CN113933362B - 一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶c传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，其工作电极以特定的ATRP聚合液在光照条件下制备聚甲基丙烯醛修饰电极，再将银纳米粒子有效引入MVL ATRP分子链用于电化学传感器工作电极的信号放大，所制备的电化学生物传感器检测PLC十分灵敏，磷脂酶C浓度的线性检测范围为1‑106 mU/L，检出限为0.1032 mU/L(S/N=3)。与以往方法相比具有灵敏度高，可操作性强等优点。此外，本发明背景信号低、选择性高，可以避免假阳性结果的干扰、成本低、效益高。

Description

一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法
技术领域
本发明公开一种磷脂酶C传感器制备方法，尤其是一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法。
背景技术
酶作为一类极为重要的生物催化剂，能在生物体内能高效、特异地进行化学反应，逐渐成为生物传感器研发的重点。磷脂酶C（PLC）是磷酸二酯酶，可以催化磷脂中磷酸酯键水解产生二酰基甘油（DAG）和磷酸基（如磷酸化胆碱和磷酸化肌醇），在膜运输、细胞机制调节、消化代谢等方面均具有生物学功能。PLC的水解反应常与一些癌细胞中异常的胆碱代谢有关，不同类型的PLC与人体癌症、免疫紊乱和神经退行性疾病相关，目前，荧光法、酸碱滴定法、核磁共振法、放射性测定法、色谱法、电化学方法等方法已被用于测定癌细胞和细菌中的PLC活性或浓度。然而荧光法常需要荧光团对磷脂进行官能化，步骤繁琐且荧光底物和磷脂酶的低催化周转率限制了其应用；酸碱滴定法和色谱法灵敏度较低，核磁共振光谱法和放射性测定法所需设备昂贵。
ATRP于1995年由Krzysztof Matyjaszewski团队发现，它以简单的有机卤化物为引发剂，过渡金属配合物为卤原子载体，通过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，实现对聚合反应的控制，在聚合物和生物偶联物的合成和表面接枝中得到了广泛的应用。但是常规ATRP方法有二个缺点：一是低价态过渡金属离子对空气等敏感而不方便使用，聚合常需无氧体系；二是催化剂对蛋白质等生物大分子具有一定的毒性，且常见脱除催化剂的后处理工艺复杂，催化剂常有残留。为了克服这些缺点，许多改良的ATRP方法应运而生，一是改变ATRP的实施方式，克服氧气影响，减少催化剂用量（反向ATRP、电子转移活化ATRP）；二是寻找过渡金属配合物的替代物，如无金属可见光诱导的原子转移自由基聚合（MVL ATRP）。
MVL ATRP方法的出现将传统的ATRP方法进行了优化，它采用小分子光敏剂（荧光素等）代替过渡金属催化剂，避免了传统金属催化剂对蛋白质等生物大分子产生毒性，并且使用葡萄糖氧化酶可有效增加体系的耐氧性，在可见光存在下，单体聚合速度快、转化率高，已广泛应用于聚合物枝接，且已有通过MVL ATRP制备印迹聚合物检测抗生素或免疫球蛋白的方法，以及通过聚合含二茂铁基的单体制备核酸传感器的方法。
目前，人们发现某些添加剂能够将自由基聚合转化为可控/“活性”形式（CLRPs），如原子转移自由基聚合（ATRP）、可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）等，已成为一种新型信号放大策略，在临床生物分子检测及生物传感领域引起了越来越多的关注。由数千个单体单元组成的聚合物链可以引入大量的信号探针（如：二茂铁）或引入可进一步连接信号探针的官能团（-NH2、-CHO和-COOH等），即使在目标分析物丰度很低的情况下也能够输出高检测信号，大大降低检出限，提高检测灵敏度。虽然电化学方法因其特异性高、灵敏度高、稳定性好、操作方便等优点，已成功应用于生物标志物的检测，然而，迄今为止未见基于自由基聚合的电化学检测PLC方法的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为0.1-1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中12-24小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液5-30 min，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为5-20 mg/mL，NHS含量为1-4mg/mL；
步骤3：将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中1-6小时，之后再将电极用2mmol/L 牛血清白蛋白浸泡10 min，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为0.1-5 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.1-1小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、 pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，其中磷脂酶C 1-106 mU/L，CaCl2 2 mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中5-30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中5-30 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为1-5 mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为0.2-1 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照0.5-3小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于1-15 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.1-0.5 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛10-100 μL，荧光素0.3-3 μmol，三乙胺20-80 μL，葡萄糖10-3-0.1 mmol，葡萄糖氧化酶1-10 μg，无水乙醇3mL，水1.82-1.97 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。
