CN113933505A - 一组多维分析预测胃癌免疫治疗疗效的tiic指标及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明首次通过使用多重免疫组化结合数字图像分析和统计分析，揭示了GC临床标本的免疫细胞特征，公开描述了肿瘤浸润免疫细胞(tumor infiltrating immune cells,TIICs)的密度和空间模式的变化与GC分子特征及其疗效意义的关系；通过对抗PD‑1/PD‑L1治疗背景下TIICs的密度和空间模式与GC病理学进行评估，建立了一套可用于筛查肿瘤对治疗反应的决定因素的思路和方法，为肿瘤治疗的疗效预判提供了思路和科学依据，实现在治疗前对患者进行预测分层，推进了肿瘤治疗学的发展。

Description

一组多维分析预测胃癌免疫治疗疗效的TIIC指标及其应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，更为具体的，本发明涉及一组可多维分析预测肿瘤免疫治疗疗效的生物标志物及其应用。
背景技术
胃癌(gastric cancer, GC)是世界上第五大最常见的癌症和第二大癌症相关死亡原因;全球 47%以上的病例发生在中国。针对程序性细胞死亡蛋白 1(programmed celldeath protein 1,PD-1)和程序性死亡配体 1(programmed death-ligand 1, PD-L1)的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)的出现，使癌症治疗发生了革命性的变化，在胃癌中提供了强大和持久的反应。Pembrolizumab 或 Nivolumab 单药治疗的临床试验表明，在没有选择性生物标志物的晚期 GC 中有广泛的缓解率(10% -26%)。因此，为了提高抗 PD -1/PD-L1 治疗 GC 的疗效，迫切需要确定哪些患者最有可能从免疫治疗中获益。
许多生物标志物，包括肿瘤突变负荷(TMB)、PD-L1 表达、微卫星不稳定性(MSI)和Epstein-Barr 病毒(EBV)感染状态，已经被提出用于识别 PD-1/PD-L1抑制剂的易感性。然而，在个体水平上使用这些生物标志物的几个临床试验的结果并不一致;有些甚至自相矛盾。因此，到目前为止，还没有单一的生物标志物可以用于足够的患者分层，这可能是由于癌症免疫反应的复杂性导致。
肿瘤免疫细胞是异质性的，具有功能和表型可塑性，可能具有促肿瘤和抗肿瘤作用。有趣的是，不同免疫细胞亚群的分布及其与癌细胞的精确位置已经被提出作为预测肿瘤行为的有价值的指标。事实上，肿瘤微环境的组成部分可能会影响治疗反应，包括 T 细胞、B 细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，正在越来越多地被研究领域所考虑。例如，以往的研究表明，敲除环型 GMP-AMP干扰素合成酶刺激因子(STING)可促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)极化为促炎亚型，并诱导 GC 细胞凋亡，突出了 STING 在 TAMs 中的负作用。因此，分析单个细胞和非细胞组分的空间关系可能会促进对 GC 生物学的理解。然而目前GC 免疫生物学分析仍停留在传统的免疫组化方法或生物标志物的检测，尚未有能够从空间、细胞、细胞组分等多维视角分析预测GC对于免疫治疗的疗效的方法或组合的指标。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明建立了一种多重免疫组化(multiplexedimmunohistochemistry, mIHC)结合数字图像分析的方法，可用来检测GC 临床标本的免疫细胞特征，并提供一组可用来评估预测抗 PD-1/PD-L1 治疗背景下GC对免疫治疗反应的TIIC（tumor infiltrating immune cells, 肿瘤浸润免疫细胞）指标。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种多维分析预测GC免疫治疗疗效的TIIC指标，所述指标至少包括3个数量指标与1个空间指标，其中数量指标为CD8+PD-1-LAG-3-细胞的密度、CD4+FoxP3-PD-L1+细胞的密度、以及CD68+STING+细胞的密度；空间指标为CD8+PD-1+LAG3-T细胞的有效评分，其中，有效评分为半径20微米范围内，CD8+PD-1+LAG-3-细胞与周边肿瘤细胞的配对数与CD8+PD-1+LAG-3-细胞总细胞数的比值。
本发明的第二个方面，提供上述TIIC指标在预测GC免疫治疗疗效中的应用。
在一种实施方式中，所述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
