CN113999435A - 一种响应面法优化的改性壳聚糖-lzm-ca复合抑菌保鲜膜及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应面法优化的改性壳聚糖‑LZM‑CA复合抑菌保鲜膜及其制备方法和应用，属于食品包装材料技术领域。本发明提供了以淡水小龙虾为研究对象，选用了改性壳聚糖，抑菌剂溶菌酶(LZM)、良好的成膜材料卡拉胶(CA)作为复合抑菌保鲜膜材料，通过响应面实验设计确定改性壳聚糖‑LZM‑CA复合抑菌保鲜膜最佳配比，并从该复合抑菌保鲜膜对淡水小龙虾冷藏期间TVB‑N，菌落总数变化数值为指标研究保鲜效果，为淡水小龙虾等水产品的壳聚糖复合膜保鲜技术开发与应用提供理论基础。

Description

一种响应面法优化的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品包装材料技术领域，具体涉及一种食品保鲜膜，更具体地说，本发明涉及一种响应面法优化的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜及其制备方法和应用。
背景技术
目前，食品保鲜膜在食品领域应用广泛，并且处于初步发展阶段。如，2019年张涵等报道了利用聚赖氨酸复合膜协同真空包装的综合包装方法对金鲳鱼进行研究，发现可以显著提高冷鲜肉制品的保鲜效果。
壳聚糖为天然多糖中仅有的带正电荷的高分子物质，它具有良好的稳定性，吸湿性，生物官能性，抑菌性等。壳聚糖除了具有抗菌活性还具有成膜性。是一种成膜性很好的高分子化合物，所形成的膜具有一定机械强度。多项研究已证实以壳聚糖为基底的保鲜膜对水产品具有良好的保鲜效果，能够解决其易腐败、货架期短的问题。虽然，壳聚糖表现出了良好的保鲜性能，但是，在实际工业应用中还存在一些问题：抗菌广谱性差、机械强度偏弱等，这就需要我们进一步改善壳聚糖的保鲜效果。
目前，关于虾肉保鲜的方法有多种，如：物理保鲜，化学保鲜以及生物保鲜。这些现有技术普遍存在的问题是冷鲜肉的感官评定较低，抑菌效果也不是很理想。因此，开发可食用材料制作食品级保鲜膜在水产品保鲜中的应用具有广阔的市场和发展前景。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
卡拉胶(CA)主要由大分子的膳食纤维组成。由于具有良好的成膜性，可再生性和生物相容性，已被广泛用作成膜材料和可食用薄膜基材。卡拉胶可用来增加食品的粘稠度，增加膜的可塑性以及延展性。在制作保鲜涂膜中可起到增加延展性的作用。
溶菌酶(LZM)的抗菌谱较广，作为防腐剂安全性高，不仅局限于G+菌，对部分G&shy菌也有抑制效果，可通过对微生物相关结构进行识别通过结构发挥杀菌作用。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种响应面法优化的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜及其制备方法和应用，特别是在食物(例如鲜肉、淡水小龙虾等)保鲜中的应用，解决或至少部分解决现有技术中存在的上述技术缺陷。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明提供了一种新型材料：改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，该保鲜膜是将复合膜涂液均匀涂抹在洁净的基材表面，恒温干燥后获得。
本发明的另一目的在于提供上述所述改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的制备方法，其核心是利用响应面法对3种可食用材料的用量和配比进行优化组合。
本发明的还一目的在于提供上述所述改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的应用，可用于对食物(例如鲜肉、小龙虾等)进行保鲜。
本发明的第一个目的是采用下述技术方案实现的：
一种改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，所述保鲜膜是将复合膜涂液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述复合膜涂液是由改性壳聚糖、卡拉胶、溶菌酶和溶剂组成。
具体地，上述技术方案，所述干燥过程中需要不定时观察膜的状态以防破损，并在发现破损后及时取出置于室内自然晾干。较优选地，所述恒温干燥的温度为40-45℃，干燥时间为8h。
进一步地，上述技术方案，每L复合膜涂液中含有改性壳聚糖14-18g，卡拉胶1.5-2.5g，溶菌酶1-2g。
优选地，上述技术方案，每L复合膜涂液中含有改性壳聚糖16g，卡拉胶2g，溶菌酶1.5g。
进一步地，上述技术方案，所述溶剂为乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸的体积百分比优选为0.05-2％。
进一步地，上述技术方案，所述改性壳聚糖采用下述方法制得：
将壳聚糖用20-100KGy剂量辐照降解，得到所述的改性壳聚糖。
优选地，上述技术方案，所述辐照的剂量为80KGy或100KGy，较优选为100KGy。
上述采用辐照法制备得到的改性壳聚糖，抑菌能力良好，特别是经80KGY或100KGY剂量辐照后的壳聚糖分子量变化较小，趋于稳定，抑菌效果更优。
