CN113933514A - 一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用，该方法基于由时间分辨荧光微球制备得到的免疫荧光探针与生物活性分子A、生物活性分子B的结合关系构建得到，并可以通过对时间分辨荧光微球探针数目进行定量来获得样品中被检测物的具体含量浓度，操作方法简单，检测速度快。本发明中的免疫检测方法相比与现有的免疫分析法，具有更好的抗背景噪声能力，能够提高检测的信噪比，从而提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用。
背景技术
免疫检测技术在各种疾病的监测中具有极为重要的意义。随着科研技术的发展与进步、新发疾病的多样化以及人们对于早期筛查的重视，常规免疫检测的灵敏度和准确性受到的极大的挑战，人们对于检测的要求也不断的朝向高灵敏度或痕量的方向发展。现有的免疫分析法包括放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法和电化学发光免疫分析法等，这些免疫分析法或因反应体系简单、或因反应条件温和、重复好等原因被广泛地应用于无机有机化合物、生物及医药分析领域。但现行的方法中，无一例外均受到检测设备所带来的局限性，如检测信号受到背景噪声的影响较大、检测灵敏度差强人意等问题，从而难以实现真正意义上的高灵敏度检测，尤其是对于极低浓度的目标分子的检测更是成为了不可能完成的任务。因此，开发一种能够有效提高检测荧光信号强度，以实现高灵敏度水平的检测方法在生物、化学以及医学检测领域具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用，该方法相比与现有的免疫分析法，具有更好的抗背景噪声能力，能够提高检测的信噪比，从而提高检测灵敏度。
本发明第一个方面，提供一种免疫检测方法，包括如下步骤：
将检测样品滴加在表面修饰有用于特异性结合被检测物的生物活性分子B的基板上，洗涤除去未结合的检测样品，滴加免疫荧光探针，洗涤，对免疫荧光探针数目进行计数，根据所得数目得到检测样品中被检测物的浓度。
根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述免疫荧光探针为表面修饰有特异性结合被检测物的生物活性分子A的时间分辨荧光微球。
时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)泛指特定的一类特殊的功能微球，其每个微球中可包裹有大量的荧光分子，同时，其表面修饰有羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联。
在本发明的一些优选实施方式中，时间分辨荧光微球购自泰州百纳泰科新材料技术有限公司，微球直径约100nm。该时间分辨荧光微球是将稀土铕(Eu)配合物包埋到聚苯乙烯微球内制备而成，表面修饰有合适密度的羧基基团。
在本发明的一些优选实施方式中，将具有特异性结合被检测物的生物活性分子A通过EDC/NHS偶联法修饰在时间分辨荧光微球表面，得到时间分辨荧光微球免疫荧光探针。
当然，也可以根据生物活性分子A的具体选择，采用其他本领域常规方法将其修饰于时间分辨荧光微球表面。
根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述生物活性分子A具有特异性结合被检测物或被检测物-生物活性分子B复合物的能力。
本发明中的免疫检测方法基于夹心法进行检测，当然，本领域技术人员可以根据本发明中的方法进行调整，使其进一步在包括但不限于：间接法、竞争法或捕获法等方法中加以运用，从而获得检测效果优于传统的间接法、竞争法或捕获法等方法的免疫检测方法。
根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述生物活性分子A、生物活性分子B和被检测物之间的结合位点不同。
根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述时间分辨荧光微球为稀土元素荧光微球。
在本发明的一些优选实施方式中，所述稀土元素包括铕。
在本发明的一些优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球表面修饰有功能基团，所述功能基因用于结合所述生物活性分子A。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述功能基因优选包括羧基基团。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球的粒径约为几十纳米至几百纳米。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球的粒径约为10～500nm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球购自泰州百纳泰科新材料技术有限公司，微球直径约100nm。该时间分辨荧光微球是将稀土铕(Eu)配合物包埋到聚苯乙烯微球内制备而成，表面修饰有合适密度的羧基基团。
根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述基板的材料包括玻璃、硅片或高分子聚合物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，基板可以根据实际情况进行活化或修饰处理，以增加基板与生物活性分子B的结合能力。
