CN114002130A - 一种细胞变形性测定方法及测定装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞变形性测定方法及测定装置。所公开的方案包括:(1)利用在一定强度电场中细胞被拉长后细胞图形的短轴与长轴作为测定参数;(2)以短轴与长轴参数之比乘以测定时所用电场强度作为测定结果;(3)以该测定结果与对照值的比对对测定样品的细胞变形性进行评价。本发明设计可广泛用于临床对红细胞变形性测定以评估各种心脑血管疾病的风险、治疗效果,也可广泛用于各类生物医学实验室对于各种癌细胞变形性测定以评估各种实验处理或治疗措施的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,以电场中细胞的拉长度来评价细胞的变形性,对临床评估各种心脑血管疾病的风险、治疗效果,以及对各类生物医学实验室评估各种实验处理或治疗措施的效果都有广泛用途。
技术背景及意义
细胞的变形能力(Cell Deformability,CD)是细胞特性中与细胞活性、运动力或穿透力、粘附或脱落特性等最为密切相关的特性,而上述特性与心脑血管疾病的梗塞、癌症的侵袭转移等密切相关,而这些正是临床有关疾病的诊治以及实验室有关研究必须关注的指标。
人的红细胞直径一般为4-8μm(微米),人末梢微血管内经只有2μm左右,所以,双面凹型的红细胞在末梢动静脉血液转换通过微血管时,必须以良好的CD通过微血管。但随着年龄的增长以及其他所有各种不利因素如高自由基水平、药物等的影响,而使红细胞的CD退化或者丧失,加之老年人或病人的血管内壁的动脉粥样硬化、官腔变窄变粗糙,这时“变硬”的红细胞非常易于“卡住”而形成微栓塞,发展到上游大的栓塞形成时,就会引发心梗、脑梗或脑溢血等严重后果。所以,及时测定红细胞的CD,可以非常真实的反应高危人群面临的风险程度,以便及时采取措施,大大降低后果的严重性甚至避免风险。
对于癌细胞来讲,其高度异化的CD非常有利于癌症的侵袭与转移,该指标的测定对于衡量癌细胞的恶性度(Malignancy)非常重要。目前实验室衡量癌细胞CD的方法有培养细胞的划痕法、小室穿透法(Transwell)以及扫描电镜观察等,非常费时费力,而且成本较高,最重要的是不直接、不确切、不便于应用。
目前不论是医院还是实验室,都还没有检测细胞CD的方便的、廉价的、直接可靠的专门设备。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足,本发明一方面提供了一种细胞变形性测定方法。
为此,本发明提供的方法包括:
(1)样品细胞悬液在电场作用下,其中的样品细胞被拉长变形,测量变形后样品细胞的短轴长度与长轴长度;
(2)计算样品细胞变形性CD值,CD=100/(X/Y×S),X为变形后细胞的短轴长度,单位:μm;Y为变形后细胞的长轴长度,单位:μm;S为电场中正负极间的电压,单位:V;
(3)通过样品细胞变形性CD值与对照细胞变形性CD值的比对来评价样品细胞变形性。
进一步,所述电场为直流电场,电场正极与负极间的电压S=10-500V。
进一步,利用细胞培养液、生理盐水或生理缓冲液分别稀释样品细胞和对照细胞,制备样品细胞悬液和对照细胞悬液。
进一步,所述样品细胞为人红细胞、癌细胞或正常细胞;或者为经处理的人红细胞、癌细胞或正常细胞;所述对照细胞为与样品细胞属相同组织的健康细胞、未处理或不同处理的细胞。
本发明同时还提供了一种细胞变形性测定装置。为此,本发明所提供的装置包括加样室和测量室,所述加样室上设有加样口,加样室内设有储液容器;所述测量室内设有球泡和电场发生装置;所述测量室上设有出样口,所述球泡位于电场发生装置的场强中;所述加样口、储液容器、球泡、出样口依次通过毛细管连通。
进一步,所述毛细管为金属材质、橡胶材质或塑料材质,毛细管内径为 4-15μm。
进一步,所述球泡为玻璃或塑料材质的透明球泡结构,内径为 30-5000μm。
