CN113950332A

CN113950332A - 作为人工包涵体的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒

Info

Publication number: CN113950332A
Application number: CN202080043055.4A
Authority: CN
Inventors: 安东尼奥·比利亚韦德·科拉莱斯; 埃丝特·巴斯克斯·戈麦斯; 埃克托尔·洛佩斯·拉古纳; 胡列塔·玛丽亚·桑切斯; 拉蒙·玛古艾斯·巴法伊; 帕特里夏·阿拉莫
Original assignee: Biomedical Research Network Alliance Center MP Ciber; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Fundacio Institut de Recerca de lHospital de La Santa Creu i Sant Pau
Current assignee: Biomedical Research Network Alliance Center MP Ciber; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Fundacio Institut de Recerca de lHospital de La Santa Creu i Sant Pau
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2022-01-18
Also published as: US20220202733A1; AU2020271957A1; EP3953368A1; BR112021020304A2; WO2020208065A1; CA3136243A1

Abstract

本发明涉及一种包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质颗粒，其中该颗粒具有从50纳米至50微米的尺寸；在水性介质中呈球团形式；是机械稳定的；并且该颗粒在预定的时间段内释放特定重量百分比的该自含式蛋白质以及包含在该颗粒中的任何其他化合物。还披露了获得这些颗粒的特定方法，所述方法包括添加盐以允许蛋白质沉淀。还披露了包含与自含式蛋白质的组装相关的脂质的特定蛋白质颗粒。本发明还涉及该颗粒的若干用途，特别是医学用途，以及包含这些颗粒的药物组合物和化妆品组合物。

Description

作为人工包涵体的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒

本申请要求2019年4月11日提交的欧洲专利申请EP 19382271以及2019年10月17日提交的欧洲专利申请EP 19382909.0的权益。

技术领域

本发明涉及自组装生物分子领域及自组装生物分子在医学领域的特定用途。

背景技术

细菌包涵体(IB)是在重组细菌中产生的机械稳定的不溶性离散微米颗粒状蛋白质材料，其粒度范围为大约50至1500nm，并且形状包括圆柱形、无定形、球形或椭圆形。它们包含一种或几种可在生理条件下释放的功能性蛋白质种类(连同其他可能的组分)。它们通常出现在重组细菌的细胞质中，这是蛋白质过度生产期间发生构象压力的结果。它们主要由重组蛋白质形成，但也包含可变但非特征量的细菌蛋白质、脂质碳水化合物和核酸(参见Neubauer等人,“Protein inclusion bodies in recombinant bacteria[重组细菌中的蛋白质包涵体]”,237-292,Springer[施普林格]-2006)。传统上IB被认为是通过重组程序获得功能性蛋白质的障碍，因为不溶性蛋白质被认为是未折叠且无活性的。然而，2005年发明人等发现IB是由非功能性和功能性多肽的混合物形成的，并且IB是具有生物活性的蛋白质颗粒，可用于生物技术和生物医学(参见Garcia-Fruitos,E.等人“Aggregation asbacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes andfluorescent proteins[聚集为细菌包涵体并不意味着酶和荧光蛋白的失活]”,Microbialcell factories[微生物细胞工厂]2005,卷号4,27,doi:10.1186/1475-2859-4-27；和Gonzalez-Montalban,N.等人,“Recombinant protein solubility-does more meanbetter？[重组蛋白质溶解度越大越好吗？]”,Nature biotechnology[自然生物技术]2007,卷号25,页码:718-720,doi:10.1038/nbt0707-718)。非功能性蛋白质具有淀粉样结构，对应于主体材料的大约20％-40％。功能性蛋白质以一种海绵状组织嵌入这种淀粉样结构中。

因此，IB是机械稳定的功能性材料，当通过口服施用或注射暴露于细胞或生物时无毒。由于机械稳定性和功能性的组合，IB进而作为自固定化催化剂被探索，显示出在生物技术行业和应用中的前景(参见Rinas,U.等人“Bacterial Inclusion Bodies:Discovering Their Better Half[细菌包涵体：发现它们更好的一半]”.Trends inbiochemical sciences[生物化学科学趋势],doi:10.1016/j.tibs.2017.01.005(2017)；和de Marco,A.等人“Bacterial inclusion bodies are industrially exploitableamyloids[细菌包涵体是工业上可利用的淀粉样物质]”,FEMS microbiology reviews[FEMS微生物综述],doi:10.1093/femsre/fuy038(2018))。

如所指出的，当与哺乳动物细胞接触时，IB倾向于穿透它们，显然没有毒性，并且能够释放具有完整生物活性的嵌入的功能性蛋白质。通过将细胞靶向肽与重组IB蛋白融合，可以另外靶向细胞接触和穿透。功能性IB可以进而作为纳米丸递送治疗性蛋白质。这一原理已经针对分子伴侣、酶、生长因子和结构蛋白得到证实，并且也可以应用于活性需要恢复或增强的细胞因子、激素和任何具有生理作用的功能性蛋白质。这也可以被自然界中不存在的从头设计的具有活性或活性组合的蛋白质使用。当通过在肿瘤中或皮下局部注射来施用时，IB在注射部位是稳定的，并且缓慢释放IB蛋白以在局部或远处发挥功能作用(当该蛋白用归巢肽靶向时)。在体外和体内两种情况下，当IB蛋白自组装为肿瘤靶向纳米颗粒时，这些纳米颗粒均会以组装形式从IB中释放出来。然后，在远处位置的皮下注射提供了持久的贮存平台，以用于为各种临床应用递送组织靶向治疗性蛋白质纳米颗粒。

作为催化剂，IB不会造成任何监管问题，并且非常便利。然而，IB的临床应用性也有缺点，并且为此受到以下事实的限制：

首先，IB为细菌来源的，并且它们含有不可去除的与药物配制品不相容的细菌组分，其组成可变，如细胞壁、核酸、内毒素和不需要的蛋白质。并且，由于细胞工厂基础，IB在制造批次之间存在若干均质性问题。

其次，发生糖基化或遵循细菌细胞不进行的其他翻译后修饰的蛋白质不能作为功能性IB产生。

最后，如先前所阐明，尽管即使具有淀粉样物质结构也明显无毒，但很少有测定和数据与之相关。

出于所有这些原因，显然需要提供用于在生物体的细胞中递送目的化合物(小分子药物、治疗性蛋白质、酶等)的替代结构，但维持IB的所有这些有益行为和特征也是一个期望。特别是它们对细胞的高穿透性和机械稳定性。

发明内容

发明人开发了不溶性蛋白质颗粒，这些不溶性蛋白质颗粒在生理条件下具有缓慢释放蛋白质的特征，包含组装自含式蛋白质的群簇或分组，出人意料地模拟了IB的优点而免除了缺点。人工IB在体外在不存在细菌细胞的情况下被制备(无细胞工程化)，因此处于完全合成模式。根据发明人的知识所及，这是第一次制作出类似于天然IB的蛋白质微米颗粒和纳米颗粒，通过这种方式另外避免了如前所述的天然IB中存在的问题特征。

因此，本发明的第一方面是蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇以及一种或多种二价阳离子盐，二价阳离子盐的摩尔:自含式蛋白质的摩尔的比率包括4:1至1000:1，其中该纳米颗粒或微米颗粒：

-具有以流体动力学直径测量的50纳米(nm)至50微米(μm)的尺寸；

-是机械稳定的，这意味着当经受包括如下的声处理条件时该自含式蛋白质的群簇保持结构化：在具有3mm直径钛探针的高强度声波仪必能信声波破碎仪450中，5轮40秒；0.5脉冲启动；0.5脉冲关闭，和10％波宽；

-当在4℃至30℃的温度下以15.000g离心时，在水性介质中呈沉淀球团形式；并且

-该微米颗粒或纳米颗粒在24小时内和在生理温度下重悬浮于水性介质中时，释放的组装自含式蛋白质按重量计的量低于相对于组装自含式蛋白质总重量的50％。

因此，获得作为不溶性球团的纳米颗粒或微米颗粒，所述溶解度在水性介质中以4℃至30℃的温度(或在18℃至30℃的室温)下测量。

用于测试机械稳定性的声波破碎仪将交流电(AC)高电压转化为20kHz的电能。这种高频能量被送入转换器以获得机械振动。

因此，已经开发出如IB发挥作用的合成的或无细胞工程化的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒。对于合成或无细胞工程化，应理解为所述纳米颗粒和/或微米颗粒的提供者/供应者不是原核或真核细胞，而是它们在接收物中合成。一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇或分组确实将配置成蛋白质支架。它是一种三维支架，在该三维支架中可以在由组装蛋白质限定的间隙空间之间粘附或嵌入不同于自含式蛋白质的其他化合物，就像可以将其他组分捕获和/或吸附到其中的网一样。这种支架一旦经受声处理条件时保持结构化。

因此，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒不含与自含式蛋白质不同的原核或真核细胞组分。

如下面的实例中所展示，本发明的蛋白质颗粒确实模拟了天然IB的特性。即，它们是机械稳定的；它们具有50nm至50μm的尺寸；它们由自含式的蛋白质形成，并且它们任选地包含另外的功能性蛋白质。在某些特定实施例中，它们由定义的比例的一种或多种蛋白质种类(获得自外部来源如蛋白质供应商)加上任何必要的另外的组分(如脂质)形成。它们允许释放蛋白质，这些蛋白质为组装的自含式的蛋白质或者嵌入组装自含式蛋白质的群簇中的任何其他蛋白质；并且它们在没有毒性的情况下穿透哺乳动物细胞，并且在细胞内释放功能性蛋白质。此外，细胞穿透性是可靶向的。

如具体实施方式中所述，已经通过生物物理蛋白质组学方法在实验室中实现了人工IB的设计和制造。

因此，本发明的第二方面是用于合成如上定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的方法，其中该方法包括以下步骤：

(a)在接收物中将一种或多种类型的蛋白质与极性溶剂混合；

(b)使步骤(a)的混合物经受蛋白质组装条件，以获得组装自含式蛋白质的群簇；并且

(c)分离这些群簇。

因此，该第二方面是用于合成蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的无细胞方法。

本发明还涉及包含一种或多种脂质和一种或多种变性蛋白质的膜，该一种或多种脂质和该一种或多种变性蛋白质自组装并配置成三维群簇或网，所述膜设置在支持物上。

如以下实例中将展示的，本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒穿透到肿瘤细胞中。因此，本发明的第三方面是用作药物的如上定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒。

因此，这些类似于天然包涵体的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是合成包涵体，并且本发明的另一方面是作为合成细菌包涵体的如上定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒。

此外，包含功能性蛋白质的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒可用作皮下植入物。通过这种方式，它们可以将具有治疗作用的化合物递送至生物体。这些化合物是配置成颗粒群簇的自含式蛋白质，该颗粒群簇在一个时间段内持续溶解或分解，所述自含式蛋白质具有治疗作用；或者这些化合物是任何不同于该蛋白质的治疗剂，该治疗剂可以嵌入或粘附至颗粒群簇上或甚至通过可水解键连接至自含式蛋白质。所有这些选择更详细地披露于下文中。

因此，本发明的另一方面是包含如上定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的药物递送系统。对于“药物”，应理解为具有经证实的治疗作用的任何化合物或甚至组合物。

本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒可用作药物组合物中的活性物质，并且因此，本发明的一个方面还是包含治疗有效量的上文披露的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。

还取决于蛋白质的特性和功能性(或活性)，本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒可用作化妆品组合物中的活性物质，并且因此，本发明的一个方面还是包含化妆品用有效量的上文披露的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同一种或多种适当的化妆品用可接受的赋形剂或载体的化妆品组合物。

