CN113994012A - 用于靶检测的寡核苷酸探针的原位拼接 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多重核酸探针、包含所述探针的组合物及其用途。本发明涉及多重非信标、形成发夹环的核酸探针。特别地，本发明涉及多重核酸探针，每个核酸探针包含与靶核酸序列互补的核酸序列；其中所述核酸探针能够与至少相邻的探针原位形成多聚体。本发明涉及核酸探针检测生物样品中生物体的存在或不存在的用途。
Description
发明领域
本发明涉及用于检测靶序列的寡核苷酸探针的原位拼接。
发明背景
个性化医疗、癌症诊断、快速微生物抗性测试和微生物鉴定需要大量基于DNA/RNA的信息，这些信息源自体液、组织样品和拭子(swabs)。信息以非常低的浓度或单一拷贝存在，需要及时直接从样本中获取。同样，微生物感染需要立即鉴定罪魁祸首，包括用于个体的靶向治疗的重要信息，在这种情况下，现有技术的方法不能及时为临床医师提供即时信息以开始治疗方案。即使在非临床环境中，食品安全测试也难以为生产批次的放行提供数据。
有两种技术可用于提供这样的信息，每种技术都具有其特定的局限性。扩增测定，诸如PCR，在训练有素的人员中快速地充分确立并且稳健。然而，它们需要细胞破碎，在细胞水平上移除有价值的组织学、形态学和定量数据。替代的原位杂交在本领域中是众所周知的，但尚未发现其进入遗传信息的常规大容量测试。
尽管基于ISH/FISH的RNA和DNA检测技术已经存在了数十年，但它们在很大程度上是无效的。它们缺乏稳健性和灵敏度来可靠地检测遗传信息的表达。虽然微阵列和PCR提供了有用的疾病的分子概况，但在此过程中，与细胞和组织环境相关的临床相关组织学信息以及组织或混合细胞群体中表达模式的空间变化丢失。目前可用的原位应用要求冗长的杂交和扩增程序，总程序花费5小时。实际上，如果在轮班开始时开始，它们在一天内才能完成。任何较晚到达的样品都需要两班制进行，或者需要过夜程序。
已经建立PCR程序，以在1-2小时内(包括样品制备)提供快速结果。在这些快速应用中，样品制备包括RNA/DNA的总提取，这破坏任何形态学相关性(morphologicalcorrelation)。非破坏性的原位PCR应用在本领域中也是众所周知的。然而，它们要求非常细致和冗长的程序，对实践技能敏感。
设计了其他荧光原位杂交程序(FISH)来检测DNA和mRNA。这些测定要求冗长的杂交，并且因此在最好的情况下在轮班结束时产生结果，然而通常在两天以上。
开发了DNA信标技术，以便在原位大量检测靶。这包括尽可能利用DNA的偏好以形成发夹环。这被用于开发寡核苷酸，其将形成发夹环，在环中具有靶向序列，并且猝灭剂-荧光团对位于相应的3’和5’引发末端。在不存在靶的情况下，寡核苷酸将优选为发夹环构象，使荧光团和猝灭剂非常紧密接近。激发时，猝灭剂将捕获发射的光子，并且没有可见的信号。在存在靶的情况下，环将展开，并且荧光团和猝灭剂两者分离。激发时，寡核苷酸将发射明亮的信号。这项技术被进一步开发，以便在30分钟内鉴定核糖体RNA，允许在临床样品中直接即时鉴定细菌。
设计了其他原位程序以缩短测定时间。值得注意的是，分支DNA(branched DNA，bDNA)设法将测定时间缩短到一个班次。实际上，这意味着只有在轮班一开始时提取的样品才可以在同一天进行分析。在常规临床环境中，这种方法实际上是为期两天的程序。
所有这些测定都产生定性数据，在该定性数据中确定了存在/不存在。在检测极限的边界，测定的解释变得模糊不清。生物样品的情况尤其如此，令人沮丧的是，生物样品常含有自发荧光颗粒(auto-fluorescent particle)。当转变到较高的放大率时，关于背景荧光的问题被增强。样品制备中的技术和细心成为一个问题，尤其是在处理不同质量和年龄的载玻片时。
只有总周转时间为1小时至2小时的测定才能够对临床决策发现产生早期影响，并且降低治疗成本，并且有可能提高生存率。
此外，结果的定量被减少到相对于背景噪声的相对荧光。按摩尔计的定量仍然是一个挑战。
因此，将合意的是，具有一种将在组织学背景下以及与其他快速组织学技术相同的时间范围内提供定性分子数据和定量分子数据两者的测定。
发明概述
本发明提供了多重核酸探针(a multiplicity of nucleic acid probes)或者包含这样的探针的组合物，以允许用于检测DNA和RNA分子的稳健且快速的原位杂交测定。还提供了方法、测定和试剂盒。
在一个方面中，提供了一种原位拼接的DNA探针多聚体，其由被设计为协同地起作用、都能够同时杂交到感兴趣的编码和互补DNA序列的至少两个至多个寡核苷酸或核酸探针在严格相同的条件下基本上无缝地沿5’至3’或3’至5’下游靶序列形成，其中每个寡核苷酸的5’末端和3’末端含有被设计成在存在靶序列的情况下与相邻寡核苷酸原位形成螺旋茎(helical stem)的序列，以便原位聚合，得到具有增强的结合特性的延长序列。合适的是，形成与基因的编码和互补靶序列杂交的单独DNA寡核苷酸序列的基本上无缝的阵列，指示细胞的恶性或其他致病状态的存在。换句话说，一种同时原位检测DNA和cDNA的测定。在一种实施方案中，形成了与基因的编码和互补靶序列杂交的单独DNA寡核苷酸序列的基本上无缝的阵列，指示微生物中抗生素抗性或毒素基因表达的存在。
在另一个方面或实施方案中，提供了如本文定义的寡核苷酸或核酸探针的阵列，寡核苷酸或核酸探针与从小的非编码RNA到信使RNA的任何长度的任何转录产物序列杂交。在一个方面或实施方案中，提供了如本文描述的寡核苷酸或核酸探针的阵列，寡核苷酸或核酸探针具有非靶定向的3’和5’末端，被设计成形成仅与上游和下游相邻寡核苷酸原位互连的短螺旋，以有效地在5’至3’或3’至5’方向上形成一个任意长度的大的稳定杂交序列。合适地，5’末端核苷酸被设计成通过在上游靶具有第一嘌呤的地方具有替代嘌呤和相反地在靶具有第一嘧啶核苷酸的地方具有替代嘧啶来错配相应的3’上游靶的序列。合适地，下游相邻寡核苷酸3’错配序列被设计成遵循经典杂交规则与相邻上游寡核苷酸侧翼的5’核苷酸杂交。合适地，应用一组定义侧翼序列选择的规则防止侧翼区域与靶DNA或RNA杂交。合适地，所有针对靶的序列都被设计成在杂交条件下仅以一个常规ΔG(+/-2kcal/mol)杂交。
在一种实施方案中，每个茎的形成为组合的寡核苷酸阵列杂交过程提供另外的负ΔG，允许靶-杂交体和茎自由能的总和被微调到约1kcal/mol内。合适地，每个茎的形成为组合的寡核苷酸阵列杂交过程提供另外的负ΔG，在杂交条件下，靶-杂交体和茎自由能的总和被限制在约1kcal/mol内。合适地，每个茎的形成为组合的寡核苷酸阵列杂交过程提供另外的负ΔG，其总和低于用于DNA双螺旋重新形成的相应ΔG的ΔG。合适地，茎形成的ΔG被设计成在溶液中不利于阻止自伸长(self-elongation)，并且Tm被设计成低于环境温度以使任何形成的自杂交解链。合适地，寡核苷酸不形成自猝灭发夹环。
在一种实施方案中，提供了根据本发明的寡核苷酸或核酸探针的阵列，其中编码DNA和cDNA的靶序列的ΔG和Tm仅与完整靶序列的ΔG重叠50％。
在另外的实施方案中，本发明提供了核酸探针序列，其中防止了针对DNA和互补DNA的探针原位自杂交产生假阳性信号。合适地，针对互补DNA的寡核苷酸以相应的序列的互补上游和下游ΔG值的每一种的基本上一半覆盖相应的靶的互补序列。合适地，针对编码DNA和互补DNA两者选择靶同时将平衡从同源DNA-螺旋的重新形成移向异源杂交体的形成。合适地，杂交过程的平衡被组合的ΔG从自杂交拉离，拉向完整的靶加茎序列。
在另一种实施方案中，提供了根据本发明的寡核苷酸或核酸探针的阵列，其中与靶杂交的序列是DNA，并且形成茎的核苷酸是DNA类似物。在一种实施方案中，提供了根据本发明的寡核苷酸或核酸探针，其中每个交替的侧翼序列携带激发子(energizer)(a型探针)，或者携带能够进行能量共振转移的分子。合适地，主要激发能量由光波或低能核素衰变产生。在一种实施方案中，有效的能量(共振)转移仅在存在靶的情况下是可能的，该靶提供彼此的最终接近并且有效地发射可检测的光子。合适地，a型探针携带至少一个具有大斯托克斯位移的荧光部分。在一种实施方案中，a型探针携带至少一个具有大斯托克斯位移的荧光部分，其荧光发射持续长达数毫秒。合适地，b型探针携带至少一个荧光团，其激发最大值与a型探针的发射最大值一致。在一种实施方案中，发射的光子的量允许经由在任何前述权利要求下构建的标准直接定量，实现自动读数和摩尔定量。在一种实施方案中，定量提供了确定样品中和细胞水平上病毒载量的手段。
在另一种实施方案中，本发明提供了根据本发明的寡核苷酸或核酸探针的阵列，其中侧翼区域通过使用非核酸间隔臂来缩短，以形成共价交联，从而实现能够进行FRET的条件。用于核酸杂交测定的其他合适系统是酶标记系统，包括生物素-亲和素系统。
合适地，根据本发明的核酸序列可以从核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸类似物或其组合构建。
在一种实施方案中，根据本发明的核酸探针、寡核苷酸的阵列或组合物针对诊断相关基因的转录产物。
在一种实施方案中，可以选择核酸探针序列以提供至少一对仅受总靶长度或经济合理性限制的探针类型。