进一步地，上述技术方案，所述保鲜膜的厚度不限，可根据实际需要调整。例如，所述保鲜膜的厚度可以为0.1-1.0mm。
本发明的第二个目的是采用下述技术方案实现的：
一种基于响应面优化制备所述改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的方法，包括以下步骤：
(1)筛选主效因子的中心水平：以制备改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度为变量进行单因素实验，用于筛选出影响冷藏期间小龙虾挥发性盐基氮总含量(TVB-N值)的中心水平；
(2)响应面优化：根据Box-Behnken中心组的实验设计原理，根据步骤(1)单因素实验结果，选取复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度3个因素的3个较优水平为影响因素，以冷藏期间小龙虾的TVB-N值为测定指标，在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行实验设计；
(3)采用软件Design Expert对步骤(2)所得实验结果进行方差分析和线性拟合，得到方差分析结果和二阶多项式回归模型，分析各因素之间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系；
(4)对二阶多项式回归模型进行显著性分析，根据对回归方程失拟的p值检验失拟是否显著，确定回归方程是否适当；根据显著性检验，确定回归方程是否显著，根据模拟决定系数R2，模型的修正后决定系数R2 Adj与模型的预测决定系数R2 Pred来确定模型的预测价值；
(5)利用软件Design Expert根据二阶多项式回归模型进行绘图分析自变量和响应值的关系，得到回归方程的三维响应面图；通过Design-Expert软件对二阶多项式模型和响应面进行分析优化，确定复合膜涂液中各组分的最佳浓度。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)中的实验方法如下：称取改性壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，控制所述改性壳聚糖的浓度；完全溶解后加入卡拉胶，控制所述卡拉胶的浓度；分散均匀后继续加入溶菌酶，控制所述溶菌酶的浓度；完全溶解后，静置至表面气泡溶解完全，得到复合膜涂液；取11-13mL所述复合膜涂液涂覆在直径为90mm的灭菌培养皿中，置于烘箱中恒温干燥，得到改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜；然后利用所述保鲜膜包裹经蒸熟、沥干、冷却后的淡水小龙虾，放入包装袋真空包装；采用自动凯氏定氮仪法，测定小龙虾冷藏期间的TVB-N值。
具体地，上述技术方案，所述卡拉胶在改性壳聚糖的乙酸水溶液及复合膜涂液中均呈颗粒状态，不会完全溶解；加入卡拉胶后应及时成膜，防止凝固成块状。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)中各主效因子的水平范围：所述复合膜涂液中，改性壳聚糖的浓度10-18g/L，溶菌酶的浓度0.5-2.5g/L，卡拉胶的浓度1-3g/L。
进一步地，上述技术方案，步骤(2)中3个因素的3个较优水平范围为：所述复合膜涂液中，改性壳聚糖的浓度14-18g/L，溶菌酶的浓度1-2g/L，卡拉胶的浓度1.5-2.5g/L。
进一步地，上述技术方案，步骤(3)中二阶多项式回归模型方程为：
Y＝272.74-193.1*A-635.19*B-351.85*C+24.55*A*B-6.91*A*C+313.22*B*C+57.28*A2+1373.08*B2+1013.25*C2；其中A为改性壳聚糖的浓度，B为卡拉胶的浓度，C为溶菌酶的浓度。
进一步地，上述技术方案，步骤(5)中优化后的复合膜涂液的配方为：改性壳聚糖的浓度为16g/L，溶菌酶的浓度为1.5g/L，卡拉胶的浓度为2g/L。
本发明的第三个目的在于提供上述所述改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜在食品保鲜、食品包装中的应用，特别是作为包覆材料在冷藏或冷冻鲜肉、小龙虾等中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了以淡水小龙虾为研究对象，选用了改性壳聚糖，抑菌剂溶菌酶(LZM)、良好的成膜材料卡拉胶(CA)作为复合膜，通过响应面实验设计确定改性壳聚糖-LZM-CA复合膜最佳配比，并从该复合膜对淡水小龙虾冷藏期间TVB-N，菌落总数变化数值为指标研究保鲜效果，为淡水小龙虾等水产品的壳聚糖复合膜保鲜技术开发与应用提供理论基础。
(2)本发明采用脱乙酰度较高辐照降解后的壳聚糖成膜，解决了纯壳聚糖膜分子量大，难溶解，保鲜能力较差的技术问题。并且，本发明加入了卡拉胶可以增加保鲜膜的延展性和可塑性，而溶菌酶具有良好的抑菌能力，可以起到良好的保鲜作用，增加虾肉的货架期。
(3)本发明制备保鲜膜采用的复合膜涂液是由改性壳聚糖、卡拉胶、溶菌酶三种可食用材料和溶剂组成，三种可食用材料具有一定的协同作用，使得本发明制备的保鲜膜具有保鲜能力好且抑菌效果强等的优点。因此，利用本发明制备的保鲜膜可以解决现有技术中对冷藏或冷冻食物(例如鲜肉、小龙虾等)的感官评定差、抑菌效果不理想、保鲜效果未达到要求等的问题。
