CN113939312A - Ebv特异性免疫细胞 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于产生/扩增免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞，所述方法包括通过将外周血单核细胞(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。还公开了免疫细胞群体及其用途，所述免疫细胞群体包含对根据这些方法扩增的对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

Description

EBV特异性免疫细胞

本申请要求2019年4月18日提交的US16/388,776的优先权，该申请的内容和要素通过引用以其整体、出于所有目的并入本文中。

技术领域

本公开至少涉及分子和细胞生物学、免疫学领域，并且还涉及医学治疗和预防的方法。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在政府的支持下由国家健康研究所授予的CA126752号基金资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景

大约40％的淋巴瘤、所有未分化鼻咽癌(NPC)和大约10％的胃癌携带爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)基因组，并表达可被过继性转移的EBV特异性T细胞靶向的病毒蛋白。

免疫抑制情形外发生的EBV+恶性肿瘤仅表达约90种EBV蛋白中的1至4种，虽然这些抗原免疫原性差，但它们为EBVSTs提供了靶抗原。

正在进行的关于使用EBV特异性T细胞治疗EBV阳性恶性肿瘤的临床试验使用EBV转化的B细胞来扩增EBV特异性T细胞(NCT02578641)，或者涉及用对应于EBV II型潜伏期抗原的肽刺激PBMC(NCT01555892)。

发明概述

本公开基于以下意外的发现，即对应于EBV裂解性抗原的肽可用于产生/扩增EBV特异性免疫细胞群，其可用于治疗EBV相关疾病。

尽管事实上在EBV相关疾病中感染EBV的细胞仅表现出EBV潜伏期抗原的大量表达，但本发明人在此证明了通过使用EBV裂解性抗原的肽刺激免疫细胞而产生/扩增的免疫细胞群表现出针对EBV感染细胞的细胞溶解活性。此外，与通过使用EBV潜伏期抗原的肽刺激免疫细胞而产生/扩增的免疫细胞群相比，通过使用EBV裂解性抗原的肽刺激免疫细胞而产生/扩增的免疫细胞群被证明在体内显示出相似或改善的治疗EBV阳性癌症的能力。

另一个意想不到的发现是，在刺激中使用EBV裂解性抗原和EBV潜伏期抗原二者的方法并没有导致扩增群体中特异于EBV潜伏期抗原的免疫细胞的频率显著降低。

发明人进一步证明了，包含对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞的免疫细胞群体比仅包含对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞的免疫细胞群体更有效地治疗EBV相关疾病。

在第一方面，本公开提供了一种用于产生或扩增包含对爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞的免疫细胞群的方法，所述方法包括通过将外周血单核细胞(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的APC接触来再刺激所述免疫细胞。

还提供了一种产生或扩增包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞的免疫细胞群的方法，所述方法包括通过将外周血单核细胞(PBMC)与下列物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽，以及对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽以及对应于EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽以及对应于EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞接触来再刺激所述免疫细胞。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3及其组合。

在一些实施方案中，所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。在一些实施方案中，所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2、BDLF3及其组合。

在一些实施方案中，所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B。在一些实施方案中，所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A、LMP2B及其组合。

在一些实施方案中，所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。在一些实施方案中，所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1、LMP2A、LMP2B及其组合。

在一些实施方案中，所述PBMC是耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC。

还提供了通过根据本公开的方法获得或能够获得的分离的免疫细胞群。

还提供了包含对爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞的分离的免疫细胞群。

还提供了包含对爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞的分离的免疫细胞群。

还提供了包含根据本公开的分离的免疫细胞群的药物组合物。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物，用于治疗或预防疾病或病症的方法中。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的方法的药物中的用途。

还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物，用于治疗或预防与EBV感染相关的疾病或障碍的方法中。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物在制备用于治疗或预防与EBV感染相关的疾病或障碍的方法中的药物中的用途。

还提供了一种治疗或预防与EBV感染相关的疾病或障碍的方法，包括给受试者施用根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物，用于治疗或预防癌症的方法。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的方法的药物中的用途。

还提供了一种治疗或预防癌症的方法，包括给受试者施用根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，所述与EBV感染相关的疾病或病症是与EBV相关的癌症。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，所述癌症是与EBV相关的癌症。

在一些实施方案中，所述与EBV相关的癌症选自EBV阳性淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌和EBV阳性胃癌。

还提供了一种用于杀死感染了EBV的细胞的方法，包括将感染了EBV的细胞与根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物接触。该方法可以是体外或体内方法。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物用于杀死感染了EBV的细胞的用途。

还提供了一种杀死癌细胞的方法，包括将癌细胞与根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物接触。该方法可以是体外或体内方法。

还提供了根据本公开的分离的免疫细胞群或药物组合物用于杀死癌细胞的用途。

在一些实施方案中，所述癌细胞感染了EBV。

发明详述

本公开基于以下意外的发现，即对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞能够杀死EBV感染的细胞，并且与仅包含对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞的细胞群相比，包含对EBV潜伏期抗原和EBV裂解性抗原特异的免疫细胞的细胞群显示出控制EBV阳性恶性肿瘤的改进能力。

爱泼斯坦-巴尔病毒复制

爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的病毒学描述在例如Stanfield和Luftiq,F1000Res.(2017)6:386以及Odumade et al.,Clin Microbiol Rev(2011)24(1):193-209中，这两篇文献在此全部引入作为参考。

EBV通过病毒蛋白BMRF2与β1整合素的结合，以及病毒蛋白gH/gL与整合素avβ6和avβ8的结合来感染上皮细胞。EBV通过病毒糖蛋白gp350与CD21和/或CD35的相互作用感染B细胞，随后病毒gp42与MHC II类相互作用。这些相互作用触发病毒包膜与细胞膜的融合，让病毒进入细胞。一旦进入细胞内，病毒衣壳就会溶解，病毒基因组被运送到细胞核。

EBV有两种复制模式；潜伏和裂解。

潜伏周期不会导致病毒体的产生，可以在B细胞和上皮细胞中发生。EBV基因组环状DNA作为附加体存在于细胞核中，由宿主细胞的DNA聚合酶复制。在潜伏期，只有一小部分EBV的基因以被称为潜伏期程序的三种不同模式之一表达，产生不同组的病毒蛋白质和核糖核酸。潜伏周期描述于例如Amon和Farrell,Reviews in Medical Virology(2004)15(3):149–56中，在此将其全文引入作为参考。

EBNA1蛋白和非编码RNA EBER在潜伏程序I-III中均有表达。潜伏程序II和III进一步涉及EBNALP、LMP1、LMP2A和LMP2B蛋白的表达，潜伏程序III进一步涉及EBNA2、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C的表达。

EBNA1是多功能的，并且通过病毒启动子的正向和负向调节在基因调节、染色体外复制和EBV附加体基因组的维持中具有作用(Duellman等人，J Gen Virol.(2009)；90(Pt9):2251–2259)。EBNA2参与潜伏病毒转录的调节，并有助于感染EBV的细胞的永生化(Kempkes and Ling,Curr Top Microbiol Immunol.(2015)391:35-59)。EBNA-LP是天然B细胞转化所必需的，并为病毒复制招募转录因子(Szymula等，PLoS Pathog。(2018)；14(2):e1006890)。EBNA3A、3B和3C与RBPJ相互作用以影响基因表达，有助于感染细胞的存活和生长(Wang et al.,J Virol.(2016)90(6):2906–2919)。LMP1调节参与B细胞活化的基因表达(Chang et al.,J.Biomed.Sci.(2003)10(5):490–504)。LMP2A和LMP2B通过模拟活化的B细胞受体抑制正常的B细胞信号转导(Portis和Longnecker,Oncogene(2004)23(53):8619–8628)。EBERs与宿主细胞蛋白质形成核糖核蛋白复合物，并被认为在细胞转化中发挥作用。

潜伏周期可以根据B细胞中潜伏程序I至III中的任何一个进行，并且通常从III进展到II至I。当静息的幼稚B细胞被感染时，EBV进入潜伏程序III。潜伏III基因的表达激活了B细胞，其成为增殖的母细胞。然后，EBV通常通过将表达限制到一个基因亚组而进展到潜伏期II，这导致母细胞向记忆B细胞分化。基因表达的进一步限制导致EBV进入潜伏期I。当记忆B细胞分裂时，EBNA1表达允许EBV复制。在上皮细胞中，仅出现潜伏II。

在原发性感染中，EBV在口咽上皮细胞中复制，并在B淋巴细胞中建立潜伏期III、II和I感染。B淋巴细胞的EBV潜伏感染是病毒持续存在、随后在上皮细胞中复制以及将传染性病毒释放到唾液中所必需的。B淋巴细胞的EBV潜伏期III和II感染、口腔上皮细胞的潜伏期II感染和NK-或T-细胞的潜伏期II感染可导致恶性肿瘤，其特征是一致的EBV基因组存在和基因表达。[26]

在B细胞中的潜伏EBV可以被重新激活，转换为裂解性复制。裂解周期导致感染性病毒体的产生，并可在B细胞和上皮细胞中发生，例如Kenney在Arvin等人,HumanHerpesviruses:Biology(Therapy and Immunoprophylaxis；Cambridge UniversityPress(2007))中综述的，在此将其全文引入作为参考。

裂解性复制要求EBV基因组是线性的。潜伏EBV基因组是游离体的，因此必须线性化才能进行裂解性再激活。在B细胞中，裂解性复制通常只发生在从潜伏期重新激活后。

立即-早期裂解基因产物如BZLF1和BRLF1作为反式激活剂起作用，增强它们自身的表达和后期裂解周期基因的表达。

早期裂解基因产物在病毒复制中具有作用(例如EBV DNA聚合酶催化性成分BALF5；DNA聚合酶加工因子BMRF1、DNA结合蛋白BALF2、解旋酶BBLF4、引发酶BSLF1和引发酶相关蛋白BBLF2/3)和脱氧核苷酸代谢(如胸苷激酶BXLF1、dUTP酶BORF2)。其他早期裂解基因产物充当转录因子(如BMRF1、BRRF1)，在RNA稳定和加工中发挥作用(如BMLF1)，或参与免疫逃避(如抑制凋亡的BHRF1)。

晚期裂解基因产物传统上被归类为病毒复制开始后表达的那些。它们通常编码病毒体的结构成分，如核衣壳蛋白，以及介导EBV结合和融合的糖蛋白(如gp350/220、gp85、gp42、gp25)。其他晚期裂解基因产物在免疫逃避中发挥作用；BCLF1编码IL-10的病毒同源物，BALF1编码与抗凋亡蛋白Bcl2同源的蛋白质。