合适地，探针序列可以应用于非破坏性测定，而不损害标准的组织学染色和读取程序。
本发明还提供了用于检测包含根据本发明的探针序列的DNA和RNA的任何诊断试剂盒。
适用于本发明的上下文的样品包括活组织检查样品、切片和其他生物材料，诸如痰、血液、尿液或其他体液。
合适地，本发明可以用于检测来自任何界的细胞中的任何核酸。
在另一种实施方案中，本发明可以用于检测加工食品和饮料中腐败物质(spoilant)或污染物的存在或不存在。
在另一种实施方案中，本发明可以用于检测环境样品中核酸的存在或不存在，环境样品包括但不限于土壤、污物、灰尘和水。
其他实施方案提供了用于确定细菌、酵母和霉菌、寄生虫、人类和动物组织中与毒素产生或抗生素抗性相关的生物学状态的方法。
合适地，根据本发明的核酸探针序列可以被标记以允许自动定量。在一种实施方案中，标记是经由携带镧系元素复合物的b型寡核苷酸。合适地，在含水环境(即猝灭环境)中存在靶的情况下，使所述两种类型紧密接近产生了浓度依赖性信号。
本文描述的核酸探针序列可以在任何序列的任何起点设计，给出如实施例1中呈现的序列所例示的可预测序列的阵列。
在另一种实施方案中，本发明提供探针序列以确定任何界的任何细胞的现状。
合适地，探针序列能够在天然制品和固定制品二者中发挥作用。
在一种实施方案中，提供了用于检测编码HPV E6蛋白的核酸的探针序列。
使用本发明给出了通过检测微生物抗性或毒素产生的标志mRNA序列的存在/不存在，来进一步区分具有相同核糖体RNA序列的密切相关的生物体的另外的实例。令人惊讶地发现，当将ZIP原理应用于细菌的特异性鉴定时，发现在BLAST分析中确定的特异性增加了10e14的因数。图4a示出了单一探针的特异性，E值为0.049，并且图4b示出了使用相同的特异性序列联合根据本发明设计的两个侧翼探针，E值增加到2×10e-17至9×10e-20。
附图
图1示出了1-600号位置内针对HPV蛋白E6的探针的实例。
图2示出了针对编码序列和互补序列的探针的实例。
图3示出了原位拼接的探针测定的实例。
图4示出了设计成经由核糖体RNA中的特定靶来鉴定微生物的ZIP探针的实例。图4a示出了单个靶的NCBI BLAST，并且图4b示出了原位拼接探针的NCBI BLAST与各自的E值。
图5示出了用于鉴定编码具有诊断价值的表达产物的rRNA以及mRNA的探针。
图6和图7示出了在严格的ZIP要求下共同工作的三种针对大肠杆菌(E.coli)核糖体RNA的探针。
发明详述
本发明的目的是实现以1小时的目标周转时间检测DNA和RNA分子的稳健且快速的原位杂交测定。稳健性必须实现实验室间和实验室内的高重现性。需要解决三个方面，以缩短周转时间并且提高测定的重现性。第一关键点是完成杂交所需要的时间。这必须从几个小时减少到几分钟，而不损害特异性。第二点是产生结果所需要的步骤的总数目，并且第三点是探针设计的标准化。当前的测定需要时间、大量步骤和熟练的人员来进行和读取测定。
这些问题可以通过寻找向均相测定发展的方式来解决。最关键的步骤在于区分结合的探针和未结合的探针，以及产生高信噪比。一个明显的方式将是使用分子信标技术。信标技术的主要特征在于茎的构建，其中茎仅在存在同源靶序列的情况下打开。未杂交的序列回到热力学上有利的发夹环形成，其中潜在的信号被猝灭。仅有结合的、展开的信标才将给出信号。杂交释放的能量必须大于发夹环形成的自由能。因此，在打开发夹环结构时消耗大量的自由能。原位靶核酸很少能自由地用于具有直接两步动力学的二维杂交。DNA和RNA是折叠的三维分子，它们不是独立的分子，而是良好地缠绕的3维(3-D)蛋白质核酸复合物。为了杂交，需要解开这些复合物，并且必须设置离子条件以有利于探针-靶复合物而不是原生复合物。该过程在存在所有反应配偶体的情况下保持动态和竞争性，如在均相测定中的情况。
ΔG3-D靶复合物+ΔG发夹环<＝＝＝>-ΔG发夹环+ΔG探针/靶-ΔG3-D靶复合物
因此，在成功的杂交中，必须通过选择合适的探针序列和测定条件来克服有利于回到起始构型的能量。
现有的测定通过改变离子环境或洗涤未结合的探针来移动平衡。本发明涉及设计探针和条件，其将启用、促进和稳定探针/靶杂交体。潜在的概念是使用将杂交和原位形成聚合探针的序列，该聚合探针仅在成功地放置在适当的位置时，即在杂交体复合物中时产生信号。这种构型中的结合动力学，即高的Kon和Koff，将从多个小探针的快速结合转变为非常大的核酸序列的缓慢结合，即慢的Kon、Koff。
需要时间将平衡移向期望的杂交体，期望的杂交体中发夹环是打开的并且与靶杂交，对激发/发射开放。未结合的发夹环是关闭的，并且不能产生信号。
本发明的主题是利用发夹环茎形成中另外产生的自由能，并且使用该自由能来稳定多个探针与靶DNA或RNA的结合。在本发明中，选择仅在存在靶的情况下并且仅在杂交时导致茎形成的序列。在这种构型中产生的总自由能是原位形成的杂交体和茎的组合的自由能。结合的探针和未结合的探针之间的区分通过应用本领域充分描述的FRET技术来实现。
这包括选择一对荧光团，其具有与第二荧光团的激发波长重叠的第一荧光团的发射波长以及尽可能高的组合的斯托克斯位移。满足这一标准的多种荧光团是商业可得的。优选的组合是镧系元素螯合物与荧光团的组合，在620nm处具有尖锐的发射最大值。最优选的组合是在620nm处具有发射最大值的铕螯合物，与在620nm(+/-10nm)处被激发的荧光团，例如Atto620组合。这种组合需要紧密接近，以实现能量共振转移。需要选择和维持条件和序列，在这样的条件和序列下，未结合的探针的茎序列不退火而产生背景噪声，并且因此降低测定的灵敏度。
Zip探针的形成
类似于点击化学(其中反应以“一锅”进行，并且特征在于高热力学驱动力，该驱动力快速且不可逆地驱动反应以高收率产生单一反应产物)，根据本发明，核酸探针被送入细胞内部以与相应的靶序列杂交。靶被选择成尽可能彼此毗邻。相邻探针的优选的位置没有中间序列，并且最优选没有间隔核苷酸。必要的是所有探针的热力学特性(ΔG)被设计成尽可能相同。标准化是根据总体热力学特性进行的。传统上，在本领域中，Tm值被用于确定期望的NA序列的长度。然而，在此处，杂交时产生的自由能被证明是最有用的参数，因为具有正ΔG的序列将不杂交。设计是通过仔细选择和添加碱基以实现期望的负ΔG来进行的。出于实际原因，必须为所有杂交选择一个标准温度。与靶杂交的序列的ΔG应被选择为在选定的杂交温度为负。优选的ΔG在-15kcal/mol和-35±5kcal/mol之间。最优选的ΔG被发现是-26kcal/mol。此外，增加允许的ΔG的带宽的严格性增加了整体测定的稳健性。设计最严格的值为当ΔG值保持在±1.5kcal/mol内时的值。
本发明最重要的方面是添加5’侧翼序列，严格地不与附近的任何靶序列杂交，尤其是不与直接相邻的5’上游序列杂交。这是通过严格交换5’侧翼序列中的编码序列来实现的。所有的变化都将扰乱杂交。优选的交换是：A交换G；G交换T；C交换A；T交换C。相邻探针的3’侧翼序列是通过相对于所述5’侧翼序列用C互补G；用A互补T；用T互补A并且用G互补C而形成的。这种迫使5’侧翼错配的交换也将确保用于侧翼相邻3’末端的任何序列也将与靶的编码序列错配。
侧翼序列的长度可以选自一个核苷酸和多于一个核苷酸之间。优选的长度在5个核苷酸和15个核苷酸之间。当与相邻5’上游寡核苷酸的3’侧翼序列结合在一起时，核苷酸的最优选的数目由形成一个螺旋扭曲所需要的量来定义。
此外，必须以这样的方式选择序列：在一次测定中存在的寡核苷酸的混合物在杂交温度或读取温度以及它们所需要的缓冲液和盐配置下不彼此自由杂交。非常令人惊讶地发现，可以选择形成螺旋的序列，其具有负ΔG和接近0℃的Tm值。最合意的长度是当ΔG为负在-4.5(+/-1.5kcal/mol)，并且允许一个完整的螺旋扭曲时。这一发现是重要的，因为虽然侧翼区域能够形成一个长寡核苷酸多聚体，但它确保在室温的读取将不允许这些侧翼序列在溶液中退火，因此能够进行均相测定。选择这种设计允许应用FRET技术以在均相测定中产生信号。
在这样的构型中，当一个探针由此一个接一个地“拉上拉链(zip)”时，这种螺旋的ΔG增加了正的稳定效果，即这增加了释放的能量的总量。探针设计从3’末端向5’末端开始，即沿着上游编码序列。单独的探针5’到3’地构建。该过程可以沿着完整的靶序列延伸，而没有长度限制。
WO 03/076655A2的教导描述了使用至少两个紧密相邻的探针，其中茎携带荧光团到第一探针的5’侧翼，其序列与携带第二荧光团的第二探针的3’茎互补。这两个荧光团组合在一起允许能量转移。在所描述的优选的应用中，应用分子信标；其中由于信标中荧光团的猝灭，未结合的发夹环发射的信号比结合至靶的探针的信号低2倍至5倍。使用信标导致发夹环在探针与靶结合的3’末端或5’末端处与猝灭剂结合。实际上，这意味着信标的优选的使用仅允许使用两个信标以可以实现FRET的方式与靶结合。此外，如WO 03/076655 A2的图1所示，只有探针#1上的猝灭剂在5’末端携带猝灭剂，并且探针#2在3’引发末端携带猝灭剂，这才是可能的。因此，产生的总信号不会比单个信标的信号更强。组合的探针对在3’末端和5’末端上都携带猝灭剂，这排除了添加另外的探针，因为第三个相邻信标的信号将被猝灭。因此，信标的使用排除了本发明中描述的无限多聚体的形成。WO 03/076655A2因此不适合用于多聚体的产生，并且因此不适合用于均相测定中的任何实际应用。