附图说明

图1，与实例2相关，是本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的所检测直径(通过DLS计算)和这些直径的相对丰度(体积％)的图表。

图2，与实例2相关，示出了本发明的合成IB的场发射扫描电子显微术(FESEM)图像。电子高压，(EHT)＝1.00kV；工作距离(WD)＝3.3mm；信号A＝二次电子(SE2)；Mag＝2.56KX。

图3，与实例3相关，示出了在Cary Eclipse分光荧光计(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，穆尔格拉维(Mulgrave)，澳大利亚)中在512nm波长下测量的实例1的不同浓度功能性T22-GFP-H6(g/l)合成IB(浅色圆圈)的荧光发射相对强度。对照为通过组装大肠杆菌中产生的含GFP单体而形成的T22-GFP-H6的纳米颗粒(NP；深色圆圈)。

图4，与实例4相关，是随着时间(以小时(h)计的时间)以％表示的所释放功能性蛋白质的量(即功能性荧光性T22-GFP-H6的释放)的图表。

图5是在不同时间点通过流式细胞术分析的在暴露于不同实体的HeLa细胞中所检测到的细胞内荧光的图表。使用不同的内化实体进行不同的内化测定。

图6是在不同实体的存在下培养的细胞(HeLa)在24小时(左柱)、48小时(中柱)和72小时(右柱)的细胞活力百分比(细胞活力％)的图表。

图7，与实例7相关，包括通过将融合蛋白T22-GFP-H6与二价阳离子盐以不同的盐:蛋白质分子比例组装获得的若干种蛋白质微米颗粒的FESEM图像(对应地比例为40:1、100:1和150:1的图像1、2和3)。将它们与直接在细菌中产生的天然包涵体(图像0)进行比较。

图8，与实例7相关，描绘了本发明的ArtIB的特定制造模式。在图8(A)中，总结了从可溶性纯蛋白质制造ArtIB的多(ms)和单(ss)步骤程序，指示主要操作步骤(箭头)。OS是有机溶剂。精确的细节可以在实例8的方法章节中找到。最终产物被框出。在图8(B)中，为碱性磷酸酶(AP)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)ArtIB的代表性FESEM图像。所有图像的放大倍数相同。在图8(C)中，为ArtIB的DLS尺寸分析，指示模式(以nm计)和多分散指数(pdi)。在图8(D)中，为与商业可溶性蛋白质对应物的比活性相比，AP和β-Gal ArtIB二者的比活性(第一个柱对应于可溶性蛋白质，第二个柱对应于msArtIB，第三个柱对应于ssArtIB)。星号指示相对于可溶性蛋白质的比活性有统计学差异(Holme-Sidak检验，p<0.001)。

图9，也与实例8相关，示出了功能复杂的ArtIB的表征。在图9(A)中，为靶向CXCR4的ArtIB的FESEM图像，均以相同的放大倍数记录。在每个图像的底部，示出特定荧光衰减(SFD)、流体动力学尺寸峰值(pdi±sem)和ALS百分比。在图9(B)中，为T22-GFP-H6 ArtIB在培养的HeLa细胞中的内化，通过细胞内GFP荧光以暴露后的不同时间记录(顶部)。在底部，为AMD3100介导的ArtIB内化抑制(存在抑制剂的情况下为带虚线图案的柱；无抑制剂的情况下为单色柱)。在图9(C)中，为培养的HeLa细胞在存在(带虚线图案的柱)或不存在AMD3100(单色柱)的情况下在96h暴露于T22-GFP-H6和T22-PE24-H6 ArtIB后的活力。在图9(D)中，为在生理缓冲液中孵育之后7天，对从ArtIB释放的可溶性蛋白质(r)的免染蛋白质检测。在图中，为可溶性蛋白质从T22-GFP-H6 ssArtIB释放的动力学。在图9(E)中，为与从重组细菌(用于ArtIB制造的那些)纯化后的等效可溶性纳米颗粒相比，从ssArtIB释放的T22-GFP-H6纳米颗粒的流体动力学模式尺寸峰值。在插图中，为从ArtIB释放的那些纳米颗粒的FESEM图像。在图9(F)中，为AMD3100介导的对重组可溶性纳米颗粒和ArtIB释放的纳米颗粒的HeLa细胞内化的抑制。符号指示相对于对照有显著差异(*，p<0.05，图基检验)，以及在具有或不具有AMD3100的情况下在样品之间有显著差异(-，p<0.05，双尾，t检验)。

图10，与实例9相关，描绘了CXCR4⁺结直肠癌模型中ArtIB材料释放、肿瘤摄取和抗肿瘤活性。在图10(A)中，为在皮下植入T22-GFP-H6 msArtIB、T22-GFP-H6ssArtIB(Zn²⁺100:1)或PBS(缓冲液)后对所释放材料和肿瘤摄取(图表中的方形)的初步筛选：图表中的菱形表示在注射点(IP)处的剩余材料。在图10(B)中，为在注射点(IP)和远处肿瘤(T)处获得的随着在SC施用T22-GFP-H6 ssArtIB Ca²⁺、T22-GFP-H6 ssArtIB Zn²⁺(1:50)或缓冲液之后的时间(第0、3、6和10天)的代表性FLI图像。在图10(C)中，为在CXCR4⁺SW1417-luci肿瘤模型中测量为随着在SC注射1mg剂量/小鼠的T22-GFP-H6 Ca²⁺ArtlB、T22-PE24-H6 Ca²⁺ArtIB或对照PBS之后的时间的癌细胞生物发光发射的抗肿瘤作用(*，p<0.05，图基检验)。使用I

光谱测量荧光(小图a和b)或生物发光(小图c)强度，并表示为平均辐射效率的x±SE。

具体实施方式

除非另外说明，否则本申请中如本文所用的所有术语应以本领域已知的普通含义来理解。如本申请中所用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在始终适用于整个说明书和权利要求，除非另外明确列出的定义提供了更广泛的定义。

术语“自含式蛋白质”涉及如下蛋白质，当其与其他蛋白质组装时自身构成独立单元(群簇)或保持配置成由蛋白质构成的确定有序的支架或结构或分组。术语“群簇”涉及蛋白质的离散分组，以及其他化合物的离散分组。

“无活细胞工程化”或“无细胞制造”应理解为微米颗粒和纳米颗粒是合成获得的，没有任何活细胞作为所述颗粒的来源。因此，形成群簇的蛋白质尽管源自活的原核或真核细胞，但它们不在任何细胞内组装或在进行组装的接收物内不是在存在细胞的情况下组装。因此，颗粒不含在活的原核或真核细胞中形成颗粒的情况下可能存在的任何化合物(细胞碎片、细胞质组分和膜组分)。

术语“组装剂”涉及允许某些分子(如蛋白质或蛋白质和脂质的混合物)配置成分子的离散单元或分组(以三维支架的模式)的任何化合物和/或物理条件。取决于组装剂或条件以及蛋白质的性质，所述分组可以是有组织的或无组织的分组。

术语“相对于组装自含式蛋白质的总重量而言，按重量计低于50％的组装自含式蛋白质的量的释放”意指微米颗粒或纳米颗粒确实是具有缓慢释放特征的递送系统，并且经一个时间段，在生理条件下，由组装的蛋白质配置的群簇失去少于50％w/w的自含式蛋白质。生理条件包括34.5℃至42℃的温度(正常为36.5℃至37.5℃(所述生理温度))和约7(6.5-7.8)的pH。这种释放还应理解为在特定介质中递送所述蛋白质的一种方式。该介质可以特别是可使得颗粒最终被分解(特别是以持续的方式分解)的来自活生物体的组织。本领域技术人员知晓确定所释放蛋白质的量和保留在群簇中的蛋白质的量的不同方式。在本说明书的实例中披露了更具体的方式。

术语“不溶性球团”意指当在水性介质中且在4℃至30℃的温度(或18℃至30℃的室温)下制造时，纳米颗粒或微米颗粒沉淀或者它们沉积在作为它们所形成之处的接收器的底部。因此，纳米颗粒或微米颗粒在制造(在4℃-30℃)它们的水性介质中呈“沉淀球团”形式，并且该形式在允许沉积的预定时间段内或通过温和离心(例如以15.000g)可见。温和离心包括本领域技术人员已知的条件，所述条件允许在接收物的底部分离颗粒但保留其功能结构(即不损坏或破坏颗粒和/或依附于颗粒的蛋白质)。

术语“机械稳定的”，这意味着自含式蛋白质的群簇保持结构化，也就是说，当经受特定的声处理条件时，这些自含式蛋白质保持组装形成群簇。对于“保持结构化”应理解为形成群簇的一部分的组装自含式蛋白质不会失去其三维构型，从而使得自含式蛋白质保持群簇的形式(集聚、聚集)；类似于天然的包涵体。

术语“变性形式”或“变性蛋白质”意指通过施加一些外部压力或化合物(如强酸或强碱、浓无机盐、有机溶剂(如酒精或氯仿)、辐射或热)，蛋白质至少失去了在其天然状态中存在的四级结构和三级结构。

术语“功能性蛋白质”当在本说明书中使用时涉及维持、发挥或提供其预期活性的蛋白质的广泛接受的含义。例如，如果蛋白质具有荧光发射的能力，那么如果它能够发射这种荧光(这就是使用或设计它的目的)，该蛋白质就是功能性的。另一方面，如果蛋白质的通常功能涉及抑制生长因子，那么功能性蛋白质将保持这种特性。

如本文所用，“靶向分子”是指对特定细胞、组织或器官具有特异性的分子。靶向分子的优选示例包括但不限于抗体、生长因子和多糖。

该颗粒是纳米颗粒或微米颗粒。如本文所用，术语“纳米颗粒”是指至少两个维度为纳米级，特别是所有三个维度为纳米级的颗粒。以此类推，如本文所用，术语“微米颗粒”是指至少两个维度为微米级，特别是所有三个维度为微米级的颗粒。在特定实施例中，该颗粒为50nm至50μm。具体地，为60nm至10μm。更具体地，为60nm至5μm。甚至更具体地，为500nm至5μm。在某些实施例中，为60nm至1μm，甚至更具体地为60nm至900nm。其他更特别的尺寸为60nm至200nm。本发明的蛋白质颗粒以及根据其中披露的方法产生的蛋白质颗粒包括微米颗粒和纳米颗粒的分布。因此，术语“蛋白质纳米颗粒或微米颗粒”或术语蛋白质-脂质“纳米颗粒或微米颗粒”涉及包括纳米颗粒、微米颗粒或纳米颗粒和微米颗粒的组合在内的不同尺寸的颗粒的混合物或分布。

关于本文所述的纳米颗粒或微米颗粒的形状，包括球形、多面体和棒状。特别地，当纳米颗粒或微米颗粒基本上呈具有基本上圆形截面的棒状，如纳米线或纳米管、微线或微管时，“纳米颗粒”或“微米颗粒”是指至少两个维度为纳米级或微米级的颗粒，这两个维度是纳米颗粒或微米颗粒的截面。

在第一方面的任选地与上文或下文提供的任何实施例组合的特定实施例中，该颗粒为球形或伪球形。

如本文所用，术语“尺寸”是指特征物理大小。例如，在纳米颗粒/微米颗粒基本上呈球形的情况下，纳米颗粒/微米颗粒的尺寸对应于纳米颗粒/微米颗粒的直径。当将一组纳米颗粒/微米颗粒称为具有特定尺寸时，设想到了该组可具有所指定尺寸左右的尺寸分布。因此，如本文所用，一组纳米颗粒/微米颗粒的尺寸可以指尺寸分布的模式，如尺寸分布的峰值尺寸。此外，当不是完美的球形(伪球形)时，直径是包括物体在内的球形体的等效直径。该直径通常称为“流体动力学直径”，可以使用偶联Atlas细胞加压系统的Wyatt Mobius进行测量。透射电子显微术(TEM)图像也提供有关直径的信息。

