CN113967261A - Folr1抑制剂的应用和治疗肝癌药物混合物 - Google Patents

Folr1抑制剂的应用和治疗肝癌药物混合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制肝癌耐药的方法和试剂。本发明首次发现肝癌耐药细胞中FOLR1表达量上调，揭示了FOLR1与肝癌耐药密切相关，FOLR1抑制剂可以作为降低肝癌耐药性的用途。本发明的研究成果不仅为肝癌临床治疗提供理论基础，并能为肝癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

FOLR1抑制剂的应用和治疗肝癌药物混合物
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明涉及治疗肝癌耐药性领域。本发明提供了一种治疗肝癌耐药性的试剂。
背景技术
肝癌，作为一种临床常见的恶性肿瘤，具有高发病率、高死亡率的特点，严重危害人类健康。目前，化疗仍是肝癌的主要治疗手段之一。然而，在治疗过程中出现的肝癌对化疗药物的耐药性是影响治疗效果的主要障碍。因此，为了提高肝癌化疗疗效，对肝癌耐药机制进行研究，找到肿瘤耐药关键靶点，设计能够提高肝癌治疗敏感性的新药，是本领域重点研究方向。
叶酸受体α(FOLR1)是糖基-磷脂酰肌醇连接的膜蛋白，可优先结合氧化的叶酸。叶酸可以通过FOLR1转运到细胞中，对嘌呤和胸苷的生物合成起重要作用，而嘌呤和胸苷则是DNA合成，甲基化和修复所必需的。FOLR1已被证明在许多癌症表面过表达，包括肺，卵巢和乳腺癌等。目前，对于FOLR1在癌症耐药方面的功能已有初步报道，但结果不尽相同：在卵巢癌顺铂耐药SKOV3细胞中FOLR1表达下调，外源高表达FOLR1可以增加耐药SKOV3细胞对顺铂的化疗敏感性(Huang MJ,Zhang W,Wang Q,Yang ZJ,Liao SB,Li L.FOLR1 increasessensitivity to cisplatin treatment in ovarian cancer cells.J OvarianRes.2018；11(1):15)；相反，在鼻咽癌紫杉醇耐药NPC细胞中FOLR1表达则上调，通过抑制FOLR1的表达可以增强耐药NPC细胞对紫杉醇治疗的敏感性(Li W,Tan G,Ma Y,Li H,HeG.Inhibition ofαfolate receptor resulting in a reversal of taxol resistancein nasopharyngeal carcinoma.Otolaryngol Head Neck Surg.2012；146(2):250-8)。然而，FOLR1在肝癌耐药中的生物学功能研究尚未见报道。本发明利用基于质谱的定量蛋白质组学技术筛选和生物学功能研究(如采用蛋白质印迹法(参考Sambrook等人著，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和免疫荧光实验)发现：1)FOLR1在肝癌耐药细胞中表达显著上调；2)采用蛋白质印迹法，实时定量PCR检测和免疫组化实验发现FOLR1在肝癌耐药组织中表达显著上调；3)平板克隆实验及流式细胞仪检测细胞凋亡发现在肝癌耐药细胞中敲降FOLR1可以显著增强肝癌耐药细胞对药物敏感性，促进细胞凋亡；4)裸鼠荷瘤实验发现敲降FOLR1可以显著增强肝癌细胞对药物的敏感性，提高药物治疗效果；5)Kaplan-Meier数据库生成的生存曲线显示FOLR1高表达显著降低了肝癌患者的生存率。本发明首次发现FOLR1在肝癌耐药细胞中的分子功能；发现抑制FOLR1可以显著增强肝癌细胞对治疗药物的敏感性；因此FOLR1可作为肝癌耐药治疗靶点，为肝癌临床治疗提供新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对FOLR1的抑制剂作为降低或消除肝癌耐药治疗的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了抑制FOLR1的方法，是通过抑制剂实现。
进一步，所述抑制剂包括了：针对FOLR1蛋白抑制的抗FOLR1的抗体、针对FOLR1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸。
更进一步，所述抗FOLR1的抗体，包括：对FOLR1或其活性片段具有免疫活性，能够特异性识别并结合FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段。
本发明所述的针对FOLR1编码序列的RNA干扰分子，选自shRNA、siRNA、miRNA、dsRNA。
进一步，所述的RNA干扰分子siRNA的优选序列为siRNA1，正义链:5'-GAUGUUUCCUACCUAUAUATT-3'和反义链:5'-UAUAUAGGUAGGAAACAUCTT-3'；siRNA2,正义链:5'CCACUGUUCUGUGCAAUGATT-3'和反义链:5'-UCAUUGCACAGAACAGUGGTT-3'；siRNA3,正义链:5'-GGACUGAGCUUCUCAAUGUTT-3'和反义链:5'-ACAUUGAGAAGCUCAGUCCTT-3'。
