CN113993888A - 产生抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开报道了一种用于通过培养包含/转染了编码抗体(并表达所述抗体)的一种或多种(外源性)核酸的CHO细胞来产生IgG1抗体的方法，其中在编码重链可变结构域的所述核酸中去除非配对剪接位点，并且在编码重链恒定区的所述核酸中未去除这些非配对剪接位点。

Description

产生抗体的方法
本文报道了一种生产抗体的方法，其中编码核酸仅在编码可变结构域的那部分中针对供体剪接位点进行优化。
背景技术
Cannarozzi,G.等人报道了密码子顺序在翻译动力学中的作用(Cell 141(2010)355-367)。Plotkin,J.B.和Kudla,G.(Nat.Rev.Gen.12(2011)32-42)报道了密码子偏差的原因和后果。Weygand-Durasevic,I.和Ibba,M.报道了密码子使用的新作用(Science 329(2010)1473-1474)。Itzkovitz,S.等人报道了蛋白质编码序列中的重叠密码(Gen.Res.20(2010)1582-1589)。
在WO 97/11086中报道了蛋白质的高水平表达。在WO 03/70957中报道了植物多肽的产生。在WO 03/85114中，设计用于在宿主细胞中优化蛋白质表达的合成核酸序列的方法。在US 5,082,767中报道了密码子对优化。在WO2008/000632中，报道了一种实现改进的多肽表达的方法。WO 2007/142954和US 8,128,938中报道了密码子优化方法。
Watkins,N.E.等人报道了DNA双链体中脱氧肌苷对的最近邻热力学(Nucl.AcidsRes.33(2005)6258-6267)。
在WO 2013/156443中报道了使用经修饰核酸表达多肽的方法。
Zhang,M.Q.报道了人类外显子及其侧翼区域的统计特征(Hum.Mol.Genet.7(1998)919-932)。
mRNA的剪接受供体剪接位点与受体剪接位点出现的共同调控，它们分别位于内含子的5'末端和3'末端。根据Watson等人(Watson et al.(Eds),Recombinant DNA:A Shortcourse,Scientific American Books,distributed by W.H.Freeman and Company,NewYork,New York,USA(1983))是5'供体剪接位点ag|gtragt(外显子|内含子)和3'受体剪接位点(y)nNcag|g(内含子|外显子)的共有序列(r＝嘌呤碱基；y＝嘧啶碱基；n＝整数；N＝任何天然碱基)。
1980年发表了第一批关于分泌型和膜结合型免疫球蛋白起源的文章。分泌型(sIg)和膜结合型(mIg)同种型的形成源于重链前体mRNA的选择性剪接。在mIg同种型中，编码分泌型C-末端结构域(即分别为CH3或CH4结构域)的外显子中的供体剪接位点和位于其下游一定距离处的受体剪接位点用于将恒定区与下游编码跨膜结构域的外显子连接。
WO 2002/016944中报道了一种制备合成核酸分子的方法，该分子在特定宿主细胞中表达时具有减少的不当或非预期转录特征。WO 2006/042158中报道了经修饰核酸分子，以增强重组蛋白表达和/或减少或消除错误剪接和/或内含子通读副产物。Magistrelli,G.等人报道了通过密码子负优化(codon de-optimization)来优化天然双特异性抗体的组装和生产(MABS 9(2016)231-239)。
WO 2015/128509报道了用于选择表达多肽的宿主细胞的表达构建体和方法。
WO 2009/003623报道了一种导致免疫球蛋白产量提高的重链突变体。
发明内容
对于生产治疗性或诊断性抗体，高表达产量是目标。实现良好表达率的一种一般选择是首先通过将编码核酸的密码子使用调整到为旨在表达外源核酸的细胞的密码子使用来优化编码核酸的密码子使用。这种密码子调整或优化可以基于不同的既定方案进行。
但是在这样的密码子调整和优化过程中，例如非配对剪接位点，尤其是非配对供体剪接位点，可能会无意中从头产生。即，例如，在密码子优化过程中，通过在密码子优化的核酸内无意中产生遵循供体剪接位点共有序列的序列基序，在密码子使用优化的核酸中产生新的供体剪接位点序列。这种事件可以独立于密码子使用优化核酸的组织形式发生，即对于cDNA以及基因组组织形式的核酸都是可能的。它实际上是密码子使用优化过程的意外副作用。这种新的供体剪接位点是一个额外的人工供体剪接位点，它没有相关的靶受体剪接位点。因此，这种非配对的供体剪接位点可以引起随机的、即非限定的受体剪接位点存在于转录的mRNA中某处的剪接事件。因此，由于副产物的形成，表达产率降低。
本发明至少部分基于出乎意料的发现，即密码子使用优化的抗体重链编码核酸中非配对供体剪接位点的去除仅需要在所述核酸的编码重链可变结构域的那部分中但不在编码恒定区的那部分中进行，即对于恒定区，例如可以使用种系或野生型人核酸序列。从而具有正确长度的抗体重链的表达产率可以增加或成为可能。
本发明至少部分基于以下发现：仅在密码子优化的编码抗体重链可变结构域核酸中在非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化(突变)足以提高表达产量。
本发明的一个方面是通过培养包含/转染一种或多种(外源性)编码抗体重链和抗体轻链的核酸(并表达抗体)的哺乳动物细胞来生产抗体的方法，
其中所述一种或多种(外源性)核酸是针对人细胞的密码子使用和/或哺乳动物细胞的密码子使用而优化的密码子使用，
其中在编码重链可变结构域的核酸中，去除至少一个(人工)非配对供体剪接位点，并且任选地，在(人野生型或人或仓鼠密码子使用优化的)编码重链恒定区(人工)的核酸序列中不去除非配对供体剪接位点。
在一个实施例中，抗体是人IgG1亚类的抗体。在一个实施例中，抗体是人IgG1亚类的人源化抗体。在一个实施例中，抗体的恒定区包含适于诱导异二聚化或修饰Fc-受体结合的突变。
在一个实施例中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
在一个实施例中，所述转染为瞬时转染。
在一个实施例中，一种或多种(外源性)编码抗体的核酸都是cDNA。
在一个实施例中，一种或多种(外源性)编码抗体重链和/或抗体轻链的核酸是基因组组织形式的DNA，即具有内含子-外显子组织形式。
在一个实施例中，非配对供体剪接位点的去除是通过在氨基酸序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸沉默变化(突变)。在一个实施例中，在SEQ ID NO:01的密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化。
在一个实施例中，密码子使用优化基于人类密码子使用或基于中国仓鼠密码子使用进行。
在一个实施例中，编码抗体轻链的核酸是密码子使用优化的，即可变结构域和恒定区是密码子使用优化的。
在一个实施例中，在完整的轻链编码核酸中去除非配对供体剪接位点。
在一个实施例中，转染为稳定转染。
在一个实施例中，该方法包括以下步骤：
a)培养哺乳动物细胞，和
b)从所述细胞或培养基中回收所述抗体，
本发明的一个方面是仅在人或仓鼠密码子使用优化的编码抗体的核酸序列的一部分中去除非配对供体剪接位点的用途，用于减少错误剪接或/和当所述核酸用于在CHO细胞中产生抗体时增加抗体表达产量，其中该部分是编码重链可变结构域的那部分。
在一个实施例中，未去除所述核酸的编码重链恒定区的那部分中的非配对供体剪接位点。
在一个实施例中，进一步在所述核酸的编码轻链的那部分中去除非配对供体剪接位点。
在一个实施例中，非配对剪接位点的去除是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQID NO：01)中引入氨基酸沉默突变。
在一个实施例中，非配对剪接位点的去除是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQID NO：01)中，在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)处引入氨基酸沉默突变。
在所有方面和实施例的一个实施例中，非配对(供体)剪接位点是人工非配对(供体)剪接位点。
在所有方面和实施例的一个实施例中，非配对(供体)剪接位点是人工非配对(供体)剪接位点并且已经在密码子优化期间产生。
具体实施方式
