CN113939285A - Pin1活性的调节剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于调节Pin1活性的包含亲电部分和刚性部分的化合物。所述刚性部分包含至少一个能够与氢原子形成氢键的官能团，其中所述亲电部分和所述刚性部分经排列使得所述亲电部分能够与Pin1的Cys 113残基共价结合，和所述刚性部分能够与Pin1的Gin 131和His 157残基形成氢键。进一步公开了具有以下式Id的新化合物以及包含这种化合物的文库：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式Id其中虚线、W、X、Y、Z、Ra‑Rc、R1、R2、L1、L2和n如本文定义。进一步公开了通过筛选化合物的文库来鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法。

Description

Pin1活性的调节剂及其用途
相关申请
本申请要求2019年1月9日提交的美国临时申请号62/790,133的优先权的权益，其内容如同本文充分阐述一样通过参考结合。
序列表声明
与本申请的提交同时呈递、包含4,096个字节、于2020年1月9日创建的标题为80874 Sequence Listing.txt的ASCII文件，通过参考结合至本文中。
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及药理学，并且更具体地讲(但不排他地)涉及与Pin1共价结合和/或调节Pin1的活性的新设计的化合物及其例如在治疗与Pin1活性相关的疾病方面的用途。
脯氨酸定向激酶对丝氨酸-脯氨酸或苏氨酸-脯氨酸基序(pSer/Thr-Pro)的磷酸化为一种中枢信号传导机制，据报道在致癌途径中经常失调，驱动细胞转化和下调细胞凋亡[Hanahan & Weinberg, Cell 2011, 144:646-674]。该基序可通过肽基-脯氨酰异构酶NIMA-相互作用-1 (peptidyl-prolyl isomerase NIMA-interacting-1，Pin1)异构化(从顺式到反式或反式到顺式)[Lu和Zhou, Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8:904-916]，该酶为人类蛋白质组中的大约30种肽基-脯氨酰顺-反异构酶(PPIase)中唯一的磷酸化依赖性异构酶。这种异构化会引起构象变化，从而可影响底物稳定性[Lam等人, Mol Cancer2008, 7:91; Liao等人, Oncogene 2009, 28:2436-2445; Lee等人, Nat Cell Biol2009, 11:97-105]、激活[Chen等人, Cell Death Dis 2018, 9:883]、亚细胞定位[Ryo等人, Nat Cell Biol 2001, 3:793-801]和/或与相互作用配偶体的结合，所述配偶体包括脯氨酸定向激酶和磷酸酶，其大多为反式特异性的[Xiang等人, Nature 2010, 467:729-733; Zhou等人, Mol Cell 2000, 6:873-883; Brown等人, Nat Cell Biol 1999, 1:438-443]。因此，Pin1为脯氨酸定向信号传导网络的重要介质，并经常在癌症中发挥激活癌基因和使肿瘤抑制因子失活的作用[Chen等人, Cell Death Dis 2018, 9:883]。
几条证据表明异常Pin1激活为癌发生的关键驱动因素。
据报道Pin1在至少38种肿瘤类型中过度表达和/或过度激活[Bao等人, Am J Pathol 2004, 164:1727-1737]，其机制包括转录激活[Rustighi等人, Nat Cell Biol2009, 11:133-142; Ryo等人, Mol Cell Biol 2002, 22:5281-5295]和翻译后修饰[Lee等人, Mol Cell 2011, 42:147-159; Rangasamy等人, Proc Natl Acad Sci 2012, 109:8149-8154; Chen等人, Cancer Res 2013, 73: 3951-3962; Eckerdt等人, J Biol Chem2005, 280:36575-36583]。据报道高表达与临床预后不良相关[Lu, Cancer Cell 2003,4:175-180; Tan等人, Cancer Biol Ther 2010, 9:111-119]，而导致Pin1表达较低的多态性据报道可降低癌症风险[Li等人, PLoS One 2013, 8:e68148]。
据报道Pin1通过上调超过50种癌基因或生长促进因子[Chen等人, Cell Death Dis 2018, 9:883](包括 NF-κB [Ryo等人, Mol Cell 2003, 12:1413-1426]、c-Myc[Farrell等人, Mol Cell Biol 2013, 33:2930-2949]和Notch1 [Rustighi等人, Nat Cell Biol 2009, 11:133-142])，同时抑制超过20种肿瘤抑制因子或生长抑制因子比如FOXO [Brenkman等人, Cancer Res 2008, 68:7597-7605]、Bcl2 [Basu等人, Neoplasia2002, 4:218-227]和RARα [Gianni等人, Cancer Res 2009, 69:1016-1026]来维持癌细胞中的增殖信号传导。
此外，据报道，在由突变的p53 [Girardini 等人, Cancer Cell 2011, 20:79-91]、激活的HER2/RAS [Wulf等人, EMBO J 2004, 23:3397-3407]或组成型表达的c-Myc[D’Artista等人, Oncotarget 2016, 7:21786-21798]衍生的小鼠模型中，Pin1耗尽可抑制肿瘤发生。
另外，据报道Pin1抑制可使癌细胞对化疗[Gianni等人, Cancer Res 2009, 69:1016-1026; Zheng等人, Oncotarget 2017, 8:29771-29784; Sajadimajd &Yazdanparast, Apoptosis 2017, 22:135-144; Ding等人, Cancer Res 2008, 68:6109-6117]和辐射[Liu等人, Nat Cell Biol 2019, 21:203-213]敏感，并阻断癌症干细胞的肿瘤发生[Rustighi等人, Nat Cell Biol 2009, 11:133-142; Ding等人, Cancer Res2008, 68:6109-6117; Min等人, Mol Cell 2012, 46:771-783]，癌症干细胞与耐药性的发展有关[Dean等人, Nat Rev Cancer 2005, 5:275-284]。
Hennig等人 [Biochemistry 1998, 37:5952-5960]描述了胡桃醌(5-羟基-1,4-萘二酮)对几种PPIase的不可逆抑制。
Kim等人 [Mol Cancer Ther 2009, 8:2163-2171]报道了Pin1的抑制——例如被胡桃醌抑制——减少与他莫昔芬抗性乳腺癌的生长因子释放相关的血管生成。
Campaner等人 [Nat Commun 2017, 8:15772]报道了胡桃醌衍生物KPT-6566表现出通过共价抑制Pin1和释放可产生活性氧物类和DNA损伤的醌模拟药物介导的抗癌活性。
Wei等人 [Nat Med 2015, 21:457-466]报道了全反式视黄酸(ATRA)的抗癌活性通过抑制Pin1介导。
Kozono等人 [Nat Commun 2018, 9:3069]报道了三氧化二砷和ATRA的组合的抗癌活性通过三氧化二砷与Pin1的非共价结合和通过经ATRA增强三氧化二砷细胞摄取以及通过经ATRA抑制Pin1介导。
然而，Pin1作为药物靶点的潜力仍然难以捉摸，因为可获得的Pin1抑制剂缺乏特异性和/或细胞渗透性来研究其体内药理功能[Lu & Hunter, Cell Res 2014, 24:1033-1049; Moore & Potter, Bioorganic Med Chem Lett 2013, 23:4283-4291; Fila等人,J Biol Chem 2008, 283:21714-21724]。
另外的背景技术包括Blume-Jensen & Hunter [Nature 2001, 411:355-365]；Cheng等人 [J Med Chem 2016, 59:2005-2024]；Dahal等人 [Medchemcomm 2016, 7:864-872]；Flanagan等人 [J Med Chem 2014, 57:10072-10079]；Guo等人 [Bioorganic Med Chem Lett 2009, 19:5613-5616]；Guo等人 [Bioorganic Med Chem Lett 2014, 24:4187-4191]；Ieda等人 [Bioorganic Med Chem Lett 2018, S0960-894X(18) 30990-9(电子出版)]；Leeson & Springthorpe [Nat Rev Drug Discov 2007, 6:881-890]；Lian等人 [J Hematol Oncol 2018, 11:73]；London等人 [Nat Chem Biol 2014, 10:1066-1072]；Lonsdale等人 [J Chem Inf Model 2017, 57:3124-3137]；Pawson & Scott[Trends Biochem Sci 2005, 30:283-286]；Planken等人 [J Med Chem 2017, 60:3002-3019]；Resnick等人 [J Am Chem Soc 2019, 141:8951-8968]；Ward等人 [J Med Chem2013, 56:7025-7048]；Yang等人 [Anal Chem 2018, 90:9576-9582]；和Zhang等人 [ACS Chem Biol 2007, 2:320-328]。
发明概述
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种用于调节Pin1活性的化合物，所述化合物包含亲电部分和刚性部分，刚性部分包含至少一个能够与氢原子形成氢键的官能团，其中亲电部分和刚性部分经排列使得亲电部分能够与Pin1的Cys113残基共价结合，和刚性部分能够与Pin1的Gln131和His 157残基形成氢键。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供具有以下式Id的化合物：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
式Id
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
W选自O、S和NR3；
X为卤代；
Y和Z各自独立地选自O、S和NH；
Ra-Rc各自为氢；
L1为键或亚烷基；
L2为亚烷基；
n为1、2、3或4；
R1选自-CH2-C(CH3)3、-CH2-CH(CH3)2、三唑和被三唑和/或被5-或6-元环烷基取代的烷基；
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
R3选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供包含至少30种具有式Id的化合物的筛选文库。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种调节Pin1活性的方法，所述方法包括使Pin1与本文所述相应实施方案中任何一个的化合物接触。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法，所述方法包括针对能够经亲电部分与Pin1的Cys113残基相互作用、经官能团至少与Pin1的Gln131和His 157残基相互作用以及任选地经至少一个亲脂基团与Pin1的疏水补丁(hydrophobic patch)中的至少一个氨基酸残基相互作用的化合物，筛选包含至少30种具有以下式IV的化合物的文库：
E’-L’1-V
式IV
其中：
E’为亲电部分，当与硫醇反应时能够形成共价键；
L’1为连接部分；
V为特征为至少两个能够形成氢键的官能团的部分，并且任选地进一步特征为至少一个亲脂基团，
其中鉴定为能够至少与Pin1的Cys113残基和Gln131和His 157残基相互作用的化合物被鉴定为能够改变Pin1的活性。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法，所述方法包括：
a) 在允许X被Pin1的Cys113残基亲核取代的条件下使包含至少30种由以下式Ic表示的化合物的文库与Pin1接触：
Figure 853985DEST_PATH_IMAGE002
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
b) 确定哪些化合物共价结合Pin1，其中与Pin1共价结合的化合物被鉴定为能够调节Pin1的活性。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种包含至少30种由以下式Ic表示的化合物的筛选文库：
Figure 567863DEST_PATH_IMAGE002
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在。
根据本文所述任何实施方案中的一些，亲电部分包含卤烷基。
根据本文所述任何实施方案中的一些，亲电部分包含卤乙酰胺。
根据本文所述任何实施方案中的一些，官能团能够与Gln131的骨架酰胺氢和/或与His157的咪唑NH形成氢键。
根据本文所述任何实施方案中的一些，氢键将官能团的原子连接于Gln131或His157的氮原子，使得官能团的原子与Gln131或 His157的氮原子之间的距离在2.5-3.5 Å的范围内。
根据本文所述任何实施方案中的一些，官能团为氧原子。
根据本文所述任何实施方案中的一些，刚性部分包含砜基团。
根据本文所述任何实施方案中的一些，刚性部分为或包含环丁砜或环丁烯砜。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物进一步包含疏水部分。
根据与疏水部分相关的本文所述任何实施方案中的一些，疏水部分与Pin1的Ser115、Leu122和/或Met130形成疏水相互作用。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物具有低于500 Da的分子量。
根据任何本文所述实施方案中的一些，化合物由以下式I表示：
E-L1-G(F)m
式I
其中：
E为亲电部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；
L1为键或连接部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；
G为刚性部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；
F各自为形成氢键的官能部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；和
m为2、3或4。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物由以下式Ia表示：
Figure 347600DEST_PATH_IMAGE003
式Ia
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
Y和Z各自独立地选自O、S和NH；
R2和Ra-Rc各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，或者当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
n为1、2、3 或 4。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物由以下式Ib表示：
Figure 742810DEST_PATH_IMAGE001
式Ib
其中：
W选自O、S和NR3；
X为卤代；
Ra-Rc各自为氢；
L1为键或亚烷基；
L2为亚烷基；和
R1和R3各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，L2为亚甲基。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，W为O。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，n为2。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，Y和Z各自为O。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，L1为键。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物由以下式Ic表示：
Figure 291603DEST_PATH_IMAGE002
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，X为氯代。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，R1具有以下式II：
-CH2-R’1
式II
其中R’1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基。
根据与式II相关的本文所述任何实施方案中的一些，R’1为叔烷基、烯基、炔基、环烷基或杂脂环基。
根据与式II相关的本文所述任何实施方案中的一些，R’1为取代或未取代的叔丁基。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，R1或R’1为杂芳基。
根据与为杂芳基的R1或R’1相关的本文所述任何实施方案中的一些，杂芳基为三唑。
根据与三唑相关的本文所述任何实施方案中的一些，三唑具有以下式III：
Figure 114065DEST_PATH_IMAGE004
式III
其中R4选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
根据与式III相关的任何本文所述实施方案中的一些，R4为取代或未取代的苯基。
根据与式III相关的本文所述任何实施方案中的一些，R4为被选自羟基、羟基烷基、卤代、烷氧基、羰基、羧基和磺酰氨基的取代基取代的苯基。
根据与式III相关的本文所述任何实施方案中的一些，R4为对-甲氧基羰基苯基。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，虚线代表饱和键。
根据本文所述任何相应实施方案中的一些，R2为氢。
根据本文所述任何实施方案中的一些，化合物用于治疗其中调节Pin1的活性为有益的病症。
根据与其中调节Pin1的活性为有益的病症相关的本文所述任何实施方案中的一些，病症为增殖性疾病或障碍和/或免疫性疾病或障碍。
根据与增殖性疾病或障碍相关的本文所述任何实施方案中的一些，增殖性疾病或障碍为癌症。
根据与增殖性疾病或障碍相关的本文所述任何实施方案中的一些，增殖性疾病或障碍选自胰腺癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌和乳腺腺癌。
根据与增殖性疾病或障碍相关的本文所述任何实施方案中的一些，增殖性疾病或障碍为胰腺癌。
根据与增殖性疾病或障碍相关的本文所述任何实施方案中的一些，增殖性疾病或障碍为神经母细胞瘤。
根据与筛选文库相关的本文所述任何实施方案中的一些，筛选通过计算对接(computational docking)进行。
根据与筛选文库相关的本文所述任何实施方案中的一些，所述方法进一步包括使鉴定的化合物与Pin1接触，从而确定化合物是否与Pin1结合和/或调节Pin1的活性，
其中确定为能够与Pin1结合和/或调节Pin1的活性的化合物被鉴定为能够改变Pin1的活性。
根据与筛选文库相关的本文所述实任何施方案中的一些，所述方法进一步包括针对与除Pin1的Cys113以外的硫醇的低反应性，筛选文库。
除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明实施方案的实践或测试中可使用与本文所述的那些相似或等效的方法和材料，但以下描述示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，并且不旨在进行必要的限制。
附图的几个视图的简述
本发明的一些实施方案本文仅通过实例并参考附图来描述。现具体详细地参考附图，强调所显示的细节为通过实例进行并且出于对本发明实施方案的说明性讨论的目的。在这一点上，结合附图的描述使得本领域技术人员清楚可如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1呈现使用亲电文库筛选和完整蛋白质谱(MS)标记(200 μM化合物在4℃下24小时)确定与Pin1共价结合的示例性化合物。
图2呈现显示Pin1筛选命中分析的饼图：993个片段中有48个命中标记为Pin1 (>75%)，并且这48个最高命中中有9个(18.75%)为共享环砜骨架作为共同基序的氯乙酰胺类(右侧)。
图3描绘来自亲电文库筛选的48个最高命中中9种共享相似结构基序(含有环丁砜或环丁烯砜部分)的化合物的结构。
图4呈现如通过对接模拟确定的与Pin1结合的示例性化合物的预测结合模式：A)PCM-0102755 (紫色)和PCM-0102760 (青色)的苯基和环己基分别突出到由Met130、Gln131和Phe134构成的疏水腔中；和B) PCM-0102832 (橙色)的环丙基覆盖由Ser115、Leu122和Met130形成的浅疏水补丁，而PCM-0102105 (棕色)的乙基和PCM-0102313 (浅棕色)的环戊基部分分别突出到溶剂中。
图5描绘基于初步结果设计的一组示例性测试化合物的结构(“第二代”)。
图6描绘来自图5所示的示例性组的前10种Pin1结合剂的结构，以及非反应性(无氯)对照化合物(Pin1-3-AcA)和胡桃醌(已知的Pin1抑制剂)的结构。
图7描绘在2 μM下1小时没有Pin1标记的化合物(上排)和具有另外亚甲基(在酰胺和亲脂基团之间)的在相同条件下表现出27-65%的Pin1标记的类似化合物(下排)。
图8描绘基于先前结果设计的一组示例性测试化合物的结构(“第三代”)。
图9呈现显示来自一组示例性测试化合物(“第二代”)的前10个命中的Pin1标记百分比作为反应性的函数(量化为(log(k))，并且在标记百分比和反应性之间缺乏相关性(R2= 0.0029)的图表。
图10呈现显示使用DTNB (二硫代硝基苯甲酸)测定对来自一组示例性测试化合物(“第二代”)的前10个命中的硫醇的反应性的柱状图。
图11呈现显示使用DTNB (二硫代硝基苯甲酸)测定对来自一组示例性测试化合物(“第三代”)的前10个命中的硫醇的反应性的柱状图。
图12呈现显示Pin1的催化活性(%)作为示例性化合物(Pin1-3)或为阳性对照的胡桃醌的浓度函数的图表。
图13呈现显示如通过N-末端荧光素标记的肽(Bth-D-phosThr-Pip-Nal)的荧光偏振测定的示例性化合物与Pin1的结合作为在室温下温育14小时后化合物浓度的函数(胡桃醌用作阳性对照和非反应性Pin1-3-AcA用作阴性对照)的图表。
图14A和14B呈现显示结合Pin1-3的百分比作为时间的函数的图表(图14A)和速率作为Pin1-3浓度的函数用于确定Kinact和Ki的曲线图(图14B)。
