CN113930327B - 用于核酸检测的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

用于核酸检测的微流控芯片及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法。所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；所述气道层包含两个独立的气道，所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭，所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道，所述微阀通过弹性薄膜与气道层的气道相连，并通过气道层气压的改变来实现微阀的开关，实现不同进样口的顺序进样。本发明将微流控与LAMP扩增技术以及CRISPR检测技术相结合，在单个芯片上实现高灵敏，高特异性的检测病毒核酸。

Description

用于核酸检测的微流控芯片及检测方法
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，涉及一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是一种急性呼吸道传染病，患者以发热、干咳、乏力等为主要表现，可导致急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。目前迫切需要一种快速、方便和准确的方法来检测新冠病毒。
定量逆转录聚合酶链反应被认为是“金标准”，常被用于新冠病毒的核酸检测，但是这种方法需要专业的人员和专门的设备，不仅速度慢且不适合床旁诊断。成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关(Cas) 核酸酶方法目前已被应用于病原体检测，这种方法速度快、特异性高且操作简单。CRISPR/Cas12a系统用于核酸检测的原理是：Cas12a酶与相应的crRNA结合成Cas12a-crRNA复合体，一旦crRNA识别到对应的靶标，Cas12a酶就会被激活，随后无差别的切割附近的单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成淬灭的荧光探针，通过监测荧光信号可实现目标序列的检测。LAMP扩增具有高度特异性，可在短时间内产生高产量的扩增子，扩增子与CRISPR-Cas系统结合，可实现对目标核酸的几个拷贝的高度特异性、灵敏的检测。
微流控芯片技术是1990年由Manz等人首次提出，它凭借体积小、试剂使用量小、反应快、易携带、可并行处理和易实现自动化等优势，在生物、化学和医药领域得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法，特别是基于CRISPR/Cas系统，结合LAMP扩增技术，提供一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特异性的核酸检测芯片。
所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；
所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I、气道II；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀④的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀①和微阀②的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀③的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；
所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭（通过改变气道中的气压以实现微阀的开闭）；
所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道；
其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室和CRISPR反应室，两个反应室之间通过流道①连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为两个进样口；
流道①包含一条与流道①呈T字交叉垂直设置的分支流道②，分支流道②的末端为进样口；
丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道③，分支流道③的末端为进样口；且分支流道③与分支流道②平行排布；
分支流道②上设有微阀①，分支流道③上设有微阀②，且微阀①与微阀②之间的连线与流道①平行；流道①上设有微阀③，且微阀③位于LAMP反应室与流道①的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀④，且微阀④位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；
微阀④通过弹性薄膜与气道层的气道I相连；微阀①、②和③通过弹性薄膜与气道层的气道II相连；
LAMP反应室和CRISPR反应室上各设有一个出样口，或者出样口位于反应室外侧并通过流道分别与各反应室连通。
优选地，用于制作气道层、流道层的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
第二方面，本发明提供一种核酸检测方法（含非疾病诊断和治疗目的），利用所述微流控芯片进行核酸检测。
具体地，所述核酸检测方法包括以下步骤：
（1）向微流控芯片的气道II中通入气体，使得微阀④打开，微阀①、②、③关闭；
（2）向微流控芯片的丫字形流道的一个进样口中通入待测液体样本，另一个进样口中通入LAMP扩增反应液，两种液体流向LAMP反应室；
（3）将微流控芯片置于60-65℃（优选63℃左右）保温30~60分钟，得到LAMP反应产物；
（4）向微流控芯片的气道I中通入气体，使得微阀④关闭，微阀①、②、③打开；
（5）向微流控芯片的分支流道③的进样口中通入双蒸水或缓冲液，使LAMP反应产物进入CRISPR反应室，同时向分支流道②的进样口中通入CRISPR反应液，流向CRISPR反应室；
（6）将微流控芯片置于37℃左右保持5~10分钟，分析所得的反应产物。
前述的方法，所述CRISPR反应液包含反应缓冲液、Cas12a蛋白、RNase 抑制剂 、crRNA和ssDNA，其中ssDNA为淬灭的荧光探针。