(4)本发明利用三种可食用材料之间的协同作用减少了三种组分的用量，降低了生产成本，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1中从左到右依次为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜成品和对比例2制备的改性壳聚糖膜成品对比图；
图2为辐照剂量与产物分子量关系图；
图3为各辐照后壳聚糖的各抑菌效果生长曲线图，其中：(A)、(B)、(C)、(D)依次为腐败希瓦氏菌，大肠杆菌，金色黄葡萄球菌，鼠伤寒沙门氏菌；
图4为单因素实验不同组分配比得到的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜对小龙虾冷藏期间TVB-N值的影响图：其中：(A)为复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度对TVB-N值的影响图；(B)为复合膜涂液中溶菌酶的浓度对TVB-N值的影响图；(C)为复合膜涂液中卡拉胶的浓度对TVB-N值的影响图；
图5中(A)、(B)、(C)为依次为响应面实验中改性壳聚糖的浓度、卡拉胶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图；改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图；溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图；
图6中A图为对比例2制得的改性壳聚糖膜的扫面电镜图；B图为对比例3制备的改性壳聚糖-CA复合膜的扫面电镜图；C图为对比例4制备的改性壳聚糖-LZM复合膜的扫面电镜图；D图为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的扫面电镜图；
图7为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜、对比例2-4分别制得的改性壳聚糖膜、改性壳聚糖-CA复合膜和改性壳聚糖-LZM复合膜的XRD测试结果图。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
实施例1
本发明采用辐照降解所得改性壳聚糖成膜，通过改变壳聚糖分子量来提高抑菌能力。
分别称取5份壳聚糖原料，每份壳聚糖均为10g，分别用20KGy，40KGy，60KGy，80KGy，100KGy剂量辐照降解处理，即用剂量率6.25Gy/min的辐照源分别辐照53.3h，106.67h，160h，213.3h，266.67h，分别得到5种经不同辐照剂量处理的改性壳聚糖；其中：所述辐照源是：60Co源，38万居里，剂量率是6.25Gy/min。
对比例1
本对比例采用的壳聚糖原料与实施例1相同，为了与实施例1形成对比，本对比例未对壳聚糖原料进行辐照降解处理。
本发明对实施例1获得的改性壳聚糖和对比例1中未经改性的壳聚糖原料的分子量分别进行了测定，具体测定方法如下：
S21.计算壳聚糖原料的脱乙酰度：
精密称取待测壳聚糖原料0.3g，放入120℃恒温干燥箱内干燥15min至恒重，计算出干燥失量百分比。
室温下，取0.5g壳聚糖，精密称定，然后精密加入盐酸滴定液(0.3mol/L)18L，将所得混合液置于磁力搅拌器上，调节适量转速磁力搅拌2小时，使壳聚糖充分溶解；再加入1％甲基橙指示剂3滴，充分摇晃后用氢氧化钠滴定液(0.15mol/L)缓慢滴定至变为橙色，滴定过程中注意充分搅拌，记录实验数据。
以下式计算壳聚糖原料的脱乙酰度。脱乙酰度应大于70％。
Figure BDA0003345709560000071
式中D.D.％为脱乙酰度；N HCl为盐酸滴定液(0.3mol/L)的浓度，mol/L；V HCl为盐酸滴定液(0.3mol/L)的体积，L；N NaOH为NaOH滴定液(0.15mol/L)的浓度，mol/L；V NaOH为NaOH滴定液(0.15mol/L)的体积，L；G为供试品称重，g；W为干燥失量百分比，％，例如，干燥失量百分比为20％，此时W为20；16为与1mol/L盐酸相当的氨基量，g。所用氢氧化钠溶液17L，代入得计算结果为95.57％，即壳聚糖的脱乙酰度为95.57％。
S22.测定壳聚糖的特性粘度：
本步骤下述采用的混合溶剂，是由乙酸水溶液和氯化钠水溶液按体积比1：1组成；其中：所述乙酸水溶液的浓度为0.1mol/L，氯化钠水溶液的浓度为0.2mol/L。
配制待测壳聚糖溶液：将适量壳聚糖溶于50mL所述混合溶剂中，配制成壳聚糖待测溶液，浓度记为C1。
将乌氏粘度计垂直固定于恒温水浴中(温度30℃士0.05℃)，室温30°可直接测。水浴的液面高于最上方小球，测定10mL待测壳聚糖溶液流经粘度计上下刻度线(即a1至a2)的时间，记为T1；然后精确量取5mL所述混合溶剂加入粘度计中稀释所述待测壳聚糖溶液，得到稀释液1，浓度记为C2，测定所述稀释液1流经粘度计上下刻度线(即a1至a2)的时间，记为T2；继续分别精确量取5mL、5mL、5mL混合溶剂依次加入粘度计用来稀释样品，分次稀释得到相应的稀释液，浓度依次记为C3、C4、C5，分别测定流经上下刻度线的时间记为T3、T4、T5。同样的方法测定10mL混合溶剂(5mL浓度为0.1mol/L的乙酸水溶液+5mL浓度为0.2mol/L的氯化钠水溶液)的流出时间记为T0。