图15呈现显示来自一组示例性测试化合物(“第二代”)的前10个命中的Pin1标记百分比作为反应性的函数(量化为(log(k))的图表；PIN1-3、PIN1-3-13和细胞毒性片段(Tox)的反应性通过虚线描绘。
图16呈现显示来自一组示例性测试化合物(“第三代”)的前10个命中的Pin1标记百分比作为反应性的函数(量化为(log(k))的图表。
图17呈现显示Cys113和Pin1-3之间的连续电子密度的X射线晶体结构。
图18呈现与Pin1-3复合的Pin1的X射线晶体结构(1.4 Å分辨率)；氢键描绘为虚线。
图19呈现图18所示的X射线晶体结构(Pin1为白色，Pin1-3为鲑肉色)和与三氧化二砷(紫色)复合的Pin1 (青色)的X射线晶体结构(pdb代码：6DUN；1.6 Å分辨率)的叠加；Pin1-3的环丁砜部分和三氧化二砷占据由M130、Q131、F134、Thr152和H157形成的疏水性Pro结合口袋，和Pin1-3的磺酰基氧(红色)和三氧化二砷类似地介导与Q131的骨架酰胺和H157的咪唑NH的氢键。
图20呈现示例性脱硫生物素探针Pin1-3-DTB的结构。
图21呈现显示荧光偏振(表示为归一化的mP值)作为Pin1-3、Pin1-3-DTB和Pin1-3-AcA浓度的函数的图表。
图22呈现显示在PAT8988T细胞裂解物中温育1小时后 0.1、0.25、0.5或1 μMPin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹。
图23呈现显示在使PATU-8988T细胞暴露于1 μM Pin1-3 0、0.5、1、2或4小时后1 μM Pin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹；Pin1-3以时间依赖性方式与探针Pin1-3-DTB竞争Pin1结合(细胞与Pin1-3一起温育指定时间，然后裂解并与 Pin1-3-DTB一起温育)。
图24呈现显示在使PATU-8988T细胞暴露于0.25、0.5或1 μM Pin1-3或1 μM Pin1-3-AcA后1 μM Pin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹；Pin1-3与探针Pin1-3-DTB以剂量依赖性方式在细胞中竞争Pin1结合，在1 µM下完全接合Pin1，而非反应性类似物Pin1-3-AcA则没有(细胞在指定浓度下与测试化合物一起温育5小时，然后裂解并与Pin1-3-DTB一起温育1小时)。
图25呈现显示在使PATU-8988T细胞暴露于1 μM Pin1-3 24、48或72小时后1 μMPin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹；72小时之后仍观察到Pin1-3对Pin1的显著接合(>50%) (细胞在有或没有Pin1-3的情况下温育指定时间，然后裂解并与Pin1-3-DTB一起温育)。
图26呈现显示在使IMR32细胞暴露于0.25、0.5或1μM Pin1-3或1 μM Pin1-3-AcA后Pin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹；Pin1-3以剂量依赖性方式与探针Pin1-3-DTB在细胞中竞争Pin1结合，在1 µM下完全接合Pin1，而非反应性类似物Pin1-3-AcA则没有。
图27呈现显示在给予或不给予小鼠10或20 mg/kg Pin1-3的情况下1 μM Pin1-3-DTB与Pin1的结合的Western印迹；在每个Pin1-3剂量下，对至少一些样品观察到Pin1-3对Pin1的显著接合(小鼠用指定量的Pin1通过口服管饲法治疗，每天一次持续3天，并然后裂解脾脏并与Pin1-3-DTB一起温育)。
图28呈现示例性CITe-Id实验的示意图，该实验用于在用Pin1-3进行剂量反应处理后在整个蛋白质组中鉴定竞争性标记的半胱氨酸。
图29呈现显示示例性CITe-Id实验(如图28所示进行)的结果的图表；在162个所鉴定的标记半胱氨酸残基中，只有Pin1中的C113 (由箭头指示)以剂量依赖性方式被标记。
图30呈现显示如通过示例性CITe-Id实验(如图28所示进行)确定的，由Pin1-3进行Pin1 C113标记的剂量依赖性的柱状图。
图31呈现用于评价Pin1-3蛋白质组学选择性的示例性rdTOP-ABPP实验的示意图。
图32呈现显示在rdTOP-ABPP实验(如图31所示)中鉴定的前25种肽的竞争比率的图表。
图33呈现显示野生型8988T胰腺癌细胞在与1 μM Pin1-3或媒介物(DMSO)一起温育后作为时间的函数的归一化细胞生长的图表(*** p < 0.001, **** p < 0.0001)。
图34呈现显示Pin1-敲除8988T胰腺癌细胞在与1 μM Pin1-3或媒介物(DMSO)一起温育后作为时间的函数的归一化细胞生长的图表。
图35呈现显示野生型(813)和Pin1-敲除(826) 8988T胰腺癌细胞中的Pin1表达(微管蛋白表达用作上样对照)的Western印迹图像。
图36呈现显示PC3癌细胞在与1或2.5 μM Pin1-3或者2.5 μM Pin1-3-AcA或媒介物(DMSO)一起温育后作为时间的函数的归一化细胞生长的图表。
图37呈现显示Kuramochi癌细胞在与1或2.5 μM Pin1-3或者2.5 μM Pin1-3-AcA或媒介物(DMSO)一起温育后作为时间的函数的归一化细胞生长的图表(**** p <0.0001)。
图38呈现显示MDA-MB-468癌细胞在与1或2.5 μM Pin1-3或者2.5 μM Pin1-3-AcA或媒介物(DMSO)一起温育后作为时间的函数的归一化细胞生长的图表(**** p < 0.01)。
图39呈现显示在用1 μM Pin1-3或Pin1-3-AcA或媒介物(DMSO)处理后野生型(WT)和Pin1-敲除(KO) 8988T胰腺癌细胞中的类器官生长(如通过发光测量确定的)的柱状图(**** p < 0.0001)。
图40呈现用1 μM Pin1-3或DMSO处理的Mino B细胞中RNA水平变化的比较(6小时，一式三份)，其中每个点代表作为转录物的Log2倍数变化的函数的该变化显著性的p值(Student t检验)；206个基因以显著方式下调(p = 0.05，由虚线表示)。
图41呈现显示使用针对ENCODE TF ChIP-seq集的Enrichr进行基因集富集分析的结果的柱状图；两个最富集的集合为来自不同细胞系的Myc靶基因。
图42呈现Tg(dβh: EGFP)和Tg(dβh: MYCN; dβh: EGFP)转基因斑马鱼(上两幅图像)和在用50或100 µM Pin1-3进行4天处理(从3到7 dpf)后的Tg(dβh:MYCN; dβh:EGFP)转基因斑马鱼(下两幅图像)的胚胎(7 dpf)的代表性图像，其中原始颈上神经节(SCG)和肾内腺(IRG) (经EGFP荧光观察)以虚线圆圈突出显示。
图43呈现在用0、25、50或100 µM Pin1-3MYCN对神经母细胞的过度增殖作用进行4天处理(从3到7dpf)后，原始颈上神经节(SCG)和肾内腺(IRG)斑马鱼胚胎(7dpf)中归一化神经母细胞瘤肿瘤面积的分布，其通过与dβh:EGFP对照报告基因系的EGFP荧光的比较显示，其中在未经处理的(0 µM) MYCN转基因系(dβh:MYCN/EGFP)中具有~10倍的横截面积(p值由用于确定显著性的置信区间为95%的Mann-Whitney检验确定；量化数据显示为中位数)。
图44呈现移植有从4个月大的Tg(dβh:MYCN; dβh:EGFP)供体斑马鱼分离的神经母细胞瘤细胞并用添加到养鱼用水中的DMSO对照(CTR)或100 μM Pin1-3处理的斑马鱼胚胎的代表性图像。
图45呈现用添加到养鱼用水中的DMSO或100 μM Pin1-3处理的斑马鱼胚胎中的归一化EGFP阳性肿瘤面积的分布(p值由用于确定显著性的置信区间为95%的Mann-Whitney检验确定；量化数据显示为中位数)。
图46A和46B呈现显示在用NP-OVA免疫之后11天在用媒介物或Pin1-3治疗的WT小鼠中FASHi CD38-生发中心(GC)细胞的量化的代表性流式细胞术图(图46A)和图表(图46B)(**表示在双尾Student t检验中p < 0.01)。
图47呈现用Pin1-3处理3天后PDAC细胞的代表性图像(比例尺= 100 µm)。
图48呈现显示在用Pin1-3处理3天后PDAC细胞生长作为Pin1-3浓度的函数的图表。
图49呈现显示用Pin1-3处理3天的PDAC细胞中的Pin1水平的Western印迹图像。
图50呈现PDAC类器官在用Pin1-3处理7天后的代表性图像(比例尺= 100 µm)。
图51呈现显示在用Pin1-3处理7天后PDAC类器官面积作为Pin1-3浓度的函数的图表。
图52呈现在给予或不给予2或4 mg/kg Pin1-3的情况下原位异种移植小鼠模型中PDX肿瘤的代表性图像。
图53呈现显示在给予或不给予2或4 mg/kg Pin1-3的情况下原位异种移植小鼠模型中PDX肿瘤体积的图表。
图54呈现显示在给予或不给予2或4 mg/kg Pin1-3的情况下原位异种移植小鼠模型中PDX肿瘤体积作为时间的函数的图表。
图55呈现在给予或不给予40 mg/kg Pin1-3的情况下原位异种移植小鼠模型中KPC小鼠来源肿瘤的代表性图像。
图56呈现显示在给予或不给予40 mg/kg Pin1-3的情况下原位异种移植小鼠模型中的KPC肿瘤体积的图表。
图57呈现显示在给予或不给予20或40 mg/kg Pin1-3的情况下KPC原位异种移植小鼠模型中的存活率的图表。
本发明具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及药理学，并且更具体地讲(但不排他地)涉及与Pin1共价结合和/或调节Pin1的活性的新设计的化合物及其例如在治疗与Pin1活性相关的疾病方面的用途。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的应用不一定限于以下描述中阐述的或由实施例举例说明的细节。本发明能够有其他实施方案或以各种方式实践或实施。
本发明人已经通过费力地筛选能够与蛋白共价反应的化合物并研究结构与活性和脱靶毒性之间的关系，发现了用于有效且选择性地调节Pin1活性的新化合物。在将本发明付诸实践的同时，本发明人发现了与Pin1的活性位点(催化结构域)选择性和共价反应的示例性化合物以及在各种生理模型中选择性调节Pin1活性的效果。
如本文使用的短语“催化结构域”描述其中发生催化反应的酶Pin1的区域。因此，该短语描述其中底物和/或参与催化反应的其他成分与酶相互作用的酶的这一部分。在本实施方案的上下文中，该短语特别地用于描述在催化活性(例如磷酸化)期间底物结合的酶(Pin1)的这一部分。因此，该短语在本文和本领域中也可互换地称为“底物结合口袋”、“催化位点”、“活性位点”等。
如本文使用的在本文中可互换地使用的短语“结合位点”、“催化结合位点”或“结合亚位点”描述包括一个或多个可经由其实现酶与底物和/或抑制剂的相互作用的反应基团的催化结构域中的特定位点。一般地，结合位点由一个或两个氨基酸残基组成，藉此相互作用一般地涉及这些氨基酸侧链处的反应基团。
如本领域众所周知的，当酶与底物或抑制剂相互作用时，初始相互作用快速引起酶和/或底物和/或抑制剂的构象变化，这增强结合并使酶的结合位点靠近底物或抑制剂中的官能团。酶-底物/抑制剂相互作用使酶和底物/抑制剂两者中存在的反应基团定向并使其彼此接近。底物/抑制剂与酶的结合使反应基团对齐，从而使得相关的分子轨道重叠。
因此，酶的抑制剂一般地与酶的催化结构域缔合，使得抑制剂的反应基团与酶催化结合位点中的相应反应基团(一般地为氨基酸残基的侧链)足够接近地定位，以允许在催化结合位点中存在有效浓度的抑制剂，并且另外，抑制剂的反应基团以适当的定向定位，以允许重叠，从而允许强的化学相互作用和低的解离。因此，抑制剂一般地包括已知参与相互作用的结构元件，并且还可限制其构象柔性，以避免会影响或削弱其与催化结合位点缔合的构象变化。
本发明人已经发现一系列结构相似的小分子有效地与Pin1的Cys113残基共价结合，并基于这些发现，设计和成功实践了能够与Pin1相互作用的新型小分子。本发明人已经鉴定允许在Pin1的催化结构域内有效相互作用，例如使得与Cys113的反应性远高于与其他硫醇基团的反应性的新设计的化合物的结构特征。
现参考附图，图1说明使用完整蛋白质谱标记来筛选亲电文库中与Pin1共价结合的化合物。图2简要概述亲电文库筛选的结果，显示活性与包含环砜部分的结构之间的相关性。图3呈现包含环砜部分的所有最高命中。
图4显示具有环砜部分的化合物的预测结合模式。
图5-6显示用于评价N-(环丁砜-3-基)-2-氯乙酰胺类的酰胺取代基对Pin1标记活性的影响的第二代化合物。类似地，图8显示用于评价N-(环丁砜-3-基)-2-氯乙酰胺类的酰胺取代基对Pin1标记活性的影响的通过点击化学产生的另外的(第三代)化合物。图12-14B显示通过示例性化合物进行的Pin1标记与酶活性的抑制相关。图7显示邻近酰胺氮原子的亚甲基接头与增强的活性相关。
图9-11和15-16显示，对于给定程度的Pin1标记，一些化合物(比如Pin1-3和P1-01-B11)对硫醇和细胞毒性表现出特别低量的非特异性反应性。
图18和19显示如通过X射线晶体学确定的与Pin1的Cys113共价结合并进一步通过砜氧与Gln131和His157之间的氢键结合的示例性化合物的结构。
图21-27显示示例性化合物在体外和体内以时间依赖性和剂量依赖性方式接合Pin1，并且共价反应性氯乙酰胺基团对于Pin1标记是重要的，因为相应的乙酰胺不能有效地与Pin1结合。图28-32显示与其他肽相比较对Pin1的选择性。
图33-39显示示例性Pin1调节化合物以依赖于Pin1的方式抑制多种癌细胞的生长。图47-47显示示例性Pin1调节化合物在多种体内模型中抑制肿瘤生长。
图42-45显示示例性Pin1调节化合物抑制神经母细胞瘤肿瘤的发生和移植的神经母细胞瘤肿瘤的生长。
图46A和46B显示Pin1抑制导致与Pin1敲除相似的表型。
图40-41显示示例性Pin1调节化合物抑制Myc转录。
因此，本发明的实施方案通常涉及新设计的小分子及其用途，例如在调节Pin1的活性方面的用途。
化合物：
根据本发明的一些实施方案，如本文所述的化合物为这样的化合物，其特征为与Pin1的催化结合位点强烈缔合。
在一些实施方案中，化合物为这样的化合物，其在接触Pin1催化结合位点时，其官能团之一共价结合Pin1的Cys113残基，并且一个或多个其他官能团相对于Pin1的催化结合位点内的至少一个另一个氨基酸残基处于如上文定义的接近和定向。
“接近和定向”意指如上文讨论的，一个或多个官能团足够靠近并且适当地定向以与酶的催化结构域内的一个或多个氨基酸残基(例如除Cys113以外的)强烈相互作用。
在化合物的官能团和催化结构域中的氨基酸残基的上下文中，“相互作用的”或“相互作用”意指由于例如非共价相互作用(比如(但不限于)疏水相互作用包括芳香相互作用、静电相互作用、范德华相互作用和氢键键合)所致的化学相互作用。相互作用为这样的相互作用，其导致如本文公开的化合物-酶复合物的解离常数低。
在本实施方案的任何方面的一些实施方案中描述的化合物及其任何组合的特征为亲电部分和刚性部分，刚性部分包含至少一个能够与Pin1的催化结构域中的一个或多个氨基酸残基相互作用的官能团。
在一些实施方案中，刚性部分的一个或多个官能团能够与Pin1的催化结构域中的一个或多个氨基酸残基的氢原子形成氢键。
在一些实施方案中，亲电部分和刚性部分经排列使得亲电部分能够与Pin1 (SEQID NO: 1)的Cys113残基共价结合，和刚性部分能够与Pin1 (SEQ ID NO: 1)的Gln131和His 157残基形成氢键。
在一些实施方案中，化合物为这样的化合物：当其接触Pin1时，刚性部分的官能团相对于亲电基团(在其与Cys113共价结合之前)和Pin1的催化结构域中的氨基酸残基(例如Pin1的Gln131和His 157残基)呈接近和定向，例如经氢键键合，使得亲电基团相对于Cys113呈接近和定向，从而促进Cys113与亲电基团的共价键合。
在一些实施方案中，化合物为这样的化合物：当其接触Pin1时，刚性部分的官能团在其与Cys113共价结合之后相对于亲电基团呈接近和定向，这允许与Pin1的催化结构域中的其他氨基酸残基(例如与Pin1的Gln131和His 157残基)相互作用，例如经氢键键合。
在一些实施方案中，官能团(包含在刚性部分中)能够与Gln131的骨架酰胺氢和/或与His157的咪唑NH形成氢键。在一些实施方案中，刚性部分包含能够与Gln131的骨架酰胺氢形成氢键的官能团，以及能够与His157的咪唑NH形成氢键的另一官能团。在一些实施方案中，官能团的原子(例如O、S或N)与经氢键连接于官能团的Gln131或His157的氮原子之间的距离在2.5-3.5Å的范围内，任选地在2.7-3.3 Å的范围内。
在本文通篇中，Pin1的氨基酸残基编号根据SEQ ID NO: 1进行编号。
如本文使用和本领域已知的，“氢键”为形成一种偶极-偶极吸引力的相对较弱的键，其当键合于强负电原子的氢原子存在于另一个具有孤对电子的负电原子附近时发生。
氢键中的氢原子部分地在两个相对负电原子之间共享。
氢键的能量一般地为1-3 kcal mol-1 (4-13 kJ mol-1)，并且其键距(从氢原子测量)一般地在1.5-2.6 Å的范围内。
氢键供体为包括氢更紧密地连接的原子和氢原子本身两者的基团，而氢键受体为较不紧密地连接于氢原子的原子。氢原子共价键合的相对负电原子将电子密度从氢原子拉开，使得其产生部分正电荷(δ+)。因此，其可通过静电相互作用与具有部分负电荷(δ-)的原子相互作用。
一般地作为供体和受体两者参与氢键相互作用的原子包括氧、氮和氟。这些原子一般地形成化学基团或部分的一部分，比如羰基、羧酸酯、酰胺、羟基、胺、亚胺、烷基氟化物、F2等。然而，其他负电原子和含有它们的化学基团或部分可参与氢键键合。
在本文所述的任何实施方案中的一些中，化合物进一步包含例如连接于亲电部分和/或刚性部分的疏水部分。在一些实施方案中，疏水部分与Pin1的Ser115、Leu122和/或Met130形成疏水相互作用。
在本文中，术语“疏水部分”是指相应的化合物(即由该部分和与之连接的一个或多个氢原子组成的化合物)不溶于水的部分，即这种化合物的水中溶解度例如在室温下小于1重量% (在约7的pH下)。
在本文所述任何实施方案中的一些中，形成氢键的官能部分为氧原子(O)、硫原子(S)和/或NH。
多个功能部分可任选地相同或不同，并且可任选地连接于刚性部分(例如环状部分)中的相同位置和/或不同位置。
在本文所述任何实施方案中的一些中，形成氢键的两个或更多个官能部分连接于刚性部分中的相同原子，例如硫原子。在一些实施方案中，官能部分为氧原子，并且连接于硫原子的两个氧原子形成砜(-S(=O)2-)基团。在一些实施方案中，砜的硫原子为环即环砜(例如环丁砜或环丁烯砜)的成员。
在本文所述的任何实施方案中的一些中，化合物具有小于1000 Da的分子量。在一些实施方案中，分子量小于900 Da。在一些实施方案中，分子量小于800 Da。在一些实施方案中，分子量小于700 Da。在一些实施方案中，分子量小于600 Da。在一些实施方案中，分子量小于500 Da。在一些实施方案中，分子量小于400 Da。
不受任何特定理论的束缚，据信小分子往往比较大分子更有希望用于治疗用途。
根据任何本发明实施方案中的一些，化合物由以下式I表示：
E-L1-G(F)m
式I
其中：
E为亲电部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；
L1为键或连接部分；
G为刚性部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；
F为形成氢键的官能部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)；和
m为2、3或4。
在本文所述任何实施方案中的一些中，刚性部分为环状部分，具有与之连接的由变量F表示的2、3或4个官能部分。在一些这种实施方案中，环状部分包含4-、5-、6-或7-元环。
由L1表示的连接部分可任选地为本文所述的任何连接基团，任选地为烃(如本文定义)。
在一些示例性的实施方案中，L1为亚甲基。在一些示例性的实施方案中，L1为键。
在本文中，短语“连接基团”描述连接于化合物中的两个或更多个部分的基团(例如取代基)；而短语“端基”描述经其一个原子连接于化合物中的单个部分的基团(例如取代基)。
在本文所述任何实施方案中的一些中，m为2，并且形成氢键的两个官能部分连接于刚性部分中的相同原子，例如硫原子(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)，例如其中刚性部分包含砜(例如环丁砜或环丁烯砜)。
在本文所述任何实施方案中的一些中，刚性部分为包含硫原子的环状部分，并且化合物由以下式Ia表示：
Figure 912257DEST_PATH_IMAGE003
式Ia
其中：
E和L1如本文对式I所定义；
虚线代表饱和或非饱和键；
Y和Z各自独立地为O、S和/或NH (根据本文关于式I中的变量F所述的相应实施方案中的任何一个)；
R2和Ra-Rc各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和/或氨基，或者当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
n为1、2、3或4，使得存在1、2、3或4个CRbRc单元(分别形成4-、5-、6-或7-元环)，和当n为2或更多时，2个或更多个单元可以相同或不同。
在示例性的实施方案中，n为2。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，Y和Z各自为氧，因此形成环砜。在一些这种实施方案中，n为2，使得环砜为环丁砜或环丁烯砜。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，Ra为氢。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，Rb为氢。在一些实施方案中，Rb和Rc各自为氢。在一些实施方案中，Ra、Rb和Rc各自为氢。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，虚线代表饱和键。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，R2为氢或烷基。在一些实施方案中，R2为氢或C1-4-烷基。在一些实施方案中，R2为氢或甲基。在一些实施方案中，R2为氢。
在本文中，术语“亲电体”和“亲电部分”是指能够与亲核体(例如具有孤电子对、负电荷、部分负电荷和/或过量电子的部分，例如硫醇基团)反应的任何部分。亲电部分一般地为缺电子的或包含缺电子的原子。
在任何相应某些实施方案中的一些中，亲电部分含有正电荷或部分正电荷，具有含有正电荷或部分正电荷的共振结构，或者为其中电子的离域或极化导致一个或多个含有正电荷或部分正电荷的原子的部分。在一些实施方案中，亲电部分包含共轭双键，例如α,β-不饱和羰基。
亲电部分可任选地能够与Cys113的硫原子结合，例如通过亲核取代(例如亲核离去基团的)和/或通过迈克尔加成，例如与碳-碳不饱和键结合，任选地由邻近的C=O (例如羰基、C-羧基或C-酰氨基的)或硝基活化。
如本文和本领域中使用的“离去基团”描述在化学反应期间易于经受从有机分子脱离的不稳定原子、基团或化学部分，而脱离一般地通过其上的离去原子、基团或部分的相对稳定性来促进。
一般地，作为强酸的共轭碱的任何基团均可作为离去基团。例如，合适的亲核离去基团可任选地为当连接于氢原子时形成pKa小于7的酸的任何基团。合适的离去基团的实例非限制性地包括卤化物(卤代，优选地为氯代、溴代或碘代)、硫酸酯、磺酸酯(例如甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯)、三氯乙酰亚氨酸酯、叠氮化物、氰酸酯、硫氰酸酯、硝酸酯和O-羧基(例如乙酸酯)。
