CN113994980A - 一种防治松材线虫的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治松材线虫的组合物及其制备方法和应用。该组合物是由万寿菊与柳叶复配后70±5％甲醇水溶液提取获得，该组合物能够有效防治松材线虫，可用于制备防治松材线虫的无公害、新型植物源杀线虫剂。本发明采用柳叶作为主要原料，价格低廉，适合推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治松材线虫的组合物及其制备方法和应用，属于松材线虫防治技术领域。
背景技术
由松材线虫(Bursaphelench xylophilus)引起的松材线虫病是松树上的一种毁灭性病害，被称为松树的“癌症”；松树一旦感染此病害，死亡率极高，防治难度大，造成相当严重的经济损失和非常重大的生态灾难，严重影响林业经济的发展和自然景观的多样性。
目前来说，化学农药的使用仍是防治松材线虫的主要手段。如CN200710067456.X公开了一种预防松材线虫病的甲维盐注射针剂，200710067455.5公开了一种预防松材线虫病的阿维菌素注射针剂。CN201010198673.4、CN201010198691.2、CN201010198681.9、CN201810420893.3分别公开了反油酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和亚精胺盐在松材线虫病防治中的应用。但化学农药所带来的负面效应愈演愈烈，在这一大背景下，生物防治逐渐成为研究热点。
植物源农药因其毒性低、选择性强、高效低残留、对环境造成的危害低等特点逐渐受到人们的青睐。但是，国内外对从植物中提取能够防治松材线虫的物质的研究少之又少，特别是从中草药中提取防治松材线虫的组合物鲜见报道。CN201410217580.X公开了一种马尾松松材线虫杀虫剂，包括苦豆、藜芦、鱼藤、万寿菊、苦楝、菌陈、百部、苦竹和射干，按计量称取各组分，粉碎加入乙醇中，浸提后的药渣再次用乙醇浸提，两次收集的药液混合后减压蒸发得到粘稠物，将粘稠物稀释后得到成品。上述组合物虽然可以用于防治松材线虫，但是其组成成分较为复杂，均采用中药原料，原料的成本较高。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种防治松材线虫的组合物及其制备方法和应用，该组合物是由万寿菊与柳叶复配后70±5％甲醇水溶液提取获得，该组合物能够有效防治松材线虫，并且采用柳叶作为主要原料，价格低廉，适合推广使用。
本发明的技术方案是：一种防治松材线虫的组合物，其特征是，该组合物为万寿菊与柳叶复配后的的70±5％甲醇水溶液提取物，其中按干物质质量计，万寿菊：柳叶＝1：1～6，优选为1：4～6，更优选为1：5。
其中，柳叶的使用部位为叶子，万寿菊的使用部位为茎和/或叶。
本发明还提供了上述组合物的制备方法，其特征是，将万寿菊与柳叶按质量比混合，粉碎后加入70±5％甲醇水溶液进行加热回流提取，得到提取物。
该方法具体包括以下步骤：
(1)原料前处理：将万寿菊和柳叶洗净，除去材料表面杂质成分，自然晾干；
(2)配料粉碎：将万寿菊和柳叶混合，经粉碎机粉碎，过100目筛，真空干燥；
(3)提取：然后加入70±5％甲醇水溶液回流提取，固液比设置为1：10～20，加热回流3～4h；
(4)浓缩：提取结束，将提取液进行浓缩，蒸发至粘稠状，再根据需要配制成不同浓度的溶液。
上述步骤(3)的提取，试验室提取优选采用索氏提取器，工业化提取采用提取罐。
本发明还提供了上述组合物在防治松材线虫病中的应用。
上述组合物的使用浓度，以生药计，优选为≥500μg/mL。
本发明的有益效果是：
1、相比化学药以及其他以中草药为主要原料的防治松材线虫的药剂，本发明采用柳叶作为主要原料(80％以上)，来源广泛，价格低廉，适合推广使用。
2、当组合物(万寿菊与柳叶比例为1：5)浓度为600μg/mL时，处理松材线虫24h后，杀虫效果为92.67％，能够有效防治松材线虫；本发明的组合物可用于制备防治松材线虫的无公害、新型植物源杀线虫剂。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中，柳叶的使用部位为叶子，薄荷、马尾藻、万寿菊的使用部位为茎叶混合物。
实施例1：粗提物获取