如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”与“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”同义。除非另有说明，否则本文使用的定冠词，如“该”还包括名词的复数形式。

如本文所用，表述“治疗有效量”是指当施用时，足够预防所处理的疾病的一种或多种症状的发展或在一定程度上缓解该疾病的一种或多种症状的化合物的量。根据本发明的所施用的化合物的具体剂量当然将由围绕病例的具体情况决定，包括所施用的化合物、施用途径、正在被治疗的具体病症、以及类似考虑事项。

术语“化妆品用有效量”被定义为在合理的医学判断范围内，任何足以显著改善皮肤美容外观而无显著刺激、但足够低以避免严重副作用(在合理的受益/风险比率下)的量。本发明颗粒的安全有效量将随消费者的年龄和身体状况、皮肤状况、治疗持续时间、任何同时治疗的性质、所用活性成分的具体组合、使用的特定化妆品用可接受的载体、以及任何主治医生的知识和专业知识中的类似因素而变化。

表述“药学上可接受的赋形剂或载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物。每种组分在与该药物组合物的其他成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它还必须适用于以合理的受益/风险比率与人类和动物的组织或器官相接触，而不产生过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症。

本文可互换使用的术语“化妆品用可接受的”或“皮肤病学上可接受的”是指适合用于与人皮肤接触而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的赋形剂或载体。

如上文所指示，本发明涉及蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是在接收物中无细胞制造的，包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇以及一种或多种二价阳离子盐，二价阳离子盐的摩尔:自含式蛋白质的摩尔的比率包括4:1至1000:1，其中这些纳米颗粒或微米颗粒：

-是机械稳定的，这意味着当经受包括如下的声处理条件时该自含式蛋白质的群簇保持结构化，意味着不失去三维构型：在具有3mm直径钛探针的高强度声波仪必能信声波破碎仪450中，5轮40秒；0.5脉冲启动；0.5脉冲关闭，和10％波宽；

-这些纳米颗粒或微米颗粒在24小时内和在生理温度下重悬浮于水性介质中时，释放的组装自含式蛋白质按重量计的量低于相对于组装自含式蛋白质总重量的50％。

在一些特定实施例中，这些颗粒在生理温度下重悬浮于水性介质中时，在至少15天内释放按重量计至少50％的组装自含式蛋白质。

在特定实施例中，蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含由一种或多种类型的组装自含式蛋白质构成的群簇，这些蛋白质由于支架(或群簇)内存在二价阳离子盐而如此组装或聚集。因此，在特定实施例中，根据第一方面的蛋白质纳米颗粒和/或微米颗粒进一步包含一种或多种二价阳离子盐。

二价阳离子盐包括单一盐和多重盐(即复盐)及其组合。在更特定的实施例中，这些盐的二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺及其组合。在特定实施例中，这些盐的二价阳离子是碱土金属阳离子。在特定实施例中，这些盐是二价阳离子的无机盐，更特别是Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺及其组合的无机盐。具体的盐包括CaCl₂、ZnCl₂、NiCh及其组合。更具体地，该盐是ZnCl₂。

在第一方面的任选地与上文或下文的任何实施例组合的另一个特定实施例中，这些组装自含式蛋白质包含一个或多个氨基酸，该一个或多个氨基酸由于在生理pH下存在电荷和/或存在芳族或杂芳族结构可以与二价阳离子配位。在第一方面的任选地与上文或下文的任何实施例组合的另一个特定实施例中，这些组装自含式蛋白质包含一个或多个组氨酸残基。因此，它们是含组氨酸蛋白质。

在任选地与上文或下文的任何实施例组合的另一个特定实施例中，蛋白质分子的群簇包含带His标签的蛋白质。带His标签的蛋白质也称为富含组氨酸的蛋白质，它们是包含多组氨酸标签的蛋白质，通常为重组蛋白质。根据本发明的带有His标签的蛋白质还包括在其氨基酸序列中具有选自3、4、5、6、7、7、9和10个组氨酸的多个组氨酸的蛋白质。多组氨酸标签是在蛋白质中的通常在蛋白质N末端或C末端的氨基酸基序，通常由至少六个组氨酸(His)残基组成。一些蛋白质还在其氨基酸序列的中间(例如环区域)包含这些至少六个组氨酸残基。这种组氨酸残基基序也称为六组氨酸标签、6xHis标签、His6标签和商标名称His-tag(由EMD Biosciences注册)。根据本发明的带His标签的蛋白质还包括在其序列中包含高量组氨酸氨基酸的天然蛋白质。

在第一方面的任选地与上文或下文的任何实施例组合的另一个特定实施例中，这些组装自含式蛋白质包括非纤维状蛋白质，或者换言之，配置成组装蛋白质的群簇的蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：膜蛋白、球状蛋白、无序蛋白及其组合。在另一个特定实施例中，配置成组装蛋白质的群簇的蛋白质选自碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及其组合。

在第一方面的另一个特定实施例中，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含自含式蛋白质，这些自含式蛋白质是治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。在该特定实施例中，配置成纳米颗粒或微米颗粒的群簇或支架的相同蛋白质是当颗粒在生理条件下在预定时间段内持续溶解时可以递送的治疗剂，该时间不仅取决于蛋白质本身的性质，而且取决于可与配置成该群簇的自含式蛋白质伴随的其他化合物(如其他功能性蛋白质、小药物分子或治疗剂)或伴随的脂质结构的性质(作为非限制性示例的方式)。

具体的治疗性蛋白质，这意味着它们是具有已证实的治疗作用的肽(4至30个氨基酸)或多肽(从31个氨基酸开始)，包括酶(如碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)、激素(即胰岛素、生长激素等)、造血生长因子(促红细胞生成素及衍生物，细胞刺激因子，如粒细胞集落刺激因子等)、干扰素(干扰素-α、-β、-γ)、血液因子(即因子VIII、因子IX)、溶栓剂(组织纤溶酶原激活剂)、抗体(单克隆和多克隆抗体)、肿瘤坏死因子、病毒表面抗原和激素(胰岛素、胰高血糖素、促性腺激素、生长激素)、细胞膜受体和相应的分泌形式(即klotho蛋白)。治疗性蛋白质还包括肽适配体和亲和性多聚体(affimer)分子。

因此，本发明的颗粒可以用作药物，特别是在有效量的治疗性蛋白质为活性成分的疾病中。

在特定实施例中，这些自含式蛋白质是具有选自以下项的治疗作用的治疗性蛋白质：抗肿瘤作用、抗炎作用、抗生素作用、抗真菌作用、抗病毒作用、生长因子作用、细胞生长抑制剂作用、抗血小板作用、抗血栓形成作用、溶栓作用及其组合。在更特定的实施例中，这些自含式蛋白质是具有抗肿瘤作用的治疗性蛋白质。

在任选地与上文或下文的实施例组合的又另一个特定实施例中，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的群簇。在该特定实施例中，该纳米颗粒或微米颗粒包含含有蛋白质和脂质的群簇，这些蛋白质和脂质配置成具有一种或多种自含式蛋白质和与这些蛋白质相缔合的脂质的立体支架(即结构)。在另一个特定实施例中，存在与包含脂质的该群簇相互作用的其他化合物，所述化合物选自不同于自含式蛋白质和/或小药物(治疗剂)的功能性蛋白质。这些其他化合物设置于脂质和蛋白质的群簇的间隙空间内和/或通过离子相互作用、范德华力粘附(吸附)到群簇上，或者它们共价连接。

因此，在蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的另一个更特定实施例中：

-这些自含式蛋白质是变性蛋白质，并与组装的脂质一起配置成三维支架；并且

-该颗粒进一步包含设置于该三维支架内和/或粘附(吸附)于该三维支架上的一种或多种功能性蛋白质。

在蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的另一个特定实施例中，一种或多种功能性蛋白质是治疗性蛋白质，这些治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。

在更特定的实施例中，该一种或多种脂质选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酸、甘油磷脂、甾醇、鞘脂及其组合。在更特定的实施例中，甘油磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及其组合。甾醇特别选自胆固醇、植物甾醇及其组合。鞘脂选自鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、葡糖脑苷脂及其组合。特别地，这些脂质是包含在三个已知类别中的那些；磷脂、糖脂和胆固醇。在特定实施例中，该一种或多种脂质是生物细胞膜中的常见脂质。

在第一方面的另一个特定实施例中，该一种或多种功能性蛋白质是治疗性蛋白质，这意味着它们是具有经证实的治疗作用的肽(4至30个氨基酸)或多肽(从31个氨基酸开始)，如先前针对自含式蛋白质所披露的。治疗性蛋白质的示例也包括酶、激素(即胰岛素、生长激素等)、造血生长因子(促红细胞生成素及衍生物，细胞刺激因子，如粒细胞集落刺激因子等)、干扰素(干扰素-α、-β、-γ)、血液因子(即因子VIII、因子IX)、溶栓剂(组织纤溶酶原激活剂)、抗体(单克隆和多克隆抗体)、肿瘤坏死因子、病毒表面抗原和激素(胰岛素、胰高血糖素、促性腺激素、生长激素)、细胞膜受体和相应的分泌形式(即klotho蛋白)。治疗性蛋白质还包括肽适配体和亲和性多聚体(affimer)分子。

在另一个特定实施例中，在二价阳离子的存在下功能性蛋白质被配置为自组装蛋白质(更特别为含组氨酸蛋白质)的纳米颗粒，这些二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺及其组合。该特定实施例将是在特别是具有1μm至50μm尺寸的蛋白质微米颗粒中。

在第一方面的另一个特定实施例中，设置于自组装蛋白质的或者蛋白质和脂质的支架或群簇内的一种或多种功能性蛋白质可以另外共价连接至该支架。在这种特定情况下，并且当功能性蛋白质是有待释放的活性物质时，共价连接是可水解的键。更具体地说，它们在生理条件下是可水解的(即酯键、酰胺键)。

在另一个特定实施例中，这些一种或多种功能性蛋白质是共价连接和/或缀合至治疗剂或多于一种治疗剂的蛋白质。这意味着除了功能性蛋白质本身具有治疗作用外，其他具有治疗作用的分子也被组合(与或不与功能性蛋白质共价连接)。在一个特定实施例中，这些治疗剂是小分子(≤900Da)。在替代方案中，连接或缀合至功能性蛋白质的治疗剂是另一种蛋白质或肽。在又另一个特定实施例中，治疗剂和功能性蛋白质构成融合蛋白并包含两个或更多个通过重组技术(即在表达细胞中的外源表达)可操作地连接和产生的多肽片段。在后一种情况下，当使用融合蛋白时，融合多肽中的一种或多种是功能性蛋白质并具有治疗作用。在特定实施例中，融合蛋白的治疗作用是多价治疗作用，这意味着融合多肽中的每一个发挥可以彼此互补的不同作用。在另一个特定实施例中，所有融合蛋白发挥相同的治疗作用(即所有融合部分都具有抗肿瘤作用)。

在又另一个特定实施例中，嵌入或粘附至纳米颗粒或微米颗粒的群簇、连接和/或缀合至一种或多种功能性蛋白质或颗粒中的自含式蛋白质的治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：抗肿瘤剂、抗炎分子、抗生素、抗真菌分子、抗病毒分子、生长因子、细胞生长抑制剂、抗血小板剂、抗血栓形成剂、溶栓剂及其组合。