在任何相应实施方案中的一些中，亲核离去基团当连接于氢原子时形成pKa小于0的酸，例如碘代、溴代、氯代、硫酸酯或磺酸酯。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分包含卤代，任选地为溴代、氯代或氟代。在一些实施方案中，亲电部分包含卤烷基(即用卤代取代的如本文定义的烷基)。在一些实施方案中，卤烷基在其末端位置(即伯碳)处被卤代(例如氯代或氟代)取代，例如其中卤烷基为卤甲基(例如氯甲基或氟甲基)。氯甲基为示例性的卤烷基。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分具有式-NR1-C(=W)-L2-X，其中W为O、S和/或NR3；X为卤代；L2为亚烷基；和R1和R3各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和/或杂芳基。在一些实施方案中，R1为本文所述相应实施方案中任何一个的疏水部分。在一些实施方案中，W为O。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分包含卤乙酰胺，即被卤代，并且任选地被本文定义的任何其他合适的取代基(CH3基团上的烷基取代基和/或酰胺氮原子上的酰胺取代基)取代的乙酰胺(-NH-C(=O)-CH3)的衍生物，例如其中L2 (如本文定义)为取代或未取代的亚甲基。在示例性的实施方案中，卤乙酰胺在CH3基团处包含单个卤代且没有另外的取代基，从而具有式-NR1-C(=O)-CH2X，其中X为卤代(例如氯代)，和R1如本文定义。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分包含取代或未取代的丙烯酰基，即丙烯酰基(-CH=CH-C(=O)-)或其取代的衍生物，其可任选地呈酯(例如具有式-O-C(=O)-CH=CH2的亲电部分)或酰胺(例如具有式-NR-C(=O)-CH=CH2，其中R为如本文定义的酰胺基团的合适取代基)的形式。取代的丙烯酰基任选地为氰基丙烯酰基(在接近C=O的位置，即α位被氰基取代)。或者或另外，丙烯酰基在α或β位被烷基(例如C1-4-烷基)取代。
在与包含丙烯酰基的亲电部分相关的任何实施方案中的一些中，基团为未取代的(甲基)丙烯酰基，即丙烯酰基(-CH=CH-C(=O)-)或甲基丙烯酰基(-CH=C(CH3)-C(=O)-)基团，其可任选地呈(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯酰胺的形式。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分包含取代或未取代的乙烯基磺酰基，即-S(=O)2-CH=CH2或其取代的衍生物，其可任选地呈磺酸酯(例如具有式-O-S(=O)2)-CH=CH2的亲电部分)或磺酰胺(例如具有式-NR-S(=O)2-CH=CH2，其中R为如本文定义的磺酰胺基团的合适取代基)的形式。
在任何相应实施方案中的一些中，亲电部分包含α-酮酰胺，即包括-NR-C(=O)-C(=O)-连接基团(其中R为如本文定义的酰胺基团的合适取代基)。
可结合到本文所述化合物中的合适的亲电部分的另外实例描述于美国专利号9,227,978和美国专利号7,514,444中，其各自的内容通过参考结合至本文中，特别是描述亲电部分的内容。
应当意识到，酰胺连接基团(如本文定义的)可在根据本文所述相应实施方案中的任何一个的亲电部分和刚性部分之间提供强烈(和易于形成)的共价键，并且可任选地向可进一步增强对Pin1的亲和力的合适部分(例如疏水部分，根据本文所述相应实施方案中的任何一个)，例如本文中由变量R1表示的部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)，提供另外共价键。
在其中亲电部分具有式-NR1-C(=W)-L2-X的本文所述任何实施方案中的一些中，化合物由式Ia表示，使得化合物由式Ib表示：
Figure 111157DEST_PATH_IMAGE001
式Ib
其中W为O、S和/或NR3；X为卤代；Ra-Rc任选地各自为氢；L1为键或亚烷基；L2为亚烷基；和R1和R3各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和/或杂芳基。
在本文所述任何实施方案中的一些中，刚性部分为环丁砜或环丁烯砜部分(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)，其包含两个氧原子作为能够形成氢键的官能团，并且亲电部分为卤乙酰胺(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。在一些这种实施方案中，化合物由以下式Ic表示：
Figure 780036DEST_PATH_IMAGE002
式Ic
其中虚线代表饱和或非饱和键；X为卤代；和R1和R2如本文中根据相应实施方案中的任何一个定义。在示例性的实施方案中，X为氯代。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，R1为具有式II的烷基、烯基或炔基：
-CH2-R’1
式II
其中R’1为烯基(使得R1总体上为烯基)、炔基(使得R1总体上为炔基)、烷基(使得R1总体上为取代或未取代的烷基)或环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼或氨基(使得R1总体上为取代的烷基)。
不受任何特定理论的束缚，据信邻近于(R1所连接的)氮原子的未取代的亚甲基(CH2)增强化合物与Pin1的结合。
在任何相应实施方案中的一些中，R’1为分支烷基、分支烯基、分支炔基、环烷基或杂脂环基。在一些实施方案中，R’1为仲烷基、烯基、炔基、环烷基或杂脂环基，即接近CH2的R’1的碳原子(如式II所示)连接于R’1中的两个其他碳原子。在一些实施方案中，R’1为叔烷基、烯基、炔基、环烷基或杂脂环基，即接近CH2的R’1的碳原子(如式II所示)连接于R’1中的三个其他碳原子。示例性的叔R’1基团包括(取代或未取代的)叔丁基(例如如在示例性化合物Pin1-3和Pin1-3-DTB中)；和 1-三氟甲基环丙基(例如如在示例性化合物Pin1-3-9中)、叔环烷基。
在任何相应实施方案中的一些中，R1或R’1为芳基，例如其中R’1为芳基(和R1为-CH2-芳基)。在一些实施方案中，芳基为苯基，其可为未取代的或者例如被烷基(例如甲基)、卤代(例如氟代或氯代)、芳基(例如苯基或3-三氟甲基苯基)和/或烷氧基(例如苄氧基)取代。示例性的苯基包括未取代的苯基(例如如在示例性化合物Pin1-437和Pin1-2-9中)、间-甲基苯基(例如如在示例性化合物Pin1-2-6中)和邻-苄氧基苯基(例如如在示例性化合物Pin1-2-7中)。
在任何相应实施方案中的一些中，R1或R’1为杂芳基，例如其中R’1为杂芳基(何R1为-CH2-杂芳基)。
在一些实施方案中，杂芳基为三唑、噻吩(例如噻吩-2-基)或呋喃(例如呋喃-2-基)，其各自可为取代或未取代的。
在一些实施方案中，杂芳基为噻吩(例如噻吩-2-基或3-甲基-噻吩-2-基，分别如在示例性化合物Pin1-433和Pin1-2-8中)。
在一些实施方案中，杂芳基为(取代或未取代的)三唑，其可任选地具有以下式III：
Figure 570137DEST_PATH_IMAGE005
式III
其中R4为烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基或杂芳基。
在任何相应实施方案中的一些中，杂芳基被一个或多个(取代或未取代的)苯基取代，例如其中式III中的R4为苯基。苯基取代基可任选地例如被一个或多个羟基、羟基烷基(例如羟甲基或羟乙基)、卤代(例如氟代、氯代或溴代)、烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)、羰基(例如甲酰基或乙酰基)、羧基(例如C-羧基酯基团，比如甲氧基羰基或乙氧基羰基)和/或磺酰氨基(例如-S(=O)2NH2)取代。
苯基取代基(根据相应实施方案中的任何一个)可任选地在其邻位(例如被羟基)、在其间位(例如被卤代或羰基)和/或在其对位(例如被羟基、羟基烷基(例如羟甲基)、烷氧基(例如甲氧基)、羰基(例如乙酰基)、羧基(例如甲氧基羰基)或磺酰氨基(例如-S(=O)2NH2))取代。在一些示例性的实施方案中(例如在示例性化合物P1-01-B11中)，苯基为对-甲氧基羰基苯基。
在一些实施方案中，提供一种由式Ib表示的化合物，其中W、X、Y、Z、Ra-Rc、L1、L2、n、R2和R3如本文所述相应实施方案中的任何一个所述，并且 R1为异丁基(例如-CH2-CH(CH3)2)、新戊基(例如-CH2-C(CH3)3)、被5-或6-元环烷基取代的烷基(例如甲基)、被三唑取代的烷基(例如甲基)或三唑(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。其中R1基团以这种方式定义的这种结构在本文中也称为式Id。
式Id的示例性环烷基包括未取代的环戊基和未取代的环烷基。
在与式Id相关的任何相应实施方案中的一些中，R1为新戊基(例如-CH2-C(CH3)3)、被三唑取代的烷基(例如甲基)或三唑(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。在示例性的实施方案中，R1为新戊基(例如-CH2-C(CH3)3)或被三唑取代的烷基(例如甲基) (根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。
如本文实施例部分中举例说明的，使用点击化学形成三唑(从炔基前体，其可市售获得)或在还原条件下使用醛形成(任选取代的)烷基可(例如从通常可获得的前体)易于制备式Id化合物。
文库：
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种筛选文库，其包含多种本文所述实施方案中任何一个的化合物，例如多种式I化合物、多种式Ia化合物、多种式Ib化合物、多种式Ic化合物和/或多种式Id化合物。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。方法包括筛选多种由式IV表示的化合物：
E’-L’1-V
式IV
其中E’为根据本文所述相应实施方案中的任何一个的当与硫醇反应时能够形成共价键的亲电部分；L’1为本文(例如关于L1)所述相应实施方案中任何一个的连接部分；和V为特征为至少两个能够形成氢键的官能团的部分，并且任选地进一步特征为至少一个亲脂基团(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。
在一些实施方案中，筛选用于能够经亲电部分与Pin1的Cys113残基相互作用，经官能团至少与Pin1的 Gln131和His 157残基相互作用以及任选地经至少一个亲脂基团与Pin1的疏水补丁中的至少一个氨基酸残基相互作用的化合物。鉴定为能够至少与Pin1的Cys113残基和Gln131和His 157残基相互作用的化合物被鉴定为能够改变Pin1的活性。
筛选可任选地通过计算对接(例如如本文中举例说明)来实现。
或者或另外，筛选可任选地通过使鉴定的化合物与Pin1接触，从而确定化合物是否与Pin1结合(例如共价地)于和/或调节Pin1的活性来进行。可通过直接确定这种调节的能力和/或较不直接地(其中确定为能够与Pin1结合(例如共价地)的化合物被鉴定为能够调节Pin1的活性)，将化合物鉴定为能够改变Pin1的活性。
在一些实施方案中，所述方法包括在允许Pin1的Cys113残基与本文所述的亲电部分共价结合的条件下，任选地通过使亲电部分中的卤原子被Cys113亲核取代，用Pin1筛选多种式I化合物、多种式Ia化合物、多种式Ib化合物、多种式Ic化合物和/或多种式Id化合物。
用于Cys113残基与亲电部分共价结合的合适条件可如本文中举例说明，例如在室温或冷藏(例如4℃)下的水溶液中(例如在pH 7.4下缓冲)。
在与鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法相关的任何实施方案中的一些中，所述方法进一步包括针对与除Pin1的Cys113以外的硫醇的低反应性，筛选文库。
在示例性的实施方案中，与硫醇的反应性通过将化合物(例如以200 μM的浓度)添加至硫代硝基苯甲酸根(TNB2-)的水溶液(例如在pH 7.4下缓冲)(任选地浓度为100 µMTNB2-)中(例如在37℃下)；测定TNB2-随着时间推移的吸光度(例如在约412 nm 处)；并将光谱数据拟合成二级反应方程，使得速率常数k为ln([A][B0]/[B][A0])的斜率来确定，其中[A0]和[B0]分别为化合物(例如200 µM)和TNB2- (例如100 µM)的初始浓度，和[A]和[B]为作为时间的函数的化合物的剩余浓度。
在一些实施方案中，与硫醇表现出低反应性的化合物为速率常数k不多于3x10-7M-1*秒-1的化合物。在一些实施方案中，速率常数k不多于2x10-7M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于10-7M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于5x10-8M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于3x10-8M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于2x10- 8M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于10-8M-1*秒-1。在一些实施方案中，速率常数k不多于5x10-9M-1*秒-1。
在任何相应实施方案中的一些中，根据本文所述方面中的任何一个，多种化合物包含至少30种不同的化合物。在一些实施方案中，文库包含至少50种化合物。在一些实施方案中，文库包含至少100种化合物。在一些实施方案中，文库包含至少200种化合物。在一些实施方案中，文库包含至少300种化合物。在一些实施方案中，文库包含至少500种化合物。
技术人员将能够根据文库总体上期望的特性来选择合适的文库。例如，由相对窄的化学式(例如式Ib、式Ic和/或式Id)涵盖的文库化合物可提供相对高比例的命中(因为所述式是为此目的而设计的)，但可能遭受相对低的内部多样性；而仅由相对宽泛的化学式(例如式I、式Ia和/或式IV)涵盖的文库化合物可提供相对高的内部多样性，但会以命中比例为代价。
适应症和用途：
本文所述实施方案中任何一个的化合物可任选地用于治疗其中调节Pin1的活性为有益的病症。
预计从本申请成熟的专利有效期期间将鉴定许多相关病症，并且术语“其中调节Pin1的活性为有益的病症”的范围旨在先验地包括所有这种新治疗类型。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种或多种本文所述实施方案中任何一个的化合物在制造用于治疗其中调节Pin1的活性为有益的病症的药物中的用途。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种治疗其中调节Pin1的活性为有益的病症的方法，所述方法包括给予需要它的受试者一种或多种本文所述实施方案中任何一个的化合物。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供一种调节Pin1活性的方法，所述方法包括使Pin1与一种或多种本文所述实施方案中任何一个的化合物接触。Pin1活性的调节可任选地在体外(例如用于研究目的)或体内(例如其中通过给予需要它的受试者来实现接触)而实现。
在本文中，术语“调节”包括活性(例如Pin1的活性)的上调和下调(例如通过拮抗性结合)，并且可例如通过与活性位点(例如Pin1的活性位点)相互作用或通过调节蛋白的降解而实现。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，根据本文所述方面中的任何一个，调节Pin1的活性包括抑制Pin1的活性。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理学(疾病、障碍或病症)的发展和/或引起病理学的减轻、缓解或消退。本领域的技术人员将理解，可使用各种方法和测定来评价病理学的发展，并且类似地，可使用各种方法和测定来评价病理学的减轻、缓解或消退。
如本文使用的术语“预防”是指在可能处于疾病风险下但尚未诊断为患有疾病的受试者中防止疾病、障碍或病症的发生。
如本文使用的术语“受试者”包括哺乳动物，优选地为处于任何年龄的人类，其患有病理学。优选地，该术语包括处于发展病理学的风险下的个体。
其中调节Pin1的活性可为有益的病症的实例非限制性地包括增殖性疾病或障碍和免疫性疾病或障碍。增殖性疾病或障碍可为例如癌症或癌前期。
在本文所述任何相应实施方案中的一些中，治疗用于抑制肿瘤(任选地为神经母细胞瘤)的发生，例如抑制转移。
可根据本发明相应实施方案中的一些进行治疗的Pin1相关癌症的非限制性实例可为任何实体或非实体癌症和/或癌症转移，包括(但不限于)胃肠道肿瘤(结肠癌、直肠癌、结直肠癌(colorectal carcinoma)、结直肠癌(colorectal cancer)、结直肠腺瘤、遗传性非息肉病1型(hereditary nonpolyposis type 1)、遗传性非息肉病2型(hereditarynonpolyposis type 2)、遗传性非息肉病3型(hereditary nonpolyposis type 3)，遗传性非息肉病6型(hereditary nonpolyposis type 6)；结直肠癌、遗传性非息肉病7型(hereditary nonpolyposis type 7)、小肠和/或大肠癌、食管癌、食管癌胼胝形成(tylosis with esophageal cancer)、胃癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤)；子宫内膜癌、隆突性皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcoma protuberans)、胆囊癌、胆道肿瘤、前列腺癌、前列腺腺癌、肾癌(例如维尔姆斯肿瘤(Wilms’ tumor) 2型或1型)、肝癌(例如肝母细胞瘤、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular cancer))、膀胱癌、胚胎性横纹肌肉瘤、生殖细胞肿瘤、滋养细胞肿瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、卵巢未成熟畸胎瘤、子宫、卵巢上皮、骶尾部肿瘤、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤、成人上皮性肿瘤(epithelialadult tumor)、卵巢癌、浆液性卵巢癌、卵巢性索肿瘤(ovarian sex cord tumors)、子宫颈癌(cervical carcinoma)、子宫颈癌(uterine cervix carcinoma)、小细胞和非小细胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌(例如导管乳腺癌、浸润性导管内乳腺癌、散发性；乳腺癌、乳腺癌易感性、4型乳腺癌、乳腺癌-1、乳腺癌-3；乳腺-卵巢癌)、鳞状细胞癌(例如在头颈部)、神经源性肿瘤、星形细胞瘤、神经节母细胞瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤(例如霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、B细胞、伯基特(Burkitt)、皮肤T细胞、组织细胞、淋巴母细胞、T细胞、胸腺)、神经胶质瘤、腺癌、肾上腺肿瘤、遗传性肾上腺皮质癌(hereditary adrenocortical carcinoma)、脑部恶性肿瘤(brain malignancy) (肿瘤)、各种其他癌(例如支气管源性大细胞、导管、Ehrlich-Lettre腹水(Ehrlich-Lettreascite)、表皮样、大细胞、Lewis肺、髓样、粘液表皮样、燕麦细胞、小细胞、梭形细胞、棘细胞、移行细胞、未分化、癌肉瘤、绒毛膜癌、囊腺癌)、室管膜母细胞瘤、上皮瘤、红白血病(例如Friend、淋巴母细胞)、纤维肉瘤、巨细胞瘤、神经胶质瘤(glial tumor)、胶质母细胞瘤(例如多形性、星形细胞瘤)、神经胶质瘤(glioma)肝癌(hepatoma)、异源杂交瘤(heterohybridoma)、异源骨髓瘤(heteromyeloma)、组织细胞瘤、杂交瘤(例如B细胞)、肾上腺样瘤、胰岛素瘤、胰岛肿瘤、角质瘤、平滑肌母细胞瘤、平滑肌肉瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性、急性淋巴母细胞性、急性淋巴母细胞性前B细胞、急性淋巴母细胞T细胞白血病、急性-巨核母细胞性、单核细胞性、急性髓性、急性髓细胞性、伴嗜酸性粒细胞增多的急性髓细胞性(acute myeloid with eosinophilia)、B细胞、嗜碱性、慢性髓细胞性、慢性、B细胞、嗜酸性、Friend、粒细胞或髓细胞性、毛细胞、淋巴细胞性、巨核母细胞性(megakaryoblastic)、单核细胞性、单核细胞性-巨噬细胞、成髓细胞性、髓细胞性、髓单核细胞性、浆细胞、前B细胞、早幼粒细胞性、亚急性、T细胞、淋巴样肿瘤、易患髓细胞性恶性肿瘤、急性非淋巴细胞白血病)、淋巴肉瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、间皮瘤、转移性肿瘤、单核细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、骨髓瘤、肾母细胞瘤、神经组织神经胶质瘤、神经组织神经元肿瘤(nervoustissue neuronal tumor)、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、骨软骨瘤、骨髓瘤、骨肉瘤(例如尤因氏(Ewing's))、乳头状瘤、移行细胞、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤(浸润性)、浆细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤(例如尤因氏(Ewing's)、组织细胞、Jensen、骨源性、网状细胞瘤)、许旺氏细胞瘤(schwannoma)、皮下肿瘤、畸胎癌(例如多能性)、畸胎瘤、睾丸肿瘤、胸腺瘤和毛发上皮瘤、胃癌、纤维肉瘤、多形性胶质母细胞瘤；多发性血管球瘤、Li-Fraumeni综合征(Li-Fraumeni syndrome)、脂肪肉瘤、lynch癌家族综合征II型(lynchcancer family syndrome II)、雄性生殖细胞肿瘤、肥大细胞白血病、甲状腺髓样癌、多发性脑膜瘤、内分泌肿瘤粘液肉瘤、副神经节瘤、家族性非嗜铬性(familialnonchromaffin)、毛母质瘤(pilomatricoma)、乳头状、家族性和散发性、横纹肌样易感综合征(rhabdoid predisposition syndrome)、家族性、横纹肌样肿瘤、软组织肉瘤和Turcot综合征伴胶质母细胞瘤(Turcot syndrome with glioblastoma)。
胰腺癌(例如胰腺腺癌)为根据本发明的一些实施方案可治疗的示例性癌症类型。