由此得到C2＝2/3×C1，C3＝＝1/2×C1，C4＝2/5×C1，C5＝1/3×C1。对应的相对粘度[η]，η1＝T1/T0，η2＝T2/T0，η3＝T3/T0，η4＝T4/T0，η5＝T5/T0。增比粘度ηsp＝η-1；比浓粘度为ηsp/C。计算各时间点的比浓粘度。用比浓粘度对浓度作一条直线，截距为特性粘度η。
本发明各改性壳聚糖的特性粘度测试方法与所述壳聚糖的特性粘度的测试方法基本相同；区别仅在于待测原料为改性壳聚糖。
本发明实施例1经各辐照剂量处理得到的改性壳聚糖和对比例1中未经改性壳聚糖测定的T值及浓度如下表1所示。
表1实施例1及对比例1中各辐照剂量下测定的T值及浓度对比表
Figure BDA0003345709560000081
各辐照剂量处理得到的壳聚糖特性粘度如下表2所示。
表2各辐照剂量处理得到的壳聚糖特性粘度对比表
辐照剂量 0KGy 20KGy 40KGy 60KGy 80KGy 100KGy
特性粘度 380 237 127 115 111 110
按η＝k×Ma，K＝1.63×10-30×(D.D.)14，a＝-1.02×10-2×(D.D.)+1.82，经计算各辐照剂量下的壳聚糖分子量如表3所示。
表3各辐照剂量处理得到的壳聚糖分子量对比表
辐照剂量 0KGy 20KGy 40KGy 60KGy 80KGy 100KGy
数均分子量 591862 329097 151527 133937 128170 126736
图2为辐照剂量与产物分子量关系图。因此，由图2和表3可知，当辐照剂量为100KGy时，壳聚糖分子量基本不再下降。在小于60KGy时，壳聚糖分子量下降较快，在100KGy时，分子量趋于稳定。
因本发明采用改变壳聚糖分子量来提高抑菌能力，因此需筛选出何种剂量下辐照得到的改性壳聚糖的抑菌能力最佳。
改性壳聚糖的抑菌能力的探究：
1、配置MH肉汤液体培养基：取21g MH肉汤固体培养基，稀释定容到1000mL的容量瓶中，使用高压锅在121℃的温度下灭菌30min后，取出分装到250mL的锥形瓶中，冷藏贮存备用。
将经0KGy，20KGy，40KGy，60KGy，80KGy，100KGy辐照降解后的壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，在无菌条件下，分别取3L 0.5g/mL的0KGy、20KGy、40KGy、60KGy、80KGy、100KGy剂量辐照后的壳聚糖加入到50mL离心管中，再分别加入27mL所述液体培养基，将0.5g/mL的壳聚糖稀释到0.05g/mL，作为一组。按上述相同的操作，共配制四组经不同辐照处理的壳聚糖稀释液。再取1个50mL的离心管加入30mL的液体培养基有菌无壳聚糖，作为对照组。
在无菌条件下，往四组稀释后的壳聚糖溶液中分别加入80μL大肠杆菌，80μL金色黄葡萄球菌，80μL腐败希瓦氏菌，80μL鼠伤寒沙门氏菌待测菌，震荡后测定0h吸光度。放入恒温震荡箱内，每两小时测定一次吸光度。
腐败希瓦氏菌的测定：取21g MH肉汤固体培养基，稀释定容到1000mL的容量瓶中，加热至开始沸腾时加入琼脂，使用玻璃棒继续搅拌加热5分钟，然后分装在4个250mL的锥形瓶中，密封。制备无菌水，用一个锥形瓶分装100mL蒸馏水密封。将盛有蒸馏水的锥形瓶和固体培养基还有试管一起放在高压锅里面，在121℃的温度下灭菌30min后，取出分装到250mL的锥形瓶中，冷藏贮存备用。灭菌后将高压灭菌锅里的固体培养基和试管取出，在灭菌环境下在试管中倒入10mL左右的固体培养基，倾斜制作斜面。待培养基凝固后，将腐败希瓦氏菌冻干粉用0.5mL的无菌水溶解，然后接种在已经制备好的2支斜面上，放入恒温培养箱中，37℃培养2天。2天后观察菌种生长的情况，然后根据菌种生长的情况再重复上述大肠杆菌与金色黄葡萄球菌的生长周期的测定方法进行腐败希瓦氏菌生长周期的测定。
图3为各辐照处理后壳聚糖的各抑菌效果生长曲线图；其中：(A)、(B)、(C)、(D)依次为腐败希瓦氏菌，大肠杆菌，金色黄葡萄球菌，鼠伤寒沙门氏菌。
图3可知结合测定数据绘制大肠杆菌，金色黄葡萄球菌，腐败希瓦氏菌，鼠伤寒沙门氏菌的生长曲线，对比每组实验结果可知，在四种抑菌效果图中，辐照剂量均为100KGy时，抑菌效果最佳。因此，本发明中壳聚糖的最佳辐照剂量采用100KGy。
实施例2
本实施例采用的改性壳聚糖是实施例1中经100KGy辐照降解后得到的改性壳聚糖，数均分子量为126736。
本实施例提供了一种响应面法优化的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)筛选主效因子的中心水平：
S11.称取一定量改性壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，用玻璃棒搅拌均匀后放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min待壳聚糖完全溶解定容至100L容量瓶中，得到壳聚糖涂膜液；
S12.取一定量卡拉胶溶于步骤S11所得壳聚糖涂膜液中，放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min，完全溶解，得到壳聚糖-CA混合液；称取一定量溶菌酶溶解于壳聚糖-CA混合液中，因溶菌酶易溶于水，即用玻璃棒稍微搅拌即可溶解；得到复合膜涂液；