对于生产治疗性或诊断性抗体，高表达产量是目标。实现良好表达率的一种选择是首先优化编码核酸的密码子使用，然后将其调整为旨在表达外源核酸的细胞的密码子使用。这种密码子调整或优化可以基于不同的既定协议来完成。
但是在这样的密码子调整和优化过程中，例如可以从头生成非配对剪接位点。即，在密码子优化期间，在密码子使用优化的核酸中产生新的供体剪接位点序列。这与密码子使用优化核酸的组织形式无关，即cDNA或基因组组织形式的核酸都是可能的。它实际上是密码子使用优化过程的意外副作用。由于这样一个新的供体剪接位点是额外的人工供体剪接位点，它没有相关的靶受体剪接位点。因此，这种非配对的供体剪接位点可以引起随机的、即非限定的受体剪接位点存在于转录的mRNA中某处的剪接事件。从而降低表达产量。
本发明至少部分基于出乎意料的发现，即密码子使用优化的抗体重链编码核酸中非配对供体剪接位点的去除仅需要在所述核酸的编码重链可变结构域的那部分中但不在编码恒定区的那部分中进行，即对于恒定区，例如可以使用种系或野生型人核酸序列。
本发明至少部分基于以下发现：仅在密码子优化的编码抗体重链可变结构域核酸中在非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化(突变)足以提高表达产量。
定义
用于实施本发明的方法和技术是本领域技术人员已知的，并且例如描述于Ausubel,F.M.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997),and Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。如本领域技术人员所知，能够使用重组DNA技术生产核酸和/或多肽的多种衍生物。此类衍生物可以例如在单个或几个位置处通过取代、改变、交换、缺失或插入来加以修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如，Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,USA)。重组技术的使用使本领域技术人员能够用异源核酸转化各种宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译(即表达机制)使用相同的元件，但属于不同物种的细胞可能具有不同的所谓密码子使用等。因此，相同的多肽(对于氨基酸序列)可以由不同的核酸编码。此外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
术语“大约”表示其后的值不是精确值，而是值的+/-10％或值的+/-5％或值的+/-2％或值的+/-1％范围的中心点。如果该值是以百分比给出的相对值，则术语“大约”还表示其后的值不是精确值，而是值的+/-10％或值的+/-5％的或值的+/-2％或值的+/-1％的范围的中心点，其中范围的上限不能超过100％的值。
本申请中使用的术语“氨基酸”表示羧基α氨基酸组，其可以直接或以前体形式由核酸编码。单个氨基酸由由三个核苷酸组成的核酸即所谓的密码子或碱基三联体编码。每个氨基酸由至少一个密码子编码。不同密码子对同一氨基酸的编码被称为“遗传密码的简并”。如本申请中所用的术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸，并且包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
本文中的术语“免疫球蛋白”以最广泛的含义使用并涵盖各种免疫球蛋白结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体以及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其包含至少部分恒定结构域或区域的片段。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”表示由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。该定义包括诸如突变形式的变体，即具有一个或多个氨基酸的取代、缺失和插入的形式、N-末端截短的形式、融合形式、嵌合形式以及人源化形式。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及来自例如灵长类动物(包括人类)和啮齿动物的无数免疫球蛋白可变区基因。优选单克隆免疫球蛋白。免疫球蛋白的重多肽链和轻多肽链中的每一者都包含恒定区(通常是羧基末端部分)。
本文所使用的术语“单克隆免疫球蛋白”是指从基本上同质的免疫球蛋白群中获得的免疫球蛋白，例如，除了可能存在的少量天然存在的突变，该免疫球蛋白群包含的单个免疫球蛋白是相同的。单克隆免疫球蛋白对单个抗原位点具有高特异性。此外，与包括针对不同抗原性位点(决定簇或表位)的不同抗体的多克隆免疫球蛋白制剂相反，每种单克隆免疫球蛋白针对抗原上的单一抗原性位点。除特异性以外，单克隆免疫球蛋白的优势还在于它们可以在不受其他免疫球蛋白污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示免疫球蛋白的特征是从基本上同质的免疫球蛋白群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生免疫球蛋白。
术语“密码子”表示由编码确定氨基酸的三个核苷酸组成的寡核苷酸。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由多于一个密码子编码。这些编码同一氨基酸的不同密码子在单个宿主细胞中具有不同的相对使用频率。因此，特定氨基酸由恰好一个密码子或由一组不同密码子编码。同样，多肽的氨基酸序列可由不同的核酸编码。因此，多肽中的特定氨基酸(残基)可由一组不同的密码子编码，由此这些密码子中的每一个在给定的宿主细胞内具有使用频率。
由于大量基因序列可用于许多常用宿主细胞，因此可以计算密码子使用的相对频率。计算的密码子使用表可从例如"Codon Usage Database"(www.kazusa.or.jp/codon/),Nakamura,Y.,et al.,Nucl.Acids Res.28(2000)292获得。
智人和仓鼠的密码子使用表已获自“EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite"(Rice,P.,et al.,Trends Gen.16(2000)276-277,Release 6.0.1,15.07.2009)，如下表所示。大肠杆菌、酵母、人类细胞和CHO细胞的20种天然氨基酸的不同密码子使用频率是针对每种氨基酸计算的，而不是针对所有64种密码子。
表：智人整体密码子使用频率
(编码的氨基酸|密码子|使用频率[％])
Figure BDA0003423434240000081
表：仓鼠整体密码子使用频率
(编码的氨基酸|密码子|使用频率[％])
Figure BDA0003423434240000091
如本文所用，术语“表达”是指在细胞内发生的转录和/或翻译过程。细胞中目标核酸序列的转录水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量来确定。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过RT-PCR(qRT-PCR)或通过Northern杂交(参见Sambrook,J.,et al.,1989，同上)进行定量。由目的核酸编码的多肽可以通过多种方法定量，例如，通过ELISA，通过测定多肽的生物学活性，或采用与此活性无关的测定，例如蛋白印迹法或放射免疫测定法，使用识别和结合多肽的免疫球蛋白(参见Sambrook,J.,et al.,1989，同上)。
“表达盒”是指包含必要的调控元件，例如启动子和聚腺苷酸化位点的构建体，用于在细胞中至少表达所包含的核酸。