现有技术中的缺点在本发明中通过使用发夹环来解决，该发夹环在发夹环的3’末端和5’末端严格使用相同的荧光团，实现了无需洗涤步骤的均相测定。FRET是通过使荧光团在上游和下游交替来实现的，发夹环在每个各自的发夹环上携带荧光团“A”或“B”，仅在与靶结合时才形成FRET对“AB”(图1)。本领域熟知的FRET对可以被选择用于该应用。这代表了由茎序列的设计驱动的原位拼接。
在这种形成中，只有严格省略猝灭剂的使用，才有可能形成结合至靶的多个发夹环，这节选了小发夹环的快速动力学，并且展现了原位结合至靶的大序列的完全组合的热力学优点。此外，只有在这种形成中，才有可能实现使多个探针结合至一个靶的增强的灵敏度。
此外，WO 03/076655A2没有教导如何设计没有交叉反应性的茎。如上描述的茎的仔细设计以避免不对准和背景噪声是本发明的基本部分，并且排除了信标的使用。US2005/0287548 A1的教导描述了使用具有共享茎的信标以形成FRET对，并且由于所述排除，不导致多聚体的形成。US6472156B1使用等位基因构型来使荧光团物理邻近，以允许FRET发生。它没有教导多聚体的形成。
令人惊讶的是，当NCBI BLAST用于根据本发明构建的原位拼接的探针时，与相应的单一特异性探针相比，利用用于鉴定微生物诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的特异性探针和相邻非特异性探针，E值从<0,05下降到<10-15(图4a和图4b)。这指示原位拼接的探针相对于单个线性或信标探针的特异性的显著增强。
本发明的另外的方面是从靶的所述3’末端开始向第一探针的5’侧翼添加荧光团，并且在第二5’上游邻居的3’侧翼添加对应的荧光团。热力学上有利的螺旋被形成为不间断的茎，并且将使两个荧光团非常紧密接近，以便使FRET能够发生。非常紧密接近是有利的，因为共振耦合随距离呈指数式衰减。与时间分辨的荧光的优点结合，这种原位配对能够实现均相测定，消除自动荧光和背景荧光。荧光团经由间隔物附接至寡核苷酸。如果包括长的间隔臂，这是特别有利的，长的间隔臂隔开荧光团，并且作为电介质防止由富含电子的堆积的核苷酸引起的猝灭。
理论上，这些间隔臂也可以携带化学活性基团，这将允许应用蛋白质亲和标记领域中熟知的技术以原位形成交联。这将在寡核苷酸之间给出共价连接，以原位形成一个长的共价连接的分子。亲和标记的优选的选择将包括一个侧翼上的叠氮基基团和赖氨酸的设计，其中游离的ε氨基基团被定位，使得共价连接可以由测定中基于镧系元素的荧光团的激发所需要的相同波长形成。
可以选择本领域中描述的任何一对荧光团。荧光团的优选的选择是可以实现能量共振并且能量从一个荧光团转移到另一个荧光团的情况。选择的目的是产生最高可能的组合的斯托克斯位移和优化的能量转移。这仅在实现紧密接近以允许(荧光)共振能量转移(F)RET的情况下才有可能，如
(
Theodor(1948):Intermolecular EnergyMigration and Fluorescence.Ann Phys 437:55–75)所描述的。其他未结合的荧光团将在被水包围的溶液中，这将猝灭来自未结合的探针的信号。这是省时的均相测定的关键组成部分。最优选的选择是使用螯合的镧系元素作为能量/电子供体，以及激发波长等于镧系元素的发射波长的荧光团。具有250nm至300nm的组合的斯托克斯位移的该组合给出了非常高的信噪比，该信噪比可以通过利用本领域熟知且易于商业获得的时间分辨的荧光技术来进一步增强。
在FRET中选择配偶体时，需要满足三个条件。首先，供体和受体应呈现能量相容性，即，供体发射光谱和受体激发光谱应完全重叠。第二，供体和受体应呈现相容的定向。当供体和受体跃迁偶极矩平行时转移最大，并且当供体和受体跃迁偶极矩垂直时转移最小(等于0)。最重要的因素是，仅当两个配偶体非常紧密接近时，能量转移才可以发生。转移的效率与距离的六次方成反比。
E＝R6/R6+r6
其中R0是对应于50％能量转移效率的距离。为使FRET发生，两个配偶体应在
内的范围。构建这种构型的目的是利用螺旋形成以提供紧密接近，并且以最高可能的信噪比最大化FRET效率。
本领域中描述了许多荧光团组合，这些荧光团组合可以实现FRET。因为发射峰在490nm附近，所以铽穴状化合物(Terbium-cryptate)是一种选择，并且与作为受体的荧光素样荧光团相容。特别优选的镧系元素是铕，其在335nm处被激发。它呈现出大的斯托克斯位移，主要发射峰在615nm-620nm。铕还具有特别适合用于时间分辨的荧光的光子发射时间。这使得铕螯合物与深红色荧光团相容，深红色荧光团是进行FRET的荧光团的最优选的选择。
在所述测定形成中使用所述荧光团配偶体时，所形成的螺旋将使两个配偶体处于FRET所需要的范围内。其他未结合的探针将间隔太远，并且被均相测定的含水环境猝灭。
设计这样的富含电子和能量的荧光团的另外的方面在于激发的能量可以被耗散到其他富含能量的组分，诸如核苷酸，尤其是胍。它们需要用电介质分隔开。这是通过为螯合物选择足以抑制能量的耗散(即猝灭)的间隔臂来实现的。间隔物设计也可以被进行以使用所述亲和标记技术在两个配对间隔臂之间掺入交联。在DNA探针的帮助下，可以以多种方式实现接近。长的间隔臂可以与所述交联试剂一起添加，而不需要茎的帮助。然而，选择茎以便增强杂交条件下的动力学性能并且简化探针构建。
交联继而使短探针原位聚合，以快速形成一个大的杂交分子，该分子现在具有变化的动力学性质。
实际上，一个大的NA多聚体是通过原位拼接，并且仅在存在同源序列的情况下形成的，该NA多聚体现在以越来越强的强度与靶结合。随着链长度的增长，由多聚体产生的自由能将越来越负ΔG，并且具有比单独的小寡核苷酸更高的Tm。该杂交体将稳定并且不解离，提供常规测定所需要的稳健性。总之，动力学可以被描述为
＝＝＞原位，具有低koff动力学的一个大探针
这样的测定设计将小寡核苷酸杂交的速度与大核苷酸探针或粘粒的灵敏度和特异性相结合。
同样的原理可以被用于开发针对感兴趣序列的信使RNA的探针。由于RNA和DNA之间结合的热力学特性不同于DNA/DNA杂交体，为了在相同的测定条件下工作，用于mRNA检测的序列将更短。这将允许商业测定的有效开发，这些测定均在相同的条件下工作。此外，它将允许在相同的细胞中同时检测给定的DNA序列及其表达产物。
减少杂交时间并且同时使信号强度加倍的另外的方面是针对与靶互补的DNA序列即cDNA提供探针。这通常将是一种弄巧成拙的方法，因为针对cDNA的探针将与针对原始靶序列的探针杂交，从而消灭最初的目的。然而，这可以通过引入“相移(phase shift)”来避免。针对互补的DNA和cDNA靶的两个探针(two probes addressing complementary DNAand cDNA targets)之间的重叠在它们的ΔG值方面仅允许具有50％的重叠。当严格应用时，这将使所述探针之间的结合在热力学上远不如任何完全连续的匹配，从而使这种方法可行。
因此，当试图一起检测DNA和cDNA以提高灵敏度时，需要考虑以下内容。为了防止靶向初级DNA靶的探针和靶向互补序列的探针偶然地自杂交，靶和互补靶必须与下一个下游序列最大程度地重叠。这一要求决定了互补序列的序列。此外，重叠需要以ΔG来测量，因为绝对数量(sheer numbers)产生偏移并且导致偏差，这可能导致自杂交。这实际上将使探针脱离平衡，并且降低杂交效率，并且因此减慢整个测定。
将cDNA从平衡中移除将另外地有利于杂交体的形成，而不是原始螺旋DNA的重新形成，加速且稳定了系统。
设计的另外方面是组合了DNA和DNA类似物的优点。由于缺乏带电荷的磷酸主链，DNA类似物在含水环境中的溶解性差。实际上它们的长度被限制在12-15mer。对靶序列使用DNA与对茎形成序列使用DNA类似物组合将保持溶解度，同时容易穿过膜。这不仅可以加速膜通过并且因此加速测定，还可以减少与膜的非特异性结合。此外，DNA类似物具有更负的ΔG，并且将增加结合时释放的自由能。
鉴于以上所述，将理解，本发明还涉及以下项目：
项目1：多重非信标、形成发夹环的核酸探针，能够原位与靶核酸序列形成拼接的杂交体，所述核酸探针包含：
与靶核酸序列互补的核酸序列；
包含第一检测部分的5’侧翼序列，和
包含第二检测部分的3’侧翼序列；
其中所述核酸探针能够与至少另一个相邻的核酸探针原位形成多聚体，使得当所述核酸序列与靶序列结合时，所述核酸探针的所述5’侧翼序列与相邻探针的所述3’侧翼序列的至少一部分互连以形成茎，使得茎的所述第一检测部分和第二检测部分相互作用以产生信号。
项目2：根据项目1所述的多重核酸探针，其中所述5’侧翼序列和/或3’侧翼序列不与所述靶核酸序列杂交。
项目3：根据项目1或项目2所述的多重核酸探针，其中由所述5’侧翼序列和3’侧翼序列形成的所述茎是具有负ΔG和接近0℃的Tm值的螺旋。
项目4：根据前述项目中任一项所述的多重核酸探针，其中与所述靶核酸序列互补的所述核酸序列包含核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸类似物或其组合。
项目5：根据前述项目中任一项所述的多重核酸探针，其中与所述靶核酸序列互补的所述核酸序列是DNA，并且所述5’侧翼序列和3’侧翼序列包含DNA类似物。