S13.静置待复合膜涂液表面气泡溶解后，用注射器抽取12mL复合膜涂液，均匀涂抹在直径为90mm的灭菌塑料培养皿中，再放在45℃烘箱中干燥8h即可得到改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜。
单因素实验设计：为了获得对小龙虾保鲜效果最佳的复合膜涂液，可以考察三种组分添加量的不同浓度配比的复合膜涂液对冷藏期间小龙虾TVB-N值的影响。即改变其中一种组分的添加量固定其余两种组分的添加量。以溶菌酶为例，固定改性壳聚糖和卡拉胶的量分别为10g/L和1g/L，探究溶菌酶的添加量分别为0.5g/L，1g/L，1.5g/L，2g/L，2.5g/L时所得复合膜对小龙虾TVB-N值的影响。选取一个LZM最佳浓度。类似的，探究改性壳聚糖添加量时，固定CA和LZM添加量为2g/L和1.5g/L。探究CA添加量时，固定改性壳聚糖和LZM添加量为14g/L和1.5g/L。单因素实验设计如表4所示。
表4单因素实验设计表
Figure BDA0003345709560000111
小龙虾的处理：将买回来的鲜活淡水小龙虾用自来水清洗3-4次，剥去虾头，去除肠线后再对虾尾进行清洗沥干，随后放入蒸锅中，在100℃条件下蒸7min，然后冷却，沥干后用不同配比复合膜包裹放入包装袋真空包装。定期选样进行相应指标测试。
TVB-N值测定：参考国家标准GB5009.228-2016，淡水小龙虾TVB-N值测定采用自动凯氏定氮仪法。将样品捣碎并加入30mL蒸馏水匀浆，放入离心机调节7500r/min，4°，20min后离心完成，取出上清液与1g MgO注入蒸馏管，蒸馏。甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇溶液比例为1：5，临用时混合加入硼酸溶液中。标准溶液使用硫酸标准滴定溶液(0.1mol/L)。硼酸接收液加入设定为30L。蒸馏时间为3min。
样品中TVB-N的含量计算公式为：X＝[(V1-V2)×C×14]×100/M。
V1——试样消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位为L；
V2——试剂空白消耗硫酸标准溶液的体积，单位为L；
14——滴定1.0mol硫酸溶液相当的氮含量，单位为克每摩尔；
C——硫酸标准溶液的浓度，单位为L；
M——试样质量，单位为g；
100——计算结果换算为毫克每百克的换算系数。
不同组分添加量的复合膜对小龙虾TVB-N值影响如图4所示。图4为单因素实验不同组分配比得到的复合保鲜膜对小龙虾冷藏期间TVB-N值的影响图：其中：(A)为复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度对TVB-N值的影响图；(B)为复合膜涂液中溶菌酶的浓度对TVB-N值的影响图；(C)为复合膜涂液中卡拉胶的浓度对TVB-N值的影响图。由此可知，改性壳聚糖最佳添加量为16g/L，卡拉胶的最佳添加量为2g/L，溶菌酶的最佳添加量为1.5g/L。
不同改性壳聚糖添加量影响为在浓度为16g/L时TVB-N值已经较低，增加浓度后数值变化幅度不大且差异不显著，考虑改性壳聚糖溶解度，因此改性壳聚糖最佳添加量为16g/L。响应面实验设计改性壳聚糖添加量应选择14g/L-18g/L。不同卡拉胶添加量影响为在浓度为2g/L时TVB-N值较低，但在增加浓度后仍会下降但差异不显著，综合以上结果，考虑CA添加量对小龙虾冷藏期间TVB-N值变化影响保鲜剂少量使用原则，应选择2g/L，并在1.5g/L-2.5g/L范围内采用响应面法对CA添加量进一步进行优化。不同溶菌酶添加量影响为在浓度为1.5g/L时TVB-N值最低，但在增加浓度后仍会下降但差异不显著，综合以上结果，考虑LZM添加量对小龙虾冷藏期间TVB-N值变化影响保鲜剂少量使用原则，应选择1.5g/L，并在1g/L-2g/L范围内采用响应面法对LZM添加量进一步进行优化。
(2)响应面实验设计：根据Box-Behnken中心组的实验设计原理，根据步骤(1)单因素实验结果，选取改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度3个因素的3个较优水平为影响因素，以冷藏期间小龙虾的TVB-N值为测定指标，在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行实验设计。
具体实验方法如下：根据单因素实验结果，以改性壳聚糖的浓度水平14g/L-18g/L、溶菌酶的浓度水平1g/L-2g/L、卡拉胶的浓度水平1.5g/L-2.5g/L为考察因子，以小龙虾冷藏期间挥发性盐基氮总含量作为响应值，设计如下表5(响应面实验因素与水平表)和表6(响应面实验方案与结果)，根据实验结果确定最佳配比。
表5响应面实验因素与水平表
Figure BDA0003345709560000121
表6响应面实验方案与结果表
Figure BDA0003345709560000131
(3)采用软件Design Expert对步骤(2)所得实验结果进行方差分析和线性拟合，得到方差分析结果和二阶多项式回归模型，分析各因素之间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系；
二阶多项式回归模型方程为：