所述LAMP扩增反应液包含LAMP Master预混液，一对外部引物（F3和B3）、一对内部引物（FIP和BIP）以及两个环导引物（loop F和loop B）。
进一步地，步骤（6）将所述微流控芯片置于荧光检测平台，通过检测荧光信号来检测样本中的核酸。
本发明中，样本可以是病毒的DNA或RNA。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明将微流控与LAMP扩增技术以及CRISPR检测技术相结合，在单个芯片上实现高灵敏，高特异性的检测病毒核酸。
（二）采用封闭式的方式，全程无污染。
（三）实现COVID-19等冠状病毒的核酸检测，实现对病毒感染的快速应对。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中微流控芯片的整体结构示意图。
图2为图1中气道层的结构示意图。
图3为图1中流道层的结构示意图。
图中：1-气道层；2-中间层；3-流道层；4-气道I；5-气道II；6-进样口①；7-进样口②；8-进样口③；9-进样口④；10-出样口①；11-出样口②；12-LAMP反应室；13-CRISPR反应室；14-微阀④；15-微阀②；16-微阀③；17-微阀①；18-流道①；19-分支流道②；20-分支流道③。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
本实施例提供一种将LAMP扩增与CRISPR/Cas12a切割系统集成到同一个微流控芯片中，且灵敏度高、特异性高的核酸检测芯片，其结构如图1~图3所示。
该微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层1、中间层2和流道层3；
所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I（图2中4）、气道II（图2中5）；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀④的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀①和微阀②的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀③的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；
所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭（通过改变气道中的气压以实现微阀的开闭）；
所述流道层包含四个进样口（进样口①、②、③、④分别对应于图3中6、7、8、9），两个出样口（出样口①、②分别对应于图3中10、11），四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道；
其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室12和CRISPR反应室13，两个反应室之间通过流道①（图3中18）连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为进样口①、进样口②；
流道①包含一条与流道①呈T字交叉垂直设置的分支流道②（图3中19），分支流道②的末端为进样口③；
丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道③（图3中20），分支流道③的末端为进样口（图3中8）；且分支流道③与分支流道②平行排布；
分支流道②上设有微阀①（图3中17），分支流道③上设有微阀②（图3中15），且微阀①与微阀②之间的连线与流道①平行；流道①上设有微阀③（图3中16），且微阀③位于LAMP反应室与流道①的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀④（图3中14），且微阀④位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；
微阀④通过弹性薄膜与气道层的气道I相连；微阀①、②和③通过弹性薄膜与气道层的气道II相连；
LAMP反应室和CRISPR反应室上各设有一个出样口；或者，出样口①位于LAMP反应室外侧并通过流道与LAMP反应室连通，出样口②位于CRISPR反应室外侧并通过流道与CRISPR反应室连通。
其中，用于制作气道层、流道层的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
对于气道层1：
气道层需要通入气体，所以需要能够开孔。
所述气道层1的贯通孔（进气口和出气口）的半径为0.75毫米。贯通孔的大小设置与注射器针管及导管大小匹配，与所通气体无关。
所述气道层包含两个气道，气道I隔着中间层薄膜与流道层的微阀④连接，气道II隔着中间层薄膜与流道层的微阀①、②、③连接，改变气道中的气压可以实现微阀的开关，当通入正压时，微阀关闭，通过负压时，微阀打开。
对于中间层2：
因为中间层控制微阀的开关，所以中间层为弹性薄膜，弹性薄膜将气道层的空腔与下方的留到隔开，当气道层气压增大时，弹性薄膜向下变形从而关闭通道，当气道层气压减小时，弹性薄膜恢复从而打开通道。
对于流道层3：
流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP扩增区（LAMP反应室）和一个CRISPR反应区（CRISPR反应室）。
进样口①、进样口②汇集并与LAMP扩增区连接，进样口③连接于LAMP扩增区前的通道，CRISPR反应区与LAMP扩增区相连，进样口④位于LAMP扩增区与CRISPR反应区之间。
流道层的反应腔室用于相应的反应液反应，其溶剂需要一定的比例，因此需要设计合适的尺寸。
本发明中，通过外部加热来维持两个反应室的反应温度，将所述微流控芯片置于荧光检测平台，通过检测荧光信号来检测核酸。
实施例2 利用微流控芯片检测核酸的方法
以新冠病毒检测为例，具体检测方法如下：
1、取实施例1制作的微流控芯片，气道I不通气体，气道II通入气体，使得微阀④打开，微阀微阀①、②、③关闭；
2、进样口①通入SARS-COV-2病毒目标RNA（0.2-0.8μl/min），进样口②通入LAMP扩增反应液（0.2-0.8μl/min），两种液体流向LAMP扩增室12；
3、将芯片置于65℃加热40分钟；
4、气道I通入气体，气道II不通气体，使得微阀④关闭，微阀①、②、③打开；
5、进样口③通入双蒸水，将LAMP扩增室12的液体（0.2-0.8μl/min）挤入CRISPR反应区13，同时，进样口④通入CRISPR反应液（0.2-0.8μl/min），流向腔室13；