EBV相关癌症中的EBV抗原表达

在EBV阳性癌症中表达的EBV抗原描述在例如Craddock和Heslop Update CancerTher.(2008)Mar；3(1):33–41,Gottschalk和Rooney Curr Top Microbiol Immunol.(2015)391:427–454,以及Shinozaki-Ushiku等人，Int J Oncol.(2015)46(4):1421-34。

出现在免疫缺陷受试者中的EBV相关淋巴瘤，例如在HSCT或实体器官移植后，患有先天性免疫缺陷或HIV感染的受试者表现出III型潜伏，并表达EBNA1、EBNA2、EBNA-LP、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1和LMP2。EBV相关的EBV阳性霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、部分类型和T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、部分病例的B细胞淋巴瘤和鼻咽癌表现为II型潜伏，并表达EBNA1、BARF1、LMP1和LMP2。EBV阳性的伯基特淋巴瘤表现I型潜伏，表达EBNA1和BARF1。EBV阳性胃癌表现I型或II型潜伏。

以前认为，在有免疫能力的受试者中，EBV阳性癌细胞只表达EBV潜伏期抗原(而部表达裂解周期抗原)。编码裂解周期基因产物的转录物最近在包括胃癌、鼻咽癌和B细胞淋巴瘤在内的EBV阳性恶性肿瘤中被检测到。

尚未确定是否有可能从患有EBV阳性癌症的患者或健康供体受试者中产生对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞群体，对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞是否会对EBV感染细胞表现出效应子活性，或者对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞群体是否可用于治疗EBV相关癌症。

EBV抗原

本公开的方面采用对应于EBV抗原的肽。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU、EBNA1-FUK、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3和gp350。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU、EBNA1-FUK、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3、gp350及其组合。在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3及其组合。在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2、BDLF3及其组合。

在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BXLF1、BALF1、BLLF2、BALF2、BNLF2A、BNLF2B和BMRF2。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BXLF1、BALF1、BLLF2、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2及其组合。在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BXLF1、BALF1、BLLF2、BALF2和BNLF2A。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BXLF1、BALF1、BLLF2、BALF2、BNLF2A及其组合。在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B和BMRF2。所述EBV裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2及其组合。

在一些实施方案中，EBV裂解性抗原选自立即-早期裂解性抗原、早期裂解性抗原或晚期裂解性抗原。

在一些实施方案中，立即早期裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1和BMRF1。所述立即早期裂解性抗原可以选自BZLF1、BRLF1、BMRF1及其组合。

在一些实施方案中，早期裂解性抗原选自BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU和EBNA1-FUK。所述早期裂解性抗原可以选自BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU、EBNA1-FUK及其组合。在一些实施方案中，早期裂解性抗原选自BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4和BMRF2。所述早期裂解性抗原可以选自BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2及其组合。在一些实施方案中，早期裂解性抗原选自BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B和BMRF2。所述早期裂解性抗原可以选自BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2及其组合。

在一些实施方案中，晚期裂解性抗原选自BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3和gp350。所述晚期裂解性抗原可以选自BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3、gp350及其组合。在一些实施方案中，晚期裂解性抗原选自BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。所述晚期裂解性抗原可以选自BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3及其组合。在一些实施方案中，晚期裂解性抗原是BDLF3。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，EBV潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B。EBV潜伏期抗原可以选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A、LMP2B及其组合。在一些实施方案中，EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。EBV潜伏期抗原可以选自EBNA1、LMP1、LMP2A、LMP2B及其组合。在一些实施方案中，EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1和LMP2A。EBV潜伏期抗原可以选自EBNA1、LMP1、LMP2A及其组合。

在一些实施方案中，EBV潜伏期抗原选自III型潜伏期抗原、II型潜伏期抗原或I型潜伏期抗原。

在一些实施方案中，III型潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C。所述III型潜伏期抗原可以选自EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C及其组合。在一些实施方案中，II型潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B和BARF1。II型潜伏期抗原可以选自EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1及其组合。在一些实施方案中，I型潜伏期抗原选自EBNA1和BARF1。I型潜伏期抗原可以选自EBNA1、BARF1及其组合。

当在此提及EBV抗原时，本公开还考虑了给定EBV抗原的同种型、片段、变体(包括突变体)。给定EBV抗原的氨基酸序列，例如本文所指的EBV抗原，可以从例如The UniProtKnowledgebase(UniProtKB)得到，参见The UniProt Consortium,Nucleic AcidsResearch(2019),47(D1):D506-D515。

参考EBV抗原的“同种型”、“片段”或“变体”可以任选地表征为与参考EBV抗原的氨基酸序列(例如，抗原的参考同种型)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

“片段”通常指参考蛋白的一部分，并且可以是任何长度(按氨基酸数量计)，尽管可以任选地是参考蛋白(即衍生该片段的蛋白质)长度的至少20％，并且可以具有参考蛋白长度的50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％之一的最大长度。“变体”通常指具有相对于参考蛋白的氨基酸序列而言包含一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其他修饰的氨基酸序列、但与参考蛋白的氨基酸序列保持相当程度的序列同一性(例如至少60％)的蛋白质。“同种型”通常指由EBV表达的参考蛋白的变体。

在根据本文描述的各个方面的一些实施方案中，提及来自给定列表的“一种或多种”抗原。提及“一种或多种”抗原是指列表中列举的一种或所有抗原之间的任何地方。根据所列抗原的数量，“一种或多种”可以指例如列举的抗原中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等。

肽和肽混合物(pepmix)

本公开的方面在产生/扩增对EBV抗原特异的免疫细胞群体的方法中使用对应于EBV抗原的肽。

如本文所用，“肽”是指通过肽键连接的两个或多个氨基酸单体的链。肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是由两个或多个肽组成的聚合物链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。

如本文所用，“对应于”参考抗原的肽包含所述参考抗原的氨基酸序列或由其组成。例如，“对应于”EBNA1的肽包含在EBNA1的氨基酸序列中发现的氨基酸序列(即，是EBNA1氨基酸序列的子序列)或由其组成。

本文使用的肽通常具有5-30个氨基酸的长度，例如5-25个氨基酸、10-20个氨基酸或12-18个氨基酸之一。在一些实施方案中，肽具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸之一的长度。在一些实施方案中，肽具有大约15个氨基酸的长度。

本文所用的“肽”可以指包含不同肽的群体。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，该方法使用对应于一种以上抗原的肽。在这样的实施方案中，至少有一种肽对应于每种抗原。例如，当所述方法使用对应于EBNA1和LMP1的肽时，所述肽包含至少一种对应于EBNA1的肽和至少一种对应于LMP1的肽。

在一些实施方案中，该方法使用对应于参考抗原的全部或部分的肽。对应于给定抗原的全部的肽覆盖了所述抗原的氨基酸序列的全长。也就是说，这些肽一起包含给定抗原的氨基酸序列的所有氨基酸。

对应于给定抗原的部分的肽覆盖了所述抗原的氨基酸序列的部分。在肽覆盖抗原的氨基酸序列的部分的一些实施方案中，所述肽一起可以覆盖所述抗原的氨基酸序列的例如大于10％，例如大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％之一。

在一些实施方案中，该方法使用重叠的肽。“重叠”有共同的氨基酸，更典型的是氨基酸序列。举例来说，第一肽由对应于EBNA1氨基酸序列的第1-15位的氨基酸序列组成，第二肽由对应于EBNA1氨基酸序列的第5-20位的氨基酸序列组成。所述第一和第二肽是对应于EBNA1的重叠肽，重叠11个氨基酸。

在一些实施方案中，重叠肽重叠1-20、5-20、8-15或10-12个氨基酸之一。在一些实施方案中，重叠肽重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸中的一种。在一些实施方案中，重叠肽重叠11个氨基酸。

在一些实施方案中，该方法使用长度为5-30个氨基酸、重叠1-20个氨基酸的肽，对应于给定参考抗原的全部或部分。

在一些实施方案中，该方法使用长度为15个氨基酸、重叠11个氨基酸的肽，对应于所有给定的参考抗原。对于给定的抗原，这些肽的混合物在本文中可称为“肽混合物(肽混合物)肽库”或“肽混合物”。

例如，本文实施例1中使用的“EBNA1 pempmix”是指158种15聚肽的库，所述肽重叠11个氨基酸，跨越EBNA1的氨基酸序列的全长，如UniProt:P03211-1，v1所示。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，“对应于”给定的EBV抗原的肽可以是该抗原的肽混合物。

用于产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群体的方法

本公开的方面涉及产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群体。

“对EBV特异的免疫细胞”表达/包含能够识别EBV抗原的肽(例如当由MHC分子呈递时)的受体(优选T细胞受体)。由于编码这种抗原受体的内源性核酸的表达，或者由于已经被工程化以表达这种受体，EBV特异性免疫细胞可以表达/包含这种受体。

免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天淋巴细胞(ILC)，或其前体。免疫细胞可以表达例如CD3多肽(例如CD3γCD3εCD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。

技术人员熟知在体外/离体产生/扩增病毒特异性免疫细胞群的方法。典型的培养条件(即细胞培养基、添加剂、温度、气体环境)、细胞数量、培养周期等可以通过参考例如Ngo et al.,J Immunother.(2014)37(4):193–203来确定，通过引用将其全部内容并入本文。

方便的是，根据本公开的细胞培养物可以在含有5％CO₂的潮湿气氛中在37℃维持。可以在任何合适的密度建立和/或保持根据本公开的细胞培养物的细胞，这可以由技术人员容易地确定。例如，可以以约0.5×10⁶至约5×10⁶个细胞/毫升培养物的初始密度(例如约1×10⁶细胞/毫升)建立培养物)。

培养可以在适合培养物体积的任何容器中进行，例如在细胞培养板的孔、细胞培养瓶、生物反应器等中。在一些实施方案中，细胞在生物反应器中培养，例如在Somerville和Dudley，Oncoimmunology(2012)1(8):1435-1437中描述的生物反应器中，其全部内容通过引用结合于此。在一些实施方案中，细胞在GRex细胞培养容器中培养，例如GRex烧瓶或GRex 100生物反应器。

该方法通常包括在提供适当的共刺激和信号放大从而引起激活和扩增的条件下，在存在呈递病毒抗原肽:MHC复合物的抗原呈递细胞(APC)的情况下，培养免疫细胞群体(例如免疫细胞(例如外周血单核细胞，PBMC)的异质群体)；其中包含具有抗原特异性受体的细胞。T细胞活化的过程是技术人员熟知的，并描述于例如Immunobiology,第5版，Janeway CAJr,Travers P,Walport M等人，New York:Garland Science(2001),第8章中，其全部内容通过引用并入本文。