下文列出了不同性质的、嵌入、粘附或连接在微米颗粒或纳米颗粒中的治疗剂的非限制性示例：

抗生素的非限制性示例包括β-内酰胺抗生素(青霉素衍生物、单环β-内酰胺类(monobactam)和碳青霉烯类；多粘菌素类，如粘菌素；利福霉素类；闰年霉素类(lipiarmycin)；喹诺酮类；磺胺类；大环内酯类；林可胺类；四环素类；杀细菌性氨基糖苷类；环脂肽类，如达托霉素；甘氨酰环素类，如替加环素；噁唑烷酮类，如利奈唑胺；和闰年霉素类，如非达霉素。

以类似的方式，抗真菌分子的非限制性示例是两性霉素B、杀假丝菌素、菲律宾菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素和龟裂杀菌素；唑类抗真菌剂，如咪唑类，例如联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；三唑类，例如阿巴康唑、氟康唑、伊夫康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑；和噻唑类，例如阿巴芬净；烯丙胺类，如阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬和特比萘芬；棘球白素类，如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；苯甲酸；环吡酮胺；氟胞嘧啶；灰黄霉素；托萘酯和十一碳烯酸。

抗病毒分子的非限制性示例包括病毒辅助蛋白(VAP)抗独特型抗体；金刚烷胺；金刚乙胺；普乐康尼；阿昔洛韦；齐多夫定(AZT)；拉米夫定；整合酶；福米韦森；利米定(rifampicin)；扎那米韦和奥司他韦，以及抗寄生虫分子，如甲苯咪唑；双羟萘酸噻嘧啶；噻苯咪唑；乙胺嗪(diethylcarbamazine)；伊维菌素；氯硝柳胺；吡喹酮；阿苯达唑；吡喹酮；利福平(rifampin)；两性霉素B；美拉胂醇(melarosprol)；依氟鸟氨酸；甲硝唑；替硝唑和米替福新。

治疗剂的另外的示例包括生长因子，如肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、mystatin(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、和胎盘生长因子(PIGF)。

在又一个更特定的实施例中，抗肿瘤剂选自由以下组成的分类组中的一种或多种：化疗剂、细胞毒剂(即具有多肽性质或小药物)和抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗转移剂或抗增殖剂(即抗有丝分裂剂)、免疫刺激剂(即促进对肿瘤的免疫应答)、由肿瘤抑制基因编码的多肽、毒素及其组合。

作为最终旨在对抗患者的癌症过程的化合物的抗肿瘤剂的具体示例包括但不限于法尼基转移酶抑制剂；烷化剂，如氮芥，例如二氯甲二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安；亚硝基脲，例如N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链脲佐菌素；四嗪类，例如达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺，以及氮丙啶类，例如噻替哌、丝裂霉素、亚胺醌(AZQ)；和顺铂，例如顺铂、卡铂和奥沙铂(oxaplatin)；抗代谢物，如抗叶酸，例如甲氨蝶呤和培美曲塞；氟嘧啶，例如氟尿嘧啶和卡培他滨；脱氧核苷类似物，如阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、维达扎(Vidaza)、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他汀；和硫嘌呤类，例如硫鸟嘌呤和巯嘌呤；抗微管剂，如长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁；和紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；和鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、麦尔巴隆(merbarone)和阿柔比星；细胞毒性抗生素，如蒽环类，例如多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星、米托蒽醌、放线菌素、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素。其他特定的抗肿瘤剂包括抗体，特别是单克隆抗体，如曲妥珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、替坦-艾瑞妥莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗(panatimumab)。

其他治疗剂包括核酸适配体、肽适配体以及亲和性多聚体。

在本发明第一方面的又另一个特定实施例中，蛋白质纳米颗粒或微米颗粒进一步包含与组装自含式蛋白质的群簇连接的靶向分子。该靶向分子对必须递送本发明颗粒的特定细胞、组织或器官具有特异性。靶向分子的优选示例包括但不限于抗体、生长因子和多糖。

本发明还包括一种用于合成如上定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的方法，其中该方法包括以下步骤：

(a)在接收物中将一种或多种类型的蛋白质在极性溶剂中、更特别是在极性缓冲溶剂中混合；

(b)使步骤(a)的混合物经受蛋白质组装条件，以获得包含组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒；并且

(c)分离该纳米颗粒或微米颗粒。

因此，本发明包括蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇，其中该纳米颗粒或微米颗粒：

-该纳米颗粒或微米颗粒在24小时内和在生理温度下重悬浮于水性介质中时，释放的组装自含式蛋白质按重量计的量低于相对于组装自含式蛋白质总重量的50％；

并且其中该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒通过包括以下步骤的方法可获得：

(b)使步骤(a)的混合物经受蛋白质组装条件，以获得包含组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒；并且(c)分离该纳米颗粒或微米颗粒。

在第二方面的方法和通过该方法可获得的纳米颗粒或微米颗粒的更特定实施例中，在步骤(b)中蛋白质组装条件包括将盐添加至步骤(a)的混合物中，这些盐在该混合物中的最终盐浓度允许该一种或多种蛋白质沉淀，和/或应用蛋白质变性温度。

在第二方面的方法和通过该方法可获得的纳米颗粒或微米颗粒的另一个更特定的实施例中，该方法包括以下步骤：

(a)在接收物中将一种或多种类型的蛋白质在极性溶剂中混合；

(b)向步骤(a)的混合物中添加二价阳离子盐溶液，这些盐在该混合物中的最终盐浓度允许该一种或多种蛋白质沉淀；

(c)将沉淀的一种或多种蛋白质与它们沉淀于其中的溶剂分离，该沉淀的一种或多种蛋白质是包含组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，并且任选地将它们重悬浮于新鲜缓冲溶剂中。

新鲜缓冲液意指新的极性溶剂，该极性溶剂包含用于控制pH的缓冲系统以及具有蛋白质所需离子力(等渗)的盐浓度。

因此，在第一方面的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的特定实施例中，所述蛋白质纳米颗粒或微米颗粒通过包括以下步骤的方法可获得：

在特定实施例中，分离的步骤(c)通过技术人员已知的选自下组的方式进行，该组由以下各项组成：离心、过滤、干燥及其组合。在另一个更特定的实施例中，通过离心进行分离。

在第二方面的方法和通过该方法可获得的纳米颗粒或微米颗粒的另一个特定实施例中，当使用二价阳离子盐时，二价阳离子盐的摩尔:蛋白质的摩尔的最终比率包括4:1至1000:1。该比例将取决于将要使用的蛋白质，并且技术人员将知道如何调节量。例如，可以与二价阳离子形成复合连接的组氨酸残基或其他氨基酸残基的数量在调整比例时将是可变的，当在蛋白质分子中与阳离子残基的这种复合的数量更高时，主要需要少量的二价阳离子。因此，它会根据蛋白质分子中可以与二价阳离子螯合(配位连接)的氨基酸而变化。在使用二价阳离子盐时的第二方面的方法的特定实施例中，该一种或多种蛋白质包含一个或多个组氨酸残基。

在第二方面的方法和通过该方法可获得的纳米颗粒或微米颗粒的另一个更特定的实施例中，二价阳离子盐的摩尔:蛋白质的摩尔的最终比率包括5:1至500:1。更特别的为10:1至500:1，甚至更特别的为20:1至200:1。特别优选的比率选自5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、100:1和150:1。技术人员将理解这些比率以及4:1至1000:1的那些比率在根据第一方面定义的所获得的纳米颗粒或微米颗粒中将得以保持。

二价阳离子的特定盐与针对本发明第一方面所指示的相同。

因此，在特定实施例中，本发明包括一种蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是无细胞制造的纳米颗粒或微米颗粒，该无细胞制造的纳米颗粒或微米颗粒包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇以及一种或多种二价阳离子盐，二价阳离子盐的摩尔:自含式蛋白质的摩尔的比率包括4:1至1000:1，其中该纳米颗粒或微米颗粒：

(b)向步骤(a)的混合物中添加二价阳离子盐溶液，二价阳离子盐的摩尔:

在该混合物中自含式蛋白质的摩尔的最终比率包括4:1至1000:1，以允许该一种或多种蛋白质沉淀：

在该方法的另一个特定实施例中，所述方法用于合成如上文定义的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒并且包括以下步骤：

(b)向步骤(a)的混合物中添加蛋白质变性盐浓度的盐溶液，和/或使该混合物经受蛋白质变性温度，从而允许变性形式的该一种或多种蛋白质(变性蛋白质)沉淀；

(c)将沉淀的一种或多种蛋白质与该一种或多种蛋白质在其中沉淀的溶剂分离，并将该一种或多种蛋白质重悬浮于新鲜缓冲溶剂中，所述用新鲜溶剂重悬浮的步骤包括：

(c.1)将沉淀的蛋白质与溶解于有机溶剂中的一种或多种脂质混合，并且其中蛋白质和脂质的量的比率为0.8:1至1:0.8，更特别为1:1；

(c.2)将该有机溶剂去除以在该接收物的表面上获得变性蛋白质和脂质的干膜；

(c.3)将步骤(c.2)的干膜用缓冲组合物悬浮，所述缓冲组合物任选地包含在水性介质中的一种或多种功能性蛋白质，同时在4℃至8℃的受控温度下搅拌该混合物以获得蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的群簇，所述群簇任选地包含嵌入和/或吸附在组装自含式蛋白质和脂质的群簇内的一种或多种功能性蛋白质；

(c.4)将该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒与剩余的缓冲组合物分离。

因此，在第一方面的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的特定实施例中，所述蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒通过包括以下步骤的方法可获得：

(b)向步骤(a)的混合物中添加蛋白质变性盐浓度的盐溶液，同时和/或使该混合物经受蛋白质变性温度，从而允许变性形式的该一种或多种蛋白质(变性蛋白质)沉淀；

在这些方法的特定实施例中，步骤(a)的极性溶剂是水性缓冲组合物，更特别地是pH为6.8至7.5的水性缓冲组合物。更特别地是具有调节pH的缓冲液的水。特定的缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(含有磷酸氢二钠、氯化钠，并且在一些配制品中含有氯化钾和磷酸二氢钾)、Tris-甘氨酸或Tris-HCl。水性缓冲组合物在本说明书中也称为“水性介质”。

在应用蛋白质变性温度以允许蛋白质沉淀的方法的特定实施例中，所述温度包括60℃至120℃。这些温度允许获得变性蛋白质。在该方法的另一个特定实施例中，在步骤(b)的最终混合物中蛋白质变性盐浓度为至少0.5M。又更特别地，用于合成蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法的步骤(b)在90℃至120℃的温度下进行，并且盐浓度为至少0.5M。

在用于合成蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法中的特定盐选自单价阳离子盐、二价阳离子盐及其组合。特定的二价阳离子盐选自下组，该组是先前针对第一方面所指示的。更特别地，盐选自下组，该组由以下各项组成：NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂、ZnCl₂及其组合。

在用于合成蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法的另一个特定实施例中，在将沉淀的一种或多种蛋白质进行分离和重悬浮的步骤(c)中，步骤(c1)是用选自下组的有机溶剂进行的，该组由以下各项组成：乙醇、氯仿和甲醇的混合物、己烷、氯仿、甲醇及其组合。

在用于合成蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法的另一个特定实施例中，在将沉淀的一种或多种蛋白质进行分离和重悬浮的步骤(c)中，步骤(c3)是用水性缓冲组合物、更特别地为pH在6.8至7.5的水性缓冲组合物进行的。在另一个更特定的实施例中，该缓冲组合物包含水性介质中的一种或多种功能性蛋白质，使得当用所述缓冲液重悬浮变性蛋白和脂质的膜时，形成群簇并且这些群簇包含嵌入群簇中或粘附(吸附)于群簇上的另外的功能性蛋白质