基因的表达以瞬时或永久表达的形式进行。目的多肽通常是分泌的多肽，因此含有N-末端延伸(也称为信号序列)，这是多肽通过细胞膜转运/分泌到细胞外介质中所必需的。通常，信号序列可以源自编码分泌多肽的任何基因。如果使用异源信号序列，则其优选是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的异源信号序列。例如，对于酵母中的分泌，待表达的异源基因的天然信号序列可以被源自分泌基因的同源酵母信号序列取代，例如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和汉逊酵母属α-因子前导序列，第二个描述于US 5,010,182)、酸性磷酸酶信号序列或白色念珠菌葡糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞表达中，目标蛋白质的天然信号序列是令人满意的，尽管其他哺乳动物信号序列可能是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列(如对于人或鼠来源的免疫球蛋白)，以及病毒分泌信号序列，例如单纯疱疹糖蛋白D信号序列。编码这种前段的DNA片段在框内连接，即可操作地连接到编码目的多肽的DNA片段。
术语“细胞”或“宿主细胞”是指其中可以转染或转染了核酸(例如编码异源多肽核酸)的细胞。术语“细胞”包括用于表达核酸和生产编码的多肽(包括质粒的增殖)的原核细胞和用于表达核酸和生产编码的多肽的真核细胞。在一个实施例中，真核细胞为哺乳动物细胞。在一个实施例中，哺乳动物细胞是CHO细胞，任选地CHO K1细胞(ATCC CCL-61或DSMACC 110)，或CHO DG44细胞(也称为CHO-DHFR[-],DSM ACC 126)，或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan,D.,et al.,Biochemistry 26(1987)2959-2963)，或CHO-S细胞，或Super-CHO细胞(Pak,S.C.O.,et al.Cytotechnology 22(1996)139-146)。如果这些细胞不适合在无血清培养基或悬浮液中生长，则在用于当前方法之前进行调整。如本文所用，表述“细胞”包括受试细胞及其后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和不考虑转移或亚培养的次数从该细胞衍生的培养物。还应当理解，由于故意的或非故意的突变，所有后代可能在DNA含量上不是精确地相同的。包括如在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的变体子代。
术语“密码子优化的核酸”表示已经调整用于改善细胞(例如哺乳动物细胞)中的表达的编码多肽的核酸，通过用(例如在细胞中具有不同的相对使用频率)编码相同氨基酸残基的密码子替换亲本多肽编码核酸中的一个、至少一个或多于一个密码子。
如本文所用，术语“非配对供体剪接位点”表示一方面已在核酸序列内人工产生(例如通过核酸序列的密码子优化)的供体剪接位点，另一方面由于其人工引入到核酸序列中，在核酸序列下游没有连接的受体剪接位点。虽然符合供体剪接位点共有序列，但它不遵循(生物)剪接原理，即在加工过程中切除不需要的核酸部分。
“基因”表示作为片段的核酸，其例如在染色体或质粒上，可以影响肽、多肽或蛋白质的表达。除了编码区，即结构基因，基因还包含其他功能元件，例如信号序列、启动子、内含子和/或终止子。
术语“密码子组”及其语义等价物表示编码一个(即相同)氨基酸残基的限定数量的不同密码子。一组的个体密码子在细胞基因组中的总体使用频率不同。一组密码子中的每个密码子在组内都有特定的使用频率，这取决于组中密码子的数量。该组内的特定使用频率可以不同于细胞基因组中的整体使用频率，但取决于(与其相关)整体使用频率。一组密码子可以仅包含一个密码子，但也可以包含多达六个密码子。
术语“细胞基因组中的总体使用频率”表示特定密码子在细胞的整个基因组中的出现频率。
一组密码子中密码子的“特定使用频率”这一术语表示一组密码子中的单个(即特定的)密码子相对于一组密码子的所有密码子可以在编码用本文报道的方法获得的多肽的核酸中发现的频率。特定使用频率的值取决于特定密码子在细胞基因组中的整体使用频率和组内密码子的数量。因此，由于一组密码子不一定包含编码一个特定氨基酸残基的所有可能密码子，一组密码子中密码子的特定使用频率至少与其在细胞基因组中的总体使用频率相同，并且最多100％，即它至少是相同的，但如果某些使用频率低的密码子被排除在该组之外，则它可以高于细胞基因组中的整体使用频率。一组密码子的所有成员的特定密码子使用频率的总和始终约为100％。
术语“氨基酸密码子基序”表示密码子序列，它们都是同一组密码子的成员，因此编码相同的氨基酸残基。氨基酸密码子基序中不同密码子的数量与一组密码子中不同密码子的数量相同，但每个密码子可以在氨基酸密码子基序中出现多次。此外，每个密码子都以其特定的使用频率存在于氨基酸密码子基序中。因此，氨基酸密码子基序代表编码相同氨基酸残基的不同密码子的序列，其中每个不同密码子以其特定使用频率存在，其中该序列以具有最高特定使用频率的密码子开始，并且其中密码子按限定的顺序排列。例如，编码氨基酸残基丙氨酸的密码子组包括四个密码子GCG、GCT、GCA和GCC，具体使用频率分别为32％、28％、24％和16％(对应于4:3:3:2比例)。氨基酸残基丙氨酸的氨基酸密码子基序定义为包含比例为4:3:3:2的四个密码子GCG、GCT、GCA和GCC，其中第一密码子为GCG。丙氨酸的一种示例性氨基酸密码子基序是gcg gct gca gcc gcg gct gca gcc gcg gct gca gcg(SEQ ID NO:06)。该基序由十二个连续密码子(4+3+3+2＝12)组成。当氨基酸残基丙氨酸在多肽的氨基酸序列中第一次出现时，氨基酸密码子基序的第一密码子用于相应的编码核酸。在第二次出现丙氨酸时，使用氨基酸密码子基序的第二密码子，依此类推。在多肽的氨基酸序列中第十三次出现丙氨酸时，在相应的编码核酸中使用位于氨基酸密码子基序的第十三位，即最后一个位置的密码子。在多肽的氨基酸序列中第十三次出现氨基酸丙氨酸时，再次使用氨基酸密码子基序的第一密码子，依此类推。
“核酸”或“核酸序列”，这些术语在本申请中可互换使用，是指由单个核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或RNA中的u)组成的聚合分子，例如DNA、RNA或它们的修饰和混合物。该多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。该定义还包括天然存在的多核苷酸分子，其中一个或多个核苷酸被改变(例如通过诱变)、缺失或添加。核酸可以是分离的，也可以整合到另一种核酸中，例如在表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其由单个核苷酸组成的核酸序列。
对于本领域的技术人员而言，将(例如多肽的)氨基酸序列转化为相应的编码该氨基酸序列的核酸序列的程序和方法是众所周知的。因此，核酸的特征在于其核酸序列由单独的核苷酸组成，并且特征同样在于由其编码的多肽的氨基酸序列。
“结构基因”表示没有信号序列的基因区域，即编码区。
“转染载体”是核酸(也称为核酸分子)，其提供包含编码核酸/结构基因的转染载体在宿主细胞中表达的所有必需元件。转染载体包含原核质粒增殖单元(例如对于大肠杆菌)，又包含原核复制起点和赋予原核选择剂抗性的核酸，进一步包含转染载体、一种或多种赋予真核选择剂抗性的核酸和一种或多种编码目标多肽的核酸。优选地，赋予选择剂抗性的核酸和编码目的多肽的核酸各自置于表达盒内，由此每种表达盒包含启动子、编码核酸和包括聚腺苷酸化信号的转录终止子。基因表达通常处于启动子的控制之下，这种结构基因被称为“可操作地连接到”启动子。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子可操作地连接。
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链，每条全长抗体轻链在N-末端至C-末端方向包含轻链可变区和轻链恒定结构域，每条全长抗体重链在N-末端至C-末端方向包含重链可变区、第一重链恒定结构域、铰链区、第二重链恒定结构域和第三重链恒定结构域。与天然抗体相反，全长抗体可包含与全长抗体不同链的一个或多个末端缀合的另外的免疫球蛋白结构域，例如一种或多种额外的scFv、或重链或轻链Fab片段、或scFab，但每个末端仅缀合单个片段。这些缀合物也为术语全长抗体所涵盖。
抗体的“类别”是指抗体的重链，优选地Fc-区所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“重链恒定区”表示免疫球蛋白重链中包含恒定结构域的区域，即CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施例中，人IgG恒定区从Ala118延伸至重链的羧基末端(根据Kabat EU索引编号)。然而，恒定区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在(根据Kabat EU索引编号)。术语“重链恒定区”表示包含两个重链恒定区的二聚体，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