6、将芯片置于37℃反应5分钟；
7、将芯片置于蓝光下，检测荧光信号。
所述CRISPR反应液的组成如下：缓冲液、Cas12a蛋白、RNase 抑制剂 、crRNA和ssDNA，其中ssDNA为淬灭的荧光探针。
crRNA：GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU
ssDNA：6-FAM-TTATT-BHQ1
所述LAMP扩增反应液的组成如下：LAMP Master预混液（WarmStart LAMP Kit，NewEnglandBiolabs），一对外部引物（F3和B3），一对内部引物（FIP和BIP）以及两个环导引物（loop F和loop B，即LF和LB）。
引物序列如下（5′-3′）：
F3: TGTGAAGTTCTTTTCTTGTGC
B3: GACTTCAAAGTTTGCAGACA
FIP: GCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCA-CATAAGTCACATGCAAGAAGA
BIP: ACACTCTGACATTTTAGTAGCAGC-GTGACTCAACAATTAATTAGAGC
LF: AAGATTAGCAGAAGCTCTGATT
LB: GTCAGCACCTCATGGTGTAG
实验结果显示，在蓝光下，CRISPR检测区有明显的荧光，并进一步检测了其他RNA，结果显示，只有来自SARS-Cov-2的RNA有荧光信号，其他RNA没有检测到任何荧光信号。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.新冠病毒核酸检测方法，其特征在于，利用微流控芯片进行核酸检测；所述方法为非疾病诊断和治疗目的；
包括以下步骤：
（1）向微流控芯片的气道II中通入气体，使得微阀④打开，微阀①、②、③关闭；
（2）向微流控芯片的丫字形流道的一个进样口中通入待测液体样本，另一个进样口中通入LAMP扩增反应液，两种液体流向LAMP反应室；
（3）将微流控芯片置于60-65℃保温30~60分钟，得到LAMP反应产物；
（4）向微流控芯片的气道I中通入气体，使得微阀④关闭，微阀①、②、③打开；
（5）向微流控芯片的分支流道③的进样口中通入双蒸水或缓冲液，使LAMP反应产物进入CRISPR反应室，同时向分支流道②的进样口中通入CRISPR反应液，流向CRISPR反应室；
（6）将微流控芯片置于37℃保持5~10分钟，分析所得的反应产物；
所述CRISPR反应液包含反应缓冲液、Cas12a蛋白、RNase抑制剂、crRNA和ssDNA，其中ssDNA为淬灭的荧光探针；
crRNA：GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU
ssDNA：6-FAM-TTATT-BHQ1
所述LAMP扩增反应液包含LAMP Master预混液，一对外部引物F3和B3、一对内部引物FIP和BIP以及两个环导引物LF和LB；
引物序列如下：
F3: 5′-TGTGAAGTTCTTTTCTTGTGC-3′
B3: 5′-GACTTCAAAGTTTGCAGACA-3′
FIP: 5′-GCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCA-CATAAGTCACATGCAAGAAGA-3′
BIP: 5′-ACACTCTGACATTTTAGTAGCAGC-GTGACTCAACAATTAATTAGAGC-3′
LF: 5′-AAGATTAGCAGAAGCTCTGATT-3′
LB: 5′-GTCAGCACCTCATGGTGTAG-3′；
所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；
所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I、气道II；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀④的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀①和微阀②的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀③的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；
所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭；
所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道；
其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室和CRISPR反应室，两个反应室之间通过流道①连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为两个进样口；
流道①包含一条与流道①呈T字交叉垂直设置的分支流道②，分支流道②的末端为进样口；
丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道③，分支流道③的末端为进样口；且分支流道③与分支流道②平行排布；
分支流道②上设有微阀①，分支流道③上设有微阀②，且微阀①与微阀②之间的连线与流道①平行；流道①上设有微阀③，且微阀③位于LAMP反应室与流道①的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀④，且微阀④位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；
微阀④通过弹性薄膜与气道层的气道I相连；微阀①、②和③通过弹性薄膜与气道层的气道II相连；
LAMP反应室和CRISPR反应室上各设有一个出样口，或者出样口位于反应室外侧并通过流道分别与各反应室连通。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于制作气道层、流道层的材料为聚二甲基硅氧烷。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（6）将所述微流控芯片置于荧光检测平台，通过检测荧光信号来检测样本中的核酸。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，样本为病毒的DNA或RNA。
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