CN113968864B - 一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针、制备方法和应用 - Google Patents

一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针、制备方法和应用。该方法为：将5‑(2‑溴乙酰氨基苯基)‑10,15,20‑三(4‑磺酸基苯基)锌卟啉(o‑ZSPBr)、N‑乙氧基乙基‑3‑烷基吡啶胺衍生物(N‑EP)、碳酸钾、碘化钾混合后溶于N,N’‑二甲基甲酰胺中，加热反应得到最终的探针o‑SZP。该探针水溶性好，在检测Cu+时可显示出明显的荧光增强，检测过程便捷，结果准确。且不受多种金属离子的干扰。结合激光共聚焦扫描显微技术，还可实现该探针在活细胞内对Cu+离子的荧光检测成像。

Description

一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种锌卟啉衍生物及基于该衍生物的荧光传感器，具体涉及一种将锌卟啉作为荧光发色团，吡啶N和醚链O作为共同信号识别原子的水溶性亚铜离子(Cu+)荧光探针的制备方法，以及该探针分子在水溶液及细胞中亚铜离子检测的应用。
背景技术
铜是生命中不可缺少的元素。亚铜离子是多种氧化还原酶的辅因子，包括细胞色素c氧化酶，血浆铜蓝蛋白，酪氨酸酶，多巴胺β-羟化酶，赖氨酰氧化酶，铜胺氧化酶等，它们在生物体内参与电子的转移/底物的氧化，铁的摄取，色素的沉着，神经递质的合成与代谢，表观遗传的修饰以及抗氧化防御等过程，在生命活动中这些酶有着举足轻重的作用。亚铜离子含量的失调会引发Wilson氏病，神经退行性疾病等，如帕金森氏病，阿尔兹海默症，亨廷顿舞蹈病，阮病毒等。糖尿病及肥胖等代谢紊乱也和体内的亚铜离子息息相关。相关研究表明，亚铜离子还可影响癌细胞的生长。因此，对亚铜离子进行快速且灵敏的检测具有至关重要的临床意义与广大的应用前景。
现存的很多方法能对亚铜离子进行分析测定，如分光光度法，化学发光法，催化动力学法，原子吸收光谱法，电化学等，但这些方法对样品的预处理操作复杂，无法对生物体内的离子进行实时原位动态检测，且设备维护成本高，因此其应用受到一定限制。相比之下，荧光探针检测法因其离子选择性好，灵敏度高，毒性较低，对生物体内金属离子检测有着良好的应用前景。荧光探针通常由荧光基团，连接基团以及识别基团三部分组成。识别基团能够特异性地结合待检测物质，二者相互作用后，荧光基团的荧光强度改变，或最大发射波长位移发生改变，从而达到对被分析物的定性或定量检测。近年来，针对亚铜离子的特异性探针在研究领域受到越来越多的重视，但已报道的亚铜离子荧光探针仍然较少。公开号为CN110305111A的专利“一种新的亚铜离子近红外探针及其制备方法和应用”报道了一种以N3O结构作为新型亚铜离子识别基团的近红外荧光探针，其具有良好的水溶性和生物相容性，能够运用于环境及细胞内亚铜离子的检测。文献(Imaging of the IntracellularTopography of Copper with a Fluorescent Sensor and by Synchrotron x-RayFluorescence Microscopy.2005,102(32):11179-11184.)中报道了一种以冠硫醚为亚铜离子识别基团的小分子荧光探针及其在细胞内亚铜离子检测方面的应用。目前已报道的亚铜离子探针不仅数量相对少，大多数还存在水溶性与生物相容性差的问题，不能应用于细胞及生物体内的亚铜离子检测，且不能排除二价铜离子的干扰，高效地区分一价和二价铜离子，实现对亚铜离子的专一性识别。此外，一些探针需要额外的紫外激发，这可能会破坏活体生物样品并干扰细胞的自发荧光，进一步地限制了其生物检测方面的应用。因此，设计制备兼顾生物相容性和亚铜离子选择性的荧光探针十分必要，这要求从探针的识别基团及荧光基团两方面考虑，构建出具有亚铜离子专一识别能力和良好生物适应性的荧光探针，最终实现生物体内的亚铜离子检测。#
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：改进现有亚铜离子检测探针的不足，并提供一种制备亚铜离子检测探针的方法，合成步骤简单，合成的亚铜离子检测探针解决水溶性及细胞透膜性差，毒性大，生物相容性差等问题。
根据本发明的第一个方面，本发明采用的技术方案是：
一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针，具有如下结构通式：
Figure BDA0002598918890000021
其中，n＝1或2。
根据本发明的第二个方面，本发明采用的技术方案是：