本发明的第三个方面，提供上述TIIC指标在制备用于预测GC免疫治疗疗效的产品中的应用。
在一种实施方式中，上述产品包括试剂盒等。
本发明相对于现有技术可获得如下有益的技术效果：
1. 本发明首次通过使用多重免疫组化结合数字图像分析和统计分析，揭示了GC临床标本的免疫细胞特征；
2. 本发明首次公开描述了肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的密度和空间模式的变化与GC 分子特征及其疗效意义的关系；
3. 通过对抗 PD-1/PD-L1 治疗背景下 TIICs 的密度和空间模式与GC病理学进行评估，建立了一套可用于筛查肿瘤对治疗反应的决定因素的方法，为肿瘤治疗的疗效预判提供了思路和科学依据，实现在治疗前对患者进行预测分层，推进了肿瘤治疗学的发展。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：Panel1的mIHC染色图；
图2：Panel2的mIHC染色图；
图3：Panel3的mIHC染色图；
图4：图像分割流程：包括HE对照-mIHC多色染色-组织拆分-细胞拆分-细胞亚型确定；
图5：空间分析示例图；
图6：空间有效评分计算示例图；
图7：训练集、测试集以及全部患者的ROC曲线；
图8：TIIC特征预测患者治疗疗效有反应R(Response)组和无反应N(non-response)组之间的对比柱状图；
图9：所有患者单独TIIC特征预测患者治疗疗效瀑布图（有反应R，无反应N）。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：生物标志物的筛选
1.标本采集
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)胃癌组织取自北京大学肿瘤医院病理科。胃癌组织包括从2018年3月至2020年12月收集的60例经组织学证实的胃癌患者的60个预处理样本。我们排除了同时患有自身免疫性疾病、HIV或梅毒的患者。本研究经北京大学肿瘤医院伦理委员会批准。所有参与者或其法定监护人签署知情同意书。
2.评估标准
EBV（EB病毒）状态是通过使用针对Epstein-Barr编码RNA 1 (EBER1)的探针进行原位杂交来确定的。通过免疫组化分析DNA错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达来评估MMR（基因错配修复）状态。免疫治疗有效者(R, response)定义为RECIST完全缓解(CR)或部分缓解(PR)患者，无反应者(N, non-response)定义为疾病进展(PD)或稳定(SD)患者。
3.多重免疫组织化学
3.1胃癌原发灶肿瘤微环境检测
A. 免疫细胞亚型标记及免疫检查点标记设计
肿瘤免疫panel包括如下：第一，肿瘤组织及细胞结构化组成：用作肿瘤及间质分割，包括细胞角蛋白PanCytokeratin, 细胞核染色DAPI(nuclei)；第二，免疫细胞类型标记，包括CD4 (T-helper), CD8 (T-cytotoxic), FoxP3 (T-regulatory), CD68(macrophages), HLA-DR(macrophages 1)，CD163(macrophages 2)；第三，免疫检查点/治疗靶点，包括PD-L1, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, STING。
B. 多色免疫荧光试验（m-IHC染色）
为了研究标本中TIICs的分布情况，我们通过m-IHC染色定量60个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中免疫细胞的密度和空间位置。具体步骤如下：
烤片：石蜡包埋（FFPE）样本在烤箱中65℃烤20分钟；
脱蜡：二甲苯脱蜡（5分钟，重复3次）；
水合：梯度乙醇浸片（100% 5分钟，95% 5分钟，70% 2分钟）；
抗原修复：将脱蜡水合后的玻片置于碱性抗原修复液浸没(PANOVUE; Cat.0019020500)，微波炉内高火煮沸，低火维持15分钟，取出室温自然冷却至室温；
封闭：滴加一抗封闭液(PANOVUE; Cat. 0018001120)，室温保湿震荡10分钟；
一抗孵育：以PD-1为例，PD-1 (CST43248, 1:100) ，室温孵育30分钟；
二抗孵育：滴加HRP二抗工作液(PANOVUE; Cat.0013001010)，室温保湿孵育10分钟；
荧光染色放大信号：加入TSA染料PPD520 TSA (1:100) ，室温保湿震荡孵育10分钟。1×TBST buffer浸洗, 重复3次。
可重复抗原修复，进行下一轮抗体染色。