(1)收集35种植物材料作为供试材料，具体为：积雪草、当归、万寿菊、川芎、人参、柳叶、茯苓、红花、五倍子、鬼针草、小蓟、椴树、合欢、地锦、丹参、薄荷、马尾藻、柑橘、毛竹、马齿苋、刺五加、黄芪、紫花地丁、紫珠草、鱼腥草、蒲公英、金银花、紫苏、苦参、昆布、肉桂、牡丹、苦丁茶、甜菜、桃花；将上述材料分别用清水洗净并浸泡5min，除去材料表面杂质成分，自然晾干；
(2)将植物材料粉碎机粉碎1min，过100目筛，并在常温下真空干燥24h；
(3)粗提物获取：取20g粉碎干燥的植物材料，置于上下密封的装有脱脂棉填塞的滤纸筒中，放入规格250mL的索氏提取器；精确量取300mL 70％甲醇溶液，加到索氏提取器中，剩余甲醇溶液加入圆底烧瓶中；样品充分浸泡3～4h，80℃加热回流提取3～4h；
(4)浓缩：提取结束，冷却，将提取液进行旋转蒸发，蒸发至粘稠状；
(5)样品经多个索氏提取器进行分批提取。
提取完成后加入甲醇定容至100mL，并加入甲醇稀释调整各物质浓度为：以生药计为2000μg/mL，用于下述的实验例。
试验例1：抗松材线虫单体物质筛选
1.实验方法
收集线虫液：将在平板培养好的含松材线虫培养基5片置于漏斗中，漏斗表覆4层纱布，并用无菌水浸湿纱布边缘，漏斗下接含止水夹的橡皮管；处理完成后，静置20h；静置完成后，用3mL离心管接出无菌水，在3500r/min条件下离心5min去除杂质，用无菌水稀释线虫液体，重复3次，最后收集到线虫液。其中含松材线虫培养基为：20g燕麦片+60mL水；
毒力测定：摇匀线虫液(15条/100μL)，用移液枪吸取100μL于96孔板中，加入100μL不同粗提液(浓度2000μg/mL)，摇匀，由于活性物质溶液与线虫液按体积比1：1比例加入，因此，各物质终浓度为1000μg/mL；对照用无菌水代替粗提液，每处理重复三次；处理完成后，将96孔板盖上板盖，置于20℃恒温培养箱，在12h、24h、36h、48h、60h和72h用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况。
2.结果分析
经实验证明，在提取的35种单体物质中，只有柳叶、薄荷、马尾藻、万寿菊提取物具有杀松材线虫活性；进一步分析发现，万寿菊提取液在处理24h后，全部杀死松材线虫；马尾藻提取液在处理36h后，全部杀死松材线虫；薄荷提取液在处理60h后，全部杀死松材线虫；柳叶提取液在处理72h后，全部杀死松材线虫；因此，四种单体物质活性大小为：万寿菊＞马尾藻＞薄荷＞柳叶(参照表1)。
表1不同材料提取液处理松材线虫校正死亡率统计
试验例2：四种单体物质抗松材线虫活性测定
(1)实验方法
首先制备不同浓度活性物质溶液。利用稀释法(甲醇为溶剂)将4种活性物质分别稀释到200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL和1200μg/mL。在实验过程中，活性物质溶液与线虫液按体积比1：1比例加入，因此，各物质终浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL和600μg/mL。
不同浓度活性物质粗提液毒力测定。摇匀线虫液(15条/100μL)，用移液枪吸取100μL于96孔板中，加入100μL不同浓度活性物质粗提液，摇匀；对照用无菌水代替粗提液，每处理重复三次；处理完成后，将96孔板盖上板盖，置于20℃恒温培养箱，于24h用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况。
(2)结果分析
用不同浓度活性物质粗提液处理松材线虫，在24h检测了各处理松材线虫死亡情况，并计算了各处理松材线虫校正死亡率。结果发现，随着各物质粗提液浓度的增加，其灭虫活性不断增强；当各物质浓度为600μg/mL时，万寿菊粗提液杀虫率为76.77％，马尾藻粗提液杀虫率为71.00％，薄荷粗提液杀虫率为66.67％，柳叶杀虫率为60.00％；通过分析得到了各处理的毒力回归方程，通过毒力回归方程计算得到万寿菊粗提液LC50＝319.82μg/mL，马尾藻粗提液LC50＝360.00μg/mL，薄荷粗提液LC50＝413.90μg/mL，柳叶粗提液LC50＝478.63μg/mL，说明四种单体物质灭虫活性大小为：万寿菊＞马尾藻＞薄荷＞柳叶，与筛选结果相一致(参照表2)。
表2不同浓度四种抗松材线虫单体物质处理松材线虫校正死亡率统计
试验例3：组合物抗虫活性测定
试验例2说明，万寿菊粗提物灭虫效果要优于马尾藻、薄荷和柳叶，因此以万寿菊为标准，设置万寿菊：马尾藻＝1：1、万寿菊：薄荷＝1：1、万寿菊：柳叶＝1：1，将材料按上述质量比充分混合并粉碎，利用索氏提取器按实施例1的方法进行提取。