一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：将5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)、 N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)、碳酸钾、碘化钾混合后溶于溶剂一中，加热反应后，将反应液于1000kDa的透析袋中透析48～56h，冷冻干燥 20～28h后得到最终的上述分子结构的探针分子o-SZP。上述的反应时间一般为 4h左右。
进一步地，5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr) 的制备方法如下：
(1)将市售的5-(2-氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-ATPP)溶于浓硫酸中，形成浓度为14.3mg/mL的溶液，油浴加热反应液至回流，反应6～ 8h，反应期间利用薄层层析法对反应进行的程度进行监测，待原料点反应完全后停止加热；在反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液的pH值至7；收集反应液于1000kDa的透析袋中透析65～70h，冷冻干燥24～28h，待水溶液除去后得到产物5-(2-氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-SNH2)。 o-SNH2的结构式为：
Figure BDA0002598918890000031
(2)将5-(2-氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-SNH2)溶于DMF 中，形成浓度为12mg/mL的溶液一，将溴乙酰溴也溶于DMF中，形成浓度为 71mg/mL的溶液二，两者混合后，再加入浓度为5mg/mL的氢氧化钠水溶液。溶液一、溶液二、氧化钠水溶液的体积比为5:1:1。在0℃冰浴下反应1h后，常温继续反应1h。结束后，收集反应液于1000kDa的透析袋中透析48～72h，继而冷冻干燥12～20h后得到5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-SPBr)。
o-SPBr的结构式为：
Figure BDA0002598918890000041
(3)将5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-SPBr)与二水合醋酸锌以1:2的摩尔比混合后，溶于溶剂二中，形成o-SPBr浓度为10 mg/mL的溶液；60℃条件下回流4h后，于1000kDa的透析袋中透析48～72h，冷冻干燥20～28h后得到5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)。
o-ZSPBr的结构式为：
Figure BDA0002598918890000042
所述步骤(2)中，溶液一、溶液二、氧化钠水溶液的体积比优选为5:1:1，这使得所有反应物和催化剂都在溶剂用量最小的情况下充分溶解，在保证反应充分进行的前提下还满足了绿色化学的要求。按此比例混合的溶液中o-SNH2与溴乙酰溴的摩尔比为1:5。溴乙酰溴远过量于原料o-SNH2的做法可以使该反应充分进行，提高o-SNH2转化为5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基) 卟啉(o-SPBr)的效率。此外，由于反应物o-SNH2与产物o-SPBr的分子量相近，在透析纯化时较难分离，而小分子的溴乙酰溴可以轻松通过透析步骤除去，因此过量的溴乙酰溴在提升原料o-SNH2的利用度的同时，也减少了后处理中纯化除杂的时间。
进一步地，N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)的制备方法如下：
将市售3-烷基吡啶，2-溴二乙醚，碳酸钾以2:1:1的摩尔比混合后，60℃条件下反应1h，通过薄层层析法监测反应，待产物点不再增加时停止加热；在反应液中加入二氯甲烷猝灭反应后，利用蒸馏水洗涤反应液三次，收集有机相旋干溶剂后得到N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)。
N-EP的结构式为：
Figure BDA0002598918890000051
其中，n＝1(N-EP1)或2(N-EP2)。