癌前期在本领域中得到良好表征并且已知(例如参见Berman JJ. 和Henson DE.,2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform DecisMak. 3:8)。适合于经本发明方法治疗的癌前期的类别包括获得性小的或微观癌前期、具有核异型的获得性大病变、伴随进展为癌症的遗传性增生综合征(inherited hyperplasticsyndrome)发生的前期病变以及获得性弥漫性增生(acquired diffuse hyperplasias)和弥漫性化生(diffuse metaplasias)。小的或微观癌前期的实例包括HGSIL (子宫颈的高级别鳞状上皮内病变(High grade squamous intraepithelial lesion))、AIN (肛门上皮内瘤变(anal intraepithelial neoplasia))、声带发育不良(dysplasia of vocal cord)、异常隐窝(aberrant crypts) (结肠的)、PIN (前列腺上皮内瘤变(prostaticintraepithelial neoplasia))。具有核异型的获得性大病变的实例包括管状腺瘤、AILD(血管免疫母细胞性淋巴结病伴异常蛋白血症(angioimmunoblastic lymphadenopathywith dysproteinemia))、非典型脑膜瘤(atypical meningioma)、胃息肉(gastricpolyp)、大斑块副银屑病(large plaque parapsoriasis)、脊髓发育不良增生异常(myelodysplasia)、原位乳头状移行细胞癌(papillary transitional cell carcinomain-situ)、未成熟细胞过多的难治性贫血(refractory anemia with excess blast)和Schneiderian乳头状瘤(Schneiderian papilloma)。伴随进展为癌症的遗传性增生综合征发生的前期病变的实例包括非典型痣综合征(atypical mole syndrome)、C细胞腺瘤病(Ccell adenomatosis)和MEA。获得性弥漫性增生和弥漫性化生的实例包括AIDS、非典型淋巴样增生(atypical lymphoid hyperplasia)、骨Paget氏病、移植后淋巴增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disease)和溃疡性结肠炎。
适合于与本发明相应实施方案中任何一个的一种或多种化合物组合的用于治疗癌症的治疗方案包括(但不限于)化疗、放射疗法、光疗和光动力疗法、手术、营养疗法、消融疗法、组合放射疗法和化疗、近距离疗法、质子束疗法、免疫疗法、细胞疗法和光子束放射外科疗法。
可任选地与本发明化合物共同给予的备选或另外的化疗药物(例如抗癌药物)包括(但不限于)阿西维辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、阿克宁(acronine)、阿多来新(adozelesin)、阿地白介素(aldesleukin)、六甲蜜胺(altretamine)、安波霉素(ambomycin)、阿美蒽醌(ametantrone)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、氨茴霉素(anthramycin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、曲林菌素(asperlin)、阿扎胞苷(azacitidine)、阿扎替派(azetepa)、阿佐霉素(azotomycin)、巴马司他(batimastat)、苯佐替派(benzodepa)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、双萘法德(bisnafide)、比折来新(bizelesin)、博来霉素(bleomycin)、布奎那(brequinar)、溴匹立明(bropirimine)、白消安(busulfan)、放线菌素C (cactinomycin)、卡鲁睾酮(calusterone)、卡拉酰胺(caracemide)、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、卡柔比星(carubicin)、卡折来新(carzelesin)、西地芬戈(cedefingol)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、西罗霉素(cirolemycin)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、克立那托(crisnatol)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、右奥马铂(dexormaplatin)、地扎胍宁(dezaguanine)、地吖醌(diaziquone)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、达佐霉素(duazomycin)、依达曲沙(edatrexate)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、依沙芦星(elsamitrucin)、恩洛铂(enloplatin)、恩普氨酯(enpromate)、依匹哌啶(epipropidine)、表柔比星(epirubicin)、厄布洛唑(erbulozole)、依索比星(esorubicin)、雌莫司汀(estramustine)、依他硝唑(etanidazole)、依托泊苷(etoposide)、艾托卜宁(etoprine)、法曲唑(fadrozole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟西他滨(flurocitabine)、磷喹酮(fosquidone)、福司曲星(fostriecin)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依莫佛新(ilmofosine)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂(iproplatin)、伊立替康(irinotecan)、兰瑞肽(lanreotide)、来曲唑(letrozole)、亮脯利特(leuprolide)、利阿唑(liarozole)、洛美曲索(lometrexol)、洛莫司汀(lomustine)、洛索蒽醌(losoxantrone)、马索罗酚(masoprocol)、美登素(maytansine)、氮芥(mechlorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美仑孕酮(melengestrol)、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氯苯氨啶(metoprine)、美妥替哌(meturedepa)、米丁度胺(mitindomide)、米托卡星(mitocarcin)、米托孔星(mitocromin)、米托洁林(mitogillin)、丝裂马菌素(mitomalcin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托司培(mitosper)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺考达唑(nocodazole)、诺加霉素(nogalamycin)、奥马铂(ormaplatin)、奥昔舒仑(oxisuran)、紫杉醇(paclitaxel)、培门冬酶(pegaspargase)、佩里霉素(peliomycin)、奈莫司汀(pentamustine)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、哌泊溴烷(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、吡咯蒽醌(piroxantrone)、普卡霉素(plicamycin)、普洛美坦(plomestane)、卟吩姆(porfimer)、泊非霉素(porfiromycin)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、嘌呤霉素(puromycin)、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、利波腺苷(riboprine)、罗谷亚胺(rogletimide)、沙芬戈(safingol)、司莫司汀(semustine)、辛曲秦(simtrazene)、斯帕磷酸(sparfosate)、稀疏霉素(sparsomycin)、螺旋锗(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、螺铂(spiroplatin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、他利霉素(talisomycin)、替可加兰(tecogalan)、替加氟(tegafur)、替洛蒽醌(teloxantrone)、替莫卟吩(temoporfin)、替尼泊苷(teniposide)、替罗昔隆(teroxirone)、睾内酯(testolactone)、硫唑嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、噻唑呋林(tiazofurin)、替拉扎明(tirapazamine)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、曲托龙(trestolone)、曲西瑞宾(triciribine)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、妥布氯唑(tubulozole)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、乌瑞替派(uredepa)、伐普肽(vapreotide)、维替泊芬(verteporfin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春匹定(vinepidine)、长春甘酯(vinglycinate)、环氧长春碱(vinleurosine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春罗定(vinrosidine)、长春利定(vinzolidine)、伏氯唑(vorozole)、齐尼铂(zeniplatin)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)及其任何药学上可接受的盐。另外的抗肿瘤剂包括在Goodman和 Gilman "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 第18版, 1990, McGraw-Hill, Inc.(Health Professions Division)的Chapter 52, Antineoplastic Agents (PaulCalabresi和Bruce A. Chabner)及其介绍, 1202-1263中公开的那些。
预计从本申请成熟的专利有效期期间将开发出许多相关药物，并且术语“抗癌剂”、“化疗药物”、“抗肿瘤剂”等的范围旨在先验地包括所有这种新技术。
可根据待治疗的病症任选地选择另外的抗癌剂，例如通过选择用于治疗已对其批准药物(本身)的病症的药物，例如如下表所示：
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制剂和给予：
本发明一些实施方案的化合物可本身或以其中其与合适的载体或赋形剂混合的药用组合物给予生物体。
如本文使用的“药用组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学成分比如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药用组合物的目的为促进将化合物给予生物体。
在本文中，术语“活性成分”是指一种或多种负责生物效应的化合物(根据本文所述相应实施方案中的任何一个)。
在下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所给予化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。这些短语下包括佐剂。
在本文中，术语“赋形剂”是指加入到药用组合物中以进一步促进活性成分的给予的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油类和聚乙二醇。
用于药物配制和给予的技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版中找到，其通过参考结合至本文中。
合适的给予途径可例如包括口服、直肠、经粘膜(尤其是经鼻)、肠或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内(例如进入右或左心腔，进入冠状总动脉)、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于将药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输注)；物质的分子操纵(例如产生包含对内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽与本身不能穿过BBB的物质组合的嵌合融合蛋白)，以试图利用BBB的其中一种内源性转运途径；旨在增加物质脂溶性的药理学策略(例如水溶性物质与脂质或胆固醇载体的缀合)；以及通过高渗破坏(由于将甘露醇溶液输注入颈动脉或使用生物活性剂比如血管紧张素肽)进行的BBB完整性的暂时破坏。然而，这些策略中的每一个均有局限性，比如与侵入性手术程序相关的固有风险、由内源性转运系统固有的局限性强加的大小限制、与全身给予包含可能在CNS外有活性的载体基序的嵌合分子相关的潜在不期望的生物学副作用，以及其中BBB被破坏的脑区域内可能存在脑损伤的风险，这使其成为次优的递送方法。
或者，可以局部而非全身方式给予药用组合物，例如经由将药用组合物直接注射到患者的组织区域中。
术语“组织”是指由旨在执行一种或多种功能的细胞组成的生物体的一部分。实例包括(但不限于)脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明一些实施方案的药用组合物可通过本领域众所周知的方法制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。
根据本发明的一些实施方案使用的药用组合物因此可使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制备物。适当的制剂取决于所选择的给予途径。
对于注射，药用组合物的活性成分可配制于水溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液，比如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给予，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常为本领域已知的。
对于口服给予，通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合，可易于配制药用组合物。这种载体使得可将药用组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等，供患者口服摄取。可使用固体赋形剂任选地研磨所得混合物，并在需要时加入合适的助剂之后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯，而制备用于口服使用的药理学制备物。合适的赋形剂特别为填充剂比如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，比如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可加入崩解剂，比如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐比如海藻酸钠。
糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此，可使用浓糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖衣丸包衣中，用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药用组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊剂以及由明胶和增塑剂比如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊剂。推入配合式胶囊剂可含有与填充剂比如乳糖、粘合剂比如淀粉、润滑剂比如滑石粉或硬脂酸镁以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体，比如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。用于口服给予的所有制剂的剂量应适合于所选择的给予途径。
对于口腔给予，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分以气溶胶喷雾剂形式从加压包装或雾化器使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳便利地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来确定。可配制用于分配器的例如明胶的胶囊剂和药筒，其含有化合物和合适的粉末基质比如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的药用组合物可配制用于胃肠外给予，例如通过推注或连续输注。注射用制剂可以单位剂型，例如以安瓿或多剂量容器(任选地添加防腐剂)呈现。组合物可为在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有配制剂比如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给予的药用组合物包括水溶性形式的活性制备物的水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成适当的油性或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油类比如芝麻油，或合成脂肪酸酯类比如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度以允许制备高浓度溶液剂的物质。
或者，活性成分可为粉末形式，以便在使用之前用合适的媒介物例如基于无菌、无热原水的溶液溶解。
本发明一些实施方案的药用组合物还可使用例如常规栓剂基质比如可可脂或其他甘油酯以直肠组合物比如栓剂或保留灌肠剂配制。
适用于本发明一些实施方案的上下文中的药用组合物包括其中以有效实现预期目的的量含有活性成分的组合物。更具体地讲，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善障碍(例如增殖性疾病或障碍)的症状或延长所治疗的受试者的存活期的活性成分(例如本文所述相应实施方案中任何一个的化合物，任选地与本文所述的另外物质组合)的量。
治疗有效量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。对于本发明方法中使用的任何制备物，治疗有效量或剂量可最初从体外和细胞培养测定估计。例如，可以动物模型配制剂量以达到期望的浓度或效价。这种信息可用于更准确地确定人类中的有用剂量。
本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过标准药用程序在体外、细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可用于制定一系列用于人类的剂量。剂量可根据所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。确切的制剂、给予途径和剂量可由个体医师鉴于患者的状况来选择(参见例如Fingl,等人, 1975,载于“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1)。
可单独调整剂量和间隔以提供足以诱导或抑制生物效应的活性成分水平(例如血液水平)(最小有效浓度，MEC)。每种制备物的MEC会有所不同，但可根据体外数据估计。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给予途径。检测测定可用于确定血浆浓度。
根据待治疗病症的严重性和反应性，给药可为单次或多次给予，治疗过程持续数天至数周或者直至实现治愈或达到减轻疾病状态。
当然，待给予组合物的量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重性、给予方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，本发明一些实施方案的组合物可以包装或分配器装置呈现，比如FDA批准的试剂盒，其可含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可包括金属或塑料箔，比如泡罩包装。包装或分配器装置可附有给予说明。包装或分配器也可由以监管药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式存在的与容器相关的通知容纳，该通知反映机构对组合物或人类或兽医给予的形式的批准。例如，这种通知可具有美国食品药物监督管理局(U.S. Food and Drug Administration)批准的处方药标签或批准的产品插页。还可制备包含配制于相容药用载体中的本发明制备物的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗指定病症，如本文进一步详述。
另外的定义：
在本文中，术语“烃”描述包括作为其基本骨架的主要被氢原子取代的碳原子链的有机部分。烃可为饱和或不饱和的，由脂肪族、脂环族或芳香族部分组成，并且可任选地被一个或多个取代基(除氢以外)取代。取代的烃可具有一个或多个取代基，藉此每个取代基可独立地为例如环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、胺、卤化物、硫酸酯、磺酸酯、磺酰基、亚砜、磷酸酯、膦酰基、膦基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氧代、氰基、硝基、偶氮、叠氮化物、磺酰胺、羰基、硫代羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、氨基甲酸酯、酰胺、环氧化物和肼。烃可为端基或连接基团，如这些术语在本文中定义。优选地，烃部分具有1-20个碳原子。
如本文通篇使用的术语“烷基”是指包括直链和支链基团的任何饱和脂肪族烃。优选地，烷基具有1-20个碳原子。
每当在本文中陈述数字范围例如“1-20”时，其意指基团(在这种情况下为烷基)可含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多达并且包括20个碳原子。更优选地，烷基为具有1-10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另外指明，否则烷基为具有1-4个碳原子的低级烷烷基。烷基可为取代或未取代的。