项目6：根据前述项目中任一项所述的多重核酸探针，其中所述靶核酸序列是DNA或RNA。
项目7：根据前述项目中任一项所述的多重核酸探针，其中所述第一检测部分是激发子(a型探针)，并且所述第二检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)；或者其中所述第一检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)，并且所述第二检测部分是激发子(a型探针)。
项目8：一种组合物，包含前述项目中任一项要求保护的多重核酸探针。
项目9：根据项目8所述的组合物，其中相邻探针上与所述靶核酸序列互补的核酸序列被设计成在限定的杂交条件下仅以一个常规ΔG(+/-2kcal/mol)与所述靶核酸序列杂交。
项目10：根据项目9所述的组合物，其中在选定的杂交温度，ΔG<0kcal/mol，特别地其中ΔG在-15kcal/mol和-35±5kcal/mol之间，更特别地ΔG在-24kcal/mol和-30kcal/mol之间。
项目11：根据项目8-10中任一项所述的组合物，其中所述第一检测部分是激发子(a型探针)，并且所述第二检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)；或者其中所述第一检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)，并且所述第二检测部分是激发子(a型探针)，使得这样的组合将a型探针和b型探针带到一起，从而使用FRET技术以产生信号。
项目12：根据项目11所述的组合物，其中有效的能量共振转移仅在存在所述靶核酸序列的情况下是可能的，其中所述第一检测部分和第二检测部分彼此接近并且有效地发射可检测的光子。
项目13：根据项目12所述的组合物，其中发射的光子的量允许直接定量，实现自动读取和摩尔定量。
项目14：根据项目8-11所述的组合物，包含在5’末端和3’末端携带相同荧光团的探针的基本上无缝的阵列，其中相邻的探针交替携带一个探针上的荧光团A、第二个探针上的荧光团B、第三个探针上的荧光团A、第四个探针上的荧光团B以此类推，其中仅当形成A/B对时才产生FRET依赖性信号。
项目15：根据项目13所述的组合物，其中定量提供了确定样品中和细胞水平上病毒载量的手段。
项目16：根据项目8-15所述的组合物，其中所述多重探针包括针对DNA和针对mRNA的探针。
项目17：根据项目8-16中任一项所述的组合物，其中所述多重探针包括针对DNA和针对cDNA的探针，特别地其中所述探针能够同时与感兴趣的编码DNA序列和互补DNA序列杂交。
项目18：根据项目17所述的组合物，其中防止针对DNA和互补DNA的核酸探针原位自杂交，特别地其中针对互补的DNA和cDNA靶的两个探针之间的重叠在它们的ΔG值方面仅允许具有50％的重叠。
项目19：一种原位杂交方法，包括：
(a)使根据项目1-7中任一项所述的多重探针或项目8-18中任一项所述的多重核酸探针或组合物与生物样品接触；
(b)使(a)的所述核酸探针与所述样品杂交；
(c)诱导允许相邻探针之间形成茎并且有利于探针/靶杂交体复合物稳定的条件，其中所述茎允许检测部分的相互作用。
项目20：根据项目19所述的方法，其中探针序列应用于非破坏性测定。
项目21：根据项目19或20所述的方法，其中所述方法是均相测定。
项目22：根据项目1-7中任一项所述的多重核酸探针或项目8-18中任一项所述的组合物在根据项目19-21中任一项所述的方法中鉴定生物样品中一种或多于一种生物体的存在或不存在的用途。
项目23：根据项目21所述的用途，其中所述用途是诊断用途。
项目24：根据项目21或22所述的用途，其中所述生物体是病毒，例如HPV，特别地其中检测到编码HPV E6蛋白或HPV E4蛋白的核酸。
项目25：根据项目21-23中任一项所述的用途，其中所述生物样品是任何生物来源的样品，诸如临床样品或食品样品。
项目26：一种用于检测靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括根据项目1-7中任一项所述的多重核酸探针或根据项目8-17中任一项所述的多重核酸探针或组合物。
鉴于本公开内容，本发明的各种另外的方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。
本说明书中提及的所有文件通过引用以其整体并入本文。
在本文中使用的“和/或”被认为是两个指定的特征或组分中的每一个与或不与另一个一起的具体公开。例如“A和/或B”被认为是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，如同每一个在本文中单独列出一样。
拼接意味着DNA片段在另一个DNA片段的末端处接合。本发明中使用的“拼接”描述了可以与至少另一个相邻探针拼接以形成多聚体的核酸探针。有利地，随着链长度的增长，由多聚体产生的自由能将越来越负(ΔG)，并且链将具有比单独的小寡核苷酸更高的Tm。
除非上下文另有指示，否则上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
本发明的某些方面和实施方案现在将以示例的方式并且参考上文描述的附图进行说明。
实施例
a.探针设计：热力学值使用DINAMelt网络服务器：http://unafold.rna.albany.edu/？q＝DINAMelt/Two-state-melting提供的工具，输入标准杂交条件和选择的温度计算。选定的杂交温度是50℃，并且针对输入测定的任何尿素进行校正。盐和Mg的浓度被标准化为25mM NaCl和10mM二价金属盐。
b.这里选择的实例是为了展示检测来自HPV E6蛋白的DNA的测定。以下探针序列是一个实例，从公布序列的61位任意地开始。遵循此处给出的教导从任何其他位置开始设计一组探针将产生高度可预测的序列。序列样品及其相应的热力学值在附件图1中。图1示出了1-600号位置内针对HPV蛋白E6的探针的实例。
此外，图2示出了针对编码序列和互补序列的探针的实例。
c.选定的另外的实例是为了证明本发明的有用性在于设计以增强的特异性经由核糖体RNA中的特定靶来鉴定微生物的ZIP探针(图4a，图4b)。
d.测定程序
i.样品制备：
如果样品是涂片、拭子、痰、切片和石蜡包埋切片，样品制备遵循所有本领域已知的描述为用于ISH程序的良好建立的程序，并且不要求与该程序偏离，除了一个例外。如本领域熟知的，当应用针对革兰氏阳性细胞的探针时，需要用包含蛋白水解酶诸如但不限于溶菌酶和/或溶葡萄球菌酶的裂解混合物来消化细胞壁，以使所述探针能够进入细胞质。
ii.完整测定(a)
1.在EtOH浴中浸泡5min
2.放置在热(50℃)板上直到干燥
3.添加足以覆盖组织的杂交混合物
4.封闭盖子并且杂交10min
5.在RT在停止溶液(不含探针的杂交缓冲液)中短暂浸泡1min
6.在EtOH中浸泡
7.在热板(50℃)上干燥
8.在荧光显微镜(时间分辨的荧光装置)下读取
iii.完整测定(b)
1.将10μl样品施加在显微镜载玻片上的每个区域，并且在热(50℃)板上干燥
2.对于针对革兰氏阴性生物的探针，将10μl裂解混合物放置在热板上并且干燥
3.在EtOH浴中浸泡5min
4.放置在热(50℃)板上直到干燥
5.添加10μl杂交混合物，或者对于切片足以覆盖组织
6.封闭盖子并且杂交10min
7.在环境温度在停止溶液(不含探针的杂交缓冲液和含有50％乙醇的甲酰胺)中短暂浸泡1min。
8.在乙醇(EtOH)中短暂浸泡
9.在热板(50℃)上干燥
10.在荧光显微镜下读取
e)结果
根据本发明构建了三种Zip探针(SEQ ID NO:117、118和119)，它们被鉴定为与以下DNA序列杂交：AGCGTGCCTTCTCCCGAGAT ATG TAG GTG AAG CGA CTTGCTCCTTCGACTGATTTCAGCTCCAC(SEQ ID NO:120)，该序列对大肠杆菌核糖体RNA具有特异性。根据完整测定对样品进行分析(步骤diii(b))。细胞内富含核糖体的区域在荧光显微镜下显示出亮绿色荧光。图6和图7图示了由亮灰色荧光标识的富含核糖体的区域，示出了针对大肠杆菌的核糖体RNA的三种探针(SEQ ID NO:117、118和119)在严格的ZIP要求下共同工作。
表1：图1-图5中图示的序列
序列表
<110> 奇生物有限公司
<120> 用于靶检测的寡核苷酸探针的原位拼接
<130> P9211WO1
<150> GB1908481.3
<151> 2019-06-13
<160> 120
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列3h
<400> 1
cgtgaagtct tttggtgcat aaaatgtctg cttttatact aa 42
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列3
<400> 2
tagtataaaa gcagacattt tatgcaccaa aaga 34