进一步,所述储液容器为球形或管状,材质为橡胶或塑料,内容积为 0.5-2.0ml。
进一步,所述电场发生装置包括位于球泡对应两侧内壁或球泡外侧的正、负两电极板,且正、负电极板的面积为1.0-5.0mm2。
进一步,还包括位于加样室的气泵或蠕动装置,所述气泵用于调节加样室内的气压,所述蠕动装置用于对弹性储样容器进行挤压蠕动,使得细胞经毛细管进入球泡中。
进一步,本发明的装置还包括显微拍摄装置,用于对球泡中的细胞进行观察。
进一步,本发明的装置还包括图像与数据显示装置,用于显示球泡中的细胞外观形态和测定数据。
本发明设计可广泛用于临床对红细胞变形性测定以评估各种心脑血管疾病的风险、治疗效果,也可广泛用于各类生物医学实验室对于各种癌细胞变形性测定以评估各种实验处理或治疗措施的效果。
附图说明
图1为本发明的原理示意图;
图2为本发明装置的外观示意图;右图为俯视图,左图为侧视图;
图3为实施例1中现有常用方法Transwell及形态观察测定CK2基因敲除后肝癌细胞HepG2恶性表型的变化;图3A为考马斯亮蓝染色后的HepG2 细胞,图3B为扫描电镜下的HepG2细胞,图3C为Transwell膜上的HepG2 细胞,图3D为图3C的数据分析。
图中:1-加样室;2-测量室;3-球泡;4-加样口;5-毛细管;6-显示装置; 7-电场调节旋钮;8-细胞。
以下结合附图和具体实例对本发明设计作进一步说明。
具体实施方式
除非另有说明,本说明中的术语或方法根据普通技术人员的认识或采用已有方法实现。
本发明的方法适用于悬浮于培养液、生理盐水或其它生理缓冲液中的游离红细胞、癌细胞、正常细胞或经处理(包括常规的实验处理、基因学处理、遗传学处理等生物、化学、物理处理)的变形性的检测和评价。所述人红细胞是指静脉、手指或耳垂采血,经过抗凝处理而悬浮于血浆中、生理盐水或其它生理缓冲液中的红细胞;所述人或动物癌细胞、正常细胞是指实验室保存的细胞系、从病人或动物样品分离培养的癌细胞或正常细胞,这些细胞存活并游离悬浮于液体培养基、生理盐水或其它生理缓冲液中。所述细胞悬液是指悬浮于细胞培养液(如BME、MEM、DMEM、HamF12、RPMI1640、199等)、生理盐水或其他生理缓冲液(如PBS等)中的游离的细胞悬液。对细胞稀释、悬浮所用液体的要求:导电、生理渗透压、不使细胞在数分钟至一小时内失去活性。
本发明利用在一定强度电场中细胞被拉长后细胞图形的短轴与长轴作为测定参数,以短轴与长轴参数之比(短轴/长轴)乘以测定时所用电场强度作为测定结果,以该测定结果与对照值的比对即可对测定样品的细胞变形性进行评价。测定过程中,在电场中的导电细胞培养液、生理盐水或其它生理缓冲液中的细胞在直流+→-方向电场中可以被拉伸而变形,使细胞变为椭圆或长椭圆形,拉伸程度就直接代表了待测细胞的CD,如图1所示。CD计算式:CD=100/(X/Y×S)(X:短轴长度;Y:长轴长度;S:电场电压),长度单位为μm,电压单位为V。
本发明的装置是用于实现本发明测定方法的装置,测定过程需满足细胞在检测过程中的存活条件,使细胞经加样口→储液容器→毛细管→测定室内球泡,该球泡位于一个可调控强度(要有强度指示值)的+→-方向直流电场中央,直流电场正、负电极位于球泡的对应两侧内壁或外侧(电极板面积 1.0-5.0mm2),当调节电场强度到一定程度(10-500V)时使细胞拉伸。为实现高自动化和智能化程度,本发明装置设置有显微拍摄装置和显示装置,通过高分辨率的可对细胞进行显微数码拍摄的装置和软件,对测定小室被拉伸的细胞进行快速拍摄并反映至屏幕,同时给出测定数据(见图2)。
本发明装置所用毛细管和测量室的透明小球泡可以是一体的,也可以是互相联接的。毛细管为金属材质、橡胶材质或塑料材质微管结构,内径为4-15μm,仅容悬浮状态下的细胞“挤过”,测量室的透明小球泡为球形透明玻璃材质或透明塑料材质小泡状结构,内径为30-5000μm。这些元件和电极是有一定使用寿命的常规耗材,可以用消毒生理盐水或其它生理缓冲液加入清洗。