当取代时，取代基可为例如环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，如这些术语在本文中定义。
在本文中，术语“烯基”描述包括直链和支链基团的包含至少一个碳-碳双键的不饱和脂肪族烃。优选地，烯基具有2-20个碳原子。更优选地，烯基为具有2-10个碳原子的中等大小的烯基。最优选地，除非另外指明，否则烯基为具有2-4个碳原子的低级烯基。烯基可为取代或未取代的。
取代的烯基可具有一个或多个取代基，藉此每个取代基可独立地为例如炔基、环烷基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基。
在本文中，术语“炔基”描述包括直链和支链基团的包含至少一个碳-碳叁键的不饱和脂肪族烃。优选地，炔基具有2-20个碳原子。更优选地，炔基为具有2-10个碳原子的中等大小的炔基。最优选地，除非另外指明，否则炔基为具有2-4个碳原子的低级炔基。炔基可为取代或未取代的。
取代的炔基可具有一个或多个取代基，藉此每个取代基可独立地为例如环烷基、烯基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基。
术语“亚烷基”描述饱和或不饱和的脂肪族烃连接基团，如该术语在本文中定义，其与如本文定义的烷基(当饱和时)或者烯基或炔基(当不饱和时)的区别仅在于亚烷基为连接基团而非端基。
“环烷基”基团是指饱和或不饱和的全碳单环或稠环(即共享相邻的碳原子对的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统。环烷基的实例非限制性地为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷。环烷基可为取代或未取代的。当取代时，取代基可为例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，如这些术语在本文中定义。当环烷基为不饱和时，其可包含至少一个碳-碳双键和/或至少一个碳-碳叁键。环烷基可为端基，如该短语在本文中定义，其中其连接于单个相邻的原子，或者为连接基团，如该短语在本文中定义，连接两个或更多个部分。
“芳基”基团是指具有完全共轭的π电子系统的全碳单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)端基。芳基的实例非限制性地为苯基、萘基和蒽基。芳基可为取代或未取代的。当取代时，取代基可为例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，如这些术语在本文中定义。芳基可为端基，如该短语在本文中定义，其中其连接于单个相邻的原子，或者为连接基团，如该短语在本文中定义，连接两个或更多个部分。
“杂芳基”基团是指在一个或多个环中具有一个或多个原子(比如氮、氧和硫)，并且另外具有完全共轭的π电子系统的单环或稠环(即共享相邻原子对的环)端基。杂芳基的实例非限制性地包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可为取代或未取代的。当取代时，取代基可为例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，如这些术语在本文中定义。
术语“亚芳基”描述单环或稠环多环连接基团，如该术语在本文中定义，并且涵盖与芳基或杂芳基(如这些术语在本文中定义)的区别仅在于亚芳基为连接基团而非端基的连接基团。
“杂脂环基”基团是指在一个或多个环中具有一个或多个原子比如氮、氧和硫的单环或稠环基团。环也可具有一个或多个双键。然而，这些环不具有完全共轭的π电子系统。杂脂环基可为取代或未取代的。当取代时，取代基可为例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，如这些术语在本文中定义。代表性的实例为哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。杂脂环基可为端基，如该短语在本文中定义，其中其连接于单个相邻的原子，或者为连接基团，如该短语在本文中定义，连接两个或更多个部分。
在本文中，术语“胺”和“氨基”各自是指-NR’R’’端基、-N+R’R’’R’’’端基、-NR’-连接基团或-N+R’R’’-连接基团，其中R’、R’’和R’’’各自为氢或者取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基(经其环碳连接于胺氮)、芳基或杂芳基(经其环碳连接于胺氮)，如本文定义。任选地，R’、R’’和R’’’为氢或包含1-4个碳原子的烷基。任选地，R’和R’’(和R’’’，如果存在)为氢。当取代时，与胺的氮原子结合的R’、R’’或R’’’烃部分的碳原子优选地不被氧代取代，使得R’、R’’和R’’’不为(例如)羰基、C-羧基或酰胺，如这些基团在本文中定义，除非另外指明。
“叠氮化物”基团是指-N=N+=N-基团。
“烷氧基”基团是指如本文定义的-O-烷基和-O-环烷基端基两者，或者指如本文定义的-O-亚烷基-或-O-环烷基-连接基团。
“芳氧基”基团是指如本文定义的-O-芳基和-O-杂芳基端基两者，或者指如本文定义的-O-亚芳基-连接基团。
“羟基”基团是指-OH基团。
“巯基”或“硫醇”基团是指-SH基团。
“硫代烷氧基”基团是指如本文定义的-S-烷基端基和-S-环烷基端基两者，或者指如本文定义的-S-亚烷基-或-S-环烷基-连接基团。
“硫代芳氧基”基团是指如本文定义的-S-芳基和-S-杂芳基端基两者，或者指如本文定义的-S-亚芳基-连接基团。
“羰基”基团是指-C(=O)-R’端基，其中R’如上文定义，或者指-C(=O)-连接基团。
“硫代羰基”基团是指-C(=S)-R’端基，其中R’如本文定义，或者指-C(=S)-连接基团。
“羧基”、“羧基的”或“羧酸酯”是指“C-羧基”和“O-羧基”端基两者，以及指-C(=O)-O-连接基团。
“C-羧基”基团是指-C(=O)-O-R’基团，其中R’如本文定义。
“O-羧基”基团是指R’C(=O)-O-基团，其中R’如本文定义。
“羧酸”是指-C(=O)OH基团，包括去质子化的离子形式及其盐。
“酯”是指-C(=O)OR’基团，其中R’不为氢。
“氧代”基团是指=O基团。
“硫代羧基”或“硫代羧酸酯”基团是指-C(=S)-O-R’和-O-C(=S)R’端基两者，或者指-C(=S)-O-连接基团。
“卤代”基团是指氟、氯、溴或碘。
“卤烷基”基团是指如本文定义的被一个或多个卤代基团取代的烷基。
“亚磺酰基”基团是指-S(=O)-R’端基，其中R’如本文定义，或者指-S(=O)-连接基团。
“磺酰基”基团是指-S(=O)2-R’端基，其中R’如本文定义，或者指-S(=O)2-连接基团。
“磺酸酯”基团是指-S(=O)2-O-R’端基，其中R’如本文定义，或者指S(=O)2-O-连接基团。
“硫酸酯”基团是指-O-S(=O)2-O-R’端基，其中R’如本文定义，或者指-O-S(=O)2-O-连接基团。
“磺酰胺”或“磺酰氨基”基团包括如本文定义的S-磺酰氨基和N-磺酰氨基端基两者，以及-S(=O)2-NR’-连接基团。
“S-磺酰氨基”基团是指-S(=O)2-NR’R’’基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“N-磺酰氨基”基团是指R’S(=O)2-NR’’基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“氨基甲酰基”或“氨基甲酸酯”基团包括O-氨基甲酰基和N-氨基甲酰基端基，以及指-OC(=O)-NR’-连接基团。
“O-氨基甲酰基”基团是指-OC(=O)-NR’R’’基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“N-氨基甲酰基”基团是指R’OC(=O)-NR’’-基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“硫代氨基甲酰基”或“硫代氨基甲酸酯”基团包括O-硫代氨基甲酰基和N-硫代氨基甲酰基端基，以及指-OC(=S)-NR’-连接基团。
“O-硫代氨基甲酰基”基团是指-OC(=S)-NR’R’’基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“N-硫代氨基甲酰基”基团是指R’OC(=S)NR’’-基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“酰胺”或“酰氨基”基团包括如本文定义的C-酰氨基和N-酰氨基端基，以及指-C(=O)-NR’-连接基团。
“C-酰氨基”基团是指-C(=O)-NR’R’’基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“N-酰氨基”基团是指R’C(=O)-NR’’-基团，其中R’和R’’中的每一个如本文定义。
“脲基”是指-N(R’)-C(=O)-NR’’R’’’端基，或者指-N(R’)-C(=O)-NR’’-连接基团，其中R’、R’’和R’’’中的每一个如本文定义。
“硫脲基”是指-N(R’)-C(=S)-NR’’R’’’端基，或者指-N(R’)-C(=S)-NR’’-连接基团，其中R’、R’’和R’’’中的每一个如本文所定义。
“硝基”基团是指-NO2基团。
“氰基”基团是指-C≡N基团。
术语“膦酰基”或“膦酸酯”描述-P(=O)(OR’)(OR’’)端基，或-P(=O)(OR’)-O-连接基团，其中R’和R’’如上文定义。
术语“磷酸酯”描述-O-P(=O)(OR’)(OR’’)端基或-O-P(=O)(OR’)-O-连接基团，其中R’和R’’中的每一个如上文定义。
术语“膦基(phosphinyl)”描述-PR’R’’端基或-PRR’-连接基团，其中R’和R’’中的每一个如上文定义。
术语“肼”描述-NR’-NR”R’’’端基或-NR’-NR”-连接基团，其中R’、R’’和R’’’如本文定义。
如本文使用的术语“酰肼”描述-C(=O)-NR’-NR”R”’端基或-C(=O)-NR’-NR”-连接基团，其中R’、R’’和R’’’如本文定义。
如本文使用的术语“硫代酰肼”描述-C(=S)-NR’-NR”R”’端基或-C(=S)-NR’-NR”-连接基团，其中R’、R’’和R’’’如本文定义。
“胍基”基团是指-RaNC(=NRd)-NRbRc端基，或-RaNC(=NRd)-NRb-连接基团，其中Ra、Rb、Rc和Rd中的每一个可如本文中对于R’和R’’定义。
“脒基”或“鸟嘌呤”基团是指RaRbNC(=NRd)-端基或-RaNC(=NRd)-连接基团，其中Ra、Rb和Rd如本文定义。
如本文使用的术语“约”是指±10%。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其词形变化意指“包括(但不限于)”。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
如本文使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指涉，除非上下文另外明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种合物，包括其混合物。
在整个本申请中，可以范围格式呈现本发明的各种实施方案。应当理解，以范围格式描述仅是为了方便和简洁，并且不应解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围比如1-6的描述应认为具有具体公开的子范围，比如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
每当在本文中指明数字范围时，均意指包括在所指示范围内任何列举的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字的范围内/范围在第一指示数字和第二指示数字之间”和“在第一指示数字到第二指示数字的范围内/范围从第一指示数字到第二指示数字”在本文中可互换使用并且意指包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括(但不限于)化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
当指涉特定序列表时，这种指涉应理解为还包括与其互补序列基本对应的序列，包括例如由测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变引起的微小序列变异，前提是这种变异的频率低于50个核苷酸中的1个，或者低于100个核苷酸中的1个，或者低于200个核苷酸中的1个，或者低于500个核苷酸中的1个，或者低于1000个核苷酸中的1个，或者低于5,000个核苷酸中的1个，或者低于10,000个核苷酸中的1个。
应当意识到，为了清楚起见而在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁起见而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合或视情况而定在本发明的任何其他所述实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不认为是那些实施方案的必不可少的特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下是不可操作的。
如上文描绘的和如所附权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
材料和方法：
材料：
用于有机合成的所有溶剂和试剂均得自Sigma-Aldrich、Merck、Baker和/或Acros，并且无需进一步纯化即使用。
用于合成的构件得自Enamine和MolPort。
使用自动快速色谱系统(automated Flash chromatography system)(CombiFlash® Systems, Teledyne Isco, USA)和RediSep® Rf正相快速柱(RediSep®Rf Normal-phase Flash Column)纯化前体。最终化合物通过半制备型HPLC在配备有UV/Vis检测器2489的Waters Prep 2545制备型色谱系统上，使用XBridge® Prep C18 10 µm10x250 mm柱(PN: 186003891, SN:161I3608512502)进行纯化。使用Waters UPLC®-MS系统：配备有PDA检测器、Acquity™ UPLC® BEH C18 1.7 µm 2.1x50 mm柱(PN:186002350,SN 02703533825836)、Waters SQ检测器2的Acquity™ UPLC® H类，监测产物的LC-MS-ESI光谱和反应进展。
亲电体文库筛选：
通过每孔混合4或5种化合物的0.5 µl 20 mM储备溶液，将993种化合物转移至384孔板工作副本中。将Pin1的催化结构域(2 µM)在20 mM Tris、75 mM NaCl (pH 7.5)中的溶液与200 µM每种化合物一起温育，并在4℃下适度振荡24小时。通过添加甲酸至最终浓度为0.4% (v/v)来停止反应。
液相色谱/质谱运行使用电喷雾电离(ESI)以正离子模式在Acquity™ UPLC® H-class系统(Waters)上进行。UPLC分离在C4柱(300 Å, 1.7 µM, 21 mm × 100 mm)上进行。柱保持在40℃下，和自动进样器保持在10℃下。流动溶液A为0.1%甲酸在水中的溶液和流动相B为0.1%甲酸在乙腈中的溶液。运行流量为0.4 ml/分钟；和使用20% B持续2分钟，线性增加至60% B持续3分钟，在60% B下保持1.5分钟，在0.1分钟内变为0% B并在0%下保持1.4分钟的梯度。脱溶剂气温度(Desolvation temperature)为500℃，流速为1000升/小时。毛细管电压为0.69 kV和锥孔电压为46 V。原始数据使用OpenLynx™软件进行处理，并使用MaxEnt工具解卷积。如Resnick等人 [J Am Chem Soc 2019, 141:8951-8968]所述进行标记分配。
共价对接：
使用DOCKovalent 3.7 [London等人, Nat Chem Biol 2014, 10:1066-1072]针对Pin1的16个结构进行共价对接。PDB代码：1PIN、2ITK、2Q5A、2XP3、2ZQV、2ZR4、3IK8、3KAB、3KCE、3NTP、3ODK、3OOB、3TC5、3TCZ、3TDB、3WH0。对接的化合物包括来自亲电文库的具有以下ID的七个环丁砜命中：PCM-0102138、PCM-0102178、PCM-0102105、PCM-0102832、PCM-0102313、PCM-0102760、PCM-0102755。共价键长度设置为1.8Å，和两个新形成的键角设置为Cβ-Sγ-C=109.5±5°和Sγ-C-Ligatom=109.5±5°。
用于原位质谱(MS)筛选的448种三唑类似物文库的制备：
点击反应在384孔板(Greiner)中以0.2 µmol规模进行。在每个孔中，使用多通道移液器分配DMSO中的叠氮化物(28.57 mM, 8.75 µl, 1.25当量)、DMSO中的Pin1-4 (100mM, 2 µl, 1当量)、叔丁醇(10.15 µl)、抗坏血酸钠水溶液(1.5 mM, 26.7 µl, 0.2当量)、1:1 DMSO/H2O 中的1:1 CuSO4/THBTA (三(3-羟丙基三唑基甲基)胺) (2.5 mM, 2.4 µl,0.03当量)。每孔含有50 µl反应混合物和最终产物浓度为4 mM，提供完全反应。将板密封并在室温下于振荡器上温育过夜。通过在DMSO中稀释产物以达到最终浓度为50 µM来制备工作板。
三唑类似物文库的原位质谱(MS)筛选：
为了筛选，将2 µl作为50 µM DMSO储备液的448种点击产物中的每一种转移到384孔板工作板中。加入48 µl含75 mM NaCl的20 mM Tris (pH 7.5)中的Pin1催化结构域(2 µM)并适度振荡，且在室温下温育15分钟。通过添加甲酸至最终浓度为0.4% (v/v) (20 µl)来停止反应。类似于本文所述的亲电体文库温育，通过液相色谱/质谱分析混合物。通过液相色谱/质谱(LC-MS)对命中进行回顾性分析以确保反应完成。
质谱数据的标记分配和处理：
对于每个测量孔，搜索经处理的峰以匹配在对照样品或标记蛋白中发现的未标记蛋白或未标记蛋白的常见小加合物的质量。化合物的标记百分比确定为特定化合物的标记除以总体检测到的蛋白种类。质量无法分配的峰从总体标记计算中弃去。使用python脚本分析数据以处理MaxEnt解卷积的光谱。峰从离子计数归一化为百分比，其中最高峰定义为100%。未标记蛋白的质量从仅含有蛋白的参考孔中推导。
硫醇反应性测定：
将50 μM DTNB (二硫代硝基苯甲酸)与200 μM TCEP (三(2-羧乙基)膦)一起在含150 mM NaCl的20 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中于室温下温育5分钟，以获得TNB2- (硫代硝基苯甲酸根二价阴离子)。随后将200 µM化合物添加至TNB2-中，然后立即在412 nm处(在37℃下)进行UV吸光度测量。每15分钟采集UV吸光度持续7小时。使用Spark™10M读板器(Tecan)在384孔板中进行测定。通过在没有DTNB的相同条件下测量每种化合物在412 nm处的吸光度来减去化合物的背景吸光度。一式三份测量化合物。将数据拟合成二级反应方程，使得速率常数k为ln([A][B0]/[B][A0])的斜率，其中[A0]和[B0]分别为化合物(200 µM)和TNB2- (100 µM)的初始浓度，和[A]和[B]为如根据光谱测量确定的作为时间的函数的剩余浓度。使用Prism®软件进行线性回归，以针对前4小时的测量结果拟合速率。
细胞活力测定：
使MDA-MB-231细胞在补充有10% FCS (胎牛血清)、1% PS (青霉素-链霉素)和1%L-谷氨酰胺(全部来自Biological Industries)的DMEM培养基中生长。支原体污染的排除通过用MycoAlert™试剂盒(Lonza)进行的测试监测和进行。细胞用胰蛋白酶消化并计数，并使用Multidrop™ 384 (Thermo Scientific) Washer Dispenser II将1000个细胞/孔于50 µl生长培养基中接种到384孔白TC板(Greiner)中。根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo®发光试剂盒(Promega)监测活细胞的数量。使用PHERAstar™ FS读板器(BMG Labtech)的发光模块测量发光。使用GeneData 12分析软件进行数据分析。测定准备好的板制备：使用Labcyte Echo®声学分配技术将化合物转移到黑色微孔板(Greiner784900)中。然后用热封密封测定准备好的板。如果不立即使用，将板冷冻于-20℃下并保存于带有硅胶干燥剂的聚丙烯盒中。
荧光偏振(FP)测定：
使用荧光偏振测定法测定与Pin1的结合亲和力，以评价与N-末端荧光素标记肽(Bth-D-phosThr-Pip-Nal)的竞争，该肽得自JPT Peptide Technologies和ProteintechGroup。指定浓度的候选化合物在4℃下与在10 mM HEPES、10 mM NaCl和1%甘油(pH 7.4)的缓冲液中含有 250 nM谷胱甘肽S-转移酶(GST)-Pin1、5 nM 荧光素标记肽探针、10 µg/ml牛血清白蛋白、0.01% Tween-20和1 mM DTT (二硫苏糖醇)的溶液一起预温育12 小时。使用EnVision™读数器在黑色384孔板(Corning)中进行FP的测量。从FP测定结果获得的表观Ki值(在测试条件下)得自Kenakin Ki方程：
Kenakin K i = (Lb)(EC50)(K d)/(Lo)(Ro) + Lb(Ro-Lo + Lb-K d)
其中K d [M]：探针的K d，EC50 [M]：从FP测定中获得，总示踪剂Lo[M]：FP中的探针浓度，结合示踪剂Lb [M]：85%的探针浓度与靶蛋白结合，总受体Ro [M]：FP测定中的Pin1浓度，如[Auld D.S.等人, Receptor binding assays for HTS and drug discovery.载于Assay Guidance Manual eds. Sittampalam G.S.等人, Eli Lilly & Company and theNational Center for Advancing Translational Sciences, 2004]所述。
Pin1底物活性测定：
使用胰凝乳蛋白酶偶联的PPIase测定，使用GST-Pin1和Suc-Ala-pSer-Pro-Phe-pNA (SEQ ID NO: 2)肽底物(50 mM)，根据由Yaffe [Science 1997, 278:1957-1960]所述的程序确定对Pin1异构酶活性的抑制。GST-Pin1与指定浓度的化合物在4℃下于含有35 mMHEPES (pH 7.8)、0.2 mM DTT和0.1 mg/ml BSA (牛血清白蛋白)的缓冲液中一起预温育12小时。紧在测定开始之前，先后加入胰凝乳蛋白酶(最终浓度为6 mg/ml)和肽底物(Suc-Ala-pSer-Pro-Phe-pNA (SEQ ID NO: 2)肽底物，最终浓度为50 mM)。从PPIase测定获得的表观Ki值(在测试条件下)得自Cheng-Prusoff方程：
K i = IC50/ (1 + S/Km)
其中Km为所用底物的米氏常数，S为测定中底物的初始浓度，IC50为抑制剂的半数最小抑制浓度。
免疫印迹：