Y＝272.74-193.1*A-635.19*B-351.85*C+24.55*A*B-6.91*A*C+313.22*B*C+57.28*A2+1373.08*B2+1013.25*C2；其中A为改性壳聚糖的浓度，B为卡拉胶的浓度，C为溶菌酶的浓度。
(4)对二阶多项式回归模型进行显著性分析，根据对回归方程失拟的p值检验失拟是否显著，确定回归方程是否适当；根据显著性检验，确定回归方程是否显著，根据模拟决定系数R2，模型的修正后决定系数R2 Adj与模型的预测决定系数R2 Pred来确定模型的预测价值；
响应面实验结果分析：响应面实验设计与结果如表6，中心实验重复3次，共计15个实验点。采用软件Design Expert对表进行方差分析和线性拟合，得到方差分析结果和二阶多项式回归模型。可以看出，该模型F＝18.97，P<0.0，表明显著，而失拟项p＝0.6826>0.05，不显著，模拟决定系数R2为0.9606，修正系数R2 Adj＝0.9100，说明此模型可以解释91.00％的响应值变化，方程拟合度较好。因此，该模型可靠，所得方程可用于确定该复合膜涂液中各组分最优配比。
表7为响应面回归方程方差分析表。
表7响应面回归方程方差分析表
来源 平方和 自由度 均方 F值 p 显著性
模型 235.74 9 26.19 18.97 0.0004 显著
A-改性壳聚糖 12.10 1 12.10 8.77 0.0211
B-CA 4.61 1 4.61 3.34 0.1105
C-LZM 1.26 1 1.26 0.9099 0.3719
AB 8.27 1 8.27 5.99 0.0433
AC 3.86 1 3.86 2.80 0.1384
BC 64.00 1 64.00 46.36 0.0003
A<sup>2</sup> 42.74 1 42.74 30.96 0.0008
B<sup>2</sup> 84.45 1 84.45 61.17 0.0001
C<sup>2</sup> 3.63 1 3.63 2.63 0.1489
残差 9.66 7 1.38
失拟项 2.77 3 0.9228 0.5353 0.6826 不显著
纯误差 6.90 4 1.72
总和 245.41 16
(5)利用软件Design Expert根据二阶多项式回归模型进行绘图分析自变量和响应值的关系，得到回归方程的三维响应面图；通过Design-Expert软件对二阶多项式模型和响应面进行分析优化，确定复合膜涂液中各组分的最佳浓度。
响应曲面斜率大小反映了因素对响应值变化的影响程度，而等高线轮廓则与因素间的交互强弱相关，越扭曲说明两个因素交互作用越强，相反，越接近圆形表示越弱的交互作用。
图5中(A)、(B)、(C)为依次为响应面实验中改性壳聚糖的浓度、卡拉胶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图；改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图；溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度与TVB-N值的影响三维响应曲面图。从图(A)中可看出，随着改性壳聚糖和卡拉胶浓度的增加，响应曲面斜率先下降后上升的趋势，等高线接近椭圆，表明壳聚糖和卡拉胶交互作用较弱。从图(B)中可看出，随着改性壳聚糖和溶菌酶浓度的增加，可以抑制TVB-N值的上升，但达到一定水平后继续提高添加量反而有所上升。等高线接近椭圆，表明具有交互作用。从图(C)中可以看出，增加溶菌酶和卡拉胶的添加量，TVB-N值达到最低后又有所上升，等高线轮廓不规则形，表示溶菌酶和卡拉胶交互影响TVB-N值。
综上所述，通过Design-Expert软件对二阶多项式模型和响应面进行分析优化，确定改性壳聚糖-LZM-CA复合膜各组分最佳添加量为壳改性聚糖16g/L，LZM 1.5g/L，CA 2g/L。在此条件下重复测定改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜包裹小龙虾的TVB-N值。
实施例3
本实施例提供一种改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，是将复合膜涂液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述复合膜涂液是由改性壳聚糖、卡拉胶、溶菌酶和溶剂组成；每L复合膜涂液中含有改性壳聚糖16g，卡拉胶2g，溶菌酶1.5g；所述溶剂为体积百分比为1％的乙酸水溶液。
本实施例所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜采用下述方法制得，步骤如下：
S11.称取1.6g实施例1经100KGy辐照处理获得的改性壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，用玻璃棒搅拌均匀后放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min，待改性壳聚糖完全溶解定容至100mL容量瓶中，得到壳聚糖涂膜液；
S12.取0.2g卡拉胶溶于步骤S11所得壳聚糖涂膜液中，放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min完全溶解，得到壳聚糖-CA混合液；称取0.15g溶菌酶溶解于壳聚糖-CA混合液中，因溶菌酶易溶于水，即用玻璃棒稍微搅拌即可溶解；得到复合膜涂液；