用以进行这些方法的特定接收物是选自下组的材料的接收物，该组由以下各项组成：玻璃、聚丙烯(HDPP或LDPP)和聚乙烯。在另一个特定实施例中，支持物是玻璃。当使用可能溶解一些塑料类型(聚合物)的特定有机溶剂时，优选使用玻璃。

本发明还涉及包含一种或多种脂质和一种或多种变性蛋白质的干膜，该一种或多种脂质和该一种或多种变性蛋白质自组装并配置成三维群簇、网，所述膜设置在支持物上。

对于干膜，应当理解，膜湿度的百分比为根据已知标准方法测量的0％至30％相对湿度。

在膜的另一个特定实施例中，支持物是选自下组的材料的平坦表面，该组由以下各项组成：玻璃、聚丙烯(HDPP或LDPP)和聚乙烯。在另一个特定实施例中，支持物是玻璃。如所指示，当使用可能溶解一些塑料类型的特定有机溶剂时，优选使用玻璃。

通过包括以下的方法可获得包含一种或多种脂质和一种或多种变性蛋白质的干膜，该一种或多种脂质和该一种或多种变性蛋白质自组装并配置成三维群簇：

(c)将沉淀的一种或多种蛋白质与它们沉淀于其中的溶剂分离，并将沉淀的蛋白质与溶解于有机溶剂中的一种或多种脂质混合，并且其中蛋白质和脂质的量的比率为0.8:1至1:0.8，更特别是1:1；并且

(d)将该有机溶剂去除以在该接收物的表面上获得变性蛋白质和脂质的干膜。

可以将本发明的该膜进一步用任选地包含一种或多种所需的如上文指示的功能性蛋白质的缓冲组合物重悬浮，以获得蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，这些蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的支架(或群簇)，所述群簇任选地包含嵌入和/或吸附在组装自含式蛋白质和脂质的群簇内的一种或多种功能性蛋白质。因此，重悬浮的膜允许获得包含具有一种或多种脂质和一种或多种变性蛋白质的群簇的颗粒，该一种或多种脂质和该一种或多种变性蛋白质自组装并配置成三维网；并且该一种或多种功能性蛋白质设置于支架内或粘附于支架上。

特定的有机溶剂如上文针对获得纳米颗粒或微米颗粒的方法所披露的。

本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒用于用作药物，作为另外的方面。

在特定实施例中，这些颗粒用于治疗选自下组的疾病，该组由以下各项组成：癌症、免疫疾病、神经变性疾病及其组合。该实施例还可以构想为如上文定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒用于制造治疗或预防选自下组的疾病的药物的用途，该组由以下各项组成：癌症、免疫疾病、神经变性疾病及其组合。本发明还涉及一种用于治疗或预防选自下组的疾病的方法，该组由以下各项组成：癌症、免疫疾病、神经变性疾病及其组合，该方法包括在包括人在内的有需要的受试者中施用药学有效量的如上文定义的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同药学上可接受的赋形剂或载体。特定的癌症包括结直肠癌。

如所指示的，本发明的一个方面是药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的上文披露的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同药学上可接受的赋形剂或载体。

在特定实施例中，本发明的药物组合物可以配制成若干种形式，包括但不限于溶液、片剂、胶囊、颗粒剂、悬浮液、分散体、乳膏、软膏、粉末、锭剂(lozenge)、可咀嚼糖果、糖果棒、浓缩物、滴剂、酏剂、乳液、膜、凝胶、颗粒、口香糖、冻胶、油、糊剂、锭剂(pastille)、小丸剂、皂、海绵、栓剂、糖浆、可咀嚼明胶形式或咀嚼片剂。

合适的药学上可接受的赋形剂的示例是溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学效应或在其他方面以有害方式与药物组合物的一种或多种任何其他组分相互作用，否则其使用被考虑在本发明的范围内。

本发明药物组合物中蛋白质纳米颗粒或微米颗粒、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量将根据所治疗受试者的特性、体型以及状况而变化，并且还取决于施用组合物的途径。

用于制造药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。根据配制者的判断，诸如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂等赋形剂可以存在于组合物中。

在药物组合物的特定实施例中，它用于皮下施用。

本发明还涉及化妆品组合物，这些化妆品组合物包含化妆品用有效量的上文披露的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同一种或多种适当的化妆品用可接受的赋形剂或载体。特别的化妆品组合物包含蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，这些蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质的群簇和任选的嵌入或粘附至所述群簇的其他功能性蛋白质，任何这些蛋白质中的一种或多种，无论是组装自含式蛋白质还是所嵌入或粘附的功能性蛋白质，均选自化妆品中常用的蛋白质并且选自任何类型的胶原蛋白、生长因子、弹性蛋白、纤维蛋白等。这些蛋白质以及由此包含这些蛋白质的化妆品组合物可特别用于皮肤护理，特别是用于改善以下症状中的至少一种：粗糙、片状、脱水、紧绷、皲裂和缺乏弹性。

其他更特别的化妆品组合物包含粘附或嵌入在纳米颗粒或微米颗粒中的另外的化妆品活性成分。化妆品活性物质的非限制性示例包括植物提取物、植物细胞裂解物、抗皱化合物、保湿化合物、增白化合物、瘢痕形成(cicatrisation)化合物、消脂肪团化合物、紧肤化合物、抗氧化化合物等。这些完整的化合物可以具有不同的性质，甚至具有肽性质或分离的氨基酸。它们还可以源自植物化合物，如植物甾醇、多酚、萜烯等，或具有脂质性质，如脂肪酸，或甚至它们可以源自核酸。也可以使用具有多糖结构的化合物(即透明质酸化合物)或羧酸。因此，所有那些提供美容效果的活性物质均可用于本发明的化妆品组合物中。

贯穿本说明书和权利要求书，词语“包含/包括”以及所述词语的变形并不旨在排除其他的技术特征、添加物、组分、或步骤。此外，词语“包含”涵盖“由……组成”的情况。当审查本说明书时，本发明的另外的目的、优点以及特征对本领域技术人员而言将变得清楚，或可以通过本发明的实践来获悉。

通过说明的方式提供了以下实例，并且它们并不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖本文所述的特定以及优选实施例的所有可能的组合。

实例

实例1.使用融合蛋白T22-GFP-H6作为模式制备蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)的方法。

所有过程均应在无菌条件下进行。

材料：

无菌双蒸水。无菌NaCl溶液。经过滤的PBS缓冲液1x和浓缩的无菌蛋白质纳米颗粒(NP)溶液。脂质(卵磷脂酰胆碱(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))或天然细胞膜中的脂质)在氯仿:甲醇(2:1)或均匀稀释所用脂质的有机溶剂中的溶液

1-制备在双蒸水中的具有相等浓度的融合蛋白T22-GFP-H6(SEQ ID NO:1)的两种溶液(溶液A和B)。(建议准备用于体外测试的浓度为1mg/mL)。溶液A含有NaCl(0.5-2M)，并且溶液B不含盐。

SEQ ID NO:1对应于以下序列，从N末端到C末端为：

T22-GFP-H6是通过在二价阳离子的存在下组装在大肠杆菌中产生的含GFP单体形成的纳米颗粒(12nm)的形式，如

-Laguna等人,“Assembly of histidine-richprotein materials controlled through divalent cations[通过二价阳离子控制的富含组氨酸的蛋白质材料的组装]”,Acta Biomaterialia[生物材料学报]2019,卷号83,页码:257-264所披露。

2-将溶液A在100℃下加热20至40min。

3-随后将其在4℃下以15.000g离心30min。球团的存在确证了蛋白质的沉淀。分离并储存标记好的上清液以评价未沉淀的蛋白质残留物的存在。随后，在与之前相同的条件下再进行两次离心(15.000g，4℃，持续30min)，并在相同的初始体积的双蒸水中重悬浮两次。

4-将最终球团与上清液分离(用金属刮刀)并置于玻璃容器(*)底部。随后，添加脂质(卵磷脂酰胆碱(西格玛奥德里奇))。在玻璃管中脂质体积含有相同量(以毫克计)的蛋白质。此外，建议在此步骤中使用尽可能少的脂质体积。这样，有机溶剂中的脂质被高度浓缩(10mg脂质/ml重悬浮于氯仿:甲烷2.1)

5-由于脂质和蛋白质的混合物含有氯仿/甲醇，因此通过N2流去除这些溶剂。将混合物干燥直至在玻璃管底部蛋白质和脂质的膜完全干燥(残留湿度为0％至30％)。如果需要在将来使用，可以将该膜(自组装蛋白质和脂质分子的支架，该支架配置成多孔三维网)储存。

6-之后，用一定体积的SEQ ID NO:1的非变性形式的功能性(这意味着它发挥或提供预期活性)荧光蛋白T22-GFP-H6(1mg/ml缓冲溶液)重悬浮蛋白质和脂质的这种膜。将样品混合至具有明显的均质性，然后将整个体积转移回塑料容器以继续该程序。

7-样品整夜保持在2至8℃(在冷室中)，以允许功能性蛋白质与蛋白脂质膜相互作用。

8-第二天，将样品在4℃以15000g离心30min，以释放未结合的功能性蛋白质。该离心再重复两次。保存上清液以评价有多少蛋白质没有结合至该膜上。

9-最后的球团含有根据本发明的蛋白质-脂质纳米颗粒/微米颗粒。如果不使用，可将此样品储存于-80℃

(*)在此阶段需要在玻璃容器中操作是由于塑料会溶解于氯仿/甲醇中。

因此，合成IB的制备通过包括以下步骤的方法进行：

(a)将一种或多种变性蛋白质与先前溶解于有机溶剂中的一种或多种脂质混合直到获得均质混合物，其中蛋白质和脂质的量的比率为至1:1；

(b)将该有机溶剂去除以获得变性蛋白质和脂质的干膜

(c)将步骤(b)的干膜用包含在水性介质中的一种或多种功能性蛋白质的组合物悬浮，同时在4℃至8℃的受控温度下搅拌该混合物以获得包含支架(或群簇)和设置于、嵌入或粘附在该支架表面中的一种或多种功能性蛋白质的蛋白质-脂质纳米蛋白或微米蛋白。

(d)将该蛋白质-脂质纳米蛋白或微米蛋白与剩余的水性介质分离。

用这种方法获得了配置成立体网的自组装蛋白质分子的支架或群簇，所述支架还包含如天然IB中的脂质。将一种功能性蛋白质(即T22-GFP-H6)加入缓冲溶液中，并留出足够的时间使其嵌入或吸附(粘附)在三维网中。

实例2.蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)的表征

尺寸和形态：

通过动态光散射(DLS)和场发射扫描电子显微术(FESEM)分析实例1的蛋白质-脂质颗粒。

如可以在图1(是检测到的直径(由DLS计算)和这些直径的相对丰度(体积％)的图表)中所见，大多数蛋白质-脂质颗粒具有大约1000nm的尺寸，并且它们包括大约66nm至115nm的颗粒(图1中的小图)。

图2示出了确证图1的数据的FESEM图像。图2(A)示出了大尺寸的合成IB，以及甚至一些先前未检测到的纳米颗粒。图2(B)展示了也通过DLS技术(图1)检测到的较小尺寸的纳米颗粒。使用以下调整后的装置参数获得图像：电子高压，(EHT)＝1.00kV；工作距离(WD)＝3.3mm；信号A＝二次电子(SE2)；Mag＝2.56K X。

因此，本发明的颗粒具有60nm至2000nm的尺寸，该尺寸在细菌包涵体的范围内。

实例3.本发明的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒中T22-GFP-H6的荧光检测

用Cary Eclipse分光荧光计(安捷伦科技公司，穆尔格拉维，澳大利亚)在512nm波长处评价荧光。数据描绘于图3中，其中对于不同浓度的T22-GFP-H6(g/l)，描绘了实例1的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒在512nm处发射的荧光的相对强度(合成IB；浅色圆圈)。作为对照，还测定了游离形式(未嵌入脂质-蛋白质支架的多孔中)的融合蛋白的荧光(NP；深色圆圈)。该游离融合蛋白是通过在二价阳离子的存在下组装在大肠杆菌中产生的含GFP单体形成的纳米颗粒(12nm)的形式，如