术语“轻链恒定区”表示免疫球蛋白轻链中包含恒定结构域，即CL结构域的区域。
术语“恒定区”包括“重链恒定区”和“轻链恒定区”。
术语“重链Fc-区”表示免疫球蛋白重链的C末端区，其包含铰链区的至少一部分(中和下铰链区)、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施例中，人IgG重链Fc-区从Asp221或从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端(根据Kabat EU索引编号)。因此，Fc-区比恒定区小但在C-末端部分与其相同。然而，重链Fc-区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在也可以不存在(根据Kabat EU索引编号)。术语“Fc-区”表示包含两个重链Fc-区的二聚体，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
抗体的恒定区，更准确地说是Fc-区(以及同样地恒定区)直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中限定的结合位点引起。此类结合位点在现有技术中是已知的，并且例如，由Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434所述。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化、C1q结合和C3活化作用，而IgG4则不活化补体系统，不结合C1q并且不活化C3。“抗体的Fc区”是技术人员所熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。
剪接
不同人免疫球蛋白的恒定区氨基酸序列由相应的DNA序列编码。在基因组中，这些DNA序列包含编码(外显子)和非编码(内含子)序列。在DNA转录为前体mRNA后，前体mRNA还包含这些内含子和外显子序列。在翻译之前，非编码内含子序列在mRNA加工过程中通过将它们从初级mRNA转录本中剪接去除以产生成熟的mRNA。初级mRNA的剪接由供体剪接位点和适当间隔的受体剪接位点共同控制。供体剪接位点位于内含子序列的5'末端，受体剪接位点位于内含子序列的3'末端。
术语“适当间隔开”表示核酸中的供体剪接位点和受体剪接位点的排列方式使得剪接过程所需的所有元件都可用并且处于适当的位置以允许剪接过程发生。
供体剪接位点(5'剪接位点)是代表内含子5'末端的核酸序列基序。
受体剪接位点(3'剪接位点)是代表内含子3'末端的核酸序列基序。
密码子优化：
重组抗体的产生至少是基于天然存在的野生型或种系序列的恒定区。为了防止这些DNA模板的生物学限制，例如RNA不稳定性、核输出效率低下、二级结构、或翻译率不足，使用生物信息学技术进行基因优化以及随后基于蛋白质序列的基因从头合成[10]。因此，可以避免复杂且耗时的克隆步骤，并且如近年来所示，通过对生产系统的密码子使用进行此类调整，可以提高翻译率[10]。对于密码子优化，高GC含量、避免剪接位点和密码子使用调整对生产生物体起着核心作用。已经建立了几种方法来检查特定密码子的使用和频率。众所周知，编码相同氨基酸的tRNA会相互竞争。一方面，识别多个密码子的多价tRNA更常见，另一方面，不同的tRNA种类以不同的频率表达。因此，由更丰富的tRNA编码的密码子也更频繁地出现在编码序列中[11]。在表1中显示了应用密码子使用调整/优化的三种可能方法。
表1：
Figure BDA0003423434240000161
一种方法的密码子使用旨在使整个tRNA库可用于翻译，即方法2。与仅使用最丰富的密码子翻译成氨基酸的“高”方法相比，使用所有可用的密码子。与方法1相比，方法2还考虑了在每个生物体的密码子使用中使用的密码子的分布，并在序列内分配密码子[11]。
剪接位点：
真核生物中几乎所有编码蛋白质的基因都分为外显子和内含子。目前，已知12种外显子变体[12]。剪接是在转录过程中从前体mRNA中切除内含子。正确剪接基于分别位于内含子和所谓分支位点的5'-和3'-末端的保守共有序列。分支位点位于内含子3'末端上游约20-50个核苷酸处[12]。在内含子的5'末端是具有特征性二核苷酸GT的供体剪接位点。在3'端是受体剪接位点，位于碱基AG[13]。该模式称为剪接位点的经典模式。然而，3.7％的注释剪接位点不遵循这种模式[14]。还观察到内含子内带有GC-AG、GG-AG、GT-TG、GT-CG或CT-AG二核苷酸的剪接位点[14]。其中一些非经典剪接位点可能与免疫球蛋白的表达有关[15]。根据Burset等人的说法，二核苷酸GC-AG剪接位点是最常见的非经典模式。此外，共有序列强烈依赖于GC含量[12]。在高GC含量下，5'末端的供体共有序列被描述为AG/GTRAGT(SEQ ID NO:02)，而不是如在低GC含量下被描述为AG/GTAAGT(SEQ ID NO:03)[12]。
内含子通过剪接体切割。那些位于经典GT-AG对两侧的内含子由具有U1、U2、U4/U6和U5亚基的剪接体从前体mRNA中释放出来[16]。此外，众所周知，真核基因组具有多种对正确剪接产生不利影响的隐蔽剪接位点。这些不同于剪接位点的共有基序。通常，这些位点不活跃或很少被细胞机器使用[17]、[18]。内含子和外显子中都存在隐蔽剪接位点。生物信息学程序的目标是识别这些神秘剪接位点的位置。其中许多程序提供信息，但由于存在多种可能性，因此不如核苷酸信息的复杂性[22]。
根据本发明的方法的具体实施例
对于生产治疗性或诊断性抗体，高表达产量是目标。实现良好表达率的一种选择是首先优化编码核酸的密码子使用，然后将其调整为旨在表达外源核酸的细胞的密码子使用。这种密码子调整或优化可以基于不同的既定协议来完成。
但是在这样的密码子调整和优化过程中，例如可以从头生成非配对剪接位点。即，在密码子优化期间，在密码子使用优化的核酸中产生新的供体剪接位点序列。这与密码子使用优化核酸的组织形式无关，即cDNA或基因组组织形式的核酸都是可能的。它实际上是密码子使用优化过程的意外副作用。由于这样一个新的供体剪接位点是额外的人工供体剪接位点，它没有相关的靶受体剪接位点。因此，这种非配对的供体剪接位点可以引起随机的、即非限定的受体剪接位点存在于转录的mRNA中某处的剪接事件。从而降低表达产量。
本发明至少部分基于出乎意料的发现，即密码子使用优化的抗体重链编码核酸中非配对供体剪接位点的去除仅需要在所述核酸的编码重链可变结构域的那部分中但不在编码恒定区的那部分中进行，即对于恒定区，例如可以使用种系或野生型人核酸序列。
本发明至少部分基于以下发现：仅在密码子优化的编码抗体重链可变结构域核酸中在非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化(突变)足以提高表达产量或允许表达所述抗体。
本发明至少部分基于以下发现：非配对供体剪接位点的去除只需要在编码重链可变结构域而非恒定区的核酸中进行，即对于恒定区，可以使用野生型序列、种系序列或用(例如WO 2013/15644中报道的)标准方法优化的序列。
本发明至少部分基于以下发现：通过使用根据本发明的方法与轻链可以提高表达产率。
本发明基于SEQ ID NO:01的供体共有序列的使用：NGGTA(G)AG。该序列已被Zhanget al.1998鉴定，但未发现用于密码子优化协议。
二核苷酸GT标志着内含子的开始，从而标志着剪接位点。其后的碱基可以是腺嘌呤或鸟嘌呤。
另一个可以考虑的参数是该序列中允许的错配数量，以便调整方法的灵敏性和严格性。
共有受体剪接序列具有SEQ ID NO:04的序列：[CT]n N[CT]AG，其中N＝任何碱基，n＝CT二核苷酸的数量。Zhang 1998也已经鉴定了这个序列。
下面用具体抗体举例说明根据本发明的方法。这些实例不应理解为对本发明的限制。这些仅作为根据本发明的普遍适用的方法的示例而呈现。
在下表2中，总结了不同处理的抗体重链和/或轻链编码核酸的表达产率。结果是通过使用两个质粒系统在HEK293细胞中的瞬时表达获得的。
构建体“00”是起始核酸。