本发明所述的反义寡核苷酸，特异地与FOLR1基因DNA或mRNA结合而抑制FOLR1基因表达，在基因水平调控的分子药物，包括人工合成或体内表达的反义DNA和反义RNA。
本发明所述的肝癌包括：原发性肝癌，继发性肝癌，以及原发性肝癌或继发性肝癌的离体培养细胞。
进一步，原发性肝癌包括：肝细胞肝癌、肝内胆管癌，肝细胞癌混合肝内胆管癌；继发性肝癌包括：肠癌、胰腺癌转移胆囊癌、胆管癌。
本发明所述的药物，包括：顺铂、吉非替尼、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、索拉非尼、西地尼布、帕唑帕尼、阿西替尼、瓦他拉尼、司马沙尼、舒尼替尼、雷莫芦单抗及阿柏西普。
本发明具有如下优点：：
(1)由于目前化疗仍是肝癌的主要治疗手段，而耐药性的产生已严重影响肝癌患者的治疗。本发明发现肝癌耐药细胞中FOLR1表达量上调，抑制FOLR1可以显著增强肝癌细胞药物敏感性，为肝癌耐药的检测及治疗提供了新的工具。
(2)本发明通过一系列的体内外功能实验验证了FOLR1表达对肝癌耐药的调控作用，为肝癌临床治疗提供理论基础。
(3)本发明首次发现FOLR1与肝癌耐药具有密切相关性，为治疗肝癌的药物开发提供了潜在的药物靶标。
附图说明
图1.FOLR1蛋白在肝癌索拉非尼耐药细胞Huh7-R中高表达
图2.siRNA1转染敲低FOLR1蛋白表达水平
图3.平板克隆实验显示抑制FOLR1表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性
具体实施方式
下面结合具体实施例，具体阐述本发明。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，如Sambrook等人著，分子克隆：实验室指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用溶液中百分比如无特殊说明均为体积比。
实施例1.FOLR1蛋白在肝癌索拉非尼耐药细胞Huh7-R中高表达
为研究FOLR1在正常肝癌细胞和肝癌耐药细胞中的表达水平，通过对肝癌细胞Huh7及索拉非尼耐药细胞Huh7-R的无标定量蛋白质组学分析发现，FOLR1在Huh7-R中的丰度明显高于Huh7中。采用蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)进一步检测两种细胞中FOLR1蛋白表达水平。
分别在10cm培养皿培养Huh7及Huh7-R细胞，当细胞密度达80％-90％时(约5×106个细胞)，首先用6ml PBS(pH 7.4)(购买于美国Gibco公司)洗3次，再加入300μl的RIPA裂解液(购买于上海碧云天生物技术有限公司，裂解液主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mMNaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS，以及sodiumorthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂)，冰上裂解细胞15min，12000g离心15min，去除沉淀获得蛋白质上清液。分别用BCA试剂盒(购买于上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白质浓度。分别采用蛋白质印迹法检测FOLR1蛋白质表达水平,每个泳道的蛋白样品上样量为60μg。Bio rad电泳仪，Bio rad转膜仪购买于美国Bio rad公司，FOLR1的抗体购买于美国Gene Tex公司,货号GTX134660。β-actin抗体做内参，购买于美国Sigma公司，货号A5441。
结果显示FOLR1在肝癌索拉非尼耐药细胞Huh7-R中蛋白表达水平明显高于对照细胞Huh7(图1)，表明FOLR1的表达与肝癌耐药具有关联。
实施例2.FOLR1蛋白在肝癌索拉非尼耐药组织中高表达
索拉非尼敏感和耐药的临床肿瘤组织样本由大连医科大学附属第二医院肿瘤科和病理科医生提供患者病理学穿刺或其它有创操作过程中肝癌组织标本，液氮速冻保存；药物疗效(即对药物敏感)的判定依据WHO肿瘤治疗反应标准。药物耐药的判定标准为初次治疗达不到部分缓解，或初次治疗有效但完成治疗后在6个月之内出现复发的情况。
按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取，用BCA试剂盒(购买于上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白质浓度。采用蛋白质印迹法检测FOLR1蛋白质表达水平,每个泳道的蛋白样品上样量为60μg。Bio rad电泳仪，Bio rad转膜仪购买于美国Bio rad公司，FOLR1的抗体购买于美国Gene Tex公司,货号GTX134660。β-actin抗体做内参，购买于美国Sigma公司，货号A5441。