具体而言，该方法包括这样的步骤，其中包含对EBV抗原肽:MHC复合物特异的T细胞受体(TCR)的T细胞被呈递对该TCR特异的EBV抗原肽:MHC复合物的APC刺激。APC被编码或包含/表达所述EBV抗原/肽、并在MHC分子的环境中呈现所述EBV抗原肽的病毒感染。刺激引起T细胞活化，并促进细胞分裂(增殖)，导致对所述EBV抗原特异的T细胞群的产生和/或扩增。

与刺激前的群体相比，刺激后获得的细胞群体富集了对所述EBV抗原特异的T细胞(即刺激后EBV抗原特异性T细胞在群体中以增加的频率存在)。以这种方式，从具有不同特异性的异质性T细胞群体中扩增/产生对所述EBV抗原特异的T细胞群体。通过刺激和随后的细胞分裂，可以从单个T细胞产生对EBV抗原特异的T细胞群。已有的对EBV抗原特异的T细胞群可以通过EBV抗原特异性T细胞群的刺激和随后的细胞分裂来扩增。

应当理解，在本公开的各个方面的实施方案中，本文中对EBV抗原特异的免疫细胞优选为T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是辅助性T细胞(T_H细胞)。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。所述免疫细胞优选表达/包含对EBV抗原的肽特异的TCR。

EBV特异性T细胞可以响应于该T细胞特异的病毒抗原，或者响应于包含/表达该病毒/抗原的细胞而表现出T细胞的某些功能特性。在一些实施方案中，所述特性是与效应T细胞例如细胞毒性T细胞相关的功能性质。

在一些实施方案中，EBV特异性T细胞可以显示一种或多种以下性质:对包含/表达EBV或该T细胞特异的EBV抗原的细胞的细胞毒性；响应于包含/表达EBV或该T细胞特异的EBV抗原的细胞而产生的增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔素表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达。

EBV特异性T细胞表达/包含当由合适的MHC分子呈现时能够识别所述T细胞特异的EBV抗原肽的TCR。EBV特异性T细胞可以是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。

本公开的方法包括通过使免疫细胞群与对应于EBV抗原的肽或呈现对应于EBV抗原的肽的APC接触来刺激对EBV抗原特异的免疫细胞。这种方法步骤在本文中可以称为“刺激”或“刺激步骤”。这种方法步骤通常包括在体外/离体培养中维持细胞，并且可以被称为“刺激培养物”。

在一些实施方案中，该方法包括一个或多个额外的刺激步骤。也就是说，在一些实施方案中，该方法包括再刺激通过刺激步骤获得的细胞的一个或多个进一步步骤。这种进一步的刺激步骤在本文中可以称为“再刺激”或“再刺激步骤”。这种方法步骤通常包括在体外/离体培养中维持细胞，并且可以被称为“再刺激培养”。

应当理解，将PBMC或通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群(用于再刺激)与对应于EBV抗原的肽“接触”通常包括在包含所述肽的体外/离体细胞培养基中培养所述PBMC/细胞群。类似地，应该理解的是，将PBMC/细胞群与对应于EBV抗原的呈递肽“接触”通常包括在细胞培养基中体外/离体共培养PBMC和PBMC/细胞群。

在一些实施方案中，该方法包括使PBMC与对应于EBV抗原的肽接触。在这样的实施方案中，在PBMC群中的APC(例如树突细胞、巨噬细胞和B细胞)内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工抗原并在MHC I类分子(交叉呈递)和/或MHC II类分子上呈递，用于随后激活PBMC群中的CD8+和/或CD4+T细胞。

在一些实施方案中，该方法包括将通过本文所述刺激步骤获得的细胞群与对应于EBV抗原的肽接触。在这样的实施方案中，细胞群(例如树突细胞、巨噬细胞和B细胞)中的APC内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工抗原并在MHC I类分子(交叉呈递)和/或MHCII类分子上呈递，用于细胞群中CD8+和/或CD4+T细胞的随后再刺激。

在一些实施方案中，该方法包括使PBMC与呈递对应于EBV抗原的肽的APC接触。在一些实施方案中，该方法包括将通过本文所述刺激步骤获得的细胞群与呈递对应于EBV抗原的肽的APC接触。

根据本发明的在刺激和再刺激中的T细胞和APC的共培养在细胞培养基中进行。细胞培养基可以是其中可以在体外/离体培养中保持T细胞和APC的任何细胞培养基。适用于淋巴细胞培养的培养基是技术人员熟知的，包括例如RPMI-1640培养基、AIM-V培养基、Iscoves培养基等。

在一些实施方案中，细胞培养基可以包含RPMI-1640培养基和/或Click’s培养基(也已知为Eagle’s Ham’s氨基酸(EHAA)培养基)。这些培养基的组成是技术人员熟知的。RPMI-1640培养基的配方描述在例如Moore et al.,JAMA(1967)199:519-524中，Click’s培养基的配方描述在Click et al.,Cell Immunol(1972)3:264-276中。RPMI-1640培养基可以从例如ThermoFisher Scientific公司获得，而Click’s培养基可以从例如Sigma-Aldrich(目录号C5572)获得。

在一些实施方案中，本公开的方法包括在包含RPMI-1640培养基和Click’s培养基的细胞培养基中，培养已经与对应于EBV抗原的肽接触过的PBMC，或在存在呈递对应于EBV抗原的肽的APC的情况下培养PBMC。在一些实施方案中，本公开的方法包括在包含RPMI-1640培养基和Click’s培养基的细胞培养基中，培养通过本文所述刺激步骤获得的、已经与对应于EBV抗原的肽接触过的细胞群，或者在存在呈递对应于EBV抗原的肽的APC情况下培养通过本文所述刺激步骤获得的细胞群。

在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)25-65％的RPMI-1640培养基和25-65％的Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含30-60％RPMI-1640培养基和30-60％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含35-55％RPMI-1640培养基和35-55％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基和40-50％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含45％RPMI-1640培养基和45％Click’s培养基。

在一些实施方案中，细胞培养基可以包含一种或多种细胞培养基添加剂。细胞培养基添加剂为本领域技术人员所熟知，包括抗生素(如青霉素、链霉素)、血清(如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA))、L-谷氨酰胺、细胞因子/生长因子等。

在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积)5-20％FBS，例如7.5-15％FBS，或10％FBS。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5-5％GlutaMax，例如1％GlutaMax。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5-5％Pen/Strep，例如1％Pen/Strep。

本公开的方面在用于产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群体的方法中使用抗原呈递细胞(APC)。

根据本公开的APC可以是专业APC。专业APC专门用于向T细胞呈递抗原；它们能有效地加工MHC肽复合物和将其在细胞表面上呈递，并表达高水平的共刺激分子。专业的APC包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。非专业APC是能够向T细胞呈递MHC肽复合物、特别是向CD8+T细胞呈递MHC I类肽复合物的其他细胞。

在一些实施方案中，APC是能够在MHC I类上交叉呈递被APC内化(例如通过内吞/吞噬被摄入)的抗原的APC。在MHC I类上内化抗原向CD8+T细胞的交叉呈递描述于例如Alloatti et al.,Immunological Reviews(2016),272(1):97-108中，通过引用将其整体结合于此。能够交叉呈递的抗原呈递细胞包括例如树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞和窦内皮细胞。

如本文所解释的，在一些实施方案中，用于刺激对EBV抗原特异的免疫细胞的APC包含在包含对EBV抗原特异的免疫细胞的细胞群(例如，PBMC)中，将根据本公开的方法扩增对EBV抗原特异的细胞群。在这样的实施方案中，APC可以是例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞或细胞群中能够向对EBV抗原特异的免疫细胞呈递抗原的任何其他细胞类型。

在一些实施方案中，该方法使用已经被修饰以表达/包含EBV抗原/其肽的APC。在一些实施方案中，由于已经与所述肽接触并且已经内化了所述肽，所以APC可以呈递对应于EBV抗原的肽。在一些实施方案中，APC可能已经被所述肽“脉冲化”，这通常包括在所述肽的存在下体外培养APC一段足以使所述APC内化所述肽的时间。

在一些实施方案中，由于细胞内编码抗原的核酸的表达，APC可以呈递对应于所述EBV抗原的肽。由于已经感染了EBV(例如在B细胞的情况下，例如LCLs)，APC可以包含编码EBV抗原的核酸。由于编码抗原的核酸已经被引入细胞，例如通过转染、转导、电穿孔等，因此APC可以包含编码EBV抗原的核酸。编码EBV抗原的核酸可以在质粒/载体中提供。

在一些实施方案中，在本公开的方法中使用的APC选自活化的T细胞(ATCs)、树突细胞、B细胞(包括例如LCLs)和人工抗原呈递细胞(aAPC)，例如Neal等人，J Immunol ResTher(2017)2(1):68-79以及Turtle和Riddell，Cancer J.(2010)16(4):374-381中描述的那些。

在一些实施方案中，就它们将一起共培养以产生/扩增包含对EBV抗原特异的免疫细胞的免疫细胞群的细胞群而言，APC是自体的。也就是说，在一些实施方案中，APC来自与获得它们要与之共培养的细胞群的受试者相同的受试者(或衍生自从其获得的细胞)。

多克隆的活化T细胞(ATCs)作为APC的用途和制备ATCs的方法描述于例如Ngo等人，J Immunother.(2014)37(4):193–203，通过引用将其并入本文。简而言之，在IL-2的存在下，通过用激动剂抗CD3和激动剂抗CD28抗体刺激PBMC，可以在体外非特异性激活T细胞来产生ATCs。

树突细胞可以根据本领域公知的方法、例如在Ngo et al.,JImmunother.(2014)37(4):193–203中描述的方法产生。树突状细胞可以从单核细胞制备，所述单核细胞可以通过从PBMC进行CD14选择获得。单核细胞可以在细胞培养基中培养，导致它们分化为未成熟的树突细胞，其可以包含例如IL-4和GM-CSF。未成熟树突状细胞可以通过在IL-6、IL-1β、TNFα、PGE2、GM-CSF和IL-4存在下培养而成熟。

LCL可以根据本领域公知的方法产生，例如描述于Hui-Yuen等人，J Vis Exp(2011)57:3321,以及Hussain和Mulherkar,Int J Mol Cell Med(2012)1(2):75-87中的方法，二者在此全部引入作为参考。简而言之，在环孢菌素A的存在下，通过将PBMC与产生EBV的细胞(例如B95-8细胞)的浓缩细胞培养上清液温育，可以产生LCL。