在使用本发明的装置进行测定时,以常规细胞培养液、生理盐水、或其他生理缓冲液作为细胞样品稀释液体,并使之成为游离细胞(即细胞不是聚合成团块状)悬液,以微量进样器从加样室的加样口加入储液容器,进一步可在加样口设螺帽进行盖封。储液容器为软质、可挤压变形的、两端连接毛细管的弹性球形或管型、软橡胶类或软塑料类材质容器,其内部容积为 0.5-2.0ml。关闭加样室盖后,给储液容器加压,驱使待测细胞经毛细管进入测量室球泡进行检测,从另一端毛细管流出测量室完成检测(见图1、图2)。
测定完成后,屏幕即给出测定参数或按以下计算式直接给出CD数据, CD数据也可据装置给出的测定参数按照以下计算式计算获得。
样品细胞CD与对照细胞CD的比对结果就是测定结论(即样品细胞CD 升高或者降低)。所述对照细胞为与样品细胞属相同组织来源的健康细胞、未处理或不同处理的细胞,例如对于红细胞来讲,其对照值可对来自于各年龄段一定群体样本量(一般至少需100人以上)的正常人群红细胞的CD值作检测,以确定各年龄段正常人群红细胞的CD值范围,从而作为对照值对检测对象的检测结果进行评价。实验室研究需有对应的对照处理细胞的CD 测定,以此对实验处理效果或药物效果进行评价。
本发明装置既可以设计为单独的一体设备,也可设计为其它设备的附属设备(见图2)。
以下是关于本发明的详细解释说明,所用元器件、试剂、材料如无特殊说明均为常规设计或市售产品。
本发明设计的应用不限于以下实施例具体涉及的人红细胞、癌细胞或正常细胞,或者经过处理后的细胞,根据本领域技术人员的常规认识,相关应用可及于包括心脑血管疾病诊治研究及临床实践、癌症治疗方法及药物研发等相关研究。
实施例1:
该实施例以Transwell及形态观察测定实验处理后肝癌细胞CD变化。
为了研究CK2(酪蛋白激酶Ⅱ)基因与肝癌发生发展的关系,以CRISPR 技术敲除肝癌细胞系HepG2细胞(购自美国ATCC,本室保存)的CK2基因后,以Transwell方法、细胞染色法、扫描电镜观察测定CK2基因表达与肝癌细胞的恶性度(相当于变形性)的关系,发现CK2基因敲除(-/-表示 CK2双等位基因敲除,+/-表示CK2单等位基因敲除)后HepG2细胞恶性表型(迁移能力、变形能力、接触抑制性等)都发生了变化(见图3),说明 CK2在肝癌的发生发展过程中扮演促癌基因的角色。
实施例2:
该实施例以本发明装置和测定方法测定实施例1所述实验处理后肝癌细胞CD变化,结果如表1。
该实施例检测用样品液体为不加血清和抗生素等附加成份的PRMI1640 细胞培养液,检测电场电压200V。
表1:以本发明装置测定CK2基因敲除后HepG2细胞CD变化
细胞分组 | 野生细胞(WT) | 单等位基因敲除细胞(+/-) | 双等位基因敲除细胞(-/-) |
短轴(μm) | 4 | 5 | 6 |
长轴(μm) | 15 | 15 | 11 |
CD | 1.89 | 1.50 | 0.92 |
检测结论 | / | 变化不明显 | CD明显降低 |
表1检测结果显示CK2基因的敲除使肝癌细胞的变形性明显降低,提示CK2基因可能是肝癌发生发展的促癌基因。与实施例1相比,该法省时省力,花费低廉,也便于推广,而且更重要的是直接获得十分精确的量化数据比较。
实施例3:
该实施例以本发明装置和方法测定人红细胞CD。实施方法和材料除以下不同外均同实施例2:电场电压150V,样品液体为生理盐水。
检测对象1(知情自愿者):22岁,男性,发明人团队研究生,健康状况良好;检测对象2(知情自愿者):60岁,男性,本院系教工,伴有高血压20年、糖尿病12年。
经手臂静脉采血2ml,加肝素抗凝处理,生理盐水5倍稀释、600转/分钟离心,再悬浮于1.0ml生理盐水。
以本发明装置和方法测定的结果如表2。
表2:以本发明装置测定人红细胞CD结果