生物活性分子B的物质类型根据实际情况，包括但不限于：抗原或抗体。当其为抗体时，根据检测样品的类别，包括但不限于为：抗毒素抗体、抗菌抗体、抗病毒抗体或亲细胞抗体。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述基板经过醛基化修饰，以提高其与生物活性分子B的结合能力。
在本发明的一些更优选实施方式中，被检测物的类型包括但不限于：病原体、微生物和常规的免疫活性物质。常规的免疫活性物质包括：补体、抗原或其抗体中的至少一种。
在本发明实施例中，当被检测物的类型为病原体、微生物或抗原时，生物活性分子A为可与被检测物特异性结合的抗体A，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体B。当被检测物的类型为抗体时，生物活性分子A为可被被检测物特异性识别的抗原，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体。
在本发明的一些更优选实施方式中，被检测物为血清骨钙素(BGP)。
本发明的第二个方面，提供一种时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒，该时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒中包括：
时间分辨荧光微球；
具有特异性结合被检测物能力的生物活性分子B；
具有特异性结合被检测物或被检测物-生物活性分子B复合物的能力的生物活性分子A。
根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述生物活性分子A、生物活性分子B优选和被检测物之间的结合位点不同。
当然，本领域技术人员可以根据使用需求，预先将时间分辨荧光微球与生物活性分子B组合为时间分辨荧光微球探针溶液或产品。
生物活性分子B的物质类型根据实际情况，包括但不限于：抗原或抗体。当其为抗体时，根据检测样品的类别，包括但不限于为：抗毒素抗体、抗菌抗体、抗病毒抗体或亲细胞抗体。
在本发明的一些更优选实施方式中，被检测物的类型包括但不限于：病原体、微生物和常规的免疫活性物质。常规的免疫活性物质包括：补体、抗原或其抗体中的至少一种。
在本发明实施例中，当被检测物的类型为病原体、微生物或抗原时，生物活性分子A为可与被检测物特异性结合的抗体A，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体B。当被检测物的类型为抗体时，生物活性分子A为可被被检测物特异性识别的抗原，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体。
在本发明的一些更优选实施方式中，被检测物为血清骨钙素(BGP)。
根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述时间分辨荧光微球为稀土元素荧光微球。
在本发明的一些优选实施方式中，所述稀土元素包括铕。
在本发明的一些优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球表面修饰有功能基团，所述功能基因用于结合所述生物活性分子A。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述功能基因优选包括羧基基团。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球的粒径约为几十纳米至几百纳米。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球的粒径约为10～999nm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述时间分辨荧光微球购自泰州百纳泰科新材料技术有限公司，微球直径约100nm。该时间分辨荧光微球是将稀土铕(Eu)配合物包埋到聚苯乙烯微球内制备而成，表面修饰有合适密度的羧基基团。
根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒可以根据实际检测需要，选择不同的使用方式进行使用，可适用于夹心法、间接法、竞争法或捕获法等多种免疫检测方法。
本发明第三个方面，提供本发明第一个方面所述的免疫检测方法在免疫活性物质或病原体体外检测中的应用。
本发明第四个方面，提供本发明第二个方面所述的时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒在免疫活性物质或病原体体外检测中的应用。
根据本发明第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述病原体包括朊毒体、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒等。
根据本发明第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述免疫活性物质包括补体、抗原或其抗体中的至少一种。
本发明的有益效果是：
1.本发明以时间分辨荧光微球为基础，构建时间分辨荧光微球探针，并通过对时间分辨荧光微球探针数目进行定量来获得样品中被检测物的具体含量浓度，操作方法简单，检测速度快。
2.本发明中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法相比与现有的免疫分析法，具有更好的抗背景噪声能力，能够提高检测的信噪比，提高了检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例中的时间分辨荧光微球免疫荧光探针的结构示意图；