结果显示FOLR1在肝癌索拉非尼耐药组中蛋白表达水平明显高于敏感组，表明FOLR1的表达与肝癌耐药具有关联。
实施例3.抑制FOLR1表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性
1，siRNA设计合成
根据FOLR1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA1，并同时提供与FOLR1基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA NC)。
siRNA NC
正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'
siRNA1 FOLR1
正义链:5'-GAUGUUUCCUACCUAUAUATT-3'
反义链:5'-UAUAUAGGUAGGAAACAUCTT-3'；
2，细胞转染
取生长良好且处于对数生长期的Huh7-R细胞(105个)铺至六孔板，采用转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX(购自Invitrogen公司)进行转染，对照组转染siRNA NC，实验组转染siRNA1 FOLR1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。采用蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)检测蛋白质表达水平。FOLR1抗体购自美国Genetex公司，货号GTX134660。HSP90抗体做内参，购买于美国Santacruz Biotochnotogy公司，货号SC-13119。蛋白质印迹法结果显示实验组转染siRNA1 FOLR1后，FOLR1的表达水平相比于对照组降低(图2)，说明转染成功，siRNA1 FOLR1可以实现FOLR1的表达敲低。
3，平板克隆
在10cm培养皿中培养肝癌索拉非尼耐药细胞Huh7-R，对数生长期时加入0.5ml胰酶消化2min，加入6ml DMEM培养基吹打细胞液，细胞计数后稀释，分别取2ml细胞液(含104个细胞)至六孔板每孔中。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX进行转染，对照组转染siRNA NC，实验组转染siRNA1 FOLR1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。继续培养24h后分别加索拉非尼至终浓度0μM,5μM,10μM,继续培养细胞，观察细胞生长状态。5-7天左右进行结晶紫染色。采用体积浓度20％乙酸500μl溶解结晶紫20min，检测590nm处吸光值。
结果显示，加索拉非尼0μM时，siRNA1 FOLR1组敲低FOLR1蛋白表达会抑制细胞的存活，促进凋亡，说明FOLR1抑制细胞凋亡。随着索拉非尼药物浓度增加，siRNA1 FOLR1组细胞存活率明显低于siRNA NC组，每组差异均具有统计学意义(*p<0.05)(图3)，结果表明抑制FOLR1表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性，提高索拉非尼药物对肝癌的治疗效果。
实施例4.抑制FOLR1表达提高肝癌耐药细胞对舒尼替尼药物敏感性
1，siRNA设计
根据FOLR1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA2，并同时提供与FOLR1基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA NC)。
siRNA NC
正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'
siRNA2 FOLR1
正义链:5'-CCACUGUUCUGUGCAAUGATT-3'
反义链:5'-UCAUUGCACAGAACAGUGGTT-3'；
取生长良好且处于对数生长期的肝癌舒尼替尼耐药细胞HepG2-SR细胞(105个)铺至六孔板，采用转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX(购自Invitrogen公司)进行转染，对照组转染siRNA NC，实验组转染siRNA1FOLR1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。采用蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)检测蛋白质表达水平。FOLR1抗体购自美国Genetex公司，货号GTX134660。HSP90抗体做内参，购买于美国Santacruz Biotochnotogy公司，货号SC-13119。蛋白质印迹法结果显示实验组转染siRNA2 FOLR1后，FOLR1的表达水平相比于对照组降低，说明转染成功，siRNA2 FOLR1可以实现FOLR1的表达敲低。