-Laguna等人,“Assembly of histidine-rich protein materials controlled through divalent cations[通过二价阳离子控制的富含组氨酸的蛋白质材料的组装]”,Acta Biomaterialia[生物材料学报]2019,卷号83,页码:257-264所披露。

颗粒中的荧光相对于产生它们的蛋白质纳米颗粒的荧光略低。

实例4.从本发明的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)释放蛋白质

为了分析使用实例1的方法获得的颗粒的可溶性蛋白质递送，将球团形式的人工IB以0.1mg/mL的终浓度重悬浮于其相应的缓冲液(没有任何另外的蛋白质)中，并且在37℃(生理温度)在不搅拌的情况下孵育。在限定的时间(0至10天)取150μl的等分试样，并在4℃以15000g离心15min。分离可溶性和不溶性部分，并进一步通过Tris-甘氨酸延伸型(TGX)免染电泳凝胶和蛋白质印迹处理。在所有情况下，然后将分离的不溶性部分以与其可溶性对应物相同的最终体积重悬浮于其各自的缓冲液中以进行比较。

测定了实例1的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒的群簇中T22-GFP-H6(SEQ IDNO:1)的释放。

图4示出了随着时间(以小时(h)计的时间)以％表示的所释放蛋白质的量(即功能性荧光性T22-GFP-H6的释放)。

相对于总蛋白质，重量百分比为40％的蛋白质在可溶性部分中；同时60％仍处于球团形式。

实例5.本发明的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)内化到肿瘤细胞中在表达细胞因子受体CXCR4的HeLa细胞系(

CCL-2^TM，可商购)(CXCR4+细胞)中测量IB穿透表达肿瘤细胞的能力。

图5是通过分光荧光计(安捷伦科技公司，穆尔格拉维，澳大利亚)在512nm波长处测定的检测到的进入细胞的荧光的图表。使用不同的内化实体进行不同的内化测定：

-CI VP1 GFP是细菌来源的IB，并且它们在图5中绘制为圆圈。

-CI T22-GFP-H6是细菌来源的IB，并且它们在图5中绘制为三角形。

-不具有脂质的CI art(合成IB)T22-GFP-H6，绘制为图5中的方形(如实例1制造，但没有步骤4-5，并在步骤6中用含有SEQ ID NO:1的功能性蛋白质的缓冲液重悬浮步骤3的球团)

-CI art(合成IB)T22-GFP-H6是根据实例1制备的，绘制为菱形。

CI VP1 GFP和CI T22-GFP-H6细菌IB是按照Unzueta等人,“Engineering tumorcell-targeting in nanoscale amyloidal materials[纳米级淀粉样物质材料中的肿瘤细胞靶向工程化]”,Nanotechnology[纳米技术]-2017,卷号28,页码:015102披露的方案获得的。简而言之，将SEQ ID NO:1的蛋白质克隆到pET22b(Novagen)载体中。将大肠杆菌菌株Origami B Novagen)用表达载体转化。IB产生是在摇瓶中在溶原性肉汤(LB)培养基中(37℃和250rpm)进行，直到在550nm处的光密度达到0.5。诱导(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷IPTG 1mM)基因过表达，并且随后的蛋白质沉积为IB。通过离心(150000g，4℃，持续15min)收获产生SEQ ID NO:1的培养物的样品。将球团重悬浮于具有溶菌酶的裂解缓冲液中。在酶消化后进行机械破碎(弗氏压碎器，1200psi下五轮)。然后将样品冷冻(-80℃)，并且解冻后在搅拌的同时洗涤IB。进行重悬浮和离心的若干个另外的步骤，连同冷冻和解冻循环，直到不存在活细菌为止。

从图5可以推断出，蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒有效地内化到细胞中。T22-GFP-H6的纳米颗粒也是如此，但程度较小。因此，蛋白质-脂质颗粒(合成IB)确实起到了天然细菌IB的作用。

实例6.在本发明的蛋白质-脂质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)的存在下的细胞活力

在CXCR4+HeLa细胞(

CCL-2^TM)中在24、48和72小时测定了实例1的本发明的蛋白质-脂质颗粒的毒性。

图6是在以下实体(如在实例1中)的存在下培养的细胞的细胞活力百分比(细胞活力％)的图表：

-CI VP1 GFP，细菌来源的IB。

-CI T22-GFP-H6细菌来源的IB。

-不具有脂质的CI art(合成IB)T22-GFP-H6(如实例1制造，但没有步骤4-5，并在步骤6中用含有SEQ ID NO:1的功能性蛋白质的缓冲液重悬浮步骤3的球团)

-CI art(合成IB)T22-GFP-H6是根据实例1制备的对照(C)对应于没有测试实体的情况下细胞的活力。它用作100％的细胞活力。

该图表示出实例1的蛋白质-脂质颗粒不影响细胞活力。

所有这些实例都可以得出以下结论：包含配置成三维支架的一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇的本发明颗粒以与天然细菌包涵体相同的方式有用。它们是稳定的，能够被肿瘤细胞内化，并且它们有效地释放任何功能性蛋白质，或甚至嵌入在组装自组装蛋白质分子的群簇中的药物

有利地，用根据本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒避免了通常与天然包涵体相关的缺点(即存在细菌组分、批次之间的非均一性、不可能包装具有翻译后修饰的蛋白质、以及推定的毒性)。

实例7.使用ZnCl₂作为二价阳离子的来源，使用融合蛋白T22-GFP-H6作为模式制备蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB)的方法

本发明的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的这种合成方法的一般程序根据以下详细步骤进行，在此使用蛋白质T22-GFP-H6(SEQ ID NO:1)进行说明：

1.从具有已知浓度(通常高于2mg/mL)的具体储存缓冲液(通常为166mM碳酸钠，具有或不具有333mM盐)中的纯化蛋白质样品开始。

2.在蒸馏水的存在下，开始制备最终浓度为400mM、最终体积为50mL的ZnCl₂储备液。

3.制备好储备液之后，将纯化的蛋白质在其具体的储存缓冲液中稀释，直至最终浓度为2mg/mL。

4.在艾本德管(eppendorf)中将稀释的蛋白质分成250μL的等分试样。

5.计算1:1(ZnCl₂:蛋白质)的工作比例。在该步骤中，需要与二价阳离子螯合的组氨酸残基或其他氨基酸残基的平均或确切数量。下文举例说明了将蛋白质T22-GFP-H6(SEQID NO:1)的分子量和融合蛋白质H6尾段中包含的六个组氨酸考虑在内的计算

6.该1:1比例对应于0.196mM的ZnCl₂，并且是用于沉淀稀释的蛋白质(2mg/mL)的比例。

7.5:1至500:1的比例示出明显的聚集趋势。在此实例中，以下是所选择的用于沉淀的比例和相应的ZnCl₂浓度(以mM计)：

8.根据每个比例的最终mM浓度、最终体积(250μL)和400mM储备液浓度，使用以下等式添加具体体积的ZnCl₂：

9.添加ZnCl₂后对蛋白质和盐的混合物进行涡旋。

10.蛋白质(自含式蛋白质的组装物)的沉淀被观察为粘液的形成。

11.通过在室温下等待10分钟使混合物沉淀。

12.将所有样品在4℃以15.000g离心15min。

13.将可溶性部分与不溶性部分分离，该不溶性样品(球团)对应于蛋白质纳米颗粒或微米颗粒(人工IB)。

14.通过布拉德福德测定(Bradford assay)定量上清液中的蛋白质浓度。

15.通过使用野生型作为对照(没有添加ZnCl₂的可溶性蛋白质样品)，计算形成的沉淀的量，以mg或％计。

[即，如果可溶性部分的定量接近具体比例的0且野生型浓度接近2mg/mL，则认为100％沉淀并且沉淀实际上为2mg/mL(对应于可溶性形式的量级)。以重量％或蛋白质重量计，这些值通过以下方式获得：将2mg/mL沉淀乘以使用的体积(250μL～0.250mL)获得0.5mg或相对于野生型对照的相应％。]

16.在布拉德福德计算后，将沉淀的百分比相对于使用的ZnCl₂的比例绘制在图表中，以根据需要在其他比例下外推沉淀。

17.此外，通过离心后球团的荧光或非荧光，可以观察到蛋白质沉淀。

18.在此具体条件下，比例100和150诱导100％的沉淀。

按照上文方法获得的蛋白质纳米颗粒和微米颗粒可以在图7的FESEM图像中看到。该图7包括通过将融合蛋白T22-GFP-H6与ZnCl₂在不同的盐:蛋白质分子比例下组装获得的若干种蛋白质微米颗粒的图像。在图像1、2和3中，分别描绘了使用分子(或mol)比例40:1、100:1和150:1的盐:蛋白质获得的颗粒。图像0示出根据Unzueta等人,Nanotechnology2017(同上)直接在细菌中产生的天然包涵体的图像。

如可以在图7中所见，用本发明的方法获得了类似于天然包涵体的离散蛋白质颗粒。对于这种特定的蛋白质和二价阳离子盐，盐的摩尔:蛋白质的摩尔的比例150:1允许获得类似于天然细菌包涵体粒度的粒度。

这些数据允许得出以下结论：根据本发明的方法是获得人工包涵体的良好的、可再现的且有效的方法。特别地，该方法包括以下步骤：

为了分析使用二价阳离子的方法获得的颗粒的可溶性蛋白质递送，将球团形式的人工IB以0.1mg/mL的终浓度重悬浮于其相应的缓冲液中，并且在37℃(生理温度)在不搅拌的情况下孵育。在限定的时间(0至10天)取150μl的等分试样，并在4℃以15000g离心15min。分离可溶性和不溶性部分，并进一步通过Tris-甘氨酸延伸型(TGX)免染电泳凝胶和蛋白质印迹处理。在所有情况下，然后将分离的不溶性部分以与其可溶性对应物相同的最终体积重悬浮于其各自的缓冲液中以进行比较。

在此测定条件下(pH大约为7)，第10天颗粒的溶解度(释放)为可溶性部分中30％w/w的蛋白质和球团(不溶性部分)中70％w/w。

在皮下植入15天后测量得出，本实例的人工IB能够释放50％的组装自含式蛋白质。这意味着这些人工IB用作递送系统时，确实是有效的，并且即使作为植入物应用时也能进入全身途径，但它们是具有缓慢释放特性的递送系统。

实例8.使用碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和融合蛋白T22-GFP-H6和T22-PE24-H6制造和表征蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB或ArtIB)。

