文本的BF4方案相比，通过使用涉及磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg对预激活的效应T细胞(Teff)和自体外周血单个核细胞(PBMC)增殖的抑制水平的图表。
图9提供描绘与本公开文本的BF4方案相比，通过使用涉及磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体的标准方案产生的人Treg在存在和不存在肿瘤坏死因子α的情况下对效应T细胞(Teff)增殖的抑制水平的图表。
图10提供描绘与本公开文本的BF10方案相比，使用在IL-1的存在下用磁珠和抗CD3和抗CD28单克隆抗体进行的两轮刺激产生的人Treg的扩增水平(珠)的图表。
具体实施方式
本公开文本总体上涉及用于过继细胞疗法的调节T细胞(Treg)的制造。特定地，本公开文本涉及用于离体扩增Treg的基于磁珠或基于饲养细胞的传统方案的替代性方法。以此方式产生的Treg适用于多种免疫治疗方案。
本公开文本提供用于产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及b)在包含CD28超级激动剂(CD28SA)抗体、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞。本公开文本还提供用于产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及b)在包含CD28SA抗体、IL-2、IL-6和TNF-α的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞。本公开文本还提供用于产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及b)在包含CD28SA抗体、IL-2、IL-1β和TNF-α的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞。在优选实施方案中，所述人Treg是CD3+、CD27+、CD62L+、CD8-和CD19-。在实施例和图中，包括在IL-6的存在下培养细胞的优选的刺激条件被称为BF4和BF4a。在实施例和图中，包括在IL-1β的存在下培养细胞的优选的刺激条件被称为BF10。
BF4和BF10条件及其变体(包括在由相同但浓度不同的细胞因子组成的培养基中培养T细胞)被认为导致产生如与在采用珠或人工抗原呈递细胞来固定抗CD3和抗CD28抗体的条件下产生的Treg相比，具有有利特性的Treg群体。不受理论束缚，认为抗CD3和抗CD28抗体的固定是过强的非生理学刺激，其导致Treg谱系不稳定且获取促炎功能。
如本文所用，术语“CD28超级激动剂抗体”、“CD28SA抗体”和“超级激动性抗CD28抗体”是指CD28特异性单克隆抗体，其能够在不存在T细胞受体激动剂的情况下激活T细胞。因此，在优选实施方案中，步骤b)不包括使用抗CD3抗体和/或不包括使用磁珠或表达Fc受体的饲养细胞来交联在分离的T细胞表面上表达的CD28和CD3。在一些实施方案中，所述培养基还包含肿瘤坏死因子受体2激动剂(TNFR2a)和干扰素γ(IFNγ)中的一种或两种。在一些实施方案中，所述TNFR2a是抗TNFR2抗体。
已经发现CD28SA单克隆抗体与CD28的免疫球蛋白样结构域的暴露的C”D环结合，而常规抗CD28单克隆抗体与CD28的暴露的F”G环结合，这对于B7结合至关重要(Luhder等人,J Exp Med,197:955-966,2003)。适用于本公开文本的方法的示例性CD28SA抗体包括但不限于由TheraMAB LLC(莫斯科，俄罗斯)开发的赛拉珠单抗(theralizumab)(也称为TAB08，并且曾称为TGN1412)，以及由Ancell Corp(贝波特，明尼苏达州)销售的ANC28.1。TGN1412及其变体的可变区的氨基酸序列描述于美国专利号8,709,414中。
本公开文本的无珠方法可以与Treg的抗原特异性扩增或选择组合用于产生抗原特异性Treg。例如，用于产生人调节T细胞(Treg)的方法还可以包括在步骤b)之前通过用主要组织相容性复合物(MHC)II类肽多聚体染色来分离抗原特异性T细胞，和/或在MHC II类肽多聚体的存在下在IL-2的存在下培养所述T细胞。采用MHC II类肽多聚体进行抗原特异性扩增的方法和用于Treg的过继转移的方法描述于美国专利号7,722,862中。
可替代地，用于产生人调节T细胞(Treg)的方法还可以包括在步骤b)之前和/或在步骤b)期间在同种异体刺激的B细胞(sBc)的存在下在IL-2的存在下培养T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含与同种异体sBc相关的HLA-DR中的错配。采用同种异体sBc进行抗原特异性扩增的方法和用于Treg的过继转移的方法描述于美国专利号9,801,911中，其实施例通过引用并入本文。