人工抗原呈递细胞(aAPC)包括例如K562cs细胞，其被工程化以表达共刺激分子CD80、CD86、CD83和4-1BBL(描述于例如Suhoski等人，Mol Ther.(2007)15(5):981-8)。

在一些实施方案中，所述APC不是被EBV感染的细胞。在一些实施方案中，所述APC不是被EBV感染的B细胞。在一些实施方案中，APC不是EBV-LCL。

在一些实施方案中，刺激步骤包括将PBMC接触对应于EBV抗原的肽。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对EBV抗原特异的免疫细胞与呈递对应于EBV抗原的肽的APC接触。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对EBV抗原特异的免疫细胞与对应于EBV抗原的ATCs呈递肽接触。

在一些实施方案中，所述方法进一步使用用于在刺激和/或再刺激中增强共刺激的试剂。这种试剂包括例如表达共刺激分子(例如CD80、CD86、CD83和/或4-1BBL)的细胞，例如LCLs或K562cs细胞。在一些实施方案中，表达共刺激分子的细胞是HLA阴性、无EBV复制能力的LCL，也称为“通用LCL”或“uLCL”。uLCL描述在例如US2018/0250379 A1中。

用于增强共刺激的试剂的其他例子包括例如对由T细胞表达的共刺激受体(例如4-1BB、CD28、OX40、ICOS等)特异的激动剂抗体，以及能够激活T细胞表达的共刺激受体的共刺激分子(如CD80、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL等)。这样的试剂可以以例如固定在珠子上的形式提供。

在一些实施方案中，再刺激步骤包括在存在uLCLs的情况下，使对EBV抗原特异的免疫细胞与呈递对应于EBV抗原的肽的ATCs接触。

免疫细胞群与对应于EBV抗原的肽或呈递对应于EBV抗原的肽的APC的接触可以在一种或多种细胞因子存在下进行，以促进T细胞活化和增殖。在一些实施方案中，刺激在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一种或多种存在下进行。应当理解，细胞因子是外源添加到培养物中的，并且是由培养物中的细胞产生的细胞因子之外的。在一些实施方案中，添加的细胞因子是重组产生的细胞因子。

因此，在一些实施方案中，本公开的方法包括在存在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一种或多种的情况下，培养已经与对应于EBV抗原的肽接触的PBMC，或者在存在呈递对应于EBV抗原的肽的APC的情况下培养PBMC。

在一些实施方案中，培养是在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21存在下进行的。在一些实施方案中，培养是在IL-7、IL-15、IL-6和/或IL-12存在下进行的。在一些实施方案中，培养是在IL-7和/或IL-15存在下进行的。

在一些实施方案中，培养物中IL-7的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种。在一些实施方案中，培养物中IL-7的最终浓度约为10ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种。在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度约为10ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种。在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度约为100ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种。在一些实施方案中，培养物中IL-6的最终浓度约为100ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-12的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种。在一些实施方案中，培养物中IL-12的最终浓度为10ng/ml。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)，IL-12的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)。

在一些实施方案中，刺激培养物中IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)。

在一些实施方案中，刺激培养物中IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，刺激培养物中IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)，刺激培养物中IL-12的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中IL-15的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)。

在一些实施方案中，再刺激培养物中IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一种，例如10ng/ml)，并且再刺激培养物中IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一种，例如约100ng/ml)。

根据本方法的刺激和再刺激通常包括将T细胞和APC共培养一段时间，这段时间足以使APC刺激T细胞，以及使T细胞经历细胞分裂。

在一些实施方案中，本公开的方法包括在至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天中之一的期间内，培养已经与对应于EBV抗原的肽接触的PBMC，或在呈递对应于EBV抗原的肽的APC存在下培养PBMC。在一些实施方案中，培养持续24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4天至11天或6天至10天或7天至9天中的一天。

在一些实施方案中，本公开的方法包括在至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天的时间内，培养通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群，所述细胞群已经与对应于EBV抗原的肽接触，或者在存在呈递对应于EBV抗原的肽的APC的情况下培养4。在一些实施方案中，培养持续24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4天至11天或6天至10天或7天至9天中的一种。

刺激和再刺激可以通过将培养物中的细胞与培养它们的培养基分开，或者稀释培养物，例如通过加入细胞培养基来结束。在一些实施方案中，该方法包括在刺激或再刺激培养结束时收集细胞的步骤。

在一些实施方案中，根据本公开的再刺激步骤可以通过添加细胞培养基(和本文所述的任何其它添加剂)来建立，添加量适于实现再刺激步骤所需的细胞培养基、条件培养基(和任何添加剂)的百分比/浓度。

在给定刺激或再刺激步骤的培养期结束时，可以收集细胞并将细胞与细胞培养上清液中分开。可以通过离心收集细胞，并且可以将细胞培养物上清液与细胞沉淀分开。然后可以将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，例如用于再刺激步骤。在一些实施方案中，细胞可以在收集后经历洗涤步骤。洗涤步骤可以包括将细胞沉淀重新悬浮在等渗缓冲液如磷酸盐缓冲盐水中，通过离心收集细胞，并丢弃上清液。

根据本公开的用于产生和/或扩增对EBV抗原特异的免疫细胞群体的方法通常包括不止一个刺激步骤。在根据本公开的方法中可以执行的刺激步骤的数量没有上限。在一些实施方案中，该方法包括多于2、3、4或5个刺激步骤。在一些实施方案中，该方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个刺激步骤中的一种。根据本公开的方法中的刺激步骤可以彼此不同。

在一些实施方案中，本发明方法中使用的PBMC耗尽了CD45RA阳性细胞。也就是说，在一些实施方案中，PBMC是“耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC”，或者是“CD45RA阴性PBMC”。CD45RA阳性细胞的耗竭旨在减少根据本公开的方法产生/扩增的细胞群中的自然杀伤细胞和/或调节性T细胞的数量。

在一些实施方案中，所述方法包括例如在根据本公开的刺激步骤之前耗尽PBMC中的CD45RA阳性细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法包括例如在根据本公开的再刺激步骤之前，对通过根据本公开的刺激步骤获得的细胞耗尽CD45RA阳性细胞的步骤。CD45RA阳性细胞的耗尽可以通过任何合适的方法来实现，例如通过MACS，例如使用

Biotec柱和磁性抗CD45RA抗体包被的珠。

在一些实施方案中，用于衍生本公开方法中使用的APC的细胞群耗尽了CD45RA阳性细胞。也就是说，在一些实施方案中，用于衍生APC的细胞群体是“耗尽了CD45RA阳性细胞的”或“CD45RA阴性的”群体。例如，在采用ATC作为APC的实施方案中，ATC可以衍生自耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC群，或者来源于CD45RA阴性的PBMC群。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括修饰对EBV抗原特异的免疫细胞，以增加细胞中IL-7介导的信号传导。IL-7介导的信号传导已被证明可以提高肿瘤特异性T细胞的存活率和抗肿瘤活性——参见例如Shum等人,Cancer Discov.(2017)7(11):1238–1247,以及WO 2018/038945 A1。

方法步骤的特定示例性实施方案

结合本公开，以下特定的示例性方法步骤明确考虑在内:

(A)通过使PBMC与BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(B)通过将PBMC与BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BXLF1肽混合物、BALF1肽混合物、BLLF2肽混合物、BALF2肽混合物和/或BNLF2A肽混合物接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(C)通过将PBMC与BZLF1肽混合物、BRLF1和/或BMRF1肽混合物接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(D)通过使PBMC与BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(E)通过使PBMC与下列物质接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(F)通过使PBMC与下列物质接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BXLF1肽混合物、BALF1肽混合物、BLLF2肽混合物、BALF2肽混合物和/或BNLF2A肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(G)通过使PBMC与下列物质接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物和/或BMRF1肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(H)通过使PBMC与下列物质接触，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(I)在IL-7、IL-15、IL-6和/或IL-12的存在下，根据(A)至(H)中任一项刺激免疫细胞。

(J)在存在IL-7和/或IL-15的情况下，根据(A)至(I)中任一项刺激免疫细胞。

(K)根据(A)至(J)中任一项刺激免疫细胞，其中所述PBMC耗尽了CD45RA阳性细胞。

(1)通过与已经用BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物脉冲的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(M)通过与已经用BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BXLF1肽混合物、BALF1肽混合物、BLLF2肽混合物、BALF2肽混合物和/或BNLF2A肽混合物脉冲的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(N)通过与用BZLF1肽混合物、BRLF1和/或BMRF1肽混合物脉冲的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(O)通过与已经用BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物脉冲的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞。

(P)通过与已经被下述物质脉冲处理的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(Q)通过与已经被下述物质脉冲处理的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物、BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BXLF1肽混合物、BALF1肽混合物、BLLF2肽混合物、BALF2肽混合物和/或BNLF2A肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(R)通过与已经被下述物质脉冲处理的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BZLF1肽混合物、BRLF1肽混合物和/或BMRF1；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(S)通过与已经被下述物质脉冲处理的APC共培养，刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞:

BMRF1肽混合物、BMLF1肽混合物、BALF2肽混合物、BNLF2A肽混合物、BNLF2B肽混合物和/或BMRF2肽混合物；和

EBNA1肽混合物、LMP1肽混合物和/或LMP2肽混合物。

(T)根据(L)至(S)中任一项刺激免疫细胞，其中所述APC是ATC。

(U)根据(T)刺激免疫细胞，其中所述ATCs来源于耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC。

(V)在存在uLCLs的情况下，根据(L)至(U)中任一项刺激免疫细胞。

(W)在存在IL-7和/或IL-15的情况下，根据(L)至(V)中任一项刺激免疫细胞。

(X)根据(A)至(K)中任一项刺激免疫细胞，随后根据(L)至(W)中任一项刺激免疫细胞。

方法/由该方法产生/扩增的免疫细胞群的特性

本公开的方法可以任选地通过参考该方法的特性和/或通过该方法产生/扩增的免疫细胞群体的特性来表征。

在一些实施方案中，根据本公开的方法产生/扩增的免疫细胞群具有以下特性中的一种或多种:

a)包含响应于对应于一种或多种EBV裂解性抗原的肽的刺激而产生IFNγ的细胞；

b)包含响应于对应于一种或多种EBV裂解性抗原的肽的刺激而产生IFNγ的细胞，并且包含响应于对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的肽的刺激而产生IFNγ的细胞；

c)包含响应于EBV感染细胞的刺激而产生IFNγ的细胞；

d)针对EBV感染的自体细胞的细胞溶解活性；

e)体内抗EBV阳性癌症的抗癌活性；

f)抑制体内EBV阳性肿瘤的生长；和

g)减少体内EBV阳性癌症的转移。

免疫细胞群可以通过例如ELISPOT分析来评估它们是否包含响应于对应于EBV抗原的肽和/或EBV感染的细胞(例如LCLs)的刺激而产生干扰素γ的细胞，所述分析可以如实施例2所述进行。