利用稀释法(甲醇为溶剂)将不同组合物分别稀释到200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL和1200μg/mL。在实验过程中，活性物质溶液与线虫液按1：1体积比加入，因此，各物质终浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL和600μg/mL。
不同组合物不同浓度粗提液毒力测定。摇匀线虫液(15条/100μL)，用移液枪吸取100μL于96孔板中，加入100μL不同浓度活性物质粗提液，摇匀；对照用无菌水代替粗提液，每处理重复三次；处理完成后，将96孔板盖上板盖，置于20℃恒温培养箱，于24h用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况。试验结果如表3所示。
表3不同组合抗松材线虫物质处理松材线虫校正死亡率统计
结果分析发现，随着各组合粗提液浓度的增加，其灭虫活性不断增强；特别是万寿菊+柳叶组合粗提物灭虫效果要显著高于其他两种组合(参照表3)；通过分析得到了各处理的毒力回归方程，通过毒力回归方程计算得到万寿菊+柳叶组合粗提液LC50＝245.64μg/mL，万寿菊+马尾藻组合粗提液LC50＝268.53μg/mL，万寿菊+薄荷组合粗提液LC50＝298.54μg/mL，说明灭虫活性大小为：万寿菊+柳叶＞万寿菊+马尾藻＞万寿菊+薄荷(参照表3)。
为了进一步确定万寿菊与柳叶的比例，设置万寿菊与柳叶质量比为2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6，利用相同的方法检测了不同比例原材料组合物毒力大小。我们通过统计不同比例万寿菊与柳叶组合物处理松材线虫校正死亡率，以此为依据得到了各处理的毒力回归方程，通过毒力回归方程计算得到不同比例万寿菊柳叶组合粗提液LC50分别为：LC50(2:1)＝289.20μg/mL、LC50(1:1)＝249.34μg/mL、LC50(1:2)＝236.92μg/mL、LC50(1:3)＝221.41μg/mL、LC50(1:4)＝206.68μg/mL、LC50(1:5)＝191.91μg/mL和LC50(1:6)＝207.87μg/mL(参照表4)，结果显示出当万寿菊与柳叶比例为1：5，其对松材线虫的杀灭率最高，600μg/mL时杀虫率达到92.67％。
表4不同比例万寿菊与柳叶组合物处理松材线虫校正死亡率统计
Claims (9)
1.一种防治松材线虫的组合物，其特征是，该组合物为：万寿菊与柳叶复配后的70±5％甲醇水溶液提取物，其中按干物质质量计，万寿菊：柳叶＝1：1～6。
2.如权利要求1所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，所述柳叶的使用部位为叶子，万寿菊的使用部位为茎和/或叶。
3.如权利要求1所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，其中按干物质质量计，万寿菊：柳叶＝1：4～6。
4.如权利要求3所述的一种防治松材线虫的组合物，其特征是，其中按干物质质量计，万寿菊：柳叶＝1：5。
5.权利要求1-4中任一项所述的防治松材线虫的组合物的制备方法，其特征是，将万寿菊与柳叶混合，粉碎后加入70±5％甲醇水溶液进行加热回流提取，得到提取物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
(1)原料前处理：将万寿菊和柳叶洗净，除去材料表面杂质成分，自然晾干；
(2)配料粉碎：将万寿菊和柳叶混合，经粉碎机粉碎，过100目筛，真空干燥；
(3)提取：然后加入70±5％甲醇水溶液回流提取，固液质量比设置为1：10～20，加热回流3～4h；
(4)浓缩：提取结束，将提取液进行浓缩，蒸发至粘稠状。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述步骤(3)的提取，采用索氏提取器。
8.权利要求1-4中任一项所述的组合物在防治松材线虫病中的应用。
9.一种防治松材线虫的方法，其特征是，采用权利要求1-4中任一项所述的组合物进行防治，组合物的使用浓度以生药计为≥500μg/mL。
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