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列4e
<400> 3
ccgcatgtcc tgtgggtcct gaaacattgc agttccttca c 41
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列4
<400> 4
gaactgcaat gtttcaggac ccacagga 28
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列5f
<400> 5
ggcgcctgca taactgtggt aactttctgg gtcgccatgc gg 42
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列5
<400> 6
gcgacccaga aagttaccac agttatgc 28
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列6k
<400> 7
accgtcaaat attatatcat gtatagttgt ttgcagctct gggcgcc 47
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列6
<400> 8
acagagctgc aaacaactat acatgatata atatt 35
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列7h
<400> 9
tcccctacag taactgttgc ttgcagtaca cacattcttg acggt 45
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列7
<400> 10
agaatgtgtg tactgcaagc aacagttact g 31
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列8d
<400> 11
ggcttgccga aaagcaaagt catatacctc acgtcgtagg gga 43
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列8
<400> 12
cgacgtgagg tatatgactt tgcttttcg 29
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列9e
<400> 13
atggattccc atctctatat actatgcata aatccgcaag cc 42
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列9
<400> 14
ggatttatgc atagtatata gagatgggaa tccat 35
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针3g
<400> 15
tcttttggtg cataaaatgt ctgcttttat actaaaggtc atg 43
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针4d
<400> 16
tgaccttcct gtgggtcctg aaacattgca gttcaatcaa act 43
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针5e
<400> 17
agtttgattt gcataactgt ggtaactttc tgggtcgcac tctagt 46
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针6j
<400> 18
tctagagtaa tattatatca tgtatagttg tttgcagctc tgcatg 46
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针7f
<400> 19
catgcagtaa ctgttgcttg cagtacacac attcccgcg 39
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针8c
<400> 20
cgcggcgaaa agcaaagtca tatacctcac gtcgagacgg 40
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针9d
<400> 21
ccgtctatgg attcccatct ctatatacta tgcataaatc caagggg 47
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列10
<400> 22
catttatcac atacagcat 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列10
<400> 23
atgctgtatg tgataaatg 19
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c1b
<400> 24
acgcgcataa agtgtatgtc gtatacctaa gggtagagat a 41
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c1b
<400> 25
tatctctacc cttaggtata cgacatacac tatt 34
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c2b
<400> 26
ggtactgcat attgatacgt atttagggct tttcgtttca gtatatgcgc gt 52
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c2b
<400> 27
catatactga aacgaaaagc cctaaatacg tatcata 37
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c3b
<400> 28
gtgggtacag tgcagcgtca ttgacaacga acgtcatgtg cagtacc 47
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c3b
<400> 29
catgacgttc gttgtcaatg acgctgcact c 31
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c4b
<400> 30
ccagggagtg tgtaagatta taatatagta catatcaaca aacgtgtacc cac 53
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c4b
<400> 31
acgtttgttg atatgtacta tattataatc ttacaca 37
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c5b
<400> 32
ccacggtacc gagacacgta ttgacaccat tgaaagactc cctgg 45
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c5b
<400> 33
tctttcaatg gtgtcaatac gtgtctcg 28
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c6b
<400> 34
ggtagggccc agcgaggaca cccaggactt tgtaagctgt accgtgg 47
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c6b
<400> 35
acgttacaaa gtcctgggtg tcctcgctgg g 31
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针序列c7b
<400> 36
caagagaaaa ccacgtattt tacagacgaa aaccctacc 39
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA靶序列c7b
<400> 37
ttttcgtctg taaaatacgt ggttttctct tg 32
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶3a
<400> 38
tagtataaaa gcagaca 17