免疫细胞群可以使用Zaritskaya et al.,Expert Rev Vaccines(2011),9(6):601-616中综述的方法，如⁵¹Cr释放试验，评估针对自体EBV感染细胞的细胞溶解活性，该文献以其整体内容并入本文。可以使用自体EBV-LCLs进行分析，例如如实施例3所述。

通过在合适的模型中进行分析，可以在体内对免疫细胞群评估针对EBV阳性癌症的抗癌活性和/或对EBV阳性肿瘤的肿瘤生长的抑制。合适的模型和分析包括实施例4中采用的EBV-LCL异种移植模型方法。转移可以通过例如在这种模型中监测动物体内癌细胞的位置来评估，例如如实施例4中所进行的。

在一些实施方案中，与根据用于产生/扩增EBV特异性免疫细胞的参考方法产生/扩增的免疫细胞群体相比，根据本公开的方法产生/扩增的免疫细胞群体可以具有以下一种或多种:

h)包含更大数量/比例的响应于对应于一种或多种EBV抗原的肽的刺激产生IFNγ的细胞；

i)包含更大数量/比例的响应于对应于一种或多种EBV裂解性抗原的肽的刺激而产生IFNγ的细胞；

j)包含对更大量的不同EBV抗原(即更宽范围的EBV抗原)特异的细胞；

k)包含更大数量/比例的响应于EBV感染细胞的刺激而产生IFNγ的细胞；

l)更大的针对体内EBV阳性癌症的抗癌活性；

m)对体内EBV阳性肿瘤的生长更大的抑制；

n)对体内EBV阳性癌症转移的更大降低；

o)体内更持久；和

p)在用免疫细胞群给药的受试者中引发增加量的一种或多种促炎细胞因子(例如GM-CSF和/或IFNγ)的产生。

p)在用免疫细胞群给药的受试者中引起一种或多种抗炎细胞因子(例如，IL-10)的产生减少。

给定免疫细胞群体在体内的存活/持久性可以通过例如用可检测的标记物或报告物标记细胞的方法来评估，并且随着时间的推移监测它们的存活。这些方法包括例如用萤火虫荧光素酶标记细胞，并测量不同时间点的活性。

施用给定免疫细胞群的受试者的细胞因子产生可以通过例如分析从受试者获得的血液衍生样品(例如全血、血浆、血清)来评估。细胞因子水平可以例如通过酶联免疫吸附测定，例如如实施例4所述。

用于产生/扩增EBV特异性免疫细胞的参考方法可以是本文实施例1中所述的方法，该方法在刺激中(仅)使用潜伏性肽混合物。

使用由该方法产生/扩增的免疫细胞群的方法

包含如本文所述产生/扩增的EBV特异性免疫细胞的免疫细胞群可用于治疗和/或预防方法。

提供了一种用于治疗/预防受试者中疾病/病症的方法，包括给受试者施用根据本公开的方法产生/扩增的对EBV特异的免疫细胞群。还提供了根据本公开的方法产生/扩增的对EBV特异的免疫细胞群用于医学治疗/预防方法中。还提供了根据本公开的方法产生/扩增的免疫细胞群用于治疗/预防疾病/病症的方法中。还提供了根据本公开的方法产生/扩增的对EBV特异的免疫细胞群在制备用于治疗/预防疾病/病症的方法的药物中的用途。

具体而言，设想了根据本公开产生/扩增的对EBV特异的免疫细胞群用于通过过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)来治疗/预防疾病/病症的方法中。

过继性细胞转移通常是指从受试者获得细胞(例如免疫细胞)的过程，通常是通过抽取用于分离细胞的血样。然后通常对细胞进行修饰和/或扩增，然后将它们施用于相同的受试者(在自体/同种自体细胞过继转移的情况下)或不同的受试者(在同种异体细胞过继转移的情况下)。该治疗通常旨在向受试者提供具有某些所需特征的细胞群，或者增加该受试者中具有这些特征的细胞的频率。过继转移的目的可以是将细胞或细胞群引入受试者，和/或增加受试者中细胞或细胞群的频率。

免疫细胞的过继转移描述于例如Kalos和June，2013,Immunity39(1):49-60以及Davis等人，2015,Cancer J.21(6):486–491中，这两篇文献在此全部引入作为参考。本领域技术人员能够根据本公开确定用于过继转移细胞的合适试剂和程序，例如通过参考Dai等人，2016J Nat Cancer Inst 108(7):djv439，其全部内容通过引用结合于此。

在一些实施方案中，该方法包括:

(a)根据本公开的方法产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群，和

(b)对受试者施用所产生的/扩增的对EBV特异的免疫细胞群。

在一些实施方案中，该方法包括:

(a)从受试者中分离/获得免疫细胞群(例如PBMC)；

(b)根据本公开的方法产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群，和

(c)对受试者施用所产生的/扩增的对EBV特异的免疫细胞群。

在一些实施方案中，从中分离免疫细胞(例如，PBMC)的受试者是施用产生的/扩增的对EBV特异的免疫细胞群体的同一受试者(即，过继转移可以是自体/自体细胞)。在一些实施方案中，从中分离免疫细胞(例如PBMC)的受试者是与施用所产生/扩增的对EBV特异的免疫细胞群体的受试者不同的受试者(即过继转移可以是同种异体细胞)。

在一些实施方案中，该方法可以包括以下一个或多个:

从受试者获取血液样本；

从血液样本中分离免疫细胞(如PBMC)；

根据本公开的方法产生/扩增对EBV特异的免疫细胞群；

收集/分离对EBV特异的免疫细胞群；

将EBV特异性免疫细胞群与佐剂、稀释剂或载体混合；

给受试者施用对EBV特异的免疫细胞群。

该方法可以有效地减少疾病/病症的发展/进展，减轻疾病/病症的症状或降低疾病/病症的病理。该方法可有效防止疾病/病症的进展，例如防止疾病/病症的恶化或减缓其发展速度。在一些实施例中，该方法可以导致疾病/状况的改善，例如疾病/状况的症状的减少或疾病/状况的严重性/活动性的一些其他相关性的减少。在一些实施例中，所述方法可以防止疾病/病症发展到后期阶段(例如慢性阶段或转移)。

应当理解，根据本公开产生/扩增的细胞群的治疗和预防效用可延伸至对将从EBV负荷和/或受EBV感染的细胞的数量/活性减少中获得治疗或预防益处的任何疾病/病症的治疗/预防。

例如，所述疾病/病症可以是其中EBV或受EBV感染的细胞在病理学上受到牵连的疾病/病症，例如其中EBV感染与所述疾病/病症的发作、发展或进展和/或所述疾病/病症的一种或多种症状的严重性正相关的疾病/病症，或者其中EBV感染是疾病/病症的发作、发展或进展的危险因素的疾病/病症。

该治疗可以针对以下一种或多种:降低EBV负荷，减少EBV阳性细胞的数量/比例，降低EBV阳性细胞的活性，延迟/预防疾病/病症症状的发作/进展，降低疾病/病症症状的严重程度，减少EBV阳性细胞的存活/生长，增加受试者的存活率。

在一些实施方案中，根据本公开内容进行治疗/预防的疾病/病症是以EBV感染为特征的疾病/病症。

在一些实施方案中，可以基于例如在外周或在受所述疾病/病症影响的器官/组织中(例如所述疾病/病症的症状在其中显现的器官/组织)EBV/受EBV感染的细胞的检测，或通过EBV阳性癌细胞(例如肿瘤中的EBV阳性细胞)的检测，来选择受试者进行本文所述的治疗。所述疾病/病症可能影响任何组织或器官或器官系统。在一些实施方案中，所述疾病/病症可能影响几个组织/器官/器官系统。

在一些实施方案中，可以基于受试者感染EBV或包括感染EBV的细胞的测定来选择受试者用于根据本公开进行治疗/预防。

EBV与多种癌症有关，如Jha et al.,Front Microbiol.(2016)7:1602中综述的，在此将其全部内容引入作为参考。

因此，在一些实施方案中，待根据本公开进行治疗/预防的疾病是癌症。

癌症可以指任何不想要的细胞增殖(或任何以不想要的细胞增殖为表现的疾病)、赘生物或肿瘤。癌症可以是良性的或恶性的，可以是原发性的或继发性的(转移性的)。肿瘤可以是任何异常的细胞生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是来源于例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食管、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、大网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴和/或白细胞。

肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可起源于中枢或外周神经系统，如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可以起源于任何其他非神经组织，例子包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、血液学癌和肉瘤。

在一些实施方案中，癌症选自:结肠癌、结肠癌瘤、结肠直肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、口咽癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、口腔癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌或间皮瘤。

在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是与EBV相关的癌症。“EBV相关”癌症可以是由EBV感染引起或加重的癌症、感染是其危险因素的癌症和/或感染与发病、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。

可以根据本发明治疗/预防的EBV相关癌症包括B细胞相关癌症，例如伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、中枢神经系统淋巴瘤(CNS淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和与免疫缺陷相关的EBV相关淋巴瘤(包括例如与X连锁淋巴增生性疾病相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/艾滋病相关的EBV阳性淋巴瘤和口腔毛状白斑(oral hairyleukoplakia))，以及上皮细胞相关癌症，例如鼻咽癌(NPC)和胃癌(GC)。

在一些实施方案中，癌症选自淋巴瘤(例如EBV阳性淋巴瘤)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC；例如EBV阳性的HNSCC)、鼻咽癌(NPC；例如EBV阳性的NPC)和胃癌(GC，例如EBV阳性GC)。

EBV-感染还与多种自身免疫性疾病的发展/进展有关，如多发性硬化和系统性红斑狼疮(SLE，参见例如Ascherio and Munger Curr Top Microbiol Immunol.(2015)；390(Pt 1):365-85)，并且EBV抗原EBNA2最近被证明与被暗示为SLE、多发性硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病、1型糖尿病、幼年特发性关节炎和乳糜泻发展的危险因素的遗传区域相关(Harley et al.,Nat Genet.(2018)50(5):699–707)。

因此，在一些实施方案中，待根据本公开内容治疗/预防的疾病/病症选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病、1型糖尿病、幼年特发性关节炎和乳糜泻。