本公开文本的方法还可以包括步骤c)收获人Treg，其在一些实施方案中在步骤b)开始后7至18天开始。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)开始后最少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天和/或在步骤b)开始后最多18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8天开始。本公开文本的方法还可以包括步骤c)收获人Treg，其在一些实施方案中在步骤b)开始后11至18天开始。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)开始后最少11、12、13、14、15、16或17天和/或在步骤b)开始后最多18、17、16、15、14、13或12天开始。本公开文本的方法适合于将人Treg扩增约200至约2000倍。在优选实施方案中，所述方法导致产生比在步骤a)开始时存在的人Treg多至少200、600、1000、1400或1800倍的人Treg。在一些实施方案中，在收获当天通过流式细胞术评估人Treg中各种标记的表达水平。所评估的标记可以包括但不限于CD4、CD25、FOXP3、HELIOS、CD27、CD62L和CD8。Treg对CD4、CD25、FOXP3、HELIOS、CD27、CD62L呈阳性并且对CD8呈阴性。还使用二硫化物转化和之后的甲基化专用PCR或焦磷酸测序对TSDR脱甲基化进行定量。TSDR脱甲基化的高百分比表明，所产生的细胞是稳定的Treg谱系。
呈一般和特定形式的针对用于治疗或预防有需要的人受试者的病理学免疫应答的方法(其包括向所述受试者施用使用本公开文本的产生方法产生的人Treg)的参考文献和权利要求也涉及：
a)所述人Treg用于制造用于治疗或预防病理学免疫应答的药物的用途；以及
b)包含所述人Treg的药物组合物，其用于治疗或预防病理学免疫应答。
如本文所用，术语“病理学免疫应答”涵盖自身免疫性疾病、自身炎性疾病、同种异体移植排斥和移植物抗宿主病。“自身免疫性疾病”涉及免疫识别，从而导致对自身组织的直接损伤和功能受损。在病理上，自身免疫性疾病通常由适应性免疫系统的细胞驱动。自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、天疱疮、银屑病、I型糖尿病、乳糜泻和舍格伦综合征。“自身炎性疾病”涉及免疫系统的自发激活或对非自身抗原(例如，环境、食物、共生或其他抗原)的过度反应，从而导致对自身组织的间接(旁观者)损伤和功能受损。在病理上，自身炎性疾病通常受先天免疫系统的细胞支配。自身炎性疾病的例子包括但不限于炎性肠病、肌萎缩侧索硬化和其他神经系统变性疾病、过敏性气道疾病以及慢性阻塞性肺病。
本公开文本还提供药物组合物，其包含人Treg和生理学上可接受的缓冲液，如盐水或磷酸盐缓冲盐水。用于过继细胞疗法的有效量的药物组合物包含107至1011个(1千万至1千亿个)人Treg(参见例如，Tang和Lee,Curr Opin Organ Transplant,17:349-354,2012)。在一些情况下，将人Treg局部施用至患病组织(例如，在治疗类风湿性关节炎时，通过关节内输注至受影响关节)，或者系统性施用(例如，在治疗系统性红斑狼疮时，通过静脉内输注)。在一些实施方案中，Treg作为单一输注来施用，或者作为多次输注来施用，用于更好的移植物移入和延长的效果。局部输注可以包括施用107至109个Treg，而系统性输注可以包括施用109至1011个Treg。实体器官移植的治疗或预防可以包括施用109至1011个Treg，而移植物抗宿主病的治疗或预防可以包括施用1010至1011个Treg。
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数形式，除非另有指示。例如，“一种”赋形剂包括一种或多种赋形剂。
如本文所用短语“包含”是开放性的，表明此类实施方案可以包括另外的要素。相比之下，短语“由……组成”是封闭性的，表明此类实施方案不包括另外的要素(除了痕量杂质以外)。短语“基本上由……组成”是部分封闭性的，表明此类实施方案还可以包括不会实质性改变此类实施方案的基础特征的要素。应理解，本文描述为“包含”的方面和实施方案包括“由实施方案组成”和“基本上由实施方案组成”。
如本文所用关于值的术语“约”涵盖该值的90％至110％(例如，约200倍是指180倍至220倍并且包括200倍)。
本文公开的药剂的“有效量”是足以实现明确陈述的目的的量。“有效量”可以关于所陈述的目的凭经验来确定。药剂的“有效量”或“足量”是足以影响所需生物学作用(如有益结果，包括有益临床结果)的量。术语“治疗有效量”是指药剂(例如，人Treg)有效“治疗”受试者(例如，哺乳动物，如人)的疾病或障碍的量。药剂的“有效量”或“足量”可以以一个或多个剂量来施用。