构建体“00”-“06”和“16”已经用来自WO 2013/156443的本领域已知方法＝参考现有技术方法进行了密码子优化。
构建体“07”-“11”和“17”已经根据本发明进行处理，即来自WO2013/156443的参考现有技术方法，并且基于SEQ ID NO:01的共有基序去除供体剪接位点。
构建体“12”-“15”已由商业供应商Geneart使用不同于WO 2013/156443的方法作为第二个参考现有技术方法进行密码子优化。
术语“hu”表示使用了人密码子，而术语“CHO”表示使用了中国仓鼠密码子。
表2：
Figure BDA0003423434240000191
Figure BDA0003423434240000201
从数据可以看出以下几点：
对于轻链：
-当使用基因组组织形式时，根据本发明的处理导致相当的表达产量，
Figure BDA0003423434240000202
-使用cDNA通常会提高表达产量，
Figure BDA0003423434240000203
-当使用cDNA时，根据本发明的处理在大多数情况下导致表达产量增加，在其他情况下表达产量相当，
Figure BDA0003423434240000204
Figure BDA0003423434240000211
对于重链：
-当使用基因组组织形式时，如果至少重链可变结构域被优化，则根据本发明的处理导致表达产量增加或允许表达，
Figure BDA0003423434240000212
-使用cDNA通常会提高表达产量。
Figure BDA0003423434240000213
Figure BDA0003423434240000221
-当使用cDNA时，根据本发明对重链恒定区的处理似乎不会进一步增加表达产量，
-当使用cDNA时，根据本发明的处理导致进一步增加表达产量，
Figure BDA0003423434240000222
因此，如本文所报告的一个方面是一种用于生产免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
-培养哺乳动物细胞，优选CHO细胞，其包含具有编码人IgG1亚类的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的内含子-外显子组织形式的核酸，从而表达免疫球蛋白，
-从细胞或培养基中回收免疫球蛋白，从而生产免疫球蛋白，
其中在所述核酸的编码免疫球蛋白重链可变结构域的那部分中，通过在非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)处引入氨基酸序列沉默核苷酸变化来去除根据SEQ ID NO:01的非配对供体剪接位点。
参考密码子优化方法
可以优化编码免疫球蛋白的核酸，例如通过根据WO 2013/156443中报道的方法调整一般密码子使用。
所述参考方法基于以下发现：为了在细胞中表达多肽，使用多肽编码核酸，其特征在于每个氨基酸由一组密码子编码，其中这组密码子中的每个密码子由组内的特定使用频率定义，该组内的特定使用频率与该密码子在细胞基因组中的总体使用频率相关，并且由此密码子在(总)多肽编码核酸中的使用频率大致与各自组内的使用频率相同。
所述参考方法是在哺乳动物细胞中重组生产多肽的方法，包括培养包含编码多肽的核酸的细胞，并从哺乳动物细胞或培养基中回收多肽的步骤，
其中多肽的每个氨基酸残基由一个或多个(至少一个)密码子编码，由此编码相同氨基酸残基的(不同)密码子组合在一个组中并且在一个组中的每个密码子由组内的特定使用频率定义，该频率是可以在编码多肽的核酸中发现的一组密码子的单个密码子相对于一组的所有密码子的频率，其中一组中所有密码子的特定使用频率总和为100％，
其中多肽编码核酸中每个密码子的总体使用频率与其在其组内的特定使用频率大致相同。
在一个实施例中，氨基酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D和E各自由一组密码子编码，并且氨基酸残基M和W由单个密码子编码。
在一个实施例中，氨基酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D和E各自由一组密码子(包含至少两个密码子)编码，并且氨基酸残基M和W由单个密码子编码。
在一个实施例中，如果氨基酸残基恰好由一个密码子编码，则该密码子的特定使用频率是100％。
在一个实施例中，氨基酸残基G由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基A由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基V由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基L由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基I由一组至多3个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基M恰好由1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基P由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基F由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基W恰好由1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基S由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基T由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基N由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Q由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Y由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基C由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基K由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基R由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基H由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基D由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基E由一组至多2个密码子编码。
在一个实施例中，氨基酸残基G由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基A由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基V由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基L由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基I由一组1至3个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基M由一组1个密码子即恰好1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基P由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基F由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基W由一组1个密码子即恰好1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基S由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基T由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基N由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Q由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Y由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基C由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基K由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基R由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基H由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基D由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基E由一组1至2个密码子编码。