根据本公开产生/扩增的细胞群也可独立于EBV感染而用于治疗/预防疾病/病症。

如上所述，根据本公开产生/扩增的细胞群可用于治疗癌症的方法中。

在一些实施方案中，所述癌症可以表达癌抗原。“癌抗原”是由癌细胞表达或过表达的抗原。癌抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌抗原的表达可能与癌症有关。癌抗原可能由癌细胞异常表达(例如，癌抗原以异常定位表达)，或可能由癌细胞以异常结构表达。癌抗原可能能够引发免疫反应。在一些实施方案中，所述抗原在癌细胞的细胞表面表达(即癌抗原可以是癌细胞表面抗原)。在一些实施方案中，与本文所述的抗原结合分子结合的抗原部分展示在癌细胞的外表面上(即在细胞外)。在一些实施方案中，癌抗原是其表达与癌症症状的发展、进展或严重性相关的抗原。癌症相关抗原可能与癌症的病因或病理有关，或者可能因癌症而异常表达。在一些实施方案中，癌抗原是其表达被癌细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平)的抗原，例如与相当的非癌细胞(例如源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比。在一些实施方案中，癌抗原优先由癌细胞表达，并且不由相当的非癌细胞(例如源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方案中，癌抗原是突变的癌基因或突变的肿瘤抑制基因的产物。在一些实施方案中，癌抗原是过表达的细胞蛋白、致癌病毒产生的癌抗原、癌胚抗原、细胞表面分子(例如细胞表面蛋白或糖蛋白)的产物。在一些实施方案中，癌抗原是细胞信号传导分子，例如。细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素或淋巴因子。在一些实施方案中，癌抗原是生长因子或激素。

在一些实施方案中，癌症对所述癌抗原呈“阳性”，意味着所述癌症包含表达所述癌抗原的细胞(例如在细胞表面表达所述癌抗原的细胞)。癌抗原阳性癌症可能过表达所述癌抗原。癌抗原的过表达可以通过检测癌抗原的基因或蛋白质表达水平来确定，该水平高于等效的非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。癌抗原的基因/蛋白质表达可能是癌症和/或转移的症状的发生、发展、进展或严重程度的危险因素和/或与其正相关。

受试者

根据本公开内容描述的各方面的受试者可以是任何动物或人。受试者优选哺乳动物，更优选人。受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人。受试者可以是任何性别。受试者可能是患者。受试者可能已经被诊断患有需要治疗的疾病/病症，可能被怀疑患有这种疾病/病症，或者可能有发展/感染这种疾病/病症的风险。

在根据本公开的实施方案中，受试者优选为人受试者。在一些实施方案中，待根据本文公开的治疗或预防方法治疗的受试者是患有疾病/病症或有发展疾病/病症风险的受试者。在根据本公开的实施方案中，可以基于这种疾病/状况的某些标记的特征来选择受试者用于根据所述方法进行治疗。

序列同一性

为了确定两个或多个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比进行的成对和多序列比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，如ClustalOmega(

J.2005,Bioinformatics 21,951-960),T-coffee(Notredame等人，2000,J.Mol.Biol.(2000)302,205-217),Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005,BMCBioinformatics,6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013,Molecular Biology andEvolution,30(4)772–780软件。当使用这种软件时，优选使用默认参数，例如缺口罚分和延伸罚分。

编号段落

以下编号的段落提供了关于本公开所涵盖的特征和特征组合的进一步陈述:

1.一种用于产生或扩增免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞，所述方法包括通过将PBMC(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括再刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞，其通过使所述免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的APC接触来进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述PBMC是耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC。

6.一种用于产生或扩增免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞，所述方法包括通过将PBMC(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽，以及对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽以及对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包括再刺激所述对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和所述对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞，其是通过使所述免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽和对应于EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的APC接触来进行的。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。

12.根据权利要求6所述的方法，其中所述PBMC是耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC。

13.通过权利要求1的方法获得或能够获得的分离的免疫细胞群。

14.一种用于治疗或预防与EBV感染相关的疾病或障碍的方法，包括给受试者施用根据权利要求13所述的分离的免疫细胞群。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病或障碍是选自EBV阳性淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌和EBV阳性胃癌的EBV相关癌症。

***

本发明包括所描述的各方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或明确避免的。

此处使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

现在将参考附图，通过示例的方式来说明本发明的方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中提到的所有文件都通过引用并入本文。

在整个说明书中，包括随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

必须注意的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。范围在这里可以表示为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“大约”将值表示为近似值时，应当理解，所述特定值形成另一个实施方式。

本文公开了核酸序列时，也明确涵盖其反向互补序列。

本文描述的方法可以在体外或体内进行。在一些实施方案中，本文描述的方法在体外进行。术语“体外”旨在包括用培养的细胞进行的实验，而术语“体内”旨在包括用完整的多细胞生物进行的实验。

附图简述

现在将参考附图讨论说明本公开的方法和组合物的原理的实施例和实验。

图1A和1B的数据。条形图显示从四个不同的EBV阳性淋巴瘤患者获得的PBMC扩增的细胞群中，每100，000个对指示的EBV抗原特异的细胞的斑点形成细胞(SFCs)数。图1A显示了每100，000个细胞响应于指定抗原的刺激的SFC数，包括通过使用潜伏肽混合物刺激产生的(T2 EBVSTs)或用潜伏+裂解肽混合物(全EBVSTs)刺激产生的EBVST。图1B显示了每100，000个细胞响应于指定抗原的刺激的SFC数，包括通过使用裂解肽混合物(裂解EBVSTs)或潜伏+裂解肽混合物(全EBVSTs)刺激产生的EBVST。

图2。柱状图显示了通过使用潜伏肽混合物(T2-EBVSTs)、裂解肽混合物(裂解-EBVSTs)或潜伏+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)刺激，从两个EBV阳性淋巴瘤患者的PBMC扩增的EBVSTs中，每100，000个特异于指定EBV抗原的细胞的斑点形成细胞(SFCs)数。以条形显示了细胞的总数。

图3。柱状图显示了通过使用潜伏肽混合物(T2-EBVSTs)、立即-早期裂解肽混合物(IE-EBVSTs)、早期裂解肽混合物(E-EBVSTs)或潜伏+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)的刺激，从三名健康供体受试者的PBMC扩增的EBVST内，每100，000个对指示的EBV抗原特异的细胞的斑点形成细胞(SFC)数。

图4。条形图显示了在体外细胞溶解活性测定中，通过使用潜伏肽混合物(T2-EBVSTs)、立即-早期裂解肽混合物(IE-EBVSTs)、早期裂解肽混合物(E-EBVSTs)或潜伏+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)刺激，从三名健康供体受试者的PBMC扩增的EBVSTs溶解的自体EBV-LCLs的百分比。

图5。柱状图显示了通过使用潜伏肽混合物(T2-EBVSTs)或潜伏+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)刺激从PBMC扩增的EBVST中，每100,000个对指示的EBV抗原或LCLs特异的细胞的斑点形成细胞(APC)数。

图6A至6C。图形和图像显示了在EBV阳性癌症的小鼠异种移植模型中，通过使用潜伏期肽混合物(T2-EBVSTs)或潜伏期+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)对自体EBV-LCLs的刺激而从PBMC扩增的EBVSTs的体内抗癌活性。对照组接受PBS而不是EBVST。图6A显示肿瘤体积(mm³)随时间的变化，图6B和6C显示肿瘤负荷随时间的变化，通过表达萤火虫荧光素酶的EBV-LCLs的荧光素酶活性测量。

图7。图像显示了在EBV阳性癌症的小鼠异种移植物模型中，在研究通过使用潜伏期肽混合物(T2-EBVSTs)或潜伏期+裂解肽混合物(BR-EBVSTs)对自体EBV-LCLs的刺激从PBMC扩增的EBVSTs的抗癌活性的实验的指定日，小鼠体内表达萤火虫荧光素酶的EBV-LCLs的负荷和位置。对照组接受PBS而不是EBVST。

图8A至8D。图像和图表显示了在EBV阳性癌症的小鼠异种移植物模型中，通过使用潜伏肽混合物(T2-EBVSTs)、裂解(2)肽混合物(裂解(2)-EBVSTs)或裂解(2)+潜伏肽混合物(BR(2)-EBVSTs)刺激从PBMC扩增的EBVSTs对自体EBV-LCL的体内抗癌活性。对照组接受PBS而不是EBVST。图8A至8C显示了通过表达萤火虫荧光素酶的EBV-LCLs的荧光素酶活性测量的肿瘤负荷随时间的变化。图8A示出了背侧视图，图8B示出了相对于注射EBVST的指定日期的腹侧视图。图8C显示了总肿瘤负荷随时间的变化。图8D显示了肿瘤体积(mm³)随时间的变化。

图9A至9C。方框图显示了在EBVST注射后的指定天数，在EBV阳性癌症的小鼠异种移植物模型中，通过使用潜伏期肽混合物(T2-EBVSTs)、裂解肽混合物(裂解(2)-EBVSTs)或裂解性肽混合物(2)+潜伏期肽混合物(BR(2)-EBVSTs)的刺激，在接受用从PBMC扩增的EBVSTs治疗的小鼠的血清中检测到的细胞因子水平。图9A显示了GM-CSF的水平，图9B显示了干扰素γ的水平，图9C显示了IL-10的水平。***P＝0.0001。

图10。柱状图显示了在通过使用潜伏肽混合物刺激、从来自从四个不同健康供体受试者(D#1至D#4)获得的PBMC扩增的细胞群中，每100，000个对EBV抗原特异的细胞中的斑点形成细胞(SFC)数。WW＝从全PBMC扩增、并使用来自全PBMC的ATCs进行再刺激的EBVST；WD＝从全PBMC扩增、并使用来源于耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC的ATCs进行再刺激的EBVST；DW＝从耗尽CD45RA阳性细胞扩增的PBMC，并使用来自全PBMC的ATCs进行再刺激的EBVST；和DD＝从耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC中扩增、并使用来源于耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC的ATCs进行再刺激的EBVST。

图11。直方图显示了CD80和HLA-DR在来自四个不同健康供体受试者(D#1至D#4)、来自完整PBMC或来自耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC的ATCs上的表达，如通过流式细胞术测定的。

实施例

在以下实施例中，发明人描述了通过用不同EBV抗原的肽刺激，从PBMC群体产生包含EBV特异性T细胞的细胞群体。本发明人对扩增的细胞群鉴定了其EBV反应性、显示抗EBV感染细胞的效应活性的能力以及其体内抗EBV阳性癌症的抗癌活性。发明人还研究了增加扩增群体中EBV反应性细胞的比例的方法，以及它们的抗癌活性和体内持久性。