术语疾病的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指执行方案，所述方案可以包括将一种或多种药物施用至个体(人或其他个体)，以努力减轻所述疾病的体征或症状。因此，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”不需要完全减轻体征或症状，不需要治愈，并且明确包括仅对个体具有姑息作用的方案。如本文所用，并且如本领域所熟知，“治疗”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、降低疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解。“治疗”还可以意指与未接受治疗的同种异体接受者的预期存活相比，延长同种异体接受者的存活。“缓和”疾病或障碍意味着，如与预期的未治疗的结果相比，疾病或障碍的程度和/或不期望的临床表现被减轻，和/或疾病或障碍的进展的时程被减慢。
列举的实施方案
在下述实施方案中，对实施方案1的任何提及涵盖实施方案1A和实施方案1B中的一者或两者。
1A.一种产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：
a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及
b)在包含CD28超级激动剂(CD28SA)抗体、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞，任选地其中所述人Treg是CD62L+和TNFR2+。
1B.一种产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：
a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及
b)在包含CD28超级激动剂(CD28SA)抗体、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞，任选地其中所述人Treg是CD62L+和TNFR2+。
2.根据实施方案1所述的方法，其中步骤b)不包括使用抗CD3抗体。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中步骤b)不包括使用磁珠或表达Fc受体的饲养细胞来交联所述分离的T细胞的CD28和CD3。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含肿瘤坏死因子受体2激动剂(TNFR2a)和干扰素γ(IFNγ)中的一种或两种；任选地其中所述TNFR2a是抗TNFR2抗体。
5.根据实施方案1B-4中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含IL-6和IL-1β中的一种或两种，任选地其中所述培养基还包含IL-1β而非IL-6，任选地其中所述培养基还包含IL-6IL-1β而非IL-1β。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述含有淋巴细胞的生物样品选自全血、白细胞单采术产物和外周血单个核细胞(PBMC)；任选地其中所述生物样品是新鲜的或者在从所述人受试者获得后冷冻保存，并且随后在步骤a)之前解冻。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中步骤a)的所述CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞是通过荧光激活的细胞分选(FACS)或磁性激活的细胞分选(MACS)从所述生物样品分离。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其还包括步骤c)收获所述人Treg。
9.根据实施方案8所述的方法，其中步骤c)在步骤b)开始后7-18天开始，任选地其中步骤c)在步骤b)开始后11-18天开始。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述人Treg包含比步骤a)开始时的所述CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞多约200至约2000倍的细胞。
11.一种药物组合物，其包含107至1011个使用根据实施方案1-10中任一项所述的方法产生的人Treg和生理学上可接受的缓冲液。
12.一种治疗或预防有需要的人受试者的病理学免疫应答的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用有效量的根据实施方案11所述的药物组合物；任选地其中所述有效量的所述药物组合物包含107至1011个所述人Treg，并且以20-40分钟的间隔静脉内输注至所述人受试者。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述病理学免疫应答是自身免疫或自身炎性疾病。