细胞分组 | 22岁男性红细胞 | 60岁男性红细胞 |
短轴(μm) | 2 | 4 |
长轴(μm) | 10 | 7 |
CD | 3.33 | 1.17 |
检测结论 | 红细胞CD良好 | 红细胞CD明显降低 |
该检测结果明确地以数据指标提示:该60岁男性的红细胞CD明显降低,提示了心脑血管疾病发生的高度风险。
与目前临床常用心脑血管疾病发生风险评估的其他方法(如血液分析、血液流变分析等等)相比,以本发明装置和方法进行的测定花费低廉、简单,更重要的是直接以量化数据给出结果,更为准确。
Claims (12)
1.一种细胞变形性测定方法,其特征在于,方法包括:
(1)样品细胞悬液在电场作用下,其中的样品细胞被拉长变形,测量变形后样品细胞的短轴长度与长轴长度;
(2)计算样品细胞变形性CD值,CD=100/(X/Y×S),X为变形后细胞的短轴长度,单位:μm;Y为变形后细胞的长轴长度,单位:μm;S为电场中正负极间的电压,单位:V;
(3)通过样品细胞变形性CD值与对照细胞变形性CD值的比对来评价样品细胞变形性。
2.如权利要求1所述细胞变形性测量方法,其特征在于,所述电场为直流电场,电场正极与负极间的电压S=10-500V。
3.如权利要求1所述细胞变形性测量方法,其特征在于,利用细胞培养液、生理盐水或生理缓冲液分别稀释样品细胞和对照细胞,制备样品细胞悬液和对照细胞悬液。
4.如权利要求1所述细胞变形性测量方法,其特征在于,所述样品细胞为人红细胞、癌细胞或正常细胞;或者为经处理的人红细胞、癌细胞或正常细胞;所述对照细胞为与样品细胞属相同组织的健康细胞、未处理或不同处理的细胞。
5.一种细胞变形性测定装置,其特征在于:包括加样室和测量室,所述加样室上设有加样口,加样室内设有储液容器;所述测量室内设有球泡和电场发生装置;所述测量室上设有出样口,所述球泡位于电场发生装置的场强中;所述加样口、储液容器、球泡、出样口依次通过毛细管连通。
6.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,所述毛细管为金属材质、橡胶材质或塑料材质,毛细管内径为4-15μm。
7.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,所述球泡为玻璃或塑料材质的透明球泡结构,内径为30-5000μm。
8.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,所述储液容器为球形或管状,材质为橡胶或塑料,内容积为0.5-2.0ml。
9.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,所述电场发生装置包括位于球泡对应两侧内壁或球泡外侧的正、负两电极板,且正、负电极板的面积为1.0-5.0mm2。
10.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,还包括位于加样室的气泵或蠕动装置,所述气泵用于调节加样室内的气压,所述蠕动装置用于对弹性储样容器进行挤压蠕动,使得细胞经毛细管进入球泡中。
11.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,还包括显微拍摄装置,用于对球泡中的细胞进行观察。
12.如权利要求5所述的细胞变形性测量装置,其特征在于,还包括图像与数据显示装置,用于显示球泡中的细胞外观形态和测定数据。
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罗薛峰等: "体外培养滋养细胞受电场作用后迁移行为及形态的变化", 《四川大学学报(医学版)》, vol. 41, no. 5, pages 1 - 1 * |
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