2，细胞转染和收集
在10cm培养皿中培养肝癌舒尼替尼耐药细胞HepG2-SR，对数生长期时加入0.5ml胰酶消化2min，加入6ml DMEM培养基吹打细胞液，细胞计数后稀释，分别取2ml细胞液(含104个细胞)至六孔板每孔中。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX进行转染，对照组转染siRNA NC，实验组转染siRNA1 FOLR1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。继续培养24h后分别加舒尼替尼至终浓度0μM,2μM,4μM,继续培养细胞48h，观察细胞生长状态。
3，细胞凋亡检测
加入100μL胰蛋白酶消化2min后收集细胞，3ml PBS清洗3次，300g离心5min收集细胞沉淀，采用美国BD公司细胞凋亡检测试剂盒(货号556547)，按照试剂盒说明书进行操作，使用1×binding buffer重悬细胞，5μL FITC加5μL PI避光染色15min，上机检测荧光强度，并进行统计学分析。
结果显示，在加药舒尼替尼终浓度0μM,2μM,4μM时，siRNA2 FOLR1组细胞凋亡率为分别是(6.15±1.6)％，(15.26±3.5)％，(23.08±4.3)％，明显高于siRNA NC组的凋亡率(4.03±1.1)％，(8.37±2.6)％，(15.14±3.3)％，结果表明抑制FOLR1表达导致肝癌细胞对舒尼替尼药物敏感性增加，提高舒尼替尼药物对肝癌的治疗效果。
实施例5.抑制FOLR1表达提高肝癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶药物敏感性
1，siRNA设计合成
根据FOLR1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA2，并同时提供与FOLR1基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA NC)。
siRNA NC
正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'
siRNA2 FOLR1
正义链:5'-CCACUGUUCUGUGCAAUGATT-3'
反义链:5'-UCAUUGCACAGAACAGUGGTT-3'；
2，细胞转染和收集
在10cm培养皿中培养肝癌耐药细胞Bel-7402-5-氟尿嘧啶细胞，对数生长期时加入0.5ml胰酶消化2min，加入6ml RPMI 1640培养基吹打细胞液，细胞计数后稀释，分别取2ml细胞液(含104个细胞)至六孔板每孔中。48h后，细胞贴壁生长良好时，进行细胞转染。采用转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX进行转染，对照组转染siRNA NC，实验组转染siRNA1FOLR1，实验操作及试剂用量参照转染试剂盒说明书即可。继续培养24h后分别加5-氟尿嘧啶至终浓度0μM,10μM,20μM,继续培养细胞48h，观察细胞生长状态。
3，细胞凋亡检测
加入100μL胰蛋白酶消化2min后收集细胞，3ml PBS清洗3次，300g离心5min收集细胞沉淀，采用美国BD公司细胞凋亡检测试剂盒(货号556547)，按照试剂盒说明书进行操作，使用1×binding buffer重悬细胞，5μL FITC加5μL PI避光染色15min，上机检测荧光强度，并进行统计学分析。
结果显示，在5-氟尿嘧啶药物终浓度为0μM,10μM,20μM时，siRNA2FOLR1组细胞凋亡率为(6.75±1.3)％，(19.17±3.8)％，(33.19±5.1)％，明显高于siRNA NC组的凋亡率(4.12±1.2)％，(11.37±2.6)％，(20.63±4.1)％，结果表明抑制FOLR1表达提高肝癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶药物敏感性，提高5-氟尿嘧啶药物对肝癌的治疗效果。
实施例6.动物实验水平抑制FOLR1表达提高肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性
BALB/C-nu/nu免疫缺陷雄性裸鼠(5-6周龄)购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在大连医科大学SPF实验动物中心喂养，随机分成2组，每组10只。