用于免疫印迹的全细胞裂解物通过将来自每个细胞系的细胞在4℃下(以300 g)沉淀5分钟来制备。所得细胞沉淀用冰冷的1x PBS洗涤1x，并然后重悬于指定的细胞裂解缓冲液中。在使用BCA测定试剂盒(Pierce，cat. #23225)量化之前，裂解物在4℃下以每分钟14,000转澄清15分钟。将全细胞裂解物装入到Bolt™ 4-12% Bis-Tris Gels (ThermoFisher, cat. #NW04120BOX)中，并通过95 V电泳分离1.5小时。使用iBlot®凝胶转移装置(Thermo Fisher, cat. #IB23001)在P3处将凝胶转移至硝酸纤维素膜上持续6分钟，并然后在室温下于Odyssey®封闭缓冲液(LI-COR Biosciences, cat. #927-50010)中封闭1小时。在1x TBST (含 Tween™ 20的Tris缓冲盐水)中的20% Odyssey®封闭缓冲液中，于4℃下过夜使用针对相关蛋白的抗体对膜进行探测。然后膜用1x TBST洗涤3次(每次洗涤至少5分钟)，然后与IRDye®山羊抗小鼠(LI-COR Biosciences, cat. #926-32210)或山羊抗兔(LI-COR Biosciences, cat. #926-32211)二抗(1:10,000稀释)一起在1x TBST中的20%Odyssey®封闭缓冲液中于室温下温育1小时。用1x TBST洗涤3次(每次洗涤至少5分钟)之后，使用Odyssey®红外成像系统(LI-COR Biosciences)目视化免疫印迹。
裂解物下拉(pull-down)测定：
指定细胞用浓度增加的DMSO、Pin1-3或Pin1-3-AcA处理5小时。在用50 mM HEPES(pH 7.4)、1 mM EDTA、10%甘油、1 mM TCEP、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40和蛋白酶抑制剂片剂(Roche cat. #4693159001)裂解之前，通过刮取收获细胞并用PBS洗涤两次。澄清(14,000 rpm持续15分钟)之后，样品用指定浓度的Pin1-3-DTB在4℃下处理1小时。然后将裂解物与链霉亲和素琼脂糖树脂(Thermo Scientific, cat. #20349)一起在4℃下温育1.5小时。将珠粒用500 µl洗涤缓冲液(50 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM NaCl、1 mM EDTA、10%甘油)洗涤4次，然后通过离心沉淀并干燥。将珠粒在2x LDS + 10% β-巯基乙醇中于95℃下煮沸5分钟。然后使用bolt系统(Life Technologies)经Western印迹评价感兴趣的蛋白。
细胞靶点接合-活细胞竞争测定：
将指定细胞铺板于10 cm板中，每板在6 ml培养基中含有250万个细胞。铺板之后第二天，在指定时间点用指定浓度的候选抑制剂处理细胞。然后将细胞用冷的磷酸盐缓冲盐水(每10 cm板1 ml)洗涤两次，并通过用细胞刮刀刮取进行收集。在50 mM HEPES (pH7.4)、1 mM EDTA、10%甘油、1 mM TCEP、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40和蛋白酶抑制剂片剂(Roche)中裂解细胞-每10 cm细胞板使用210 µl细胞裂解缓冲液。澄清(14,000 rpm持续15分钟)之后，将9 µl每个裂解物样品与5 µl 4x LDS + 10% β-巯基乙醇(比率为3:1)混合，煮沸5分钟，并预留用于输入上样对照。然后，将200 µl每个裂解物样品与1 µM Pin1-3-DTB一起在4℃下温育1小时，并如上文中对于裂解物下拉测定所述进行处理。
RNA测序：
Mino细胞(从ATCC获得)在37℃下于5% CO2加湿温育箱中生长，并在补充有15%胎牛血清(Biological Industries)和1%青霉素-链霉素溶液(Biological Industries)的RPMI-1640 (Biological Industries)中培养。将11×106个细胞与1 µM Pin1-3 (0.02%DMSO)或与0.02% DMSO一起一式三份温育6小时。用RNeasy™试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用SENSE™ mRNA-Seq文库制备试剂盒V2 (Lexogen)从2 µg总RNA制备RNA文库。使用Qubit™荧光测定和TapeStation™分析(Agilent)来分析总RNA和文库质量。在NextSeq™ 550上使用NextSeq™ 500/550高输出试剂盒v2.5 (Illumina)对样品进行测序。
使用STAR [Dobin等人, Bioinformatics 2013, 29:15-21]将RNA-seq读出与人类基因组(hg19组装)比对，并使用RSEM [Li & Dewey, BMC Bioinformatics 2011, 12:323]和RefSeq注释确定基因表达。使用 DESeq2 [Love等人, Genome Biol 2014, 15:550]和默认参数计算差异表达。使用Enrichr [Kuleshov等人, Nucleic Acids Res 2016, 44:W90-W97]进一步分析baseMean >50且以P<0.05下调的基因。
通过rdTOP-ABPP概况分析Pin1-3反应性半胱氨酸：
MDA-MB-231细胞在37℃和5% CO2气氛下于补充有10% FBS和1% PS的DMEM培养基中进行培养。细胞生长至70%汇合，并在无血清培养基中与DMSO或5 µM Pin1-3一起温育2小时。收获细胞，通过在含有0.1% Triton™ X-100的冰冷PBS中超声裂解，并以100,000 g离心30分钟以去除细胞碎片。然后通过BCA蛋白测定确定蛋白浓度。对于每个样品，将蛋白质组针对1 ml 中的2 mg/ml归一化。将DMSO和Pin1-3温育的蛋白质组中的每一个在室温下用100 µM碘乙酰胺炔处理1小时。将DMSO和Pin1-3温育的蛋白质组中的每一个在室温下用100µM碘乙酰胺炔烃处理1小时。然后使蛋白质组与1 mM CuSO4、100 μM TBTA (三((1-苄基-4-三唑基)甲基)胺)配体、100 μM生物素-酸-N3标签和1 mM TCEP (三(2-羧乙基)膦)反应1小时。点击反应之后，蛋白质组以8000 g离心5分钟，并然后使用冷甲醇将沉淀的蛋白洗涤两次。将蛋白质组重悬于1.2% SDS/PBS中并稀释至0.2% SDS/PBS。最后，根据Yang等人 [Anal Chem 2018, 90:9576-9582]所述的程序制备样品，在LC-MS/MS上进行分析和量化。简而言之，洗涤来自胰蛋白酶消化的珠粒并重悬于100 µl TEAB缓冲液中。将8 µl 4% D13CDO或HCHO分别添加至Pin1-3或DMSO样品中。同时，加入8 μl 0.6 M NaBH3CN并在室温下持续反应2小时。然后再次洗涤珠粒并通过2%甲酸裂解修饰的肽。LC-MS/MS数据通过ProLuCID™算法(如Xu等人[J Proteomics 2015, 129:16-24]所述)在对半胱氨酸的静态修饰(+57.0215Da)和甲硫氨酸的可变氧化(+15.9949 Da)的情况下进行分析。同位素修饰(轻和重标记分别为+28.0313和+34.0631 Da)设置为肽的N-末端和赖氨酸上的静态修饰。半胱氨酸上的可变修饰设置为+322.23688 Da。通过CImage™软件[Weerapana等人, Nature 2010, 468,790-795]量化比率。
神经母细胞瘤的斑马鱼模型：
斑马鱼用于儿童神经母细胞瘤模型，其中在斑马鱼外周交感神经系统(PSNS)中使用多巴胺β羟化酶(dβh)启动子组织特异性过度表达人类MYCN转基因驱动斑马鱼的神经母细胞瘤肿瘤发生[Zhu等人,Cancer Cell 2012, 21:362-373]。该鱼也为PSNS特异性dβh:EGFP报告基因系的转基因，因此肿瘤可通过EGFP目视化。在该模型中，交感神经母细胞的过度增殖在受精后4天(4 dpf)开始，在肾内腺(肾上腺髓质的对应部分)中明显。
将3 dpf的斑马鱼胚胎用不同浓度的测试化合物在卵水(反渗透或RO水，含有0.6gm/升速溶海盐(instant ocean salt))中处理4天。2天之后(5 dpf)将胚胎转移至含有新鲜稀释的药物的卵水中。然后在7 dpf对胚胎进行成像，并对每个实验组的EGFP+MYCN过度表达神经母细胞的相对横截面积进行量化。
Pin1的表达和纯化：
在存在50 mg/ml卡那霉素的情况下，在LB培养基中的大肠杆菌BL21 (DE3)中过度表达pET28载体中的全长人类Pin1构建体。细胞在37℃下生长至光密度(OD)为0.8，冷却至17℃，用500 μM异丙基-1-硫代-D-吡喃半乳糖糖苷诱导，在17℃下温育过夜，通过离心收集并储存于-80℃下。在缓冲液A (50 mM HEPES (pH 7.5)、500 mM NaCl、10%甘油、20 mM咪唑和7 mM BME)中对细胞沉淀进行超声处理，并将所得裂解物以30,000 xg离心40分钟。将Ni-NTA珠粒(Qiagen)与裂解物上清液混合30分钟，并用缓冲液A洗涤。将珠粒转移至FPLC相容性柱上，并用15%缓冲液B (50 mM HEPES (pH 7.5)、500 mM NaCl、10%甘油、250 mM咪唑和3mM BME)洗涤结合的蛋白且用100%缓冲液B洗脱。将凝血酶加入到洗脱的蛋白中，并在4℃下温育过夜。将样品浓缩并在含有20 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、5%甘油和1 mM TCEP的缓冲液中通过Superdex™ 200 10/300柱(GE Healthcare)。合并级分，浓缩至约37 mg/ml并在-80℃下冷冻。
Pin1结晶和浸泡：
最终浓度为1 mM的Apo蛋白在以下结晶缓冲液中通过沉滴(200 nL + 200 nL)蒸气扩散在20℃下结晶：3 M NH4SO4、100 mM HEPES (pH7.5)、150 mM NaCl、 1% PEG400和10mM DTT。将200 nL体积的1 mM Pin1-3直接添加到晶体中以在20℃下浸泡16小时。在液氮中快速冷冻之前，将晶体短暂转移至含有25%甘油的结晶缓冲液中。
结晶数据收集和结构测定：
在阿贡国家实验室先进光子源(the Advanced Photon Source at the ArgonneNational Laboratory)的NE-CAT光束线24ID-C处收集来自复合晶体的衍射数据。如Kabsch[Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2010, 66:125-132]所述，使用XDS对数据集进行整合和缩放。如McCoy等人 [J Appl Crystallogr 2007, 40:658-674]所述，使用Phaser™程序和搜索模型PDB条目1PIN，通过分子置换解析结构。使用Phenix [Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2010, 66:213-221]和Coot [Emsley & Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2004, 60:2126-2132]进行迭代手动模型构建和细化，产生具有出色统计的模型。
晶体结构的结晶条件和数据收集和细化统计如下：
RCSB登记代码：6VAJ
数据收集(使用单晶收集每种报告结构的数据)：
空间群-P 43 21 2
晶胞尺寸-a、b、c (Å) 48.96 48.96 137.04
a, b, g (°) 90.00 90.00 90.00
分辨率(Å)-39.84-1.42 (1.471-1.42) (括号中的数值适用于最高分辨率壳层)
R pim-0.01849 (0.5658)
冗余-6.2 (6.3)
完整性(%)-99.38 (99.72)
I/σI-17.67 (1.54)
结构解析：
用于分子置换的PDB条目-1PIN
细化：
反射数-32262 (3163)
R work-0.1923 (0.3278)
R free-0.2144 (0.3227)
原子数-1384
大分子-1229
配体/离子-23
水-132
B因子-31.41
大分子-30.11
配体/离子-50.67
水-40.23
R.m.s.偏差
键长(Å) - 0.006
键角(°)-1.19
Ramachandran：
优选-100.0%
允许-0.0%
不允许0.0 %
NMR光谱：
在配备有QNP探针的Bruker Avance™ 300 MHz和400 MHz光谱仪上获得通过1H-和13C-NMR进行的光谱分析。化学位移(δH &δC)以ppm为单位引用，精确到0.1 ppm，并参考三甲基硅烷(TMS)。偶合常数(J)以赫兹(Hz)为单位报告，精确到0.1 Hz。
实施例1
通过共价片段筛选鉴定Pin1结合化合物
如Resnick等人 [J Am Chem Soc 2019, 141:8951-8968]所述，含有752种氯乙酰胺和241种丙烯酰胺的993个亲电片段的文库针对Pin1进行筛选，以鉴定适合于开发有效和选择性Pin1抑制剂的亲电骨架。亲电片段充当轻微反应性的“弹头”，其能够不可逆地结合靶蛋白中的半胱氨酸。
Pin1的纯化的催化结构域与片段文库一起温育(2 µM蛋白，200 µM化合物；4℃下24小时)，然后进行完整蛋白液相色谱/质谱(LC/MS)以鉴定和量化化合物标记。图1描绘以该方式鉴定的化合物的实例。
如图2所示，在测定条件下，111个片段以> 50%不可逆地标记Pin1 (11.2%的命中率)。
如图2、图3和以下表1所示，48个最有效的命中(标记> 75%)包括9种氯乙酰胺，其共享共同的环砜部分，表明结构活性关系(SAR)。
由于在先前针对10种蛋白的不同小组的片段筛选中鉴定出的含砜命中为非混杂的[Resnick等人, J Am Chem Soc 2019, 141:8951-8968]，因此选择这些化合物进行进一步研究。为避免因2-环丁烯砜片段中存在另外的迈克尔受体而产生不期望的反应性，在该阶段仅使用环丁砜类似物。
表1：通过筛选发现的包含环砜部分的Pin1结合化合物(图3中所示的结构)-在4℃下将2 μM Pin1与200 μM测试化合物一起温育24小时之后，经完整蛋白LC/MS测定的标记百分比
化合物 标记[%]
PCM-0102372 100
PCM-0102760 100
PCM-0102539 100
PCM-0102579 100
PCM-0102868 100
PCM-0102230 87
PCM-0102105 85
PCM-0102755 83
PCM-0102313 83
PCM-0102178 72
PCM-0102832 72
PCM-0103082 69
PCM-0102138 56
PCM-0102896 42
实施例2
选择性Pin1结合化合物
DOCKovalent [London等人, Nat Chem Biol 2014, 10:1066-1072]用于生成对接预测，以便可视化与在Pin1的活性位点中的Cys113的可能结合模式。根据实施例1鉴定的所有环丁砜命中被对接到各种Pin1结构中并检查排名靠前的姿势。
如图4所示，通过示例性化合物与Pin1的对接预测两种可能的结合模式。在两种姿势中，环丁砜部分或亲脂部分(图2式中的R)：(i)突出到主要由Met130、Gln131和Phe134形成的疏水性脯氨酸结合口袋中，或(ii)与由Ser115、Leu122和Met130形成的邻近Cys113的疏水补丁相互作用。
这些结果表明可通过亲脂性残基的多样化来优化非共价结合亲和力。
基于对接预测，合成或购买了总共26种特征为一系列小或大脂肪族、芳族、联苯或杂环侧链的化合物(结构如图5所示)。为了鉴定有效的结合剂，在更严格的条件下，在蛋白与化合物的比率为1:1 (2 µM化合物；室温下1小时)的情况下，评价这些第二代化合物以及初始筛选命中的不可逆标记效率。
如表2所示，26种测试的第二代化合物中有25种表现出比初始命中更好的标记，初始命中在这些新条件下没有表现出标记。带有环己基残基的Pin1-2-3显示出最高的标记程度(65%)。另外，耐受了广泛范围的亲脂部分。
表2：示例性Pin1结合化合物(图3和5中所示的结构)-在室温下将2 μM Pin1与2 μM测试化合物一起温育1小时之后，经完整蛋白LC/MS确定的标记百分比
化合物 标记[%] 反应性k[M<sup>-1</sup>*秒<sup>-1</sup>] 反应性Log k
Pin1-18 n.d. 1.69E-08 -7.77
Pin1-2-3 65 1.53E-07 -6.82
Pin1-2-8 52 2.19E-07 -6.66
Pin1-2-1 50 1.09E-07 -6.96
Pin1-3 48 3.73E-08 -7.43
Pin1-3-13 46 1.50E-07 -6.82
Pin1-3-9 46 3.42E-07 -6.47
Pin1-433 45 2.13E-07 -6.67
Pin1-2-9 43 7.68E-08 -7.11
Pin1-2-7 37 1.02E-07 -6.99
Pin1-3-7 36 1.12E-07 -6.95
Pin1-2-6 30 1.58E-07 -6.80
Pin1-053 28 1.24E-07 -6.91
Pin1-2-2 27 8.06E-08 -7.09
Pin1-3-14 27 7.03E-08 -7.15
Pin1-437 27 1.51E-07 -6.82
Pin1-128 25 1.47E-07 -6.83
Pin1-2-10 25 1.30E-07 -6.89
Pin1-2-5 24 1.31E-07 -6.88
Pin1-3-8 23 8.22E-08 -7.09
Pin1-3-15 21 7.77E-08 -7.11
Pin1-2-11 19 1.15E-07 -6.94
Pin1-838 16 1.41E-07 -6.85
Pin1-028 16 1.59E-07 -6.80
Pin1-324 12 1.59E-07 -6.80
Pin1-707 0 1.17E-09 -8.93
PCM-0102138 0 1.20E-07 -6.92
PCM-0102178 0 1.30E-07 -6.89
PCM-0102105 0 1.10E-07 -6.96
PCM-0102832 0 6.02E-08 -7.22
PCM-0102313 0 1.07E-07 -6.97
PCM-0102760 0 1.00E-07 -7.00
PCM-0102755 0 1.54E-07 -6.81
PCM-0102230 0 8.87E-08 -7.05
如图7和表2所示，化合物PCM-0102832、PCM-0102313、PCM-0102760和PCM-0102755分别对应于Pin1-3-13、Pin1-3-14、Pin1-2-3和Pin1-437，没有与酰胺基团的氮相邻的亚甲基；并且在测试条件下没有表现出标记，而Pin1-3-13、Pin1-3-14、Pin1-2-3和Pin1-437在这种条件下各自表现出显著的标记。
这些结果表明酰胺和亲脂性侧链之间的另外亚甲基与标记效率的增加强烈相关，因为缺乏该基团的4个匹配分子对没有表现出标记。
表 3：示例性Pin1结合化合物(图5和8中所示的结构)-在室温下将2 μM Pin1与2μM测试化合物一起温育15分钟之后，经完整蛋白LC/MS确定的标记百分比
化合物 标记[%] 反应性k[M<sup>-1</sup>*秒<sup>-1</sup>] 反应性Log k
P1-01-B11 89 1.37E-07 -6.86
P1-03-G07 73 1.37E-06 -5.86
P1-02-H08 73 1.32E-06 -5.88
P1-03-C04 72 3.78E-07 -6.42
P1-02-E11 70 1.04E-06 -5.98
P1-04-B02 69 1.73E-06 -5.76
P1-01-G10 67 1.20E-07 -6.92
P1-01-F08 64 1.32E-06 -5.88
P1-02-B04 62 1.26E-06 -5.90
P1-03-D08 54 1.20E-06 -5.92
P1-01-B05 51 1.51E-06 -5.82
P1-02-B12 47 1.34E-06 -5.87
P1-03-A12 44 1.48E-06 -5.83
Pin1-2-3 42 1.53E-07 -6.82
P1-01-F11 39 6.81E-07 -6.17
P1-03-B04 34 1.66E-06 -5.78
Pin1-3 10 3.73E-08 -7.43
为进一步优化亲脂部分，制备了带有炔烃侧链的类似物，其使用铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)对448种不同的叠氮化物进行衍化。这个448种类似物的文库在严格的测定条件(室温下2 µM化合物15分钟)下以MS标记测定进行测试，以过滤高亲和力结合剂。
37种测试化合物明显比第二代结合剂更快地标记Pin1。来自37种测试化合物中的10种最有效的Pin1结合化合物的结构如图8所示。
如表3所示，P1-01-B11为结合最快的化合物，在15分钟内标记89%的Pin1。
为了估计各种亲脂部分对“弹头”反应性的影响[Flanagan等人, J Med Chem2014, 57:10072-10079; Lonsdale等人, J Chem Inf Model 2017, 57:3124-3137;Dahal等人, Medchemcomm 2016, 7:864-872]，如 Resnick等人 [J Am Chem Soc 2019,141:8951-8968]所述，使用先前应用于整个片段文库的高通量测定评价第二和第三代前10种结合剂的硫醇反应性。简而言之，评估了模型硫醇的二阶速率常数，其反映对硫醇基团的一般反应性的趋势。
如图9所示，在标记效率和反应性之间没有相关性(Pearson R = 0.003)。当比较特征为叔丁基残基的Pin1-3和结构相似的带有环丙基残基的Pin1-3-13 时，这一点特别明显。此外，结合程度最高的化合物Pin1-2-3相对于其他化合物仅表现出中等反应性。
类似地，如图10所示，Pin1-3和Pin1-3-13两者标记Pin1的程度基本上相同(48%和46%)，但其一般反应性变化了一个数量级。
类似地，如图11所示，前10种第三代结合剂的反应性也显著变化。
这些结果表明，所鉴定的化合物的结合代表与Pin1的特异性相互作用，而非非特异性反应性。
实施例3
非细胞毒性Pin1抑制
经由使用FITC标记的底物模拟肽抑制剂的荧光偏振(FP)竞争测定以及胰凝乳蛋白酶偶联的PPIase测定，使用Wei等人[Nat Med 2015, 21:457-466]所述的程序，证实Pin1的共价标记转化为酶抑制。
如图12、图13和表4所示，化合物Pin1-3和Pin1-3-13显示出类似的Pin1抑制(底物测定：103 nM；荧光偏振测定：110 nM相对于121 nM)。
如图13进一步所示，所有测试的Pin1结合化合物在FP测定中的竞争至少与已知的Pin1抑制剂胡桃醌差不多。
表4：示例性Pin1结合化合物(图3中所示的结构)及其标记百分比(如由LC/MS确定)、表观Ki (如由FP测定确定)、IC50、EC50 (如由细胞活力测定用MDA-MB-231细胞确定)和反应性(如由DTNB测定确定)-Pin1-3-AcA和胡桃醌分别作为非反应性和反应性对照
化合物 标记[%] Ki (表观)[nM] IC<sub>50</sub>[nM] 反应性k[M<sup>-1</sup>*秒<sup>-1</sup>] Log k EC<sub>50</sub>[µM]
Pin1-2-3 65 46 n.d. 1.53E-07 -6.82 7.5
Pin1-2-8 52 133 n.d. 2.19E-07 -6.66 5.1
Pin1-2-1 50 58 n.d. 1.09E-07 -6.96 2.8
Pin1-3 48 110 103 3.73E-08 -7.43 >25
Pin1-3-13 46 121 n.d. 1.50E-07 -6.82 n.d.