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针3a'
<400> 39
tgtctgcttt tatacta 17
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶3b
<400> 40
ttttatgcac caaaaga 17
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针3b'
<400> 41
tcttttggtg cataaaa 17
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶4a
<400> 42
gaactgcaat gtttca 16
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针4a'
<400> 43
tgaaacattg cagttc 16
<210> 44
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶4b
<400> 44
ggacccacag ga 12
<210> 45
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针4b'
<400> 45
tcctgtgggt cc 12
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶5a
<400> 46
gcgacccaga aa 12
<210> 47
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针5a'
<400> 47
tttctgggtc gc 12
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶5b
<400> 48
gttaccacag ttatgc 16
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针5b'
<400> 49
gcataactgt ggtaac 16
<210> 50
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶6a
<400> 50
acagagctgc aaac 14
<210> 51
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针6a'
<400> 51
gtttgcagct ctgt 14
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶6b
<400> 52
aactatacat gatataatat t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针6b'
<400> 53
aatattatat catgtatagt t 21
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶7a
<400> 54
agaatgtgtg tactg 15
<210> 55
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针7a'
<400> 55
cagtacacac attc 14
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶7b
<400> 56
caagcaacag ttactg 16
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针7b'
<400> 57
cagtaactgt tgcttg 16
<210> 58
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶8a
<400> 58
cgacgtgagg tata 14
<210> 59
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针8a'
<400> 59
tatacctcac gtcg 14
<210> 60
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶8b
<400> 60
tgactttgct tttcg 15
<210> 61
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针8b'
<400> 61
cgaaaagcaa agtca 15
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶9a
<400> 62
ggatttatgc atagtata 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针9a'
<400> 63
tatactatgc ataaatcc 18
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶9b
<400> 64
tagagatggg aatccat 17
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半探针9b'
<400> 65
atggattccc atctcta 17
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 半靶10a
<400> 66
atgctgtatg tgataaat 18
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(3b+4a)
<400> 67
ttttatgcac caaaagagaa ctgcaatgtt tca 33
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针7'
<400> 68
tgaaacattg cagttctctt ttggtgcata aaa 33
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(4b+5a)
<400> 69
ggacccacag gagcgaccca gaaa 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针6'
<400> 70
tttctgggtc gctcctgtgg gtcc 24
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(5b+6a)
<400> 71
gttaccacag ttatgcacag agctgcaaac 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针5'
<400> 72
gtttgcagct ctgtgcataa ctgtggtaac 30
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(6b+7a)
<400> 73
aactatacat gatataatat tagaatgtgt gtactg 36
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针4'
<400> 74
cagtacacac attctaatat tatatcatgt atagtt 36
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(7b+8a)
<400> 75
caagcaacag ttactgcgac gtgaggtata 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针3'
<400> 76
tatacctcac gtcgcagtaa ctgttgcttg 30
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(8b+9a)
<400> 77
tgactttgct tttcgggatt tatgcatagt ata 33
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针2'
<400> 78
tatactatgc ataaatcccg aaaagcaaag tca 33
<210> 79
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA靶(9b+10a)
<400> 79
tagagatggg aatccatatg ctgtatgtga taaat 35
<210> 80