将15cm培养皿中对数生长期的肝癌耐药Huh7-R细胞(对照组)与稳转敲降FOLR1表达的Huh7-R-shFOLR1细胞(实验组)用1ml胰蛋白酶消化2min后，加入6ml DMEM培养基终止消化，收集细胞液离心5min,转速300g。加入PBS缓冲液重悬细胞沉淀，稀释细胞液浓度为每200μl细胞液中含2×106个细胞，分别接种2×106个细胞于裸鼠右前肢腋窝处皮下组织，待皮下肿瘤达到体积100mm3后，开始给予索拉非尼30mg/(kg·d)灌胃处理，灌胃给药2周,频次:6次/周。给药期间定期观测肿瘤体积大小。
比较两组治疗前后瘤体体积差值、瘤体重量情况；统计分析结果显示，索拉非尼药物处理2周后，实验组与对照组相比，瘤体体积为(425.81±13.9)mm3 vs(1016.37±56.9)mm3，瘤体重量为(0.56±0.11)g VS(1.31±0.26)g，差异具有统计学意义(*p<0.05)，说明抑制FOLR1表达提高肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性，提高索拉非尼药物对肝癌的治疗效果。
综上所述，通过抑制肝癌耐药细胞中FOLR1的表达，可以增强肝癌的化疗治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> FOLR1抑制剂的应用和治疗肝癌药物混合物
<140> 2020107223364
<141> 2020-07-24
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gauguuuccu accuauauat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uauauaggua ggaaacauct t 21

Claims (10)

1.FOLR1抑制剂的应用，其特征在于：FOLR1抑制剂在制备提高肝癌药物治疗敏感性药品或在制备降低或消除肝癌药物治疗耐药性药品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：FOLR1蛋白抑制剂为针对FOLR1蛋白抑制的抗FOLR1的抗体、针对FOLR1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸中的一种或两种以上。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌药物为顺铂、吉非替尼、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、索拉非尼、西地尼布、帕唑帕尼、阿西替尼、瓦他拉尼、司马沙尼、舒尼替尼、雷莫芦单抗及阿柏西普中的一种或两种以上。
4.如权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述的肝癌包括原发性肝癌和继发性肝癌中的一种或者两种组合；或原发性肝癌或继发性肝癌的离体培养细胞中的一种或者两种。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：其中原发性肝癌包括：肝细胞肝癌、肝内胆管癌，肝细胞癌混合肝内胆管癌中的一种或者两种；继发性肝癌包括：肠癌、胰腺癌转移胆囊癌、胆管癌中的一种或者两种。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：抗FOLR1的抗体包括：对FOLR1或其活性片段具有免疫活性，能够特异性识别并结合FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段中的一种或两种以上；
所述的针对FOLR1编码序列的RNA干扰分子选自：shRNA、siRNA、miRNA、dsRNA中的至少一种或两种以上；
所述的反义寡核苷酸为：特异地与FOLR1基因DNA或mRNA结合而抑制FOLR1基因表达，在基因水平调控的分子药物，包括人工合成或体内表达的反义DNA和反义RNA中的一种或两种以上。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：RNA干扰分子siRNA的优选序列为下述中的一种或两种以上，
siRNA1，正义链:5'-GAUGUUUCCUACCUAUAUATT-3'和反义链:5'-UAUAUAGGUAGGAAACAUCTT-3'；
siRNA2,正义链:5'CCACUGUUCUGUGCAAUGATT-3'和反义链:5'-UCAUUGCACAGAACAGUGGTT-3'；
siRNA3,正义链:5'-GGACUGAGCUUCUCAAUGUTT-3'和反义链:5'-ACAUUGAGAAGCUCAGUCCTT-3'。
8.一种治疗肝癌药物混合物，包含FOLR1蛋白抑制剂，以及肝癌药物或肝癌药物活性成份中的一种或二种以上。
9.如权利要求8所述的治疗肝癌药物混合物，所述FOLR1蛋白抑制剂为权利要求2、6或7中所述FOLR1蛋白抑制剂中的一种或二种以上。
10.如权利要求8所述的治疗肝癌药物混合物，所述肝癌药物为权利要求3中所述肝癌药物中的一种或二种以上。
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