实施例1:EBV特异性T细胞的产生

根据标准的Ficoll-Paque密度梯度离心法，从获自健康供体或淋巴瘤患者的血样中分离PBMC。

ATCs的产生

将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28激动剂抗体通过加入0.5毫升1∶1000稀释的1毫克/毫升抗体，并在37℃孵育2-4小时，或在4℃孵育过夜，从而包被到组织培养板的孔上。通过在补充有10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的CTL细胞培养基(包含RPMI-1640培养基、50％Click氏培养基、10％FBS、1％GlutaMax、1％Pen/Strep)中在抗CD3/CD28激动剂抗体包被的平板上培养，刺激1×10⁶个PBMC(在2ml细胞培养基中)。将细胞在5％的二氧化碳气氛中保持在37℃。第二天，用含有20ng/ml IL-7和200ng/ml IL-15的新鲜CTL培养基替换1毫升细胞培养基。将ATCs保持在培养物中，随后收获并用于实验或在第5-7天冷冻保存。

通用LCLs

缺乏HLA I类和HLA II类表面表达的LCLs(即HLA阴性LCLs)是通过靶向敲除EBV转化B细胞制备的淋巴母细胞系细胞中的编码HLA I类和HLA II类分子的基因而获得的。HLA阴性的细胞被进一步修饰以敲除EB病毒复制所必需的基因。通过该方法获得的所得细胞在本文中称为通用细胞(uLCLs)。

EBV特异性T细胞的扩增

在含有50％高级RPMI、50％Click氏培养基、10％FBS、1％GlutaMax、1％Pen/Strep、补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的细胞培养基中，用从JPT技术公司获得的肽混合物的下列组合之一(重叠的15聚氨基酸肽文库，重叠11个氨基酸，跨越相关抗原的全部氨基酸序列)刺激2×10⁶个PBMC 9天，扩增EBV特异性T细胞:

(i)EBNA1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-EBNA1)+LMP1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-LMP1)+LMP2肽混合物(JPT目录号PM-EBV-LMP2)–“潜伏期肽混合物”

(ii)BZLF1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-BZLF1)+BRLF1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-BRLF1)+BMRF1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-BMRF1)+BMLF1肽混合物*+BALF2肽混合物*+BNLF2A肽混合物*+BNLF2B肽混合物*+BMRF2肽混合物*–“裂解肽混合物”

(iii)EBNA1肽混合物+LMP1肽混合物+LMP2肽混合物+BZLF1肽混合物+BRLF1肽混合物+BMRF1肽混合物+BMLF1肽混合物+BALF2肽混合物+BNLF2A肽混合物+BNLF2B肽混合物+BMRF2肽混合物–“潜伏期+裂解肽混合物”

肽混合物的组合(即肽混合物的混合物)用于刺激，最终用量为10ng肽混合物的混合物/1×10⁶个PBMC。

*用于BMLF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2的肽混合物是通过组合从Genemed获得的单个组成肽制备的。

(iv)BZLF1肽混合物+BRLF1肽混合物+BMRF1肽混合物–“立即早期裂解肽混合物”

(v)BMRF1肽混合物+BMLF1肽混合物+BALF2肽混合物+BNLF2A肽混合物+BNLF2B肽混合物+BMRF2肽混合物(JPT Cat.No.PM-EBV-BMRF1)–“早期裂解肽混合物”

在9天的过程中，根据需要添加额外的细胞培养基，并在第5、6或7天补充细胞因子。

在9天培养期结束时，在存在uLCLs的情况下，通过与经过辐射、肽脉冲处理过的自体活化T细胞(ATCs)共培养来再刺激所述细胞。简而言之，将2×10⁶个ATCs与肽混合物(10ng肽混合物的混合物/1×10⁶个ATCs)在CTL培养基中于37℃孵育30分钟，随后以30Gy照射并收获。然后，在含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的CTL培养基中，以应答细胞∶肽脉冲的ATCs∶辐射的uLCL为1∶1∶5的比例，将经过肽脉冲的ATCs与培养物中的细胞和uLCL(以100Gy辐射)混合。具体而言，将1×10⁵个应答细胞、1×10⁵个肽脉冲ATCs和0.5×10⁶个经辐射的uLCLs在2mL CTL培养基中在24孔组织培养板的孔中培养。

细胞在5％的二氧化碳气氛中保持在37℃。3-4天后，根据需要再加入含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的细胞培养基。在第5天或第6天，根据需要加入另外的含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的细胞培养基，6-7天后，收获扩增的EBVST用于分析或用于实验。

在所有实施例和附图中:

通过使用潜伏期肽混合物(即上文(i))的方法产生的EBVSTs被称为“2型潜伏期抗原(T2)-EBVSTs”；

通过使用裂解性肽混合物(即上文(ii))的方法产生的EBVSTs被称为“裂解性EBVSTs”；

采用潜伏期+裂解性肽混合物(即上文(iii))的方法产生的EBVSTs被称为“广谱(BR)-EBVSTs”；

采用立即-早期裂解肽混合物(即上文(iv))的方法产生的EBVSTs被称为“立即早期(IE)-EBVSTs”；和

通过使用早期裂解肽混合物(即上述(v))的方法产生的EBVSTs被称为“早期(E)EBVSTs”。

实施例2:分析EBVSTs对EBV抗原的特异性

通过ELISPOT分析用不同肽混合物从EBV阳性淋巴瘤患者的PBMC制备的EBVSTs，以确定它们识别不同EBV抗原的能力。

简而言之，在用抗IFNγ捕获抗体预包被的96孔板中以1×10⁵个细胞/孔的密度接种EBVSTs，并用对应于指示的EBV肽的肽混合物刺激。培养18-20小时后，对平板显色IFNγ+斑点，在室温下在黑暗中干燥过夜，并定量。每种抗原特异性的T细胞的频率表示为每输入细胞数的特异性斑点形成细胞(SFCs)。

图1A和1B表明，用单独裂解周期抗原的肽混合物进行刺激可以产生特异于裂解周期抗原的T细胞。将潜伏期抗原和裂解性抗原的肽混合物组合不会损害对任何一种抗原的特异性，当将肽混合物组合时，抗原特异性T细胞的总频率更高。

当单独使用潜伏期抗原肽混合物或裂解性抗原肽混合物时，一些患者T细胞显示出较差的特异性，但是当潜伏期抗原肽混合物和裂解性抗原肽混合物联合使用时，可以获得良好的特异性(见供体2)。这被认为是活化的T细胞产生细胞因子的结果，它们互相帮助。

图2显示，与单独使用潜伏期抗原肽混合物或单独使用裂解性抗原肽混合物产生的EBVST相比，对于使用潜伏期抗原和裂解性抗原肽混合物的组合产生的EBVST，响应于对应于EBV潜伏期和裂解性抗原的肽混合物的刺激而分泌IFNγ的细胞数量更多。当使用潜伏期抗原和裂解性抗原肽混合物组合时，产生干扰素γ的细胞数量有一个超级累加性的增加。

在进一步的实验中，通过ELISPOT分析了使用不同肽混合物从健康供体的PBMC制备的EBVST，以确定它们识别不同EBV抗原的能力，如上所述。

结果如图3所示，并证明了有可能从健康供体的PBMC中扩增出对潜伏周期抗原、即刻-早期裂解性抗原和早期裂解性抗原具有特异性的T细胞。

实施例3:用对应于不同EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的EBVSTs的杀细胞伤分 析

对通过使用不同的肽混合物刺激PBMC获得的EBVST分析其杀死EBV转化的自体B细胞系的能力。

将10μl的Cr⁵¹加入到1×10⁶个自体LCLs中，用10ng EBV潜伏+裂解肽混合物(见实施例1的(iii))对其进行脉冲，并在37℃孵育1小时。然后用CTL培养基洗涤LCLs 3次，并重新悬浮在CTL培养基中至50，000个细胞/毫升。在V形孔96孔板的孔中的200μl CTL培养基中，以20∶1的效应细胞∶靶细胞比(100，000个EBVSTs+5，000个LCL)将EBVST与用相应的肽混合物脉冲的自体LCL一起铺板。共培养物在37℃和5％CO2下培养4小时。然后收获上清液，并使用γ射线计数器测量被杀死的靶细胞释放的Cr⁵¹，以测定靶细胞的％特异性裂解。

结果如图4所示。通过使用不同的肽混合物刺激PBMC获得的EBV抗原特异性T细胞能够杀死EBV转化的自体B细胞系。

使用裂解性抗原肽混合物的方法获得的EBVSTs杀死EBV-LCL的强大能力令人惊讶，因为预计只有一小部分LCL处于裂解循环中(从而表达靶抗原)。这一结果可以用来自裂解期死亡细胞的胞吞和抗原呈递来解释。

实施例4:用对应于不同EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的EBVSTs的体内抗癌活 性分析

本发明人使用小鼠异种移植物模型研究了BR-EBVSTs和T2-EBVSTs在体内治疗EBV阳性癌症的比较性能力。

简而言之，通过将matrigel中的3.5×10⁶个表达萤火虫荧光素酶的自体LCLs皮下植入到NSG小鼠的侧腹，建立EBV阳性肿瘤。8天后，当肿瘤可见时，通过静脉注射对小鼠给予PBS(对照组)、5×10⁶个BR-EBVSTs或5×10⁶个T2-EBVSTs。

在整个实验过程中通过生物发光成像监测肿瘤；通过腹膜内注射D-荧光素(每只小鼠1.5毫克)监测荧光素酶活性，并在10分钟后使用IVIS成像仪(Xenogen)对小鼠成像。肿瘤体积也通过使用卡尺的测量来监控。

在输注前，通过ELISPOT分析BR-EBVSTs和T2-EBVSTs响应于不同EBV抗原或EBV-LCLs的刺激产生干扰素γ的能力。结果显示在图5中，并证明了与仅使用对应于EBV潜伏期抗原的肽扩增的免疫细胞群相比，使用对应于EBV潜伏期和裂解性抗原的肽扩增的免疫细胞群包含对EBV潜伏期和裂解性抗原都有反应的细胞，并且包含更大比例的响应于EBV-LCLs刺激而产生IFNγ的细胞。

图6和图7显示，BR-EBVSTs比T2-EBVSTs能更快地控制EBV阳性肿瘤。

图7还显示，经BR-EBVST治疗的小鼠比经T2-EBVST治疗的小鼠转移减少。

在进一步的实验中，如上所述通过皮下植入3.5×10⁶个表达萤火虫荧光素酶的自体LCLs建立EBV阳性肿瘤，8天后通过静脉注射给小鼠施用PBS(对照组)、1×10⁶个BR(2)-EBVSTs、1×10⁶个裂解(2)-EBVSTs或1×10⁶个T2-EBVSTs。