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述自身免疫或自身炎性疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、系统性红斑狼疮、天疱疮、银屑病、I型糖尿病、乳糜泻和炎性肠病；任选地其中所述自身免疫或自身炎性疾病是选自溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎性肠病。
15.根据实施方案13或14所述的方法，其中所述方法有效减少所述自身免疫或自身炎性疾病的症状，或者有效抑制所述自身免疫或自身炎性疾病的进展；任选地其中抑制所述自身免疫或自身炎性疾病的进展包括抑制组织破坏。
16.根据实施方案12所述的方法，其中所述病理学免疫应答是对造血同种异体移植物或实体器官同种异体移植物的排斥。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述病理学免疫应答是对造血同种异体移植物的排斥，并且所述造血同种异体移植物是骨髓移植物或外周血干细胞移植物。
18.根据实施方案16所述的方法，其中所述病理学免疫应答是对实体器官同种异体移植物的排斥，并且所述实体器官同种异体移植物选自心脏、肺、心脏/肺、肾、胰腺、肾/胰腺、肝、肠、胰岛和皮肤同种异体移植物。
19.根据实施方案16所述的方法，其中所述方法有效减少急性和/或慢性排斥的症状，或者有效延长所述器官同种异体移植物的存活。
20.根据实施方案12所述的方法，其中所述病理学免疫应答是移植物抗宿主病(GvHD)。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述方法有效减少急性和/或慢性GvHD的症状，或者有效抑制对所述宿主的皮肤、肝、肺和/或长的损伤。
22.根据实施方案12所述的方法，其中所述方法有效地相对于基线增加所述人受试者的Treg百分比。
23.一种抑制人效应T细胞(Teff)增殖的方法，所述方法包括：使人CD4+、CD25-、CD127+Teff与使用根据实施方案1-10中任一项所述的方法产生的人Treg在有效抑制所述Teff增殖的条件下接触；任选地其中所述接触是在TNF-α的存在下进行。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法或组合物，其中产生所述人Treg的所述方法符合药品生产管理规范(GMP)。
实施例
在以下实施例中更详细地描述本公开文本，所述实施例不意图以任何方式限制如要求保护的公开文本的范围。意欲将附图视为公开文本的说明书和描述的组成部分。提供以下实施例以说明而不是限制要求保护的公开文本。
在下文的实验公开文本中，适用以下缩写：Ab(抗体)；allo(同种异体)；BF(无珠)；CD28超级激动剂(CD28SA)；FACS(荧光激活的细胞分选)；IL-1β(白介素-1β)；IL-2(白介素-2)；IL-6(白介素-6)；IFNγ(干扰素γ)；PBMC(外周血单个核细胞)；Teff(效应T细胞)；TNFα(肿瘤坏死因子α)；TNF受体II激动剂抗体(TNFR2a)；Treg(调节T细胞)；TSDR(Treg特异性脱甲基化区域)；以及UCSF(加州大学旧金山分校)。
实施例1
产生调节T细胞(Treg)的无珠方法的开发
此实施例描述离体扩增人Treg的无珠方法的开发。
Treg分离.使用ficoll梯度从外周血样品分离人外周单个核细胞，之后将所述细胞洗涤两次并用针对以下的抗体染色：CD4(抗CD4 PerCP，克隆SK3，BD Biosciences，目录号347324)、CD25(抗CD25 APC，克隆2A3，BD Biosciences，目录号340939)和CD127(抗CD127PE，克隆HIL-7R-M21，BD Biosciences，目录号557938)。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分离CD4+CD25高CD127-/低Treg。
离体Treg扩增.将1x105个CD4+CD25+CD127-/低Treg铺板于48孔板的单一孔中的500ml T细胞培养基(RPMI，其含有5％FBS、青霉素/链霉素、HEPES、丙酮酸钠、glutamax和非必需氨基酸)中。可替代地，使用含有人AB血清的X-VIVO15。将T细胞用以下进行刺激：1-10μg/mL的CD28SA Ab(ANC28.1，克隆5D10，Ancell Corp.，目录号177-020)，或者与抗CD3和抗CD28抗体共价偶联的可磁化聚合物珠(抗CD3/CD28珠)，珠与细胞的比率为1:1。抗CD3/CD28珠是用于T细胞扩增和激活的DynabeadsTM人T激活剂CD3/CD28(ThermoFisherScientific，目录号111.31D)。所测试的无珠(BF)条件显示于表1-1中。在第2天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向细胞补充新鲜培养基。在第0天、第2天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天以300IU/mL补充人重组IL-2。在第0天、第2天和第5天以15、50和150ng/mL补充人重组IL-6(Peprotech，目录号200-06)。在第0天、第2天和第5天以50ng/mL补充人重组TNFα(Peprotech，目录号300-01A)。在第0天、第2天和第5天以2.5μg/mL补充TNFR2a(克隆MR2-1，HycultBiotech，目录号HM2007-FS)。在第0天、第2天和第5天以40ng/mL补充人重组IFNγ(Peprotech，目录号300-02)。在第0天、第2天和第5天以50ng/mL补充人重组IL-1β(Peprotech，目录号200-01B)。在第5天、第7天、第9天、第11天、第13天和第14天计数细胞，并且在第14天收获细胞以供分析。