Pin1-3-9 46 411 n.d. 3.42E-07 -6.47 n.d.
Pin1-433 45 40/194 n.d. 2.13E-07 -6.67 8.9
Pin1-2-9 43 83 n.d. 7.68E-08 -7.11 11.3
Pin1-2-7 37 39 n.d. 1.02E-07 -6.99 6.1
Pin1-2-6 30 194 n.d. 1.58E-07 -6.80 5.6
Pin1-3-AcA n.d. >100000 n.d. n.d. n.d. n.d.
胡桃醌 n.d. 1750 n.d. n.d. n.d. n.d.
荧光偏振测定以剂量依赖性和时间依赖性方式进行，以进一步表征Pin1-3与Pin1结合的动力学参数。
如图14A和14B所示，Pin1-3的Kinact通过荧光偏振测定确定为0.03 min-1，并且Kinact/Ki (表观)比率为令人印象深刻的29,000M-1秒-1。
如图15所示，Pin1-3表现出标记效率和低反应性的组合。
类似地，如图16所示，P1-01-B11也表现出标记效率和低反应性的组合。
这些表明Pin1-3 (第二代)和 P1-01-B11 (第三代)尤其不太可能导致脱靶活性。因此，Pin1-3和P1-01-B11被选为先导抑制剂，因为先前的研究表明，高弹头反应性会导致非特异性结合，从而导致脱靶细胞毒性[Ward等人, J Med Chem 2013, 56:7025-7048;Planken等人, J Med Chem 2017, 60:3002-3019; Cheng等人, J Med Chem 2016, 59:2005-2024]。
还在针对IMR90肺成纤维细胞的活力测定中测试了示例性Pin1结合化合物的非选择性细胞毒性。
如表4进一步所示，细胞活力测定证实Pin1-3为毒性最小的化合物，EC50值高于25µM，而其他测试化合物则表现出细胞毒性作用，EC50值在2.8 µM-11.3 µM的范围内。
这些数据表明Pin1-3具有测试的最好Pin1结合化合物的最低固有反应性，并且不表现出非选择性细胞毒性，因此显示出特别良好的效力和选择性平衡。
实施例4
Pin1与示例性Pin1结合化合物的晶体结构
以1.4Å分辨率确定了与Pin1-3复合的Pin1的共晶结构，以证实Cys113为Pin1-3的共价靶标并再次深入了解其结合模式。
如图17所示，与活性位点结合的Pin1-3与催化性Cys113形成共价键，这在2FO-FC省略图中作为连续电子密度清晰可见。
如图18和19所示，环丁砜环占据由Met130、Gln131、Phe134、Thr152和His157形成的疏水性Pro结合口袋，并且磺酰基氧介导与Q131的骨架酰胺和His157的咪唑NH的氢键。
如图19所示，上述氢键类似于三氧化二砷与Pin1结合中所特有的那些，如Kozono等人 [Nat Commun 2018, 9:3069]所述。
如图18和19进一步所示，Pin1-3的叔丁基覆盖由Ser115、Leu122和Met130形成的疏水补丁。这种浅疏水界面使叔丁基大部分为溶剂暴露的，并解释了优化工作期间在该位置处接受的广泛范围的疏水部分。
总体而言，以上结果表明，Pin1-3尽管为一种小配体(重原子计数：17，cLogP：0.36，LLE [Leeson & Springthorpe, Nat Rev Drug Discov 2007, 6:881-890] =7.34)，但即使在没有荷负电部分的情况下也能有效地利用Pin1的活性位点与磷酸结合口袋相互作用[Zhang等人, ACS Chem Biol 2007, 2:320-328]。因此，Pin1-3克服了先前开发的Pin1抑制剂的细胞渗透性问题，这些抑制剂通常为高度阴离子的[Guo等人,Bioorganic Med Chem Lett 2009, 19:5613-5616; Dong等人, Bioorganic Med Chem Lett 2010, 20:2210-2214; Guo等人, Bioorganic Med Chem Lett 2014, 24:4187-4191]。
实施例5
选择性抑制细胞中的Pin1
为了评价细胞中Pin1-3的靶标接合，开发了一种用于活细胞竞争和下拉实验的脱硫生物素探针。基于实施例4中讨论的Pin1-3的共晶结构，大部分溶剂暴露的叔丁基被鉴定为Pin1-3的标记类似物(命名为Pin1-3-DTB，如图20所示)中PEG连接的脱硫生物素部分的最合适位点。重要的是，这种修饰不会减小叔丁基部分的体积，并因此探针应保持低反应性特征。
如图21所示，Pin1-3-DTB表现出与Pin1-3相似的效力(表观Ki=38 nM (在测试条件下)，如通过荧光偏振测定法测定的)。
为了评价Pin1-3的细胞渗透性及其接合细胞Pin1的能力，PATU-8988T细胞用Pin1-3 (0.25-1 µM)处理5小时。细胞裂解之后，将裂解物与Pin1-3-DTB (1 µM，4℃下1小时)一起温育，并用链霉亲和素珠粒下拉探针标记的靶标。
如图22所示，在仅温育1小时之后就观察到1 μM Pin1-3-DTB的完全下拉。
如图24所示，Pin1-3表现出对Pin1-3-DTB下拉的剂量依赖性抑制，如通过洗脱蛋白的Western印迹确定的，在1 μM的浓度下观察到最大竞争。相比之下，阴性对照Pin1-3-AcA没有表现出竞争。
如图23所示，用固定的Pin1-3浓度(1 μM)但以不同的温育时间(30分钟-4小时)进一步温育表明Pin1结合在细胞中快速发生(4小时内完全接合，2小时之后约50%接合)。
如图25所示，Pin1-3在PATU-8988T细胞中保持与Pin1显著接合长达72小时。
如图26所示，Pin1-3在IMR32细胞中表现出与Pin1类似的接合。
在 HCT116和MDA-MB-231细胞中也观察到Pin1-3与Pin1类似的接合(数据未显示)。
然后使用Pin1-3-DTB评价Pin1-3对Pin1的体内接合。通过口服管饲法(QD)用媒介物、10 mg/kg或20 mg/kg Pin1-3治疗小鼠3天，然后裂解脾脏进行竞争下拉实验。
如图27所示，在用10 mg/kg Pin1-3治疗的3只小鼠中的1只和用20 mg/kg Pin1-3治疗的所有3只小鼠中观察到Pin1-3有效的Pin1接合，靶点接合通过失去、Pin1-3-DTB介导的下拉监测。
基于这些结果，选择40 mg/kg剂量进行进一步的小鼠实验，以确保Pin1完全接合。
这些结果表明Pin1-3在体外和体内两者均有效地接合细胞中的Pin1。
为了分析Pin1-3的选择性，进行共价抑制剂靶标位点识别(CITe-Id)实验[Browne等人, J Chem Soc 2019, 141, 191-203]，如图28所示。
该化学蛋白质组学平台使得能够在全蛋白质组规模上鉴定和量化共价抑制剂与半胱氨酸残基的剂量依赖性结合。在该竞争实验中，将活的PATU-8988T细胞与Pin1-3(100、500或1000 nM)一起温育5小时，然后进行细胞裂解并与Pin1-3-DTB (2 µM)共温育18小时。在胰蛋白酶消化和亲和素富集后，通过鸟枪LC-MS/MS分析DTB修饰的肽。
如图29和30所示，在PATU-8988T细胞中通过Pin1-3-DTB标记的162个半胱氨酸残基中，只有Pin1 Cys13表现出剂量依赖性竞争(与中位数相差多于2 个标准偏差)表现出剂量依赖性竞争，表明Pin1-3的显著选择性。
为了进一步分析Pin1-3的选择性，如图31示意性所示，使用Yang等人[Anal Chem 2018, 90:9576-9582]所述的程序进行rdTOP-ABPP实验以在整个蛋白质组中分析其半胱氨酸靶标。
isoTOP-ABPP技术的这种变体使得能够通过无标记共价抑制剂对半胱氨酸结合进行位点特异性量化。简而言之，将MDA-MB-231细胞用Pin1-3处理，裂解并用生物正交碘乙酰胺-炔烃探针标记，然后通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)与可裂解的生物素标签缀合。在珠粒上富集之后，肽通过三重还原性二甲基化进行同位素衍生化，裂解并经LC-MS/MS分析进行分析。
如图32所示，Pin1的Cys113被鉴定为在MDA-MB-231细胞中在生物学相关浓度(5 μM)下被Pin1-3标记的排名最靠前的半胱氨酸，两个生物学重复的竞争比率R = 15，而所有其他鉴定的半胱氨酸均表现出R值低于2.5。在实验中鉴定出的2134个半胱氨酸中，只有两个半胱氨酸显示轻/重比> 2.5。其中，一个半胱氨酸没有重复，并且只有Pin1 C113在两个重复中显示出15的最大比率。
综上所述，以上结果表明Pin1-3具有精细的选择性特征，在不同细胞系中使用独立的化学蛋白质组学技术证实了这一点，使其高度适合于在细胞和体内抑制Pin1。
实施例6
Pin1结合化合物在癌细胞中的作用
为了分析Pin1-3的抗增殖活性，将化合物提交给PRISM平台(Broad Institute)以评估其对300个悬浮和造血人类癌细胞系的效力。PRISM方法使得可对细胞系混合物进行高通量、合并筛选，每个细胞系均标有24个核苷酸的条形码[Yu等人, Nat Biotechnol 2016,34:419-423]。在分析的所有300个癌细胞系中，Pin1-3在5天处理之后表现出有限的至没有抗增殖活性，IC50值> 3 µM。这一结果与初始细胞毒性筛选以及来自癌症依赖性图谱(Cancer Dependency Map) (Broad Institute)的数据一致，其中Pin1在数百个癌细胞系的CRISPR-Cas9和RNAi筛选中未被鉴定为显著的遗传依赖性(www[dot]depmap[dot]org/portal/)。这表明先前发表的Pin1抑制剂(比如胡桃醌)的强烈单药细胞毒性可能归因于脱靶。
然后评价Pin1-3处理在延长处理(6-8天)之后诱导更显著的抗增殖作用的能力。为了确保在实验期间保持靶标接合，每 48小时在新鲜培养基中补充Pin1-3。
Pin1结合化合物对8988T胰腺腺癌细胞的作用通过将细胞与1 µM Pin1-3一起温育，并相对于单独与媒介物(DMSO)一起温育的细胞评估细胞生长来评价。为了证实Pin1-3的作用由Pin1介导，使用Pin1敲除细胞重复实验。
如图33所示，1 μM的Pin1-3在6-8天之后以统计上显著的方式降低胰腺癌细胞的活力。
如图34所示，1 μM的Pin1-3对Pin1敲除细胞的活力没有显著影响(尽管在第8天，小差异为统计学显著的(p < 0.01))，表明Pin1-3的抑制作用主要由Pin1调节介导。
图35证实Pin1敲除细胞确实缺乏Pin1表达。
如图36-38所示，Pin1-3表现出对PC3前列腺癌细胞(图36)、Kuramochi卵巢癌细胞(图37)和MDA-MB-468乳腺癌细胞(图38)的长期抑制，在MDA-MB-468细胞中观察到最显著的效果。
由于三维(3D)类器官模型可比单层细胞培养更好地反映体内结果[Baker等人,Trends Cancer Res 2016, 2:176-190]，PATU-8988T中Pin1-3的抗增殖活性在于Matrigel™液滴中生长为类器官的野生型或Pin1敲除细胞中进一步评估。细胞用Pin1-3 (或Pin1-3-AcA 或媒介物作为对照)处理9天，每3天补充培养基中的化合物。
如图39所示，Pin1-3在野生型8988T胰腺癌细胞中显著减缓类器官的生长，但对Pin1敲除的胰腺癌细胞没有影响，并且失活的Pin1-3-AcA对照对两种类型细胞中的任一种均没有影响。观察到的野生型和Pin1敲除细胞之间的差异指示在靶表型。
以上结果表明本文所述的Pin1结合化合物可在广泛种类的癌细胞抑制癌细胞生长，尤其是通过在延长处理之后影响细胞活力进行(例如与以短时间尺度诱导增殖缺陷相反)。
实施例7
Pin1结合化合物对Myc转录的作用
为了测试Pin1-3是否影响Myc转录输出，用Pin1-3 (1 μM)或媒介物(DMSO)处理Mino B细胞6小时(一式三份)，然后进行全局RNA测序分析以检测由于这种扰动而差异表达的基因。
如图40所示，发现206个基因显著下调。
针对通过ChIP-seq (染色质免疫沉淀然后测序)对各种转录因子鉴定的基因数据集，如Kuleshov等人 [Nucleic Acids Res 2016, 44:W90-W97]所述，使用Enrichr对这些基因进行基因集富集分析。
如图41所示，K562细胞和HeLa-S3细胞中的Myc靶基因分别显示为最富集的集和第三富集的集(调整后的p值分别为1.99x10-16和2.00x10-13)，确证了Pin1-3显著下调Myc的转录特征。
这些结果表明本文所述的Pin1结合化合物可显著下调Myc转录。
实施例8
Pin1结合化合物在神经母细胞瘤模型中的作用
Pin1结合细胞对神经母细胞瘤细胞的作用使用上文材料和方法部分中所述的程序，使用神经母细胞瘤的斑马鱼胚胎模型进行评价。神经母细胞瘤为一种源自外周交感神经系统(PSNS)的儿科恶性肿瘤。在正常斑马鱼胚胎的发育期间，神经嵴来源的PSNS神经母细胞在受精后3-7天(3-7 dpf)龄时形成原始颈上神经节(SCG)和肾内腺(IRG)，并且可使用dβh:EGFP荧光报告基因可视化[He等人, Elife 2016, 5]。在Tg(dβh:MYCN; dβh:EGFP)转基因斑马鱼的PSNS中，为大约20%人类高风险神经母细胞瘤的致癌驱动因素的MYCN癌基因过度表达导致鱼发展神经母细胞增生(如例如图42所示)，其快速进展为完全转化的肿瘤，忠实地类似于人类高风险神经母细胞瘤[Zhu等人, Cancer Cell 2012, 21:362-373; He等人, Elife 2016, 5; Zimmerman等人, Cancer Discov 2016, 8:320-335]。
如图42和43所示，Pin1-3在卵水中于25-100 μM的浓度下以剂量依赖性方式在3-7dpf的4天时间内抑制MYCN过度表达的PSNS神经母细胞的过度增殖。如其中进一步所示，在用100 µM浓度的药物处理4天之后，表达EGFP的PSNS细胞的横截面与没有过度增殖的对照的横截面无法区分。
另外，在用上述浓度的Pin1-3处理的胚胎中没有观察到毒性证据，进一步表明Pin1-3在体内被健康组织良好耐受。
MYCN为极少数在该斑马鱼模型中过度表达时可引发神经母细胞瘤的基因之一。大约70-80%在第7天具有过度增殖性PSNS神经母细胞的过度表达MYCN的鱼，将在7周龄时发展为完全转化的神经母细胞瘤。
然后在移植的斑马鱼胚胎中构建的原发性肿瘤来源的同种异体移植(PDA)模型中在体内基于完全转化的神经母细胞瘤细胞的维持来评价Pin1-3的抗肿瘤活性。从4个月大的Tg(dβh:MYCN; dβh:EGFP)供体斑马鱼中解剖出EGFP标记的神经母细胞瘤细胞，解聚、计数并将200-400个GFP标记的肿瘤细胞静脉内注射到2 dpf斑马鱼胚胎的居维叶氏管(总主静脉)中[He等人, J Pathol 2012, 227:431-445]。注射一天之后，将100 μM Pin1-3或DMSO 对照添加到含有带有移植的EGFP标记的神经母细胞瘤细胞的胚胎的养鱼用水中。5天后，对经处理的胚胎中EGFP标记的肿瘤团块的面积进行量化。
如图44和45所示，经DMSO处理的胚胎中的肿瘤团块在处理的5天内变大，而经Pin1-3处理的胚胎中的肿瘤团块尺寸减小，表明Pin1-3不仅可抑制MYCN驱动的神经母细胞瘤引发，而且还抑制完全转化的原发性神经母细胞瘤肿瘤细胞移植物的体内生长和存活。
因此，以上结果表明本文所述的Pin1结合化合物可抑制神经母细胞瘤(NB)的引发，特别是与MYCN表达相关的NB的引发。
实施例9
示例性Pin1结合化合物的药代动力学和药效学
以小鼠模型评价示例性化合物Pin1-3的药代动力学和药效学。Pin1-3在小鼠肝微粒体中表现出令人鼓舞的代谢稳定性(T1/2 = 41分钟)。
雄性C57BI/6J小鼠静脉内(作为5/5/90 NMP/Solutol/盐水中的0.2 mg/ml溶液)或口服(作为5/5/90 NMP/Solutol/盐水中的1 mg/ml 溶液)接受Pin1-3。静脉内剂量为2mg/kg和口服剂量为10 mg/kg。
结果概述于表5和6中。
表5：静脉内给予2 mg/kg Pin1-3后在3只小鼠中测定的药代动力学/药效学参数(obs. = 观察到的，extrap. = 外推的)。
Figure 961356DEST_PATH_IMAGE021
表 6：口服给予10 mg/kg Pin1-3后在3只小鼠中测定的药代动力学/药效学参数(obs. = 观察，extrap. = 外推)。
Figure 911995DEST_PATH_IMAGE022
如表6所示，口服给予10 mg/kg Pin1-3导致平均Cmax为11.47 µM，和口服生物利用度(F%)为30.42，表明Pin1-3适合于口服体内给药。
然后以急性毒性模型评估Pin1-3的毒性。小鼠每天腹膜内注射10、20或40 mg/kgPin1-3，持续两周。没有记录到不利作用，体重正常，并且尸检没有发现病理学。
这些结果表明Pin1-3表现出适合于体内使用(包括口服给予)的药代动力学和无毒性。
实施例10
Pin1敲除表型的表型复制
Phan等人[Nat Immunol 2007, 1132-1139]报道说，由于BCL6水平升高，Pin1-/-小鼠响应免疫而显示出明显更大的生发中心。
用沉淀于铝佐剂(alum)中的与半抗原4-羟基-3-硝基苯基乙酰基偶联的OVA (NP-OVA)对12只野生型小鼠进行免疫。在免疫后第7和第9天，给小鼠注射两剂Pin1-3 (IP；40mg/kg)或媒介物，并在第11天处死小鼠，且通过流式细胞术评价淋巴结中的生发中心大小。
如图46A和46B所示，经Pin1-3治疗的小鼠表现出明显更大的生发中心。
鉴于Phan等人[Nat Immunol 2007, 1132-1139]，这些结果证实Pin1-3对Pin1的抑制。
实施例11
示例性的Pin1结合化合物在另外癌症模型中的作用
胰腺导管腺癌(PDAC)细胞(源自人类患者)用Pin1-3处理3天。PDAC类器官用Pin1-3处理7天(第7天至第14天)。
如图47和48所示，Pin1-3以剂量依赖性方式抑制PDAC细胞的肿瘤生长。
如图49所示，Pin1-3以剂量依赖性方式减少PDAC细胞中的Pin1，表明诱导了Pin1降解。
如图50和51所示，Pin1-3以剂量依赖性方式抑制PDAC类器官生长。
将4x2 mm PDX (患者来源的异种移植物)肿瘤移植到NSC小鼠胰腺中(原位异种移植)。移植1周之后，开始用Pin1-3治疗小鼠。用Pin1-3稀释溶液(作为对照)或者2或4 mg/kgPin1-3 (每天4 mg/kg)治疗(IP)小鼠。测量肿瘤大小并在6周之后处死小鼠以收集肿瘤组织(n=5)。
如图52-54所示，Pin1-3以剂量依赖性方式抑制小鼠的PDX肿瘤生长。
将106 KPC (KrasLSL.G12D/+; p53R172H/+; PdxCretg/+)小鼠来源的肿瘤细胞移植到B6小鼠胰腺中(原位移植)。移植1周之后，开始用Pin1-3治疗小鼠。用Pin1-3稀释溶液(作为对照)或者每天20或40 mg/kg治疗(IP)小鼠。测量肿瘤大小，并当对照组的肿瘤大小达到2 cm时处死小鼠以收集肿瘤组织(n=4)，且进行Kaplan-Meier生存分析(n=8)。
如图55-57所示，Pin1-3抑制KPC肿瘤生长并提高小鼠的存活率。
这些结果进一步表明Pin1结合化合物可有效地治疗癌症。
实施例12
氯乙酰胺制备
一般程序：
用于制备含有环丁砜的氯乙酰胺类的一般程序如方案1所示：
方案1
Figure 528921DEST_PATH_IMAGE023
将3-氨基环丁砜盐酸盐(1 eq.)加入到三乙胺(TEA) (0.9 eq.)在无水二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液中并在室温下搅拌1小时。然后，将醛(1.1 eq.)和乙酸(0.2 eq.)加入到反应混合物中并在室温下搅拌1小时。然后立即将三乙酰氧基硼氢化钠(STAB) (2.1eq.)加入到混合物中并在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂之后，用饱和NaHCO3水溶液溶解残余物，并用乙酸乙酯(2x)萃取水溶液。合并有机层，经Na2SO4干燥并过滤。蒸发溶剂得到为盐酸盐的仲胺，其无需纯化即用于下一步。使仲胺盐酸盐(1 eq.)溶解于无水DMF中并冷却至0℃。随后，在0℃下滴加2-氯乙酰氯(1.2 eq.)和TEA (1.2 eq.)并搅拌30分钟。然后，使反应混合物达到室温并搅拌1小时。通过添加水在0℃下猝灭反应。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化：在30分钟内线性梯度5 → 95% ACN/H2O + 0.1% TFA，并且冻干得到相应的氯乙酰胺。
2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-新戊基乙酰胺(Pin1-3)的制备：
使用以上一般程序，制备示例性的化合物Pin1-3 (2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-新戊基乙酰胺)，如方案2所示：
方案2
Figure 881405DEST_PATH_IMAGE024
将3-氨基环丁砜盐酸盐(100 mg, 0.583 mmol, 1 eq.)加入到三乙胺 (TEA)(73.1 µl, 0.524 mmol, 0.9 eq.)在无水二甲基甲酰胺(DMF) (1.4 ml)中的溶液中并在室温下搅拌1小时。然后，将新戊醛(69.6μl，0.641mmol，1.1 eq.)和乙酸(6.67μl，0.117mmol，0.2 eq.)加入到反应混合物中并在室温下搅拌1小时。然后立即将三乙酰氧基硼氢化钠(STAB) (259 mg，1.223 mmol，2.1 eq.)加入到混合物中并在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂之后，用饱和NaHCO3水溶液(0.5 ml)溶解残余物，并用乙酸乙酯(2x1 ml)萃取水溶液。合并有机层，经Na2SO4干燥并过滤。蒸发溶剂得到为白色固体的仲胺化合物1 (86.2 mg，0.42mmol，72% (粗品产物))，其无需纯化即用于下一步。