实验部分

ArtIB的制造：

为了产生多步骤ArtIB(msArtIB)，即在如实例1中所指示的特定方法中获得的微米颗粒和纳米颗粒，使1mg的纯可溶性蛋白质变性，并伴随地通过在蒸馏H₂O中的NaCl₂(500mM)、ZnCl₂(26.4mM)和MgCl₂(18.4mM)中在100℃加热而沉淀。将沉淀在4℃以15,000g离心15min，从可溶性部分中分离出来，并用1mg磷脂酰胆碱和氯仿/甲醇2:1v/v重悬浮，最终体积为300μL。将过量的有机溶剂(OS)通过连续N₂流去除，从而诱导充当支架的蛋白质-脂质膜相的形成。之后在4℃将支架重悬浮于1mg/mL的稀释于PBS中的先前可溶性蛋白质中过夜。最后，将样品离心，并丢弃可溶性部分。通过在蒸馏H₂O中以2mg/mL的最终浓度和200μL的最终体积稀释纯可溶性蛋白质来实现单步ArtIB(ssArtIB)的制造。随后将蛋白质样品(0.196mM)与ZnCl₂以100:1锌与蛋白质的比率混合。在室温下孵育10min后，将样品以15,000g离心15min，并丢弃可溶性部分以获得最终产物。可替代地，对于体内实验，使用比率为50:1的锌和比率为300:1的钙(以CaCl₂的形式)。β-半乳糖苷酶(β-Gal)[EC3.2.1.23]和碱性磷酸酶(AP)[EC3.1.3.1]均来自大肠杆菌，购自西格玛-奥德里奇。T22-GFP-H6(SEQ IDNO:1)和T22-PE24-H6(SEQ ID NO:2)作为重组蛋白产生并通过单步色谱纯化。

SEQ ID NO 2对应于以下序列，从N末端到C末端为：

酶活性的测定：

在最终体积为500μL的PBS中，将3.7与21.3ng之间的纯可溶性β-Gal蛋白或β-GalArtIB与5mM邻硝基苯基吡喃半乳糖苷(ONPG)混合。将混合物在37℃孵育15min，通过添加200μL Na₂CO₃(2.8M)终止反应，并通过在紫外可见分光光度计(Ultrospec 1000E，发玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech))中测量420nm处的吸光度(ε₄₂₀＝4,530M^-1cm^-1)来测定产物量。另一方面，在最终体积为500μL的PBS中，将3.9与92ng之间的纯可溶性AP蛋白或APArtIB与20mM对硝基苯磷酸盐(pNPP)混合。将混合物在37℃下孵育15min，通过添加200μLNaOH(1M)终止反应，并通过在紫外可见分光光度计(Ultrospec 1000E，发玛西亚生物技术公司)中测量405nm处的pNPP吸光度(ε₄₀₅＝18,000M^-1cm^-1)来测定活性。

特定荧光的测定：

将纯可溶性T22-GFP-H6或ArtIB型式以0.2至1mg/mL的浓度范围稀释于PBS中。激发波长(λ_ex)设定为488nm并且发射(λ_em)设定为510nm，同时激发狭缝设定为2.5nm并且发射狭缝设定为5nm。在Cary Eclipse荧光分光光度计(安捷伦科技公司)中使用具有10mm光程的石英池测量荧光。然后将每个样品的固有荧光表示为蛋白质浓度，将特定荧光衰减(SFD)定义为以数学方式表示为斜率。SFD的％(SFD％)表示该参数与可溶性T22-GFP-H6蛋白的SFD的关系。

尺寸分布分析：

在633nm和25℃下在Zetasizer Nano ZS(马尔文仪器有限公司(MalvernInstruments Limited))中使用ZEN2112 3mm石英批次比色杯来测定所有纳米结构的体积尺寸分布。一式三份测量0.2至1mg/m L的溶解于PBS中的蛋白质样品，并获得模式尺寸峰值和多分散指数(pdi±s.e.m.)。

电子显微术：

用场发射扫描电子显微术(FESEM)在接近自然状态下表征ArtIB的超微结构形态测量(尺寸和形状)。将20μl各个在其对应缓冲液中稀释为0.3mg/mL的样品的液滴直接沉积在硅片(Ted Pella公司)上持续30s，并且立即在不包覆的情况下用在1kV运行的具有高分辨率二次电子检测器的FESEM Zeiss Merlin(Zeiss)观察。以范围在5,500x与8,500x之间的放大倍数和3.5mm的工作距离拍摄了总体视野和纳米颗粒细节的代表性图像。

衰减全反射：

在光谱晶体表面上放置最合适浓度的ArtIB并用连续N2流干燥。通过在与SpecacGolden Gate衰减全反射(ATR)附件耦合的Tensor 27布鲁克光谱仪中使用50cm^-1/min的扫描速率和2cm^-1的标称分辨率，检测15次总反射光谱作为光谱。所有测量均在25℃下进行，针对背景校正所获得吸光度，并减去PBS缓冲液信号。光谱的傅里叶解卷积和二阶导数允许鉴定不同的带组分。本质上根据所描述的程序[26]进行组分到原始(未解卷积)光谱的拟合，使得组分的峰值高度、带宽和峰值位置按此顺序一次变化一个。假定高斯形状。

细胞培养：

使用CXCR4⁺宫颈癌细胞系(HeLa

CCL-2^TM，可商购)研究ArtIB体外的性能。将细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)的伊格尔极限必需培养基(Gibco)中常规培养，并在37℃和5％的CO₂的潮湿气氛中孵育。

蛋白质内化：

将Hela CXCR4+细胞在37℃在5％CO₂的潮湿气氛中，在24孔板中在补充有胎牛血清(FBS)的MEM Alpha 1x GlutaMAX^TM培养基(Gibco)中培养，直到达到70％的汇合率。然后将培养基用无血清OptiPro培养基(Gibco)交换，之后添加蛋白质。在2.5μg的最终浓度，在范围为10min至24h的不同时间测定蛋白质摄取。将细胞解离，并通过在37℃下暴露于1mg/mL的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)15min去除外部钩状蛋白质。通过流式细胞术使用具有风冷氩离子激光器(15mW)(在488nm激发)和D检测器(530/30nm作为带通滤光器)的FACS-Canto系统(贝迪公司(Becton Dickinson))检测细胞内蛋白质荧光。此外，通过将细胞暴露于CXCR4拮抗剂AMD3100(西格玛-奥德里奇，(圣路易斯，密苏里州，美国)、1h后以(蛋白质/AMD3100)1:10比率进行蛋白质孵育，来测试通过CXCR4受体的内化特异性。

细胞活力：

将HeLa(ATCC-CCL-2，见上文)细胞系在壁不透明的96孔板中以6000个细胞/孔的最终浓度培养24h。在37℃下在5％CO₂的潮湿气氛中使用补充有胎牛血清(FBS)的MEMAlpha GlutaMAX^TM培养基(Gibco)，直到达到70％的汇合率。使用MEM Alpha GlutaMAX^TM培养基(Gibco)在1pM下将ArtIB孵育96h。通过CellTiter-

发光细胞活力测定(Promega)在多标记酶标仪Victor3(Multilabel Plater Reader Victor3)(珀金埃尔默(PerkinElmer))中测量细胞活力。

可溶性蛋白质从人工IB中释放：

在1mL的PBS 1x中重悬浮ArtIB，达到1mg/mL的终浓度，并在37℃下在不进行搅拌的情况下孵育。在范围为0至7天的不同时间从每个样品中取出100μL，并在4℃以15,000g离心15min，以分离可溶性部分和不溶性部分。然后通过TGX(TGX^TMFastCast^TM丙烯酰胺试剂盒)免染检测可溶性蛋白质，并随后通过ImageLab软件定量，以确定释放蛋白质的％。

结果

为了探讨合成IB的制作，将在重组生产期间形成功能性IB的常见实验室酶，即β-半乳糖苷酶(β-Gal)和碱性磷酸酶(AP)，选择作为用于制造ArtIB的两种替代性途径的模型。在一个(图8(A))中，可溶性蛋白质被盐析出并热聚集以产生淀粉样网络，进一步用作IB样种子以募集和截留同源可溶性蛋白质型式。这个多步骤程序(ms)旨在模仿天然IB中的双重海绵状网络。细菌IB的常见组分脂质也被并入。在更简单的单步骤(ss)途径中，将参与淀粉样物质形成并且广泛参与蛋白质-蛋白质接触的二价阳离子(Zn，以ZnCl₂的形式)添加至蛋白质溶液中(图8(A))。这些程序的应用导致尺寸大约为1-2μm(AP)和2-6μm(β-Gal)(图8(B)和(C))的机械稳定、离散和适度分散的蛋白质颗粒，其表面粗糙和无定形外观让人想起天然IB的那些(图8(B))。这种包装形式的两种酶都具有酶活性(图8(D))。另一方面，通过衰减全反射(ATR)在AP ArtIB中以与IB相配的比例(31％-37％，对应ss和ms)检测到交叉β-折叠淀粉样结构(ALS)。

此外，构建了由自组装模块蛋白质T22-GFP-H6(SEQ ID NO:1)和T22-PE24-H6(SEQID NO:2)形成的新ArtIB(图9(A))，这些自组装模块蛋白质通过N末端肿瘤归巢肽T22靶向细胞表面细胞因子受体CXCR4。当暴露于培养的CXCR4⁺Hela细胞时，通过由CXCR4拮抗剂AMD3100抑制的CXCR4依赖性途径，T22-GFP-H6 ArtIB就像在基于IB的纳米丸粒的情况下一样非常有效地内化(图9(B))。细胞活力不受T22-GFP-H6 ArtIB的影响(图9(C))，但替代地它以CXCR4依赖性方式被T22-PE24-H6 ArtIB中含有的铜绿假单胞菌外毒素(PE24)显著破坏。与IB的情况一样，ArtIB在生理缓冲液中孵育至少7天时稳定地释放一部分可溶形式的形成蛋白(图9(D))。从ArtIB体外溶解出的T22-GFP-H6是荧光性的(1039.83AU/mg)，组装成13nm纳米颗粒，与可溶性T22-GFP-H6的尺寸无法区分(图9(E))，并且同样能够以CXCR4依赖性方式穿透培养的HeLa细胞(图9(F))。这一事实揭示了ArtIB作为化学均质蛋白质储库以用于延长体内靶向肿瘤的纳米结构蛋白质药物的递送的潜力。实例9.在结直肠癌的体内小鼠模型中皮下植入蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(合成IB或也称为ArtIB)

实验部分

皮下植入的ArtIB在体内释放荧光材料及肿瘤对ArtIB的摄取：

保持在无病原体条件下的4周龄的体重范围为18-20g的瑞士裸品种雌性小鼠(查尔斯河公司(Charles River)，L-Abreslle，法国)用于体内实验。所有实验程序均经圣保罗医院动物伦理委员会批准，并根据欧洲理事会指令进行。为了产生CXCR4⁺SW1417 CRC癌症模型，从供体动物获得10mg SW1417-luci肿瘤组织的等分试样，并沉积在动物的前侧腹或后侧腹皮下组织中。当肿瘤达到大约120-200mm³体积时，将动物随机分配，并在初步研究中将在150μL PBS缓冲液中悬浮的T22-GFP-H6msArtIB或T22-GFP-H6 ssArtIB Zn²⁺的球团(两种类型均如实例8所指示来制造)以1mg/小鼠的单一剂量注射植入小鼠腰部区域的皮下组织(SC)中，而在第二个研究中，以相同剂量SC植入T22-GFP-H6 Zn²⁺ArtIB或T22-GFP-H6 Ca² ⁺ArtIB的球团。对照缓冲液注射用作阴性对照。选择ArtIB注射点以使其尽可能远离同一只小鼠的肿瘤，该肿瘤位于前侧腹或后侧腹。

在注射ArtIB球团后，使用I

光谱设备(珀金埃尔默公司)用于通过以下方式在小鼠全身监测SC植入物中GFP发射的荧光：在施用后立即(0h)和在特定时间点(3、6和10天)登记，以测定在每只小鼠中在皮下ArtIB植入物中剩余的荧光以及随着时间达到远处肿瘤的荧光材料。荧光信号被数字化，显示为伪彩色叠加，并表示为辐射效率。通过以下方式计算荧光强度(FLI)比率：将来自IB处理的小鼠的信号除以注射点或肿瘤中施用缓冲液的对照小鼠的FLI自身荧光信号。