表1-1.无珠Treg刺激条件
流式细胞术.在培养的第14天收获含有1x105个离体扩增的Treg的样品，并用针对CD4、CD27、FOXP3和HELIOS的抗体染色以供免疫表型分型。
Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)分析.在培养的第14天收获含有5x105个离体扩增的Treg的样品，并通过焦磷酸测序评估FOXP3基因座的甲基化。
体外抑制测定.收获在不同条件(如上所述)下培养的离体扩增的Treg并洗涤两次，之后将其与预激活的Teff或自体PBMC共培养。将通过FACS从PBMC分离的CD4+CD25低CD127+T细胞用抗CD3/CD28珠以1:1的细胞与珠的比率进行刺激。在第2天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天和第15天(或第2天、第5天和第7天)添加新鲜的细胞培养基，以获得预激活的Teff群体。将PBMC冷冻保存并在使用前解冻。将体外抑制测定设置为使用50,000个预激活的Teff或PBMC以及不同比率的Treg。在一些测定中，将50ng/ml TNFα添加至共培养孔。在共培养的第4天添加氚化胸苷持续最后16-18小时，并通过测量氚化胸苷掺入来确定细胞增殖。
结果
在存在或不存在IL-2的情况下，将BF1和BF1a条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。发现通过用CD28超级激动剂(CD28SA)抗体刺激实现的Treg扩增依赖于CD28SA Ab的浓度和IL-2的存在。简单来说，在存在4μg/ml而非2μg/ml CD28SA Ab时，观察到更大的Treg扩增。另外，BF1和BF1a两种条件都导致比标准抗CD3/CD28珠条件更大的且延长的Treg扩增。在培养的第5天获取的显微图像显示CD28SA Ab在IL-2的存在下对Treg的强激活，并且在不存在IL-2的情况下完全不存在激活相关的细胞群集。相比之下，在存在和不存在IL-2的两种情况下，抗CD3/CD28珠都激活Treg。
通过FACS分离T细胞的三个不同群体，并且在BF1条件或标准抗CD3/CD28珠条件下刺激七天。在培养的第7天获取的显微图像显示，相对于CD4+CD25-CD127高T效应细胞(Teff)和CD8+T细胞，CD28SA Ab优先激活CD4+CD25+CD127-/低Treg。在采用抗CD3/CD28珠时没有观察到对Treg的优先激活。
将BF1和BF2条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。发现CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率没有受到培养中IL-6添加的显著影响，并且BF1和BF2二者的速率优于使用珠刺激时观察到的。
将BF1和BF3条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。发现CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率没有受到培养中TNFα添加的显著影响，并且BF1和BF3二者的速率优于使用珠刺激时观察到的。
将BF1和BF4条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。通过在培养中添加IL-6和TNFα改进CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率。在培养的第5天的珠刺激的Treg和BF4刺激的Treg的显微图像显示在BF4条件中的广泛细胞群集，指示强Treg激活和增殖。另外，发现暴露于IL-6和TNFα的CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增是延长且稳健的。这是有利的，因为其排除了对Treg重刺激的需要，继而排除了使Treg去稳定的风险。
将BF4、BF4a和BF4b条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。发现IL-6在宽浓度范围(15、50或150ng/ml)下增强从三个不同人供体(50岁女性、21岁男性和33岁男性)的外周血分离的细胞的Treg扩增。