图2为本发明实施例中的时间分辨荧光微球免疫荧光探针、生物活性分子B以及被检测物的结合关系示意图；其中，1表示时间分辨荧光微球，2表示生物活性分子A，3表示基板，4表示生物活性分子B，5表示被检测物；
图3为20×荧光显微镜视野中的时间分辨荧光微球免疫荧光探针的成像效果；
图4为时间分辨荧光微球免疫荧光探针数量与被检测物(BGP)浓度关系曲线图；
图5为酶联免疫法的OD值与被检测物(BGP)浓度关系曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的构建
本发明实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法主要基于时间分辨荧光微球和荧光计数定量技术的组合构建得到，其主要步骤包括：
(1)构建时间分辨荧光微球免疫荧光探针：
将具有特异性结合被检测物的生物活性分子A通过EDC/NHS偶联法修饰在时间分辨荧光微球表面，得到时间分辨荧光微球免疫荧光探针。
时间分辨荧光微球免疫荧光探针的结构示意图如图1所示。
当然，也可以根据生物活性分子A的具体选择，采用其他本领域常规方法将其修饰于时间分辨荧光微球表面。
其中，时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)泛指特定的一类特殊的功能微球，其每个微球中可包裹有大量的荧光分子，同时，表面修饰有羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联。
在下述实施例中，其所使用的时间分辨荧光微球购自泰州百纳泰科新材料技术有限公司，微球直径约100nm。该时间分辨荧光微球是将稀土铕(Eu)配合物包埋到聚苯乙烯微球内制备而成，表面修饰有合适密度的羧基基团。
(2)将检测样品根据实际情况(浓度)进行稀释，可选的稀释液包括磷酸缓冲液(PBBuffer，如磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)、25％人血清白蛋白溶液中的任意一种。
在下述实施例中，其所使用的稀释液为质量浓度为0.2mol/L的PB缓冲液，按质量百分比计，其溶质包括0.1％BSA、2％蔗糖、0.1％Tween。
(3)将稀释后的检测样品滴加在表面修饰有用于特异性结合被检测物的生物活性分子B的基板上。
基板的材料可根据实际情况进行替换，包括但不限于：玻璃、硅片或高分子聚合物等。基板可以根据实际情况进行活化或修饰处理，以增加基板与生物活性分子B的结合能力。
生物活性分子B的物质类型根据实际情况，包括但不限于：抗原或抗体。当其为抗体时，根据检测样品的类别，包括但不限于为：抗毒素抗体、抗菌抗体、抗病毒抗体或亲细胞抗体。
时间分辨荧光微球免疫荧光探针、生物活性分子B以及被检测物的结合关系如图2所示。
(4)使用洗涤液除去未结合的检测样品，滴加步骤(1)制备得到的时间分辨荧光微球免疫荧光探针，充分反应，使时间分辨荧光微球免疫荧光探针特异性的与被检测物或被检测物-生物活性分子A复合物结合。使用洗涤液除去未结合的时间分辨荧光微球免疫荧光探针。使用荧光显微镜，在合适的激发光源和检测波长的条件下对时间分辨荧光微球免疫荧光探针进行计数，所得数目即为检测样品中被检测物的数目。
激发光源和检测波长的选择根据实际使用的时间分辨荧光微球免疫荧光探针决定，在本发明实施例中，激发光源为LED光源，检测波长为365nm。
在荧光显微镜下视野中的时间分辨荧光微球免疫荧光探针的成像效果如图3所示。
在本发明实施例中，被检测物的类型包括但不限于：病原体、微生物和常规的免疫活性物质。常规的免疫活性物质包括：补体、抗原或其抗体中的至少一种。
在本发明实施例中，当被检测物的类型为病原体、微生物或抗原时，生物活性分子A为可与被检测物特异性结合的抗体A，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体B。当被检测物的类型为抗体时，生物活性分子A为可被被检测物特异性识别的抗原，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体。
基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的实际应用
本实施例以血清骨钙素(BGP)为检测对象，示例性的展示出本发明实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的实际应用效果。当然，需要理解的是，本发明实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的检测对象并不局限于本实施中的BGP。
具体检测步骤如下：
(1)制备时间分辨荧光微球探针：
采用EDC/NHS偶联法将BGP抗体(购自北京科瑞美科技有限公司)修饰至时间分辨荧光微球表面，得到时间分辨荧光微球探针。
将制备好的时间分辨荧光微球探针用稀释液进行稀释，稀释至60mg/mL备用。
其中，稀释液为摩尔浓度为0.2mol/L的PB缓冲液，按质量百分比计，其溶质包括0.1％BSA、2％蔗糖、0.1％Tween。
(2)以96孔板在作为检测基板，在孔中加入75μL的使用包被液包被的包被抗体(二抗，鼠抗人骨钙素单克隆抗体，购自北京科瑞美科技有限公司，37℃反应2小时。使用洗涤液洗涤基板，甩干液体，重复3-5次。将洗涤后的基板拍干，在孔中加入75μL不同浓度的BGP抗原标准溶液(购自北京科瑞美科技有限公司，浓度分别为24.45ng/mL、12.914ng/mL、7.759ng/mL、3.8795ng/mL、1.9375ng/mL、0.97ng/mL、0.4849ng/mL和0.2424ng/mL)，每一个浓度设置三个平行孔，同时，设置空白对照。37℃孵育2h。使用洗涤液洗涤基板，甩干液体，重复3-5次。将洗涤后的基板拍干，在孔中加入75μL的时间分辨荧光微球探针溶液，37℃反应2小时。使用洗涤液洗涤基板5-10次，以除去未反应的时间分辨荧光微球探针，使用荧光显微镜在LED光源、365nm左右波长范围内对时间分辨荧光微球免疫荧光探针进行计数，所得数目反映了检测样品中BGP的浓度。