本发明以特定的ATRP聚合液在光照条件下制备聚甲基丙烯醛修饰电极，再将银纳米粒子有效引入MVL ATRP分子链用于电化学传感器工作电极的信号放大，所制备的电化学生物传感器检测PLC十分灵敏，磷脂酶C浓度的线性检测范围为1-106 mU/L，检出限为0.1032 mU/L(S/N=3)。与以往方法相比具有灵敏度高，可操作性强等优点。此外，本发明背景信号低、选择性高，可以避免假阳性结果的干扰、成本低、效益高。
附图说明
图1 是本发明实施例1的聚合物纳米银修饰电极(a)和裸金电极(b)在0.1 mol/LKCl中的循环伏安扫描图。
图2 是本发明实施例1的聚合物纳米银修饰电极(a)和其他制备过程无L-半胱氨酸(b)、无磷脂酰乙醇胺(c)、无磷脂酶C(d)、无Zr4+(e)、无引发剂(f)、无单体(g)修饰电极在0.1 mol/L KCl中的方波伏安曲线。
图3 是本发明实施例1的金电极(a)、底物修饰电极(b)、PLC反应后的电极(c)、结合Zr4+后的电极(d)、引发剂修饰电极(f)、MVL ATRP反应后的电极(g)、聚合物纳米银修饰电极(h)的电化学交流阻抗谱图。
图4 是本发明实施例1使用不同浓度磷脂酶C溶液制备的聚合物纳米银修饰电极在0.1 mol/L KCl溶液中的方波伏安曲线(A)和工作曲线(B)。
具体实施方式
实施例1：
本发明的一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中24小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液5 min，对L-半胱氨酸羧基端进行活化，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为20 mg/mL，NHS含量为4 mg/mL；
步骤3：将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中6小时，之后再将电极用2 mmol/L 牛血清白蛋白（BSA）浸泡10 min，封闭金电极上的非特异性结合位点，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为5 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育1小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，其中磷脂酶C 106 mU/L，CaCl2 2 mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中30 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为5 mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为1 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照3小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于5 mL 、15 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.5 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛100 μL，荧光素3 μmol，三乙胺80 μL，葡萄糖0.1 mmol，葡萄糖氧化酶10 μg，无水乙醇3 mL，水1.82 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。
为了观察来自AgNPs产生的信号峰，选择KCl溶液作为支持电解质溶液，比较本发明实施例1的聚合物纳米银修饰电极与裸金电极在该电解液中的循环伏安特性曲线，结果如图1所示。图1中聚合物纳米银修饰电极(a)出现一对明显的氧化还原峰，说明电极表面的AgNPs在外加电压的条件下能够在KCl溶液得失电子，而裸金电极(b)无明显氧化还原峰，说明无AgNPs存在条件下，裸金电极在KCl溶液中无氧化还原反应发生。
为了验证本发明实施例1检测PLC的可行性，采用SWV法收集了不同条件下修饰电极的方波伏安曲线。如图2所示，当磷脂酰乙醇胺(b)、磷脂酶C(c)、Zr4+(d)、引发剂(e)、或单体(f)在制备实验中缺失时，没有电流响应。若所有组分均结合在电极表面(a)时，则能够观察到明显的氧化峰。这些结果表明，以上组分均在电极制备过程中起到不可或缺的作用，MVL ATRP方法和AgNPs沉积可用于PLC电化学检测的信号放大。
通过电化学阻抗谱可以分析电极修饰过程的特性，获得电极表面结构信息。如图3所示，裸电极的Rct很小 (64.8 Ω，曲线a)，经磷脂酰乙醇胺修饰后，Rct增加(206 Ω，曲线b)，这是由于底物是惰性分子，阻碍了分子层中的电荷转移。酶切反应后，Rct值继续增加到536 Ω (曲线c)，这是因为PLC裂解底物将产生带负电荷的磷酸基团，对同带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-具有静电排斥性，不利于电子传导。同样，当在电极上修饰Zr4+(1030 Ω，曲线d)和引发剂(1530 Ω，曲线e)后，由于空间位阻Rct进一步增强。在MVL ATRP聚合后(曲线f)，Rct值显著增加到2420 Ω，证明甲基丙烯醛在电极上发生了聚合反应。当发生类银镜反应后，电活性物质AgNPs沉积到电极表面，Rct值显著降低(712 kΩ，曲线g)。这些结果表明，本发明基于MVL ATRP的聚合和AgNPs沉积是有效的。