将BF1和BF6条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。通过在培养中添加IL-6和TNFR2a改进CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率。
在BF1、BF2、BF3、BF4和标准抗CD3/CD28珠条件下的Treg离体扩增的比较显示于图1中。在培养14天后Treg的总体离体扩增的更广泛的比较显示于表1-2中。
表1-2.离体扩增功效
| 刺激条件 | 扩增倍数±SEM | ～范围(最小值至最大值) |
| 珠1:1(1次刺激) | 37.4±26.7 | 7至70 |
| 珠1:1(2次刺激) | 415.8±572.3 | 40至1560 |
| BF1 | 305.5±137.3 | 46至460 |
| BF2 | 536.5±223.9 | 218至860 |
| BF3 | 577.3±202.5 | 330至880 |
| BF4 | 935.3±431.4 | 365至1560 |
| BF4a | 1054±567.4 | 368至1540 |
| BF4b | 834.1±365.9 | 352至1200 |
| BF5 | 525.0±0 | 525 |
| BF6 | 1100±141.4 | 1000至1200 |
| BF7 | 1125±75 | 1050至1200 |
| BF8 | 530.0±400 | 130至930 |
| BF9 | 770.0±430 | 340至1200 |
| BF10 | 742.5±0 | 743 |
将BF8和BF9条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。通过在培养中添加IL-6和IFNγ中的一种或两种改进CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率。
将BF10条件与标准抗CD3/CD28珠条件进行比较。通过在培养中添加TNFα和IL-1β二者改进CD28SA Ab刺激的Treg的离体扩增速率。另外，在BF10条件下产生的Treg群体的62％是TNFR2+、CD25+，与之相比，在BF1条件下在存在CD28SA Ab和IL-2并且不存在TNFα和IL-1β的情况下产生的Treg群体的47％是TNFR2+、CD25+。有趣的是，在BF10条件下产生的Treg表达比在BF1条件下产生的Treg更高的CD71水平。CD71是转铁蛋白受体，其在激活的T细胞中上调，并且指示细胞已经进入合成代谢状态，有助于增殖。
如图2中所示，通过在促炎性细胞因子的存在下用CD28SA Ab刺激实现的Treg的离体扩增产生具有Treg谱系标记FOXP3、HELIOS和CD27的高表达水平的细胞群体。另外，扩增的细胞群体具有高度脱甲基化的TSDR。在BF1、BF2、BF3和BF4刺激条件下离体扩增的Treg的表型的比较显示于图3和图4中。在BF4条件下的Treg扩增导致产生比在刺激开始时(第0天)存在的细胞多超过1000倍的细胞，而在标准抗CD3/CD28珠条件下Treg扩增的程度显著较低，如图5中所示。类似地，在BF10条件下的Treg扩增导致产生比在标准抗CD3/CD28珠条件下扩增显著更多的细胞，如图10中所示。在BF4条件和标准抗CD3/CD28珠条件下离体扩增的Treg的表型的比较显示于图6和图7中。
通过在促炎性细胞因子的存在下在BF4刺激条件下用CD28SA Ab刺激离体扩增Treg产生对预激活的Teff和自体PBMC具有高抑制能力的细胞群体，如图8A和图8B中所示。另外，在BF4刺激条件下离体扩增的Treg是在炎性细胞因子TNF-α的存在下对Teff增殖比在标准抗CD3/CD28珠条件下离体扩增的Treg更有效的抑制剂，如图9中所示。
另外，通过在促炎性细胞因子的存在下用CD28SA Ab刺激离体扩增Treg不增加产生促炎性细胞因子IL-2、IL-17、IFN-γ和IL-4的Treg的频率。
Claims (24)
1.一种产生人调节T细胞(Treg)的方法，其包括：
a)从获自人受试者的含有淋巴细胞的生物样品分离CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞；以及
b)在包含CD28超级激动剂(CD28SA)抗体、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的培养基中，在有效产生呈CD4+、FOXP3+、HELIOS+并且具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)的人Treg的条件下，培养所述T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)不包括使用抗CD3抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)不包括使用磁珠或表达Fc受体的饲养细胞来交联所述分离的T细胞的CD28和CD3。