在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率大于5％的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为8％或更大的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为10％或更大的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为15％或更大的密码子。
在一个实施例中，编码特定氨基酸残基的多肽的核酸在5'至3'方向的的密码子序列是，即对应于，各个氨基酸密码子基序中的密码子序列。
在一个实施例中，对于从多肽的N末端开始的多肽中特定氨基酸的每次连续出现，编码核酸包含的密码子与相应特定氨基酸密码子基序中相应连续位置处的密码子相同，其中在多肽的氨基酸序列中第一次出现氨基酸残基时，氨基酸密码子基序的第一密码子用于相应的编码核酸中，在第二次出现该氨基酸残基时，使用氨基酸密码子基序的第二密码子，依此类推。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中密码子的使用频率与其在其组内的特定使用频率大致相同。
在一个实施例中，在到达氨基酸密码子基序的最终密码子后，多肽中特定氨基酸下次出现时，编码核酸包含位于氨基酸密码子基序第一个位置的密码子。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子在整个氨基酸密码子基序中随机分布。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序选自一组氨基酸密码子基序，该组氨基酸密码子基序包含通过调换其中的密码子可获得的所有可能的氨基酸密码子基序，其中所有基序具有相同数量的密码子并且每个基序中的密码子具有相同的特定使用频率。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子以递减的特定使用频率排列，由此同一个使用频率的所有密码子直接相互接替。在一个实施例中，同一个密码子使用频率的密码子被分组在一起。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的(不同)密码子在整个氨基酸密码子基序中均匀分布。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子以递减的特定使用频率排列，从而在具有最低特定使用频率的密码子或具有第二低特定使用频率的密码子之后存在(使用)具有最高特定使用频率的密码子。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子以递减的特定使用频率排列，从而在具有最低特定使用频率的密码子之后存在(使用)具有最高特定使用频率的密码子。
因此，编码多肽的核酸的特征在于多肽的每个氨基酸残基由一个或多个(至少一个)密码子编码，
由此编码相同氨基酸残基的不同密码子组合在一个组中并且在一个组中的每个密码子由组内的特定使用频率定义，该频率是可以在编码多肽的核酸中发现的一组密码子的单个密码子相对于一组的所有密码子的频率，其中一组中所有密码子的特定使用频率总和为100％，
其中多肽编码核酸中密码子的使用频率与其在其组内的特定使用频率大致相同。
在一个实施例中，氨基酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D和E各自由一组密码子编码，并且氨基酸残基M和W由单个密码子编码。
在一个实施例中，氨基酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D和E各自由一组密码子(包含至少两个密码子)编码，并且氨基酸残基M和W由单个密码子编码。
在一个实施例中，如果氨基酸残基恰好由一个密码子编码，则该密码子的特定使用频率是100％。
在一个实施例中，氨基酸残基G由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基A由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基V由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基L由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基I由一组至多3个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基M恰好由1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基P由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基F由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基W恰好由1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基S由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基T由一组至多4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基N由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Q由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Y由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基C由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基K由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基R由一组至多6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基H由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基D由一组至多2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基E由一组至多2个密码子编码。