图4是本发明实施例1使用不同浓度磷脂酶C溶液制备的聚合物纳米银修饰电极在0.1 mol/L KCl溶液中的方波伏安曲线(图A)和工作曲线(图B)。图4中1-7分别为1 mU/L，10mU/L，102 mU/L，103 mU/L，104 mU/L，105 mU/L，106 mU/L的PLC制备的聚合物纳米银修饰电极在0.1 mol/L KCl溶液中的方波伏安曲线图（A）和工作曲线（B）。AgNPs的氧化峰电流随PLC浓度的增加而增加。当PLC浓度在1~106 mU/L之间时，浓度的对数与峰电流大小具有较强线性相关性(R2=0.997)。线性回归方程表示为I(μA) = 54.09log(C PLC/mU·L-1)-35.29。基于3σ/斜率(σ代表标准偏差)，本发明得到的检出限为0.1032 mU/L，(对应物质的量浓度：7.734×10-14 mol/L，质量浓度：1.547 ×10-12 g/mL）均优于目前常见文献报道值。
实施例2：
本发明的一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为0.1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中15小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液30 min，对L-半胱氨酸羧基端进行活化，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为5 mg/mL，NHS含量为1 mg/mL；
步骤3：再将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中3小时，之后再将电极用2mmol/L 牛血清白蛋白（BSA）浸泡10 min，封闭金电极上的非特异性结合位点，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为5 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.1小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、 pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，磷脂酶C 1-105 mU/L，CaCl2 2 mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中5 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为1mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为0.2mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照3小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于5 mL 、1 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.2 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛50μL，荧光素0.5 μmol，三乙胺40 μL，葡萄糖0.1 mmol，葡萄糖氧化酶10 μg，无水乙醇3 mL，水1.97 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。
实施例3：
本发明的一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为0.2 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中12小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液10min，对L-半胱氨酸羧基端进行活化，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为10 mg/mL，NHS含量为2 mg/mL；
步骤3：再将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中1小时，之后再将电极用2mmol/L 牛血清白蛋白（BSA）浸泡10 min，封闭金电极上的非特异性结合位点，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为0.1 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.5小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，磷脂酶C 102 mU/L，CaCl2 2mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中5min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中5min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为1 mmol/L，以20%无水乙醇和80%H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为0.2 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照2小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于5 mL 、10 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.5 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛100 μL，荧光素0.3 μmol，三乙胺60 μL，葡萄糖0.01 mmol，葡萄糖氧化酶2 μg，无水乙醇3 mL，水1.84 mL；
步骤7采用水和无水乙醇冲洗聚合物纳米银修饰电极，去除表面吸附。
实施例4：
本发明的一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中18小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液20 min，对L-半胱氨酸羧基端进行活化，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为20 mg/mL，NHS含量为4 mg/mL；