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针1'
<400> 80
atttatcaca tacagcatat ggattcccat ctcta 35
<210> 81
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针7'，具有帮助茎
<400> 81
accctgtgaa acattgcagt tctcttttgg tgcataaaa 39
<210> 82
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针6'，具有帮助茎
<400> 82
tttgagggtt tctgggtcgc tcctgtgggt cccagggt 38
<210> 83
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针5'，具有帮助茎
<400> 83
ggatgtgttt gcagctctgt gcataactgt ggtaacccct caaa 44
<210> 84
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针4'，具有帮助茎
<400> 84
cgtcacagta cacacattct aatattatat catgtatagt tacccat 47
<210> 85
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针3'，具有帮助茎
<400> 85
cgcgtatacc tcacgtcgca gtaactgttg cttgtgacg 39
<210> 86
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针2'，具有帮助茎
<400> 86
acgcgtatac tatgcataaa tcccgaaaag caaagtcacg cgggttc 47
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 得到的cDNA探针1'，具有帮助茎
<400> 87
atttatcaca tacagcatat ggattcccat ctctacgcgt 40
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Staaur探针序列
<400> 88
gcaagcttct cgtccgttcg c 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Staaur靶序列
<400> 89
gcgaacggac gagaagcttg c 21
<210> 90
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #1靶
<400> 90
ugcugcaacu uuauccgccu cc 22
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #1探针，具有茎
<400> 91
atgctgcatg gaggcggata aagttgcagc aatgcagcat 40
<210> 92
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #2靶
<400> 92
auccagucua uuaauuguug ccggg 25
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #2探针，具有茎
<400> 93
atgctgcatc ccggcaacaa ttaatagact ggatatgcag cat 43
<210> 94
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #3靶
<400> 94
aagcuagagu aaguaguucg ccag 24
<210> 95
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #3探针，具有茎
<400> 95
atgctgcatc tggcgaacta cttactctag cttatgcagc at 42
<210> 96
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #4靶
<400> 96
uuaauaguuu gcgcaacguu guugcc 26
<210> 97
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #4探针，具有茎
<400> 97
atgctgcatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaaatgca gcat 44
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #5靶
<400> 98
auugcugcag gcaucguggu g 21
<210> 99
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #5探针，具有茎
<400> 99
atgctgcatc accacgatgc ctgcagcaat atgcagcat 39
<210> 100
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #6靶
<400> 100
ucacgcucgu cguuugguau gg 22
<210> 101
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #6探针，具有茎
<400> 101
atgctgcatc cataccaaac gacgagcgtg aatgcagcat 40
<210> 102
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #7靶
<400> 102
cuucauucag cuccgguucc ca 22
<210> 103
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #7探针，具有茎
<400> 103
atgctgcatt gggaaccgga gctgaatgaa gaatgcagca t 41
<210> 104
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #8靶
<400> 104
acgaucaagg cgaguuacau gauc 24
<210> 105
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #8探针，具有茎
<400> 105
atgctgcatg atcatgtaac tcgccttgat cgtatgcagc at 42
<210> 106
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #9靶
<400> 106
ccccauguug ugcaaaaaag cgg 23
<210> 107
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #9探针，具有茎
<400> 107
atgctgcatc cgcttttttg cacaacatgg ggatgcagca t 41
<210> 108
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #10靶
<400> 108
uuagcuccuu cgguccuccg 20
<210> 109
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> β-内酰胺酶基因TEM-1 #10探针，具有茎
<400> 109
atgctgcatc ggaggaccga aggagctaaa tgcagcat 38
<210> 110
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c1
<400> 110
taaagtgtat gtcgtatacc taagggtaga gata 34
<210> 111
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c2
<400> 111
acgtatttag ggcttttcgt ttcagtatat gg 32
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c3
<400> 112
gtcattgaca acgaacgtca tgtgtgta 28
<210> 113
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c4