在一个实施例中，氨基酸残基G由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基A由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基V由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基L由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基I由一组1至3个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基M由一组1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基P由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基F由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基W由一组1个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基S由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基T由一组1至4个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基N由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Q由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基Y由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基C由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基K由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基R由一组1至6个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基H由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基D由一组1至2个密码子编码。在一个实施例中，氨基酸残基E由一组1至2个密码子编码。
在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率大于5％的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为8％或更大的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为10％或更大的密码子。在一个实施例中，这些组的每一组仅包含在细胞基因组内总使用频率为15％或更大的密码子。
在一个实施例中，编码特定氨基酸残基的多肽的核酸在5'至3'方向的的密码子序列是，即对应于，各个氨基酸密码子基序中的密码子序列。
在一个实施例中，对于从多肽的N末端开始的多肽中特定氨基酸的每次连续出现，编码核酸包含的密码子与相应特定氨基酸密码子基序中相应连续位置处的密码子相同，其中在多肽的氨基酸序列中第一次出现氨基酸残基时，氨基酸密码子基序的第一密码子用于相应的编码核酸中，在第二次出现该氨基酸残基时，使用氨基酸密码子基序的第二密码子，依此类推。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中密码子的使用频率与其在其组内的特定使用频率大致相同。
在一个实施例中，在到达氨基酸密码子基序的最终密码子后，多肽中特定氨基酸下次出现时，编码核酸包含位于氨基酸密码子基序第一个位置的密码子。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的每个密码子随机分布在整个氨基酸密码子基序中。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的每个密码子均匀分布在整个氨基酸密码子基序中。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子以递减的特定使用频率排列，从而在具有最低特定使用频率的密码子或具有第二低特定使用频率的密码子之后使用具有最高特定使用频率的密码子。
在一个实施例中，氨基酸密码子基序中的密码子以递减的特定使用频率排列，从而在具有最低特定使用频率的密码子之后使用具有最高特定使用频率的密码子。
因此，根据本发明的方法是一种增加多肽在真核细胞中表达的方法，包括以下步骤，
-提供编码多肽的核酸，
其中多肽的每个氨基酸残基由至少一个密码子编码，由此将编码相同氨基酸残基的不同密码子组合成一个组，并且一个组中的每个密码子由该组内的特定使用频率定义，其中一组中所有密码子的特定使用频率总和为100％，
其中多肽编码核酸中密码子的使用频率与其在其组内的特定使用频率大致相同，
其中从编码重链可变结构域的核酸中去除根据SEQ ID NO：01的共有序列的供体剪接位点。
重组方法
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。抗体编码核酸可编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一个实施例中，表达含有免疫球蛋白恒定区的多肽的细胞已经用一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)转染。在一个实施例中，提供了一种细胞，其包含用本文报道的方法修饰的这种核酸。在一个实施例中，细胞包含以下(例如已被用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含核酸，所述核酸编码抗体的VL的氨基酸序列，所述第二载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施例中，细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施例中，提供了一种制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包括本文提供的编码所述抗体的核酸的细胞，以及任选地从细胞(或培养基)中回收所述抗体。
对于抗体重组生产，生成编码抗体的核酸(例如，本文所述)并插入至一个或多个载体中以用于在细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适细胞包括本文所述的真核细胞。
此外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体(参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414和Li,H.,et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主(参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的HEK293细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
纯化
各种不同的用于蛋白质回收和纯化的方法已经非常成熟并且得到广泛应用，诸如微生物蛋白亲和层析(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如，使用苯基-琼脂糖、亲杂氮芳基树脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如，使用Ni(II)-亲和材料和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
密码子使用
密码子使用表(示例见上表)很容易获得，例如，在http://www.kazusa.or.jp/codon/提供的“密码子使用数据库”中，这些表可以用许多方式调整(Nakamura,Y.,et al.,Nucl.Acids Res.28(2000)292)。
对于重组多肽的高产表达，编码核酸起着重要作用。天然存在的和从自然界分离的编码核酸通常未针对高产量表达进行优化，尤其是在异源宿主细胞中表达时。由于遗传密码的简并，除了氨基酸色氨酸和甲硫氨酸之外，一个氨基酸残基可以由一个以上的核苷酸三联体(密码子)编码。因此，对于一个氨基酸序列，不同的编码密码子(＝相应的编码核酸序列)是可能的。
不同的生物体以不同的相对频率(密码子使用)使用编码一个氨基酸残基的不同密码子。通常，一个特定密码子的使用频率高于其他可能的密码子。
在WO 2001/088141中，报道了根据在高度表达的哺乳动物基因中发现的密码子使用的阅读框优化。为此，生成矩阵时几乎只考虑那些在高度表达的哺乳动物基因中最常用的密码子，次优选地使用那些第二常用的密码子，如下表所示。使用来自高度表达的人类基因的这些密码子，创建了自然界中不存在的完全合成的阅读框，但它编码的产物与原始野生型基因构建体完全相同。
在US 8,128,938中报告了使用单个密码子的使用频率进行密码子优化的不同方法，例如统一优化、完全优化和最小优化。
下表显示了在高度表达的哺乳动物基因中发现的最常用的密码子(密码子1)和第二常用的密码子(密码子2)。
表.