N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)的合成参考文献(Kulinkovich-typereactions of thioamides:similar to those of carboxylic amides？[J]. ChemicalCommunications,2012,48(41):5031-5033.)中报道的方法，通过优化3- 烷基氨基吡啶，2-溴二乙醚，碳酸钾的摩尔比，调整加热的温度和时间，最终获得产率较高的N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)。
优选地，在制备o-SZP时，将5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)、N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)、碳酸钾、碘化钾以摩尔比为1:3:3:3混合后溶于溶剂一中，形成o-ZPBr浓度为10mg/mL 的溶液，60℃加热下反应4h后，将反应液于1000kDa的透析袋中透析48～56h，冷冻干燥20～28h后得到最终的产物o-SZP。
o-SZP的结构式为：
Figure BDA0002598918890000052
其中，n＝1或2
所述的溶剂一是N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，所述溶剂二是三氯甲烷。
所述的N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)分别为N-乙氧基乙基-3- 甲基吡啶胺(N-EP1)和N-乙氧基乙基-3-乙基吡啶胺(N-EP2)。选择上述两种衍生物的原因：具备的链长最适合与卟啉环中的锌离子产生轴向配合物。制备(N-EP1)和(N-EP2)所需的原料均为市售产品，价格便宜易得。
o-SZP探针分子的合成参考文献(The zinspy family of fluorescent zincsensors:syntheses and spectroscopic investigations[J]. Inorganic Chemistry,2004,43,8310-8317.)中报道的方法。在实验中，优化5-(2- 溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)、N-乙氧基乙基 -3-烷基吡啶胺衍生物(N-EP)的摩尔比为1:3。反应结果表明，当二者摩尔比为1:3时，反应底物的利用率最高，且副产物最少。
根据本发明的第三个方面，提供一种上述方法制备的基于锌卟啉轴向配位调控的荧光探针在检测亚铜离子方面的应用：
本发明所提供的o-SZP分子在自由状态时，卟啉空腔内的锌离子可与侧链上吡啶基团上的N原子形成轴向配位模式(如下式中左边分子式中虚线所示)，锌离子接受N原子的孤对电子形成σ键，引发分子内电子转移(intramolecular electron transfer(IET))，电子由吡啶氮原子流向卟啉环，使得卟啉环的荧光发生淬灭。当加入亚铜离子后，o-SZP探针分子中侧链的两个氮原子和两个氧原子可与亚铜离子作用形成稳定的配合物(如下式中右边分子式中虚线所示)，从而破坏了原有轴向配位模式，将锌卟啉荧光团释放出来，并改变了卟啉环上电子云密度，从而实现荧光增强的光学信号响应。
Figure BDA0002598918890000061
本发明的优点如下：
(1)本发明提供的o-SZP探针分子的合成步骤简便，反应条件温和，产率较高，后处理简单。
(2)本发明利用亚铜离子可与o-SZP侧链中的叔胺N原子、吡啶N原子、醚链O原子以及酰胺键O原子，形成非常稳定的四配位化合物，从而可有效破坏原有的轴向配位模式，使得锌卟啉荧光团被释放出来，显示出荧光增强。其他金属离子均无此配位能力，因此无明显干扰，实现了亚铜离子的专一且准确的检测；
(3)本发明提供的探针分子以卟啉分子为荧光报告基团，其结构稳定，为近红外荧光发色团分子，光学性能优异且具有较大的Stocks位移，反应信号的灵敏度较高；
(4)本发明提供的o-SZP探针分子具良好的水溶性，对微量亚铜离子显示出荧光敏感性质，能够实现对亚铜离子的专一识别和水溶液中浓度低至10-11 mol/L的快速检测；
(5)本发明提供的o-SZP探针分子具有较好的透膜性，可用于活细胞内亚铜离子的检测，借助激光共聚焦显微镜可进行细胞内成像。
附图说明
图1为实施例1制备的o-SZP1探针与不同浓度亚铜离子作用后的荧光光谱图；
图2为实施例1制备的o-SZP1探针及o-SZP1探针与同浓度的不同金属离子作用后的荧光强度图(623nm处)；
图3为实施例1制备的o-SZP1探针的细胞毒性评价图；