如实施例1所述产生在本实验中使用的裂解(2)-EBVST和BR(2)-EBVSTs，只是在刺激中使用以下肽混合物的组合来扩增EBVSTs:

(vi)BZLF1肽混合物+BRLF1肽混合物+BMRF1肽混合物+BMLF1肽混合物+BXLF1肽混合物+BALF1肽混合物+BLLF2肽混合物+BALF2肽混合物+BNLF2A肽混合物–“裂解(2)肽混合物”

(vii)EBNA1肽混合物+LMP1肽混合物+LMP2肽混合物+BZLF1肽混合物+BRLF1肽混合物+BMRF1肽混合物+BMLF1肽混合物+BXLF1肽混合物+BALF1肽混合物+BLLF2肽混合物+BALF2肽混合物+BNLF2A肽混合物–“裂解(2)+潜伏期肽混合物”

BMLF1、BXLF1、BALF1、BLLF2、BALF2和BNLF2A的肽混合物是通过组合从Genemed获得的单个组成肽制备的。用于EBNA1、LMP1、LMP2、BZLF1、BRLF1和BMRF1的肽混合物从JPT技术公司获得，如实施例1所示。

采用裂解肽混合物(即上文(vi))的方法产生的EBVST被称为“裂解性(2)-EBVST”，采用裂解性(2)+潜伏期肽混合物(即上文(vii))的方法产生的EBVST被称为“BR(2)-EBVST”。

在整个实验过程中，如上所述通过生物发光成像来监测肿瘤，并且还通过使用卡尺的测量来监测肿瘤体积。

在EBVST给药后第3天和第8天也从小鼠收集血浆样品，并通过酶联免疫吸附试验进行分析，以确定GM-CSF、干扰素γ和IL-10的水平。

结果如图8和9所示。

通过使用EBV潜伏期+裂解性抗原的肽刺激而扩增的EBVSTs强烈抑制肿瘤生长(图8A至8D)。通过仅使用EBV裂解性抗原的刺激而扩增的EBVST也能够抑制肿瘤生长，并且其抑制程度与通过仅使用EBV潜伏期抗原的刺激而扩增的EBVST相似或更大。

相对于用仅EBV潜伏期抗原刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠，用EBV潜伏期+裂解性抗原的肽刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠，其血清中的促炎细胞因子水平也增加，而用EBV裂解性抗原的肽刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠，其血清中的促炎细胞因子水平相对于用仅EBV潜伏期抗原刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠而言相似或增加(图9A和9B)。

相比之下，相对于用仅EBV潜伏期抗原刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠，用EBV潜伏期+裂解性抗原的肽刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠在其血清中的IL-10水平降低，而用EBV裂解性抗原的肽刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠在其血清中的IL-10水平相对于用仅EBV潜伏期抗原刺激扩增的EBVSTs处理的小鼠而言相似或降低(图9C)。

所以BR-EBVSTs被发现可以杀死更多的肿瘤细胞，产生更多的促炎细胞因子。不希望受任何特定理论的束缚，这可能导致肿瘤微环境的变化，导致体内表位扩散增加，以及非病毒肿瘤抗原特异性T细胞的额外肿瘤细胞杀伤。

实施例5:结论

总之，发明人已经显示了:

可以通过用对应于裂解性和潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激来自健康供体和淋巴瘤患者的PBMC来获得含有对裂解性和潜伏期EBV抗原特异的T细胞的T细胞群(例如参见图1和3)；

与使用仅对应于裂解性EBV抗原或仅对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物进行刺激相比，用对应于裂解性和潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC产生了更多的EBV抗原反应性T细胞(例如见图2)；

通过用对应于裂解性+潜伏期EBV抗原、或立即早期裂解性抗原、或早期裂解性抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群体能够杀死EBV-LCL，其能力与通过用对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞的T细胞群体相似(例如见图4)；

与用仅对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群相比，用对应于裂解性+潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群包含更大比例的对EBV感染细胞有反应的细胞(例如见图5)；

与通过用对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群相比，通过用对应于裂解性+潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群显示出对肿瘤生长的改善的控制和对EBV阳性癌症的减少的转移(参见例如图6和7)。

与通过用对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群相比，通过用对应于裂解EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞群对EBV阳性癌症的肿瘤生长表现出相似或改善的控制(例如见图8)。

与用通过用对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞治疗的受试者相比，用通过用对应于裂解性+潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞治疗的患有EBV阳性癌症的受试者在外周血中具有升高的促炎细胞因子(GM-CSF，IFNγ)水平和降低的抗炎细胞因子(IL-10)水平(例如参见图9)。

与用通过用对应于潜伏期EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞治疗的受试者相比，用通过用对应于裂解性EBV抗原的肽混合物刺激PBMC获得的T细胞治疗的患有EBV阳性癌症的受试者在外周血中具有相似或升高的促炎细胞因子(GM-CSF，IFNγ)水平和相似或降低的抗炎细胞因子(IL-10)水平(例如参见图9)。

实施例6:从耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC中产生EBV特异性T细胞

接下来，发明人研究了从PBMC群体耗尽CD45RA阳性细胞对EBV特异性T细胞的扩增群体的影响。

由于IL-15介导的对自然杀伤细胞增殖的刺激，在从自然杀伤细胞群扩增EBVST的方法中，来自PBMC群的自然杀伤细胞的生长可能存在问题。CD45RA是一种幼稚的T细胞标记物，也在天然的T调节细胞和自然杀伤细胞上表达，因此可以推断CD45RA+细胞的耗竭会将自然杀伤细胞从初始PBMC群体中移除。CD45RA+细胞的耗竭也去除了可以抑制抗原特异性T细胞生长的调节性T细胞，尤其是在癌症患者中，还去除了可以作为旁观者细胞生长并稀释抗原特异性T细胞的幼稚细胞。

使用

柱和CD45RA缀合的珠粒来对PBMC耗尽表达CD45RA的细胞，并且耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC随后用于基本上如实施例1中所述通过用潜伏期肽混合物刺激来扩增EBV特异性T细胞。

耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC也用作起始群体，用于产生在再刺激中使用的ATCs，其基本上如实施例1所述产生。

比较了以下实验条件:

(i)从全PBMC细胞(即未耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC细胞)扩增的EBVST+使用从全PBMC细胞产生的ATCs的再刺激-在图10中称为“WW”(即全+全)；

(ii)从全PBMC扩增的EBVST+使用从耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC产生的ATCs的再刺激-在图10中称为“WD”(即全+耗尽)；

(iii)从耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC扩增的EBVST+使用从全PBMC产生的ATCs的再刺激-在图10中称为“DW”(即耗尽+全)

(iv)从耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC扩增的EBVST+使用从耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC产生的ATCs的再刺激-在图10中称为“DD”(即耗尽+耗尽)。

通过ELISPOT分析根据上文(i)至(iv)从由四个不同健康供体(D#1至D#4)获得的PBMC制备的EBVST，以测定其识别不同EBV抗原的能力。ELISPOT分析基本上如实施例2所述进行。

结果如图10所示。对于每个供体，与使用整个PBMC群体的方法相比，使用耗尽了CD45RA阳性细胞的PBMC作为起始群体用于扩增EBVST，在扩增的群体中响应于EBV肽混合物的刺激分泌干扰素γ的细胞的比例增加。类似地，使用耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC作为起始群体用于产生用于再刺激的ATCs，导致在扩增的群体中响应于EBV肽混合物的刺激分泌干扰素γ的细胞的比例更大。

本发明人通过流式细胞术分析了共刺激分子CD80和HLA-DR(MHC II类)在由全PBMC产生的或由耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC产生的ATCs上的表达。

结果如图11所示。与从全PBMC产生的ATC相比，从耗尽了CD45RA阳性细胞缺失的PBMC产生的ATC的CD80和HLA-DR表达更高，因此改善了抗原呈递和共刺激特性。

Claims (26)

1.一种用于产生或扩增免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞，所述方法包括通过将外周血单核细胞(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括再刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞，其通过使所述免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽的APC接触来进行。

3.一种用于产生或扩增免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞，所述方法包括通过将外周血单核细胞(PBMC)与以下物质接触来刺激对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞：(i)对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽，以及对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽以及对应于一种或多种EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法进一步包括再刺激所述对EBV裂解性抗原特异的免疫细胞和所述对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞，其是通过使所述免疫细胞与呈递对应于一种或多种EBV裂解性抗原的全部或部分的一种或多种肽和对应于EBV潜伏期抗原的全部或部分的一种或多种肽的APC接触来进行的。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种EBV裂解性抗原选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种EBV潜伏期抗原选自EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述PBMC是耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC。

10.通过权利要求1-9中任一项所述的方法获得或能够获得的分离的免疫细胞群。

11.一种分离的免疫细胞群，其中包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞。

12.一种分离的免疫细胞群，其中包含对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)裂解性抗原特异的免疫细胞和对EBV潜伏期抗原特异的免疫细胞。

13.一种药物组合物，其中包含根据权利要求10至12中任一项所述的分离的免疫细胞群。

14.根据权利要求10至12中任一项所述的分离的免疫细胞群，或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗或预防疾病或障碍的方法中。

15.根据权利要求10至12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或障碍的方法中的药物中的用途。

16.一种用于治疗或预防疾病或障碍的方法，包括给受试者施用根据权利要求10至12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物。

17.根据权利要求14所述使用的分离的免疫细胞群或药物组合物、根据权利要求15所述的用途或根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病或障碍是与EBV感染相关的疾病或障碍。

18.根据权利要求14所述使用的分离的免疫细胞群或药物组合物、根据权利要求15所述的用途或根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。

19.根据权利要求17所述使用的分离的免疫细胞群或药物组合物、用途或方法，其中所述与EBV感染相关的疾病或障碍是EBV相关癌症。

20.根据权利要求18所述使用的分离的免疫细胞群或药物组合物、用途或方法，其中所述癌症是EBV相关癌症。

21.根据权利要求19或20所述使用的分离的免疫细胞群或药物组合物、用途或方法，其中所述EBV相关癌症选自EBV阳性淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌和EBV阳性胃癌。

22.一种杀死被EBV感染的细胞的方法，包括将被EBV感染的细胞与根据权利要求10-12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物接触。

23.根据权利要求10-12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物用于杀死被EBV感染的细胞的用途。

24.一种用于杀死癌细胞的方法，包括将癌细胞与根据权利要求10-12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物接触。

25.根据权利要求10-12中任一项所述的分离的免疫细胞群或根据权利要求13所述的药物组合物用于杀死癌细胞的用途。

26.根据权利要求24或25所述的方法或用途，其中所述癌细胞感染了EBV。

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