氨基酸 密码子1 密码子2
Ala GCC GCT
Arg AGG AGA
Asn AAC AAT
Asp GAC GAT
Cys TGC TGT
End TGA TAA
Gln CAG CAT
Glu GAG GAA
Gly GGC GGA
His CAC CAT
Ile ATC ATT
Leu CTG CTC
Lys AAG AAT
Met ATG ATG
Phe TTC TTT
Pro CCC CCT
Ser AGC TCC
Thr ACC ACA
Trp TGG TGG
Tyr TAC TAT
Val GTG GTC
(Ausubel，F.M.，et a1.，Current Protocols in Molecular Biology2(1994)，A1.8-A1.9)。
很少偏离严格遵守最常见密码子的使用：(i)以调整独特限制性位点的引入或去除，(ii)打破延伸超过7个碱基对的G或C段，以允许连续的PCR扩增和合成基因产物的测序。
提供以下实例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
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实例
蛋白质测定：
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过确定280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
实例1
基于不同密码子优化的核酸的抗体表达和纯化
不同的未优化或密码子优化的可变结构域与野生型人恒定区编码核酸或与CHO密码子使用优化的编码人恒定区的核酸组合。
表达质粒：
每个表达质粒包含一种用于表达重链或轻链的表达盒。这些分别组装在哺乳动物细胞表达载体中。
关于可以从中推断密码子使用的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下给出：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH出版号91-3242。
除了轻链或重链表达盒外，这些质粒还包含
-潮霉素抗性基因，
-爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的复制起点oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
重组DNA技术:
使用标准克隆技术进行克隆，描述于例如Sambrook,J.,et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)。所有分子生物学试剂都是可商购的(如果没有另外说明)并根据制造商的说明使用。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
Vector NTI Advance套件9.0版用于序列创建、映射、分析、注释和图解。
抗体的表达：
对于抗体的表达，使用了人胚胎肾细胞(HEK)293F。HEK293细胞主要用于瞬时基因表达。几天后即可收获所需的蛋白质。HEK293F培养于添加了青霉素和链霉素(PenStrep)的无血清和无蛋白质的FreeStyleTM 293表达培养基(Gibco，InvitrogenTM，LifeTechnologies)，在7％CO2、85％湿度和37℃，在摇瓶中。细胞每3-4天传代一次，并根据汇合度分盘。细胞计数始终设置为3×105细胞/mL。用CASEY细胞计数器(Roche)测量细胞计数和活力，将50μl培养物悬浮在10ml Casyton中并用适当的程序测量。
对于瞬时转染，当日细胞数调整为2×106细胞/mL。瞬时转染次数不应低于4代，也不应高于22代。对于转染，使用转染试剂PEIpro并在分批补料过程中运行7天。对于转染，以下体积和DNA量用于转染混合物(培养体积20mL)：
Figure BDA0003423434240000351
对于转染，将适量的F17、DNA和转染试剂按各自的顺序混合，混合并孵育10分钟。随后，将转染混合物加入到细胞中。大约3-5小时后，加入相应的VPA预稀释液。16小时后，向培养物中补充0.6％葡萄糖和12％补料并进一步孵育。
Figure BDA0003423434240000352
Figure BDA0003423434240000361
一周后，可以收获上清液。为此，将混合物以1200rpm离心20分钟，并用0.22μm过滤器无菌过滤掉上清液。
表达产量测定：
用填充有蛋白A的HPLC柱对上清中表达的抗体进行定量。蛋白A是一种来自金黄色葡萄球菌的细胞壁相关蛋白，它与IgG抗体的恒定区特异性结合。蛋白A固定在聚合物载体上，然后与靶分子结合。通过改变各种参数，如pH和温度，可以洗脱和检测抗体。
转染后七天，收获HEK 293细胞上清液。使用蛋白A-SepharoseTM亲和层析(GEHealthcare,Sweden)通过亲和层析从上清液中纯化其中包含的重组抗体。简言之，将含有澄清培养上清液的抗体置于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mMKCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白质A(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用pH 3.2的50mM柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体(或衍生物)。用pH 9.0的0.1ml 2M Tris缓冲液中和含蛋白级分。
Figure IDA0003423434280000011
Figure IDA0003423434280000021

Claims (21)

1.一种用于通过培养已用一种或多种包含编码抗体的重链和轻链的核酸的表达盒转染的CHO细胞来产生人IgG1亚类抗体的方法，
其中编码抗体重链和抗体轻链的所述核酸是用人细胞的密码子使用和/或CHO细胞的密码子使用优化的密码子使用，
其中在所述核酸的编码重链可变结构域的部分中，去除至少一个非配对供体剪接位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述核酸的编码重链恒定区的部分中，未去除非配对供体剪接位点。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中在编码所述抗体轻链的所述核酸中，去除非配对剪接位点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述转染是瞬时转染。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码所述抗体的所述核酸是cDNA。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码所述抗体的轻链或/和重链的所述核酸是基因组组织形式的DNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中去除非配对剪接位点是通过在非配对供体剪接位点核酸序列中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化来去除所述非配对供体剪接位点。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中去除所述非配对剪接位点是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸沉默突变。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中去除所述非配对剪接位点是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中，在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)处引入氨基酸沉默突变。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)培养所述CHO细胞，和
b)从所述CHO细胞或培养基中回收所述抗体。
11.一种用于通过培养包含一种或多种编码抗体的重链和轻链的核酸的CHO细胞来产生人IgG1亚类抗体的方法，
其中在编码重链可变结构域的所述核酸中，通过在非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)中引入氨基酸序列沉默核苷酸变化来去除非配对供体剪接位点，
其中在编码重链恒定区的所述核酸中未去除根据SEQ ID NO:01的序列的非配对供体剪接位点。
12.根据权利要求11所述的方法，其中编码抗体重链和抗体轻链的所述一种或多种核酸是基因组组织形式的DNA。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中编码所述抗体重链和所述抗体轻链的所述一种或多种核酸是用人细胞的密码子使用和/或CHO细胞的密码子使用优化的密码子使用。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中在编码所述抗体轻链的所述核酸中，通过在所述非配对供体剪接位点共有序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中，在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)处引入氨基酸序列沉默核苷酸变化来去除非配对剪接位点。
15.在人或仓鼠密码子使用优化的编码抗体的核酸序列的一部分中去除非配对供体剪接位点的用途，其中所述部分是编码重链可变结构域的部分，用于减少错误剪接或/和当所述核酸用于在CHO细胞中产生所述抗体时增加抗体表达产率。
16.根据权利要求15所述的用途，其中在所述核酸的编码重链恒定区的部分中未去除非配对剪接位点。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的用途，其中在所述核酸的编码轻链的部分中去除非配对剪接位点。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的用途，其中去除所述非配对剪接位点是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中引入氨基酸沉默突变。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的用途，其中去除所述非配对剪接位点是通过在核苷酸序列NGGTA(G)AG(SEQ ID NO:01)中，在密码子NGG或密码子GGT或密码子GTA(G)处引入氨基酸沉默突变。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法或用途，其中所述非配对剪接位点为人工非配对剪接位点。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法或用途，其中所述非配对供体剪接位点是人工供体剪接位点并且是在密码子优化过程中生成的。
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