<400> 113
tgtgtgtaag attataatat agtacatatc aacaaacgtc g 41
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c5
<400> 114
agacacgtat tgacaccatt gaaagaccc 29
<210> 115
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c6
<400> 115
agcgaggaca cccaggactt tgtaacaaga g 31
<210> 116
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针c7
<400> 116
aaaaccacgt attttacaga cgaaaatatg att 33
<210> 117
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 大肠杆菌探针5'-1，具有茎: Atto-465
<400> 117
actcagtatc tcgggagaag gcacgctgat actgagt 37
<210> 118
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 大肠杆菌探针，具有茎: Atto-514
<400> 118
actcagtacg caagtcgctt cacctacata tcgtactgag t 41
<210> 119
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 大肠杆菌探针3'+1，具有茎: Atto-465
<400> 119
actcagtact ggagctgaaa tcagtcgaag gagtactgag t 41
<210> 120
<211> 64
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 120
agcgtgcctt ctcccgagat atgtaggtga agcgacttgc tccttcgact gatttcagct 60
ccac 64
Claims (26)
1.多重非信标、形成发夹环的核酸探针，能够原位与靶核酸序列形成拼接的杂交体，所述核酸探针包含：
与所述靶核酸序列互补的核酸序列；
包含第一检测部分的5’侧翼序列，和
包含第二检测部分的3’侧翼序列；
其中所述核酸探针能够与至少另一个相邻的核酸探针原位拼接形成多聚体，使得当所述核酸序列与所述靶序列结合时，所述核酸探针的所述5’侧翼序列与相邻探针的所述3’侧翼序列的至少一部分互连以形成茎，使得茎的所述第一检测部分和第二检测部分相互作用以产生信号。
2.根据权利要求1所述的多重核酸探针，其中所述发夹环的5’侧翼茎序列和/或3’侧翼茎序列不与所述靶核酸序列杂交。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多重核酸探针，其中由所述5’侧翼序列和3’侧翼序列形成的所述茎能够与存在的其他探针形成异源双链体，并且需要具有显著更低的负ΔG和低于对杂交靶的杂交温度的Tm值。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多重核酸探针，其中设计的探针包含与所述靶核酸序列互补的核酸序列，与所述靶核酸序列互补的所述核酸序列包含核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸类似物或其组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多重核酸探针，其中与所述靶核酸序列互补的所述核酸序列是DNA，并且所述5’侧翼序列和3’侧翼序列包含DNA类似物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多重核酸探针，其中所述靶核酸序列是DNA或RNA。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多重核酸探针，其中所述第一检测部分是激发子(a型探针)，并且所述第二检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)；或者其中所述第一检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)，并且所述第二检测部分是激发子(a型探针)。
8.一种组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项要求保护的多重核酸探针。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中相邻探针上与所述靶核酸序列互补的核酸序列被设计成在限定的杂交条件下仅以一个常规ΔG(+/-2kcal/mol)与所述靶核酸序列杂交。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中在选定的杂交温度，ΔG<0kcal/mol，特别地其中ΔG在-15kcal/mol和-35±5kcal/mol之间，更特别地ΔG在-24kcal/mol和-30kcal/mol之间。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中所述第一检测部分是激发子(a型探针)，并且所述第二检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)；或者其中所述第一检测部分是能够能量共振转移的分子(b型探针)，并且所述第二检测部分是激发子(a型探针)，使得这样的组合将a型探针和b型探针带到一起，从而使用FRET技术以产生信号。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中有效的能量共振转移仅在存在所述靶核酸序列的情况下是可能的，其中所述第一检测部分和第二检测部分彼此接近并且有效地发射可检测的光子。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中发射的光子的量允许直接定量，实现自动读取和摩尔定量。
14.根据权利要求8-11中任一项所述的组合物，包含在5’末端和3’末端二者携带相同荧光团的探针的基本上无缝的阵列，其中相邻的探针交替携带一个探针上的荧光团A、第二个探针上的荧光团B、第三个探针上的荧光团A、第四个探针上的荧光团B以此类推，其中仅当形成A/B对时才产生FRET依赖性信号。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中定量提供了确定样品中和细胞水平上病毒载量的手段。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的组合物，其中所述多重探针包括针对DNA和针对mRNA的探针。
17.根据权利要求8-16中任一项所述的组合物，其中所述多重探针包括针对DNA和针对cDNA的探针，特别地其中所述探针能够同时与感兴趣的编码DNA序列和互补DNA序列杂交。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中防止针对DNA和互补DNA的核酸探针原位自杂交，特别地其中针对互补的DNA和cDNA靶的两个探针之间的重叠在它们的ΔG值方面仅允许具有50％的重叠。
19.一种原位杂交方法，包括：
(a)使根据权利要求1-7中任一项所述的多重探针或权利要求8-18中任一项所述的多重核酸探针或组合物与生物样品接触；
(b)使(a)的所述核酸探针与所述样品杂交；
(c)诱导允许相邻探针之间形成茎并且有利于探针/靶杂交体复合物稳定的条件，其中所述茎允许所述检测部分的相互作用。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述探针序列应用于非破坏性测定。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述方法是均相测定。
22.权利要求1-7中任一项所述的多重核酸探针或权利要求8-18中任一项所述的组合物在权利要求19-21中任一项所述的方法中鉴定生物样品中一种或多于一种生物体的存在或不存在的用途。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述用途是诊断用途。
24.根据权利要求21或22所述的用途，其中所述生物体是病毒，例如HPV，特别地其中检测编码HPV E6蛋白或HPV E4蛋白的核酸。
25.根据权利要求21-23中任一项所述的用途，其中所述生物样品是任何生物来源的样品，诸如临床样品或食品样品。
26.一种试剂盒，所述试剂盒用于检测靶核酸，所述试剂盒包括权利要求1-7中任一项所述的多重核酸探针或权利要求8-17中任一项所述的多重核酸探针或组合物。
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