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基还包含肿瘤坏死因子受体2激动剂(TNFR2a)和干扰素γ(IFNγ)中的一种或两种。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基还包含IL-6和IL-1β中的一种或两种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有淋巴细胞的生物样品选自全血、白细胞单采术产物和外周血单个核细胞(PBMC)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品是新鲜的或者在从所述人受试者获得后冷冻保存，并且随后在步骤a)之前解冻。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞是通过荧光激活的细胞分选(FACS)或磁性激活的细胞分选(MACS)从所述生物样品分离。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其还包括步骤c)在步骤b)开始后7-18天收获所述人Treg。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述人Treg包含比步骤a)开始时的所述CD4+、CD25+、CD127-/低T细胞多约200至约2000倍的细胞。
11.一种药物组合物，其包含107至1011个使用根据权利要求1-10中任一项所述的方法产生的人Treg和生理学上可接受的缓冲液。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗或预防有需要的人受试者的病理学免疫应答。
13.根据权利要求12所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述病理学免疫应答是自身免疫或自身炎性疾病。
14.根据权利要求13所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述自身免疫或自身炎性疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、系统性红斑狼疮、天疱疮、银屑病、I型糖尿病、乳糜泻和炎性肠病。
15.根据权利要求13所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物有效减少所述自身免疫或自身炎性疾病的症状，或者有效抑制所述自身免疫或自身炎性疾病的进展；任选地其中抑制所述自身免疫或自身炎性疾病的进展包括抑制组织破坏。
16.根据权利要求12所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述病理学免疫应答是对造血同种异体移植物或实体器官同种异体移植物的排斥。
17.根据权利要求16所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述病理学免疫应答是对造血同种异体移植物的排斥，并且所述造血同种异体移植物是骨髓移植物或外周血干细胞移植物。
18.根据权利要求16所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述病理学免疫应答是对实体器官同种异体移植物的排斥，并且所述实体器官同种异体移植物选自心脏、肺、心脏/肺、肾、胰腺、肾/胰腺、肝、肠、胰岛和皮肤同种异体移植物。
19.根据权利要求16所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物有效减少急性和/或慢性排斥的症状，或者有效延长所述器官同种异体移植物的存活。
20.根据权利要求12所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述病理学免疫应答是移植物抗宿主病(GvHD)。
21.根据权利要求20所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物有效减少急性和/或慢性GvHD的症状，或者有效抑制对所述宿主的皮肤、肝、肺和/或长的损伤。
22.根据权利要求12所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物有效地相对于基线增加所述人受试者的Treg百分比。
23.一种抑制人效应T细胞(Teff)增殖的方法，所述方法包括：使人CD4+、CD25-、CD127+Teff与使用根据权利要求1-10中任一项所述的方法产生的人Treg在有效抑制所述Teff增殖的条件下接触；任选地其中所述接触是在TNF-α的存在下进行。
24.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中产生人Treg的所述方法符合药品生产管理规范(GMP)。
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