使作为盐酸盐的化合物1 (100 mg, 0.487 mmol, 1 eq.)溶解于无水DMF (1 ml)中并冷却至0℃。随后，在0℃下滴加2-氯乙酰氯(46.8 µl, 0.584 mmol, 1.2 eq.)和TEA(81 µl, 0.584 mmol, 1.2 eq.)并搅拌30分钟。然后，使反应混合物达到室温并搅拌2小时。通过添加水(2 ml)在0℃下猝灭反应。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行Pin1-3的纯化：tR = 16分钟，在30分钟内线性梯度5 → 95% ACN/H2O + 0.1% TFA，并且冻干得到为白色粉末的氯乙酰胺Pin1-3(59.83 mg, 0.212 mmol, 43.6% (最后一步)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 4.11 (d, J=5.50 Hz, 2 H), 3.89 - 4.00 (m,1 H), 3.66 - 3.78 (m, 2 H), 3.25 - 3.34 (m, 1 H), 3.10 - 3.20 (m, 2 H), 3.00- 3.09 (m, 1 H), 2.47 - 2.61 (m, 2 H), 1.03 (s, 9 H) ppm。
13C (126 MHz, CDCl3): δ = 168.0, 62.4, 57.6, 50.3, 49.0, 42.1, 33.6,28.0, 26.6 ppm。
MS (ESI): C11H21ClNO3S+ [M+H+]的m/z理论值: 282.10; 实测值282.29。
2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-异丁基乙酰胺(Pin1-3-15) 的制备：
使用以上一般程序，制备示例性的化合物Pin1-3-15 (2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-异丁基乙酰胺)。
Figure 823953DEST_PATH_IMAGE025
将3-氨基环丁砜盐酸盐(90 mg, 0.524 mmol, 1 eq.)加入到三乙胺(TEA) (65.8µl, 0.474 mmol, 0.9 eq.)在无水二甲基甲酰胺(DMF) (1.3 ml)中的溶液中并在室温下搅拌1小时。然后，将异丁醛(57.4µl, 0.629 mmol, 1.2 eq.)、乙酸(6 µl, 0.105 mmol,0.2 eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(STAB) (233 mg, 1.101 mmol, 2.1 eq.)加入到反应混合物中并在室温下搅拌过夜。后处理和蒸发溶剂之后，仲胺(78.18 mg, 0.343 mmol, 65.5% (粗品产物))无需纯化即用于下一步。
将2-氯乙酰氯(33 µl, 0.412 mmol, 1.2 eq.)和三乙胺(57.4 µl, 0.412 mmol,1.2 eq.)滴加入到在无水二甲基甲酰胺(1 ml)中的冷却(0℃)的仲胺盐酸盐(78.18 mg,0.487 mmol, 1 eq.)中并搅拌30分钟，且然后用水(2 ml)淬灭。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行Pin1-3-15的纯化：tR= 14分钟，在30分钟内线性梯度为5 → 95% ACN/H2O + 0.1% TFA，得到为白色粉末的Pin1-3-15 (29.22 mg,0.412 mmol, 31.8 %)。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 4.02 - 4.17 (m, 3 H), 3.67 - 3.76 (m, 1H), 3.62 (dt, J=12.10, 8.80 Hz, 1 H), 3.03 - 3.24 (m, 5 H), 2.44 - 2.58 (m, 2H), 1.93 (dt, J=13.20, 6.60 Hz, 1 H), 0.99 (t, J=6.60 Hz, 6 H) ppm。
13C (126 MHz, CDCl3): δ = 167.0, 58.0, 55.2, 50.5, 49.7, 42.0, 28.4,26.2, 19.9, 19.7 ppm。
MS (ESI): C10H19ClNO3S+ [M+H+]的m/z理论值: 268.08; 实测值268.29。
2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-(环戊基甲基)乙酰胺(Pin1-3-14)的制备：
使用以上一般程序，制备示例性的化合物Pin1-3-14 (2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-(环戊基甲基)乙酰胺)。
Figure 809357DEST_PATH_IMAGE026
将3-氨基环丁砜盐酸盐(100 mg, 0.583 mmol, 1 eq.)和三乙胺(73.1 µl,0.524 mmol, 0.9 eq.)在无水二甲基甲酰胺(DMF) (1.3 ml)中的溶液在室温下搅拌1小时。然后，将环戊烷甲醛(68.4 µl, 0.641 mmol, 1.1 eq.)、乙酸(6.67µl, 0.117 mmol,0.2 eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(STAB) (259 mg, 1.223 mmol, 2.1 eq.)加入到反应混合物中并在室温下搅拌过夜。后处理和蒸发之后，仲胺(95.68 mg, 0.377 mmol, 64.7 %(粗品产物))无需纯化即用于下一步。
将2-氯乙酰氯(36.2 µl, 0.452 mmol, 1.2 eq.)和三乙胺(63.1 µl, 0.452mmol, 1.2 eq.)滴加入到在无水DMF (1 ml)中的冷却(0℃)的仲胺盐酸盐(95.68 mg,0.377 mmol, 1 eq.)中并搅拌30分钟，且然后用水(2 ml)淬灭。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行Pin1-3-14的纯化：tR = 17.5分钟，在30分钟内线性梯度为5 → 95% ACN/H2O + 0.1% TFA，得到为白色粉末的Pin1-3-14 (23.4 mg,0.08 mmol, 21.13% (最后一步))。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 4.11 (m, 3 H), 3.57 - 3.76 (m, 2 H), 3.22- 3.41 (m, 2 H), 3.15 (dd, J=12.10, 8.80 Hz, 1 H), 3.03 - 3.10 (m, 1 H), 2.46- 2.58 (m, 2 H), 2.10 - 2.21 (m, 1 H), 1.78 - 1.94 (m, 2 H), 1.60 - 1.78 (m,4 H), 1.17 - 1.29 (m, 2 H) ppm。
13C (126 MHz, CDCl3): δ = 166.8, 55.3, 55.1, 50.5, 49.7, 42.0, 40.2,30.4, 30.4, 26.3, 24.9, 24.9 ppm。
MS (ESI): C12H21ClNO3S+ [M+H+]的m/z理论值: 294.10; 实测值294.31。
2-氯-N-(环丁砜)-3-基)-N-(环己基甲基)乙酰胺(Pin1-2-3)的制备：
使用以上一般程序，制备示例性的化合物Pin1-2-3 (2-氯-N-(环丁砜-3-基)-N-(环己基甲基)乙酰胺)。
Figure DEST_PATH_IMAGE027
将在无水二甲基甲酰胺(DMF) (1.3 ml)中的3-氨基环丁砜盐酸盐(75 mg, 0.437mmol, 1 eq.)的溶液在室温下搅拌1小时。然后，将环己烷甲醛(58.2 µl, 0.481 mmol,1.1 eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(STAB) (139 mg, 0.655 mmol, 1.5 eq.)加入到反应混合物中并在室温下搅拌过夜。后处理和蒸发之后，仲胺(72.11 mg, 0.269 mmol, 62 % (粗品产物))无需纯化即用于下一步。
将2-氯乙酰氯(24.8 µl, 0.323 mmol, 1.2 eq.)和三乙胺(45 µl, 0.323 mmol,1.2 eq.)滴加入到在无水DMF (0.5 ml)中的冷却(0℃)的仲胺盐酸盐(72 mg, 0.269mmol, 1 eq.)中并搅拌30分钟，且然后用水(2 ml)淬灭。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行Pin1-2-3的纯化：tR = 18.5分钟，在30分钟内线性梯度为5 → 95% ACN/H2O + 0.1% TFA，得到为白色粉末的Pin1-2-3 (9.1 mg,0.030 mmol, 11% (最后一步))。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 4.01 - 4.15 (m, 2 H), 3.68 - 3.75 (m, 1H), 3.62 (dt, J=13.20, 8.80 Hz, 1 H), 3.04 - 3.25 (m, 4 H), 2.43 - 2.58 (m, 2H), 1.66 - 1.85 (m, 5 H), 1.57 (m, 1 H), 1.14 - 1.33 (m, 3 H), 0.90 - 1.03(m, 2 H) ppm。
13C (126 MHz, CDCl3): δ = 167.0, 57.1, 55.3, 50.5, 49.7, 42.0, 38.0,30.9, 30.8, 26.2, 26.1, 25.8 ppm。
MS (ESI): C13H23ClNO3S+ [M+H+]的m/z理论值: 308.11; 实测值308.28。
尽管已经结合其特定实施方案描述了本发明，但显然许多备选、修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，旨在包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这种备选、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均在本文中通过参考以其全部结合至说明书中至如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示为通过参考结合至本文中的程度。另外，本申请中对任何参考文献的引用或标识不应解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，其不应解释为必要限制。
另外，本申请的任何优先权文件特此通过参考以其全部结合至本文中。
Figure IDA0003252690950000011
Figure IDA0003252690950000021

Claims (50)

1.一种用于调节Pin1活性的化合物，其中所述化合物由以下式Ia表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式Ia
其中：
E为能够与所述Pin1的Cys113残基共价结合的亲电部分；
L1为键或连接部分；
虚线代表饱和或非饱和键；
Y和Z各自独立地选自O、S和NH；
R2和Ra-Rc各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，或者当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
n为1、2、3或4。
2.一种用于调节Pin1活性的化合物，所述化合物包含亲电部分和刚性部分，所述刚性部分包含至少一个能够与氢原子形成氢键的官能团，其中所述亲电部分和所述刚性部分经排列使得所述亲电部分能够与所述Pin1的Cys113残基共价结合，和所述刚性部分能够与所述Pin1的Gln131和His 157残基形成氢键。
3.权利要求2使用的化合物，其中所述亲电部分包含卤烷基。
4.权利要求2-3中任何一项使用的化合物，其中所述亲电部分包含卤乙酰胺。
5.权利要求2-4中任何一项使用的化合物，其中所述官能团能够与所述Gln131的骨架酰胺氢和/或与所述His157的咪唑NH形成氢键。
6.权利要求5的化合物，其中所述氢键将所述官能团的原子连接于所述Gln131或所述His157的氮原子，使得所述官能团的所述原子与所述Gln131或所述His157的所述氮原子之间的距离在2.5-3.5 Å的范围内。
7.权利要求2-6中任何一项的化合物，其中所述官能团为氧原子。
8.权利要求2-7中任何一项使用的化合物，其中所述刚性部分包含砜基团。
9.权利要求8使用的化合物，其中所述刚性部分为或包含环丁砜或环丁烯砜。
10.权利要求2-9中任何一项使用的化合物，其进一步包含疏水部分。
11.权利要求10使用的化合物，其中所述疏水部分与Pin1的Ser115、Leu122和/或Met130形成疏水相互作用。
12.权利要求2-11中任何一项使用的化合物，其具有低于500 Da的分子量。
13.权利要求2-12中任何一项的化合物，其由以下式I表示：
E-L1-G(F)m
式I
其中：
E为所述亲电部分；
L1为键或连接部分；
G为所述刚性部分；
F各自为形成所述氢键的所述官能部分；和
m为2、3或4。
14.权利要求13使用的化合物，其由以下式Ia表示：
Figure 67288DEST_PATH_IMAGE002
式Ia
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
Y和Z各自独立地选自O、S和NH；
R2和Ra-Rc各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基，或者当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
n为1、2、3或4。
15.权利要求14使用的化合物，其由以下式Ib表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式Ib
其中：
W选自O、S和NR3；
X为卤代；
Ra-Rc各自为氢；
L1为键或亚烷基；
L2为亚烷基；和
R1和R3各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
16.权利要求14-15中任何一项使用的化合物，其中n为2。
17.权利要求14-16中任何一项使用的化合物，其中Y和Z各自为O。
18.权利要求13-17中任何一项使用的化合物，其中L1为键。
19.权利要求13-18中任何一项使用的化合物，其由以下式Ic表示：
Figure 984428DEST_PATH_IMAGE004
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在。
20.权利要求15和19中任何一项使用的化合物，其中X为氯代。
21.权利要求15和19-20中任何一项使用的化合物，其中R1具有以下式II：
-CH2-R’1
式II
其中R’1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、卤代、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、膦基、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫代酰肼和氨基。
22.权利要求21使用的化合物，其中R’1为叔烷基、烯基、炔基、环烷基或杂脂环基。
23.权利要求22使用的化合物，其中R’1为取代或未取代的叔丁基。
24.权利要求15和19-21中任何一项使用的化合物，其中R1或R’1为三唑。
25.权利要求24使用的化合物，其中所述三唑具有以下式III：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
式III
其中R4选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
26.权利要求25使用的化合物，其中R4为取代或未取代的苯基。
27.权利要求26使用的化合物，其中R4为对-甲氧基羰基苯基。
28.权利要求14-17和19-27中任何一项使用的化合物，其中所述虚线代表饱和键。
29.权利要求14-17和19-28中任何一项使用的化合物，其中R2为氢。
30.权利要求2-29中任何一项使用的化合物，其用于治疗其中调节Pin1的活性为有益的病症。
31.权利要求30使用的化合物，其中所述病症为增殖性疾病或障碍和/或免疫性疾病或障碍。
32.权利要求31使用的化合物，其中所述增殖性疾病或障碍为癌症。
33.权利要求31使用的化合物，其中所述增殖性疾病或障碍选自胰腺癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌和乳腺腺癌。
34.一种具有以下式Id的化合物：
Figure 140996DEST_PATH_IMAGE003
式Id
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
W选自O、S和NR3；
X为卤代；
Y和Z各自独立地选自O、S和NH；
Ra-Rc各自为氢；
L1为键或亚烷基；
L2为亚烷基；
n为1、2、3或4；
R1选自-CH2-C(CH3)3、-CH2-CH(CH3)2、三唑和被三唑和/或被5-或6-元环烷基取代的烷基；
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
R3选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
35.权利要求34 的化合物，其中n为2。
36.权利要求34-35中任何一项的化合物，其中Y和Z各自为O。
37.权利要求34-36中任何一项使用的化合物，其中L1为键。
38.权利要求34-37中任何一项的化合物，其中虚线代表饱和键。
39.权利要求34-38中任何一项的化合物，其中X为氯代。
40.权利要求34-39中任何一项的化合物，其中所述三唑具有以下式III：
Figure 536206DEST_PATH_IMAGE005
式III
其中R4选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基。
41.权利要求40的化合物，其中R4为取代或未取代的苯基。
42.权利要求41的化合物，其中R4为对-甲氧基羰基苯基。
43.一种筛选文库，其包含至少30种权利要求34-42中任何一项的化合物。
44.一种调节Pin1活性的方法，所述方法包括使Pin1与权利要求34-42中任何一项的化合物接触。
45.一种鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法，所述方法包括针对能够经所述亲电部分与所述Pin1的Cys113残基相互作用、经所述官能团至少与所述Pin1的Gln131和His157残基相互作用以及任选地经所述至少一个亲脂基团与所述Pin1的疏水补丁中的至少一个氨基酸残基相互作用的化合物，筛选包含至少30种具有以下式IV的化合物的文库：
E’-L’1-V
式IV
其中：
E’为如权利要求2-4中任何一项定义的亲电部分，当与硫醇反应时能够形成共价键；
L’1为连接部分；
V为特征为至少两个能够形成氢键的官能团的部分，并且任选地进一步特征为至少一个亲脂基团，
其中鉴定为能够至少与所述Pin1的所述Cys113残基和所述Gln131和His 157残基相互作用的化合物被鉴定为能够改变所述Pin1的活性。
46.权利要求45的方法，其中所述筛选通过计算对接进行。
47.权利要求45或46的方法，其进一步包括使所述鉴定的化合物与Pin1接触，从而确定所述化合物是否与Pin1结合和/或调节Pin1的活性，
其中确定为能够与Pin1结合和/或调节Pin1的活性的化合物被鉴定为能够改变所述Pin1的活性。
48.一种鉴定能够调节Pin1活性的化合物的方法，所述方法包括：
a) 在允许X被Pin1的Cys113残基亲核取代的条件下使包含至少30种由以下式Ic表示的化合物的文库与Pin1接触：
Figure 350578DEST_PATH_IMAGE004
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在；和
b) 确定哪些化合物共价结合Pin1，其中与Pin1共价结合的化合物被鉴定为能够调节Pin1的活性。
49.权利要求48的方法，其进一步包括针对与除Pin1的Cys113以外的硫醇的低反应性，筛选所述文库。
50.一种包含至少30种由以下式Ic表示的化合物的筛选文库：
Figure 173040DEST_PATH_IMAGE004
式Ic
其中：
虚线代表饱和或非饱和键；
X为卤代；
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环基、芳基和杂芳基；和
当虚线代表饱和键时R2选自氢和烷基，和当虚线代表不饱和键时R2不存在。
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