封片：滴加DAPI工作液，室温保湿孵育；1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3分钟。
用灭菌水洗片2分钟，待玻片微干，用移液器在玻片上滴加超强抗淬灭封片剂，浸没样本区域。加盖玻片，指甲油封片。
读片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并进行判读。
每一个panel中（表1），不同标记染色顺序、以及荧光搭配在预实验中均进行优化。
表1
Figure 13987DEST_PATH_IMAGE001
多轮染色结束以后，使用Vectra 3.0 显微镜进行扫描(Perkin Elmer)，不同通道选择对应荧光滤过器通道优化图像(DAPI、PPD650、PPD690共用CY5通道, PPD520使用FITC通道，PPD620使用Texas Red通道)（多通道染色及单通道染色结果如图1-3所示）。
C. 图像免疫微环境分析
使用inForm软件(Perkin Elmer)对图像进行基本拆分。基于细胞角蛋白表达，对肿瘤、间质进行组织分割，基于DAPI染色进行细胞分割。根据染色标记进行如下进一步的多标记共表达的数据分析：
a. 细胞比例=(∑C_P)/(∑C)
其中，细胞是指不同亚型的细胞（不同亚型分别计算比例），C为视野下的细胞计数；C_P为C中染色呈阳性的表型细胞计数；
b. 密度=(∑C_P)/Area
其中，C_P定义同a中所述；Area为视野下的面积
c. 距离
细胞坐标数据来源于inform导出的cell_seg_data文件，其中Cell X Position和Cell Y Position两列分别为细胞在视野图像中的横坐标和纵坐标（原点位置和XY轴长度可由视野下的细胞分布情况自行确定）。
Figure 212887DEST_PATH_IMAGE002
细胞间距离数据均为二维笛卡尔坐标系数据，默认数据为基于矩形图像视野的像素坐标，依放大倍率可转为相应的长度坐标数据后进行计算。
距离的计算使用如下欧氏距离计算方式：
Figure 68717DEST_PATH_IMAGE003
4.多光谱成像
使用Mantra定量病理成像系统(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)获取图像。多光谱图像在显谱图中显示。简单地说，由两位专业的病理学家选择具有代表性的视野，并在20×处获取多个视野进行进一步分析。选择肿瘤中心-根据之前获得的全片扫描图像，在表型图(PerkinElmer)中用固定大小的图章选择肿瘤中心。在每个标本中选择尽可能多的可行区域，尽量减少重叠。所有处理后的数据均由病理学家进行质量控制(QC, qualitycontrol)，随后排除分析中不适当的区域，并确认离群结果。
多光谱图像使用inForm图像分析软件2.4 (PerkinElmer)进行分析（分析流程图如图4所示）。根据每个荧光的单通道染色图像建立光谱库，使用未染色切片提取组织的自荧光光谱。根据荧光团特征和与分节核相关的细胞形态特征(DAPI信号)，分别鉴定每个DAPI染色细胞。获取的图像使用inForm进行肿瘤细胞和间质区域的组织成分分割和细胞表型分析。每个视野中的细胞密度通过总细胞计数与总面积(cell/ mm2)的归一化来计算。
5.免疫治疗疗效预测模型的构建
使用Python scikit-learn软件包，构建抗PD-1/PD-L1免疫治疗疗效预测模型，选择3个数量指标（CD8+PD-1-LAG-3-细胞的密度、CD4+FoxP3-PD-L1+细胞的密度、CD68+STING+的密度）与1个空间指标（半径20微米范围内，CD8+PD-1+LAG-3-细胞与周边肿瘤细胞的配对数与CD8+PD-1+LAG-3-细胞总细胞数的比值，称为“有效评分”，空间分析示例及有效评分计算示例如图5-6所示）用于预测患者对免疫治疗的反应。通过逻辑回归算法为每个指标计算权重，并通过加权和的方式计算TIIC-特征。具体公式如下：
TIIC-特征= -0.483964*（CD8+PD-1-LAG-3-细胞的密度）+ 0.737107（CD4+FoxP3-PD-L1+细胞的密度）- 0.31882*（CD68+STING+的密度）+ 0.252046*（半径20微米范围内，CD8+PD-1+LAG-3-细胞的有效评分）
选择ROC曲线下面积最大为0.820，TIIC特征0.68为界点。当TIIC-特征大于阈值时，判定为对免疫治疗有反应；反之，当TIIC-特征小于阈值时，判定为对免疫治疗无反应。
实施例2 筛选结果
在前述实施例中，为了研究标本中TIICs的分布情况，我们先通过对3个panel进行m-IHC染色，定量分析了60个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中不同免疫细胞亚型的密度和空间位置（图1-3）。首先，病理学家对组织切片进行了HE染色，以确定肿瘤核心(TC,tumor core)。利用监督图像分析系统(inForm)，我们能够精确定义单个肿瘤细胞和TIICs的位置。