S13.静置待复合膜涂液表面气泡溶解后，用注射器抽取12mL复合膜涂液，均匀涂抹在直径为90mm的灭菌塑料培养皿中，再放在45℃烘箱中干燥8h即可得到改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜。
对比例2
本对比例提供一种改性壳聚糖膜，是将改性壳聚糖涂膜液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述改性壳聚糖涂膜液是由改性壳聚糖和溶剂组成；每L改性壳聚糖涂膜液中含有改性壳聚糖16g；所述溶剂为体积百分比为1％的乙酸水溶液。
本对比例所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜采用下述方法制得，步骤如下：
称取1.6g实施例1经100KGy辐照处理获得的改性壳聚糖加入到体积百分比为1％的乙酸水溶液中，用玻璃棒搅拌均匀后放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min待改性壳聚糖完全溶解定容至100mL容量瓶中，得到改性壳聚糖涂膜液；静置，待涂膜液表面气泡溶解后，用注射器抽取12mL涂膜液，均匀涂抹在直径为90mm的灭菌塑料培养皿中，放在45℃烘箱中干燥8h即可得到改性壳聚糖膜。
对比例3
本对比例提供一种改性壳聚糖-CA复合膜，是将复合涂膜液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述复合涂膜液是由改性壳聚糖、卡拉胶和溶剂组成；每L改性壳聚糖涂膜液中含有改性壳聚糖16g，卡拉胶2g；所述溶剂为体积百分比为1％的乙酸水溶液。
本对比例所述的改性壳聚糖-CA复合膜采用下述方法制得，步骤如下：
S11.称取16g实施例1经100KGy辐照处理获得的改性壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，用玻璃棒搅拌均匀后放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min，待改性壳聚糖完全溶解定容至100mL容量瓶中，得到壳聚糖涂膜液；
S12.取2g卡拉胶溶于步骤S11所得壳聚糖涂膜液中，放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min完全溶解，得到复合膜涂液；
S13.静置待复合膜涂液表面气泡溶解后，用注射器抽取12mL复合膜涂液，均匀涂抹在直径为90mm的灭菌塑料培养皿中，再放在45℃烘箱中干燥8h即可得到改性壳聚糖-CA复合膜。
对比例4
本对比例提供一种改性壳聚糖-LZM复合膜，是将复合膜涂液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述复合膜涂液是由改性壳聚糖、溶菌酶和溶剂组成；每L复合膜涂液中含有改性壳聚糖16g，溶菌酶1.5g；所述溶剂为体积百分比为1％的乙酸水溶液。
本实施例所述的改性壳聚糖-LZM膜采用下述方法制得，步骤如下：
S11.称取16g实施例1经100KGy辐照处理获得的改性壳聚糖溶于体积百分比为1％的乙酸水溶液中，用玻璃棒搅拌均匀后放入超声搅拌器，调节至100W加热15-20min，待改性壳聚糖完全溶解定容至100mL容量瓶中，得到壳聚糖涂膜液；
S12.称取1.5g溶菌酶溶解于壳聚糖涂膜液中，因溶菌酶易溶于水，即用玻璃棒稍微搅拌即可溶解；得到复合膜涂液；
S13.静置待复合膜涂液表面气泡溶解后，用注射器抽取12mL复合膜涂液，均匀涂抹在直径为90mm的灭菌塑料培养皿中，再放在45℃烘箱中干燥8h即可得到改性壳聚糖-LZM复合膜。
本发明对实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜、对比例2-4分别制得的改性壳聚糖膜、改性壳聚糖-CA复合膜和改性壳聚糖-LZM复合膜的表面形貌、物相分析和机械性能分别进行了测试，具体测试方法和测试结果如下：
图1中从左到右依次为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜成品和对比例2制备的改性壳聚糖膜成品对比图。由图1可知，本发明制备的复合膜的透明度与纯改性壳聚糖膜透明度差。但机械强度较大(参见表8)。可知本发明制备的复合膜成品较好。
表8实施例3与对比例2-4分别制得膜的拉伸强度和断裂伸长率对比表
拉伸强度MPa 断裂伸长率
改性壳聚糖膜 16.01 12.29
改性壳聚糖-CA复合膜 25.3 8.92
改性壳聚糖-LZM复合膜 12.31 11.57
改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜 21.13 10.03
表8是实施例3与对比例2-4分别制得的膜的物理性能测试结果。从表8的结果看出，添加了卡拉胶后，其拉伸强度得到了明显的提高。实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的拉伸强度为21.12Mpa。