步骤3：再将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中3小时，之后再将电极用2mmol/L 牛血清白蛋白（BSA）浸泡10 min，封闭金电极上的非特异性结合位点，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为1 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.5小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，磷脂酶C 1 mU/L，CaCl2 2mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中15 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为5 mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为1 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照3小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于5 mL 、1 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.5 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛10 μL，荧光素1 μmol，三乙胺20 μL，葡萄糖10-3 mmol，葡萄糖氧化酶1 μg，无水乙醇3 mL，水1.97 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。
实施例5：
本发明的一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中12小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液25 min，对L-半胱氨酸羧基端进行活化，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为5mg/mL，NHS含量为1 mg/mL；
步骤3：再将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中5小时，之后再将电极用2mmol/L 牛血清白蛋白（BSA）浸泡10 min，封闭金电极上的非特异性结合位点，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为3 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.5小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，磷脂酶C 1 mU/L，CaCl2 2mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中20 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为4 mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为0.8 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照0.5小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于5 mL 、10 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.51h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛80 μL，荧光素0.3 μmol，三乙胺50 μL，葡萄糖0.01 mmol，葡萄糖氧化酶5 μg，无水乙醇3 mL，水1.97 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。

Claims (1)

1.一种基于原子转移自由基聚合的磷脂酶C传感器制备方法，其特征在于工作电极依次按照如下步骤进行：
步骤1：将干净的金电极置于浓度为0.1-1 mmol/L的L-半胱氨酸溶液中12-24小时，得到一次修饰电极，所述L-半胱氨酸溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成；
步骤2：将一次修饰电极置于EDC-NHS溶液5-30 min，得到二次修饰电极，所述EDC-NHS溶液是以0.1 mmol/L、pH=7.0的 PBS配制而成，EDC含量为5-20 mg/mL，NHS含量为1-4 mg/mL；
步骤3：将二次修饰电极置于磷脂酰乙醇胺溶液中1-6小时，之后再将电极用2 mmol/L牛血清白蛋白浸泡10 min，得到三次修饰电极，所述磷脂酰乙醇胺溶液浓度为0.1-5 mmol/L，是以50% DMSO和50% H2O配制而成；
步骤4：将三次修饰电极置于磷脂酶C溶液孵育0.1-1小时，得到磷脂酶C修饰电极，所述磷脂酶C溶液是由50 mmol/L、 pH=7.0 的Tris-HCl配制而成，其中磷脂酶C 1-106 mU/L，CaCl2 2 mmol/L；
步骤5：将磷脂酶C修饰电极置于ZrOCl2溶液中5-30 min，再将电极置于α-溴苯乙酸溶液中5-30 min，得到经引发剂修饰电极；所述ZrOCl2溶液浓度为1-5 mmol/L，以20%无水乙醇和80% H2O配制而成，所述α-溴苯乙酸溶液浓度为0.2-1 mmol/L，以40%无水乙醇和60% H2O配制而成；
步骤6：将经引发剂修饰电极置于ATRP聚合液中，光照0.5-3小时得到聚甲基丙烯醛修饰电极，将聚甲基丙烯醛电极置于1-15 mmol/L Ag(NH3)2OH溶液反应0.1-0.5 h得到聚合物纳米银修饰电极；所述ATRP聚合液的组分及配比为：甲基丙烯醛10-100 μL，荧光素0.3-3 μmol，三乙胺20-80 μL，葡萄糖10-3-0.1 mmol，葡萄糖氧化酶1-10 μg，无水乙醇3 mL，水1.82-1.97 mL；
所述步骤1~6之后均需采用水和无水乙醇冲洗，去除表面吸附。
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