接下来，我们评估它们之间的邻近性的临床意义。为了进一步研究这些定位模式，我们使用R语言数据通用包pdist来确定任何两种细胞类型之间的核-核距离。为了结合细胞邻近性和数量，我们建立了“有效评分”参数（图5-6）:TIICs在肿瘤细胞附近的比例(在引入的定义距离标准内);这个分数是用配对的免疫细胞和肿瘤细胞的数量除以整个视野上的免疫细胞总数来计算，在很大程度上描述了空间特征。
接下来我们研究TIICs的密度和各自的有效评分是否与抗PD -1/PD-L1免疫治疗的临床结果相关。所有60例接受免疫治疗的患者被分配到训练队列(n=44，从2016/11/15到2019/7/17的回顾性队列)和验证队列(n=16，从2019/7/29到2019/12/19的前瞻性队列)。我们使用logistic回归分析来评估TIICs和客观缓解率(ORR)之间的关系。重要的是，我们发现CD4+FoxP3-PD-L1+ T细胞的密度和CD8+PD-1+LAG-3- T细胞的有效评分与抗PD-1/PD-L1治疗的阳性反应密切相关;相反，CD8+PD-1-LAG-3- T细胞和CD68+STING+巨噬细胞与抗PD-1/PD-L1治疗的阴性反应密切相关，且经过多因素调整以后，相关性更加显著(表1)。
表1.ICI治疗原发性胃癌患者免疫细胞与客观缓解率相关性的序数逻辑回归分析
Figure 62081DEST_PATH_IMAGE004
a:多变量有序逻辑回归模型最初包括分期（I vs. II vs. III vs. IV）、肿瘤位置（GEJ vs. non-GEJ）、肿瘤分化（中等 vs. 中差 vs.差）、ECOG（ 0 对 1）、治疗线数（一线对二线对三线及以上）和抗 PD-1/PD-L1 治疗类型（单药 vs. 联合化疗 vs. 联合抗VEFGvs. 联合抗 CTLA-4 vs. 联合抗HER2）。 使用阈值为 P = 0.05 的反向消除来选择最终模型中的变量。b-e:高与低的截止值如下：66.7%、70%、40%、50%。缩写：CI，置信区间； OR，优势比。
基于上述结果, CD4+FoxP3-PD-L1+ T细胞密度, CD8+PD-1-LAG3- T细胞密度,和CD68+STING+细胞密度、以及CD8+PD-1+LAG3- T的“有效评分”，可被用来定义一个TIIC特征, 该TIIC特征可预测肿瘤对抗-PD-1/ PD-L1免疫疗法的疗效。我们使用逻辑回归分析，计算训练和验证队列的曲线下面积(AUC)，分别为0.80和0.88（图7），表明TIIC特征确实可以用来预测免疫治疗的反应，且预测结果很好。综上所述，我们的数据表明，TIIC特征对预测患者疗效有非常好的预测作用。
实施例3 临床数据验证
结合60例患者进行免疫治疗后的疗效评估，我们经过实验检测和计算的TIIC特征在有反应和无反应患者中，可以看到两组评分的显著差异（P = 0.0053）,进一步证实，TIIC特征可有效预测胃癌患者免疫治疗疗效（图8）。进而，我们对60个患者，进行了单独TIIC特征评分的展示，通过瀑布图（图9）可以看到，有反应的患者集中在右侧TIIC-特征数值更高的组别，进一步证明TIIC特征与胃癌患者免疫治疗疗效相关。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种多维分析预测GC免疫治疗疗效的检测方法，其特征在于，所述方法包括对3个数量指标与1个空间指标进行检测，其中，所述数量指标为CD8+PD-1-LAG-3-细胞的密度、CD4+FoxP3-PD-L1+细胞的密度、以及CD68+STING+细胞的密度；所述空间指标为CD8+PD-1+LAG3-T细胞的有效评分，其中，有效评分为半径20微米范围内，CD8+PD-1+LAG-3-细胞与周边肿瘤细胞的配对数与CD8+PD-1+LAG-3-细胞总细胞数的比值。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗疗效是指免疫治疗是否有效。
3.一种用于预测GC免疫治疗疗效的产品，其特征在于，所述产品包括用于检测CD8+PD-1-LAG-3-细胞的密度、CD4+FoxP3-PD-L1+细胞的密度、CD68+STING+细胞的密度、以及CD8+PD-1+LAG3- T细胞的有效评分的试剂，所述有效评分为半径20微米范围内，CD8+PD-1+LAG-3-细胞与周边肿瘤细胞的配对数与CD8+PD-1+LAG-3-细胞总细胞数的比值。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒等。
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