图6中A图为对比例2制得的改性壳聚糖膜的扫面电镜图；B图为对比例3制备的改性壳聚糖-CA复合膜的扫面电镜图；C图为对比例4制备的改性壳聚糖-LZM复合膜的扫面电镜图；D图为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的扫面电镜图。从这些扫描电镜图(横截面)结果中可以看出，纯改性壳聚糖的横截面比较平滑，这与加了溶菌酶的复合膜类似。然而，当壳聚糖中加入了卡拉胶后可以发现横截面出现了更多的絮状物，说明卡拉胶的加入使保鲜膜的机械性能更好，比如：拉伸强度提高，机械性能得到加强。
图7为实施例3制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜、对比例2-4分别制得的改性壳聚糖膜、改性壳聚糖-CA复合膜和改性壳聚糖-LZM复合膜的XRD测试结果图。从XRD结果图可以看出，以壳聚糖为基底加入的材料并没有影响壳聚糖的基本成分，只是导致了其峰宽及峰面积的减小，说明卡拉胶和溶菌酶的加入会影响壳聚糖的结晶性，但是并没有出现新的峰这可能是因为后两者的结晶性较差。

Claims (10)

1.一种改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，其特征在于：所述保鲜膜是将复合膜涂液均匀涂覆在洁净的基材表面，恒温干燥后获得；其中：所述复合膜涂液是由改性壳聚糖、卡拉胶、溶菌酶和溶剂组成。
2.根据权利要求1所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，其特征在于：所述恒温干燥的温度为40-45℃，干燥时间为8h。
3.根据权利要求1所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，其特征在于：每L复合膜涂液中含有改性壳聚糖16g，卡拉胶2g，溶菌酶1.5g。
4.根据权利要求1所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，其特征在于：所述改性壳聚糖采用下述方法制得：将壳聚糖用20-100KGy剂量辐照降解，得到所述的改性壳聚糖。
5.根据权利要求4所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜，其特征在于：所述辐照的剂量为80KGy或100KGy。
6.一种基于响应面优化制备权利要求1-5任一项所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的方法，包括以下步骤：
(1)筛选主效因子的中心水平：以制备改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜的复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度为变量进行单因素实验，用于筛选出影响冷藏期间小龙虾挥发性盐基氮总含量(TVB-N值)的中心水平；
(2)响应面优化：根据Box-Behnken中心组的实验设计原理，根据步骤(1)单因素实验结果，选取复合膜涂液中改性壳聚糖的浓度、溶菌酶的浓度、卡拉胶的浓度3个因素的3个较优水平为影响因素，以冷藏期间小龙虾的TVB-N值为测定指标，在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行实验设计；
(3)采用软件Design Expert对步骤(2)所得实验结果进行方差分析和线性拟合，得到方差分析结果和二阶多项式回归模型，分析各因素之间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系；
(4)对二阶多项式回归模型进行显著性分析，根据对回归方程失拟的p值检验失拟是否显著，确定回归方程是否适当；根据显著性检验，确定回归方程是否显著，根据模拟决定系数R2，模型的修正后决定系数R2 Adj与模型的预测决定系数R2 Pred来确定模型的预测价值；
(5)利用软件Design Expert根据二阶多项式回归模型进行绘图分析自变量和响应值的关系，得到回归方程的三维响应面图；通过Design-Expert软件对二阶多项式模型和响应面进行分析优化，确定复合膜涂液中各组分的最佳浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中各主效因子的水平范围：所述复合膜涂液中，改性壳聚糖的浓度10-18g/L，溶菌酶的浓度0.5-2.5g/L，卡拉胶的浓度1-3g/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中3个因素的3个较优水平范围为：所述复合膜涂液中，改性壳聚糖的浓度14-18g/L，溶菌酶的浓度1-2g/L，卡拉胶的浓度1.5-2.5g/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中二阶多项式回归模型方程为：
Y＝272.74-193.1*A-635.19*B-351.85*C+24.55*A*B-6.91*A*C+313.22*B*C+57.28*A2+1373.08*B2+1013.25*C2；其中A为改性壳聚糖的浓度，B为卡拉胶的浓度，C为溶菌酶的浓度。
10.权利要求1-5任一项所述的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜或权利要求6-9任一项所述方法制备的改性壳聚糖-LZM-CA复合抑菌保鲜膜在食品保鲜、食品包装中的应用。
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