图4为实施例1制备的o-SZP1探针对细胞内亚铜离子检测的激光共聚焦显微镜成像图。
具体实施方式
实施例1
将o-SNH2(60mg，0.07mmol)溶于5mL DMF中，再将溴乙酰溴(71mg， 0.35mmol)溶于1mL DMF中，氢氧化钠(5mg，0.125mmol)溶于1mL蒸馏水中，三者混合后在0℃冰浴下反应1h，继续常温(20℃)反应1h后，收集反应液于1000kDa透析袋中透析52h，冷冻干燥14h后得到5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(o-SPBr)，重量53.1mg，产率为77％。
将o-SPBr(50mg，0.05mmol)和二水合醋酸锌(104.75mg，0.5mmol) 溶于6mL三氯甲烷中，加热反应液至60℃，回流反应4h后，收集反应液于1000 kDa的透析袋中透析48h，冷冻干燥24h后得到5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20- 三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)，重量49.8mg，产率为95％。
将市售3-氨甲基吡啶(510μL，5mmol)，2-溴二乙醚(280μL，2.48mmol)，碳酸钾(350mg，2.53mmol)混合后，60℃条件下反应1h后，停止加热；在反应液中加入10mL二氯甲烷猝灭反应，利用蒸馏水洗涤三次，收集有机相旋干溶剂后，采用柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚(体积比)＝3/1)，收集第二色带产物，可得到侧链化合物N-乙氧基乙基-3-甲基吡啶胺衍生物(N-EP1)，重量630mg，产率为70％。
将o-ZSPBr(40mg，0.038mmol)，N-EP1(19.9mg，0.11mmol)，碳酸钾(15.3mg，0.11mmol)，碘化钾(18.3mg，0.11mmol)混合后溶于4mL DMF 中，60℃条件下反应4h，冷却，收集反应液于1000kDa的透析袋中透析50h，冷冻干燥24h后得到终产物o-SZP1，重量29.7mg，产率为68％。利用核磁共振氢谱、高分辨质谱验证其化学结构。
其结构式如下：
Figure BDA0002598918890000081
应用例1
o-SZP1探针分子对水溶液中亚铜离子的选择性
由于只有亚铜离子在与o-SZP1探针分子作用时，其侧链中的N原子，醚链 O原子，酰胺键O原子，吡啶N原子能与亚铜离子形成稳定四配位的特异结合，将原探针分子中的金属锌离子的轴向配位打破，引起卟啉信号基团发生光谱信号的变化，因此可将一定浓度的o-SZP1探针分子水溶液与等浓度的不同金属离子水溶液混合后作用，利用荧光光谱测定其对于亚铜离子的选择性。具体操作过程如下：将固体o-SZP1探针溶于蒸馏水配制成浓度为1.0mM的母液。取一定量的母液用蒸馏水稀释到实验所用的浓度5μM。在5mL容量瓶中加入o-SZP1探针分子水溶液2.5mL(5μM)，分别加入等当量的不同金属离子的水溶液2.5mL， 37℃条件下静置30分钟后，采用荧光光谱测定探针分子与不同金属离子作用后的荧光变化谱图。结果如图1所示，只有Cu+的加入可引起o-SZP1探针在623nm 处荧光强度的升高，说明o-SZP1探针对亚铜离子具有较高的选择性(图1)。
应用例2
o-SZP1探针分子对水溶液中不同浓度亚铜离子的荧光响应：分别取o-SZP1 探针分子水溶液1.0mL(5μM)，再加入不同浓度的(0-6μM)亚铜离子水溶液1.0mL，混合后放置30分钟，使得混合液中o-SZP1的浓度为2.5μM，亚铜离子的浓度为0-6μM，采用荧光光谱测定探针分子与不同浓度亚铜离子作用后的荧光变化谱图。结果如图2所示。结果表明，空白的o-SZP1的荧光强度较弱，随着亚铜离子的加入，荧光强度逐渐增加。采集荧光光谱峰位置在623nm处的荧光强度，以其为纵坐标，亚铜离子浓度为横坐标作图进行线性拟合，从而计算出亚铜离子的检测限为6.53×10-11M。
应用例3
o-SZP1探针分子的细胞毒性测试
采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定o-SZP1探针分子的细胞毒性。选取两种细胞株：腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)，脐静脉内皮细胞(HUVEC)。将A549、HUVEC两种细胞分别以5×10-3个/孔接种于96 孔板，在37℃，5％CO2下培养12h，使细胞贴壁。加入不同浓度的o-SZP1探针，两种细胞的孵育浓度均为1-100μM。孵育4h后弃掉探针溶液，PBS冲洗细胞三遍。每孔加入20μL MTT(5mg/mL，PBS)溶液，孵育4h后弃掉溶液。每孔加入160μL的二甲亚砜(DMSO)，来回轻轻摇晃96孔板，使紫色结晶充分被DMSO溶解。后将96孔板置于酶标仪中，测定各组在570nm处的吸光值(OD)。根据如下公式计算两种细胞在不同探针孵育浓度下的存活率(Survival Rate％)，并评价相应的细胞毒性。