检测结果如图4所示。
图4为BGP标准品浓度与时间分辨荧光微球探针计数结果的关系图,进一步根据图4中的数据进行计算得到检测下限为0.3189ng/ml，得到对应的标准曲线线性方程为：
y＝18.65x+22.79；
其中，r2＝0.981
x表示荧光微球免疫荧光探针计数结果；
y表示待测样品中的待测物浓度。
基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法与常规方法的对比
以酶联免疫法作为常规检测方法，对比上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法与酶联免疫法的检测效果差异。
取同一BGP样品作为检测对象分别使用上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法与酶联免疫法进行检测。
基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的操作步骤同上述实施例。
酶联免疫法的检测步骤如下：
以96孔板在作为检测基板，在孔中加入20μL不同浓度的BGP抗原标准溶液(浓度分别为72.873ng/mL、55.52ng/mL、24.45ng/mL、12.914ng/mL和7.759ng/mL)，同时，设置空白对照。加入150μL的等体积混合的抗体混合溶液(过氧化物酶偶联一抗75μL+生物素标记二抗75μL，一抗和二抗均为鼠抗人骨钙素单克隆抗体)，室温下反应2h。使用洗涤液洗涤基板，甩干液体，重复3-5次。加入100μL底物溶液，在室温条件下避光反应15min。加入100μL终止液终止反应。在以650nm为参照测定450nm下的吸光度。
酶联免疫法检测结果如图5所示。
进一步根据图5中的数据进行计算，得到对应的标准曲线线性方程为：
y＝0.03x+0.01；
其中，r2＝0.995；
x表示OD值；
y表示待测样品中的待测物浓度。
可以发现，相比上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法，酶联免疫法的检出限为7.759ng/mL，远高于上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法的检测下限0.3189ng/mL，可以表明上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法与传统检测方法相比，降低了检测下限，提高了检测灵敏度，且操作简单，检测快速，可以对一些免疫分子进行快速准确的检测，具有极好的应用前景。
综上所述，上述实施例中的基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法在检测效果上要远优于现有技术，能够广泛的用于痕量物质的精准检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫检测方法，包括如下步骤：
将检测样品滴加在表面修饰有用于特异性结合被检测物的生物活性分子B的基板上，洗涤除去未结合的检测样品，滴加免疫荧光探针，洗涤，对免疫荧光探针数目进行计数，根据所得数目得到检测样品中被检测物的浓度；
其中，所述免疫荧光探针为表面修饰有生物活性分子A的时间分辨荧光微球；
所述生物活性分子A具有特异性结合被检测物或被检测物-生物活性分子B复合物的能力。
2.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述生物活性分子A、生物活性分子B和被检测物之间的结合位点不同。
3.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球为稀土元素荧光微球，所述稀土元素包括铕。
4.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球表面修饰有功能基团，所述功能基因用于结合所述生物活性分子A；
所述功能基因优选包括羧基基团。
5.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径为10～500nm。
6.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述基板的材料包括玻璃、硅片或高分子聚合物中的至少一种。
7.一种时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒中包括：
时间分辨荧光微球；
具有特异性结合被检测物能力的生物活性分子B；
具有特异性结合被检测物或被检测物-生物活性分子B复合物的能力的生物活性分子A；
其中，所述生物活性分子A、生物活性分子B优选和被检测物之间的结合位点不同。
8.权利要求1～6任一项所述的免疫检测方法在免疫活性物质或病原体体外检测中的应用。
9.权利要求7所述的时间分辨荧光微球免疫检测试剂盒在免疫活性物质或病原体体外检测中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述免疫活性物质包括补体、抗原或其抗体中的至少一种。
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