SC植入的ArtIB的体内抗肿瘤活性：

用于测试抗肿瘤活性的CXCR4+SW1417 CRC癌症模型如上文所述生成。该模型中癌细胞对萤光素酶的表达允许随着时间对肿瘤生长进行非侵入性追踪。在将肿瘤等分试样沉积于小鼠皮下组织中之前一周，将小鼠随机分配为在小鼠腰部区域SC施用在150μl PBS缓冲液中悬浮的1mg/小鼠剂量的T22-GFP-H6 Ca²⁺ArtIB或T22-PE24-H6 Ca²⁺ArtIB，或缓冲液处理的对照小鼠。施用IB后，记录小鼠体重，并且将使用

光谱设备(珀金埃尔默公司)测量的肿瘤中的生物发光图像强度(BLI)被数字化并表示为辐射效率。将肿瘤组织、肝脏和肾脏用福尔马林固定，并用石蜡包埋用于组织学分析。为此，将四微米厚的切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并由两名独立观察者分析可能的组织学改变。使用Cell^AB软件(奥林巴斯软件成像(Olympus Soft Imaging)v 3.3)拍摄代表性图像。

统计分析(适用于本说明中的所有实例)

所有分析均使用SPSS vs 11.0(IBM)软件进行。进行单向方差分析和t检验以评估最小n＝3时的测定差异。Holme-Sidak用于等方差，并且图基检验或曼-惠特尼U检验用于不等方差(如图中图例所指示)。双尾t检验也用于个体比较。数据呈现为平均值±平均值的标准误差(s.e.m)。在p≤0.05时，蛋白质样品之间的差异被认为是显著的。

结果

在实例8中获得的数据的背景下，将不同类别的T22-GFP-H6 ArtIB皮下(SC)植入于CXCR4⁺结直肠癌小鼠模型中，从植入点释放荧光材料，随后由远处CXCR4⁺肿瘤选择性摄取，对于每个ArtIB类型都有特定的动力学。T22-GFP-H6 msArtIB和T22-GFP-H6 ssArtIB的初步筛选(Zn²⁺，以100:1锌与蛋白质的比率)显示缓慢释放并且到21天时在肿瘤中积累的材料的量可忽略不计或较少(图10(A))。降低Zn²⁺的比例(50:1)或使用替代阳离子以诱导ssArtIB形成，可改善释放和肿瘤摄取。特别是，在该癌症模型中，由Ca⁺²形成的ssArtIB比ArtIB(Zn⁺² 50:1)在维持从SC注射部位更快和进行性的蛋白质释放方面更有效，导致在远处CXCR4⁺肿瘤中更高的积累和更长的停留时间(从第3天开始，至少直到第10天)(图10(B))。另外，与对照缓冲液处理的组(n＝2，2.6±1.0x10⁸)相比并且如在植入ArtIB之后第7天通过生物发光发射(平均辐射率)所测量，含有靶向CXCR4的细胞毒性多肽(PE)的且通过相同途径施用的T22-PE24-H6 ArtIB Ca²⁺(n＝3，1.0±0.2x10⁸)比T22-GFP-H6 Ca²⁺ArtIB(n＝3，1.5±0.7x10⁸)诱导更高的(p＝0.083)对肿瘤生长的抑制(图10(C))。这在没有全身毒性的情况下发生(实验结束时H&E染色的肝脏和肾脏无组织病理学改变，未显示)。这些观察结果完全证实了像分泌的延长的蛋白质释放和功能性材料通过血流从远处位置的精确细胞靶向。

总之，本发明的蛋白质微米颗粒和纳米颗粒(缩写为ArtIB或合成IB)可以从纯蛋白质和通过简单的物理化学方法在体外制造为一种新类型的仿生材料。这些蛋白质颗粒再现了与生物医学潜在用途相关的主要IB特性，特别是蛋白质释放。特别地，更简单的单步骤制造方法允许通过金属或非金属二价阳离子的化学计量控制来改造材料中蛋白质-蛋白质相互作用的强度。与为缓慢药物和蛋白质药物释放而开发的其他生物相容性材料相比，ArtIB在化学上是均质的，并且在载体和货物之间显示无区别，因此可以充当自含式药物材料。本发明的ArtIB不仅可以代替IB作为功能性蛋白质储库并为药物导向开发提供均质材料，而且它们还使得能够将哺乳动物细胞来源的糖基化蛋白质包装为IB样材料。由于这些蛋白质永远不会以功能性形式在细菌中产生，因此ArtIB将作为通用平台扩展可以被配制成纯微尺度生物催化剂或分泌性蛋白颗粒剂的酶或蛋白质药物的目录。

本发明的另外的方面/实施例可以见于以下条款中：

条款1.-包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中该微米颗粒或纳米颗粒：

条款2.-根据条款1所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒进一步包含一种或多种二价阳离子盐。

条款3.-根据条款2所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺及其组合。

条款4.-根据条款1-3中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些自含式蛋白质是治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。

条款5.-根据条款1-3中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的群簇。

条款6.-根据条款5所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中：

-该颗粒进一步包含设置于该三维支架内或粘附于该三维支架上的一种或多种功能性蛋白质。

条款7.-根据条款5-6中任一项所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些脂质选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酸、甘油磷脂、甾醇、鞘脂及其组合。

条款8.-根据条款5-7中任一项所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中该一种或多种功能性蛋白质是治疗性蛋白质，这些治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。

条款9.-一种用于合成根据条款1至8中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的方法，其中该方法包括以下步骤：

(c)分离该纳米颗粒或微米颗粒。

条款10.-根据条款9所述的方法，其中在步骤(b)中这些蛋白质组装条件包括将盐添加至步骤(a)的混合物中，这些盐在该混合物中的最终盐浓度允许该一种或多种蛋白质沉淀，和/或应用蛋白质变性温度。

条款11.-根据条款9-10中任一项所述的方法，其中该方法包括以下步骤：

(b)将沉淀的一种或多种蛋白质与该一种或多种蛋白质在其中沉淀的溶剂分离，并且任选地将该一种或多种蛋白质重悬浮于新鲜缓冲溶剂中。

条款12.-根据条款9-10中任一项所述的方法，该方法是用于合成蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

(b)向步骤(a)的混合物中添加蛋白质变性盐浓度的盐溶液，同时和/或使该混合物经受蛋白质变性温度，从而允许该一种或多种变性蛋白质沉淀；

(c.1)将沉淀的蛋白质与溶解于有机溶剂中的一种或多种脂质混合，并且其中蛋白质和脂质的量的比率为0.8:1至1:0.8；

(c.2)将该有机溶剂去除以获得变性蛋白质和脂质的干膜

(c.3)将步骤(c.2)的干膜用任选地包含一种或多种功能性蛋白质的缓冲组合物悬浮，同时在4℃至8℃的受控温度下搅拌该混合物以获得蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的群簇，所述群簇任选地包含嵌入和/或吸附在组装自含式蛋白质和脂质的群簇内的一种或多种功能性蛋白质；

(c.4)将该蛋白质-脂质纳米颗粒和/或微米颗粒与剩余的缓冲组合物分离。

条款13.-根据条款1-8中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒用作药物。

条款14.-根据条款13所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，用于治疗选自下组的疾病，该组由以下各项组成：癌症、免疫疾病、神经变性疾病及其组合。

条款15.-根据条款13-14中任一项所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，用于治疗癌症。

条款16.-根据条款15所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中该癌症是结直肠癌。

条款17.-一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的根据条款1-8中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同药学上可接受的赋形剂或载体。

条款18.-根据条款17所述的药物组合物，该药物组合物用于皮下施用。

引用列表

-Neubauer,et al.,“Protein inclusion bodies in recombinant bacteria”,237-292,Springer-2006.

-Garcia-Fruitos,E.et al.“Aggregation as bacterial inclusion bodiesdoes not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins”,Microbialcell factories2005,vol.no.4,27,doi:10.1186/1475-2859-4-27.

-Gonzalez-Montalban,N.,et al.,“Recombinant protein solubility-doesmore mean better？”,Nature biotechnology 2007,vol.no.25,pp.:718-720,doi:10.1038/nbt0707-718.

-

-Laguna et al.,“Assembly of histidine-rich protein materialscontrolled through divalent cations”,Acta Biomaterialia 2019,vol.no.83,pp.:257-264.

-Unzueta et al.,“Engineering tumor cell-targeting in nanoscaleamyloidal materials”,Nanotechnology-2017,vol.no.28,pp.:015102

序列表

<110> 巴塞罗那自治大学（UNIVERSITAT AUTONOMA DE BARCELONA）

<120> 作为人工包涵体的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒

<130> T-2019-053PCT

<150> EP19382271

<151> 2019-04-11

<150> EP19382909

<151> 2019-10-17

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 1

Met Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Cys Arg Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu

20 25 30

Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn

35 40 45

Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr

50 55 60

Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val

65 70 75 80

Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe

85 90 95

Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala

100 105 110

Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp

115 120 125

Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

130 135 140

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn

145 150 155 160

Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr

165 170 175

Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile

180 185 190

Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln

195 200 205

Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His

210 215 220

Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg

225 230 235 240

Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His

245 250 255

Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys His His His His His His

260 265

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 2

Met Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Cys Arg Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Arg His Arg Gln Pro Arg

20 25 30

Gly Trp Glu Gln Leu Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly

35 40 45

Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr

50 55 60

Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile

85 90 95

Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp

100 105 110

Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala

115 120 125

Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu

130 135 140

Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr

145 150 155 160

Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu

165 170 175

Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu

180 185 190

Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu

195 200 205

Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val

210 215 220

Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile

225 230 235 240

Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu

245 250 255

Asp Leu Lys His His His His His His Lys Asp Glu Leu

260 265

Claims

1.一种蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是无细胞制造的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该无细胞制造的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒包含一种或多种类型的组装自含式蛋白质的群簇以及一种或多种二价阳离子盐，二价阳离子盐的摩尔:自含式蛋白质的摩尔的比率包括4:1至1000:1，其中该微米颗粒或纳米颗粒：

2.根据权利要求1所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ra²⁺Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺及其组合。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些自含式蛋白质是治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质纳米颗粒或微米颗粒是蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，该蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒包含组装自含式蛋白质和与这些自含式蛋白质组装在一起的一种或多种类型的脂质的群簇。

5.根据权利要求4所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中：

6.根据权利要求4-5中任一项所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中这些脂质选自下组，该组由以下各项组成：脂肪酸、甘油磷脂、甾醇、鞘脂及其组合。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒，其中该一种或多种功能性蛋白质是治疗性蛋白质，这些治疗性蛋白质任选地共价连接和/或缀合至一种或多种另外的不同治疗剂。

8.一种用于合成根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒的方法，其中该方法包括以下步骤：

(b)使步骤(a)的混合物经受蛋白质组装条件以获得包含组装自含式蛋白质的群簇的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，所述蛋白质组装条件包括向步骤(a)的混合物中添加二价阳离子盐溶液，二价阳离子盐的摩尔:蛋白质的摩尔的最终比率包括4:1至1000:1，并且允许该一种或多种蛋白质沉淀，和/或应用蛋白质变性温度；并且

(c)分离该纳米颗粒或微米颗粒。

9.一种用于合成根据权利要求4-7中任一项所述的蛋白质-脂质纳米颗粒或微米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(c.2)将该有机溶剂去除以获得变性蛋白质和脂质的干膜

10.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，用作药物。

11.根据权利要求10所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，用于治疗选自下组的疾病，该组由以下各项组成：癌症、免疫疾病、神经变性疾病及其组合。

12.根据权利要求10-11中任一项所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，用于治疗癌症。

13.根据权利要求12所述的用于所述用途的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒，其中该癌症是结直肠癌。

14.一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质纳米颗粒或微米颗粒连同药学上可接受的赋形剂或载体。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，该药物组合物用于皮下施用。