Figure BDA0002598918890000091
ODControl:空白对照组的吸光值；ODSample:实验组的吸光值
如图3所示，两种不同的细胞系在0.001-0.1mmol/L范围内对o-SZP1的耐受程度良好，细胞存活率均大于80％。说明探针o-SZP1具有较优异的生物安全性与生物稳定性。
应用例4
o-SZP1探针分子对细胞内亚铜离子的检测
将固体o-SZP1探针溶于蒸馏水配制成浓度为1mM的探针分子储备液。取 o-SZP1探针分子储备液100μL，分别加到两个含有贴壁细胞的培养皿中，在37℃的5％培养箱中孵育15分钟后，将探针分子储备液弃掉，用磷酸盐缓冲液(PBS， pH 7.4)清洗3次，除去培养皿内未进入细胞的探针分子。取一个经o-SZP1探针孵育的细胞培养皿，加入2当量的亚铜离子水溶液100μL，在37℃的5％培养箱中孵育15分钟后，将亚铜离子水溶液弃掉，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4) 清洗3次，除去培养皿内未进入细胞的亚铜离子。上述两组细胞分别固定在96 孔板上，借助奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜观察成像情况。细胞成像结果如图3所示，未经亚铜离子孵育的细胞，细胞内荧光不明显；在细胞中加入亚铜离子后，细胞内荧光明显增强。该结果进一步说明o-SZP1探针分子具有良好的膜穿透性和对活细胞内的亚铜离子优异的检测性能。
对比实施例
对比已报道过的亚铜离子荧光探针，本发明所提供的荧光探针具有制备简便，透膜性优异，生物毒性小等优点。
对比实施例1
文献(Dodani S C,Leary S C,Cobine P A,Winge D R,Chang C J.A targetablefluorescent sensor reveals that copper-deficient SCO1 and SCO2 patient cellsprioritize mitochondrial copper homeostasis[J].Journal of the AmericanChemical Society,2011,133:8606-8616.)中报道了一种能够靶向细胞线粒体铜池的亚铜离子荧光探针，其创新点在于探针结构中包括了富硫的亚铜离子识别基团及靶向线粒体的三苯基膦部分。但探针的合成包括十步反应，其中第三步将中间体与过量的吡咯，在三氟乙酸的催化下进行缩合反应，得到二吡咯次甲基取代的产物，产率仅为19％。这与本发明的探针制备方法相比，合成步骤繁多，且产率较低，是其应用的一个局限。

Claims (3)

1.一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针o-SZP，其特征在于，所述探针的分子结构如下：
Figure FDA0004017032150000011
其中，n＝1或2。
2.一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：将5-(2-溴乙酰氨基苯基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)锌卟啉(o-ZSPBr)、N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物N-EP、碳酸钾、碘化钾混合后溶于溶剂一中，加热反应后，将反应液于1000kDa的透析袋中透析48～56h，冷冻干燥20～28h后得到最终的权利要求1所述分子结构的探针；
N-乙氧基乙基-3-烷基吡啶胺衍生物N-EP分别为N-乙氧基乙基-3-甲基吡啶胺N-EP1和N-乙氧基乙基-3-乙基吡啶胺N-EP2，其结构式如下：
Figure FDA0004017032150000012
3.根据权利要求2所述的一种基于锌卟啉轴向配位调控的Cu+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂一是N,N’-二甲基甲酰胺。
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