CN113929903B - 质子化氨基引发npca聚合制备端基高保真度聚多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及质子化氨基引发NPCA聚合制备端基高保真度聚多肽的方法，特别是质子化氨基引发N‑苯氧羰基保护的α‑氨基酸前体(NPCA)聚合，以实现端基高保真度和拓扑结构可设计性聚多肽的制备。解决了聚多肽合成方法学上的最重要的多个问题：首先，单体稳定，单体结构具有可设计性；其次，引发剂稳定，取用方便，具有可设计性；最后，实现了建立在稳定的单体和引发剂的基础上的活性可控聚合来制备聚多肽的方法，不论是在惰性气氛还是长时间敞口聚合体系，所得聚合物的质谱极为干净，抑制了现有技术涉及的几乎所有的可能副反应，且分布宽度窄，分子量接近于设计值。并且基于高度可控性实现了各种拓扑结构和端基高保真度聚多肽的合成。

Description

质子化氨基引发NPCA聚合制备端基高保真度聚多肽的方法

技术领域

本发明涉及高分子合成领域，具体涉及基于空气中稳定的质子化氨基引发剂引发水汽/热稳定的NPCA单体的活性/可控聚合来制备聚多肽的方法。

背景技术

生物系统产生的蛋白质具有自组装成复杂但高度有序的结构的能力。聚(氨基酸)或多肽是蛋白质的类似物，被认为具有生物相容性，可生物降解并显示出刺激反应特性，这使其成为靶向药物递送、基因治疗以及组织工程、催化和其他领域的理想材料。近年来，人们对开发新的合成路线和新的分子结构设计用于合成这些蛋白质类似物(即聚多肽)及其序列产生了兴趣，以可用于生物技术(人造组织、植入物)、分析(生物传感器、医学诊断)和生物矿化等众多领域(Progress in Polymer Science 2007；32(8))858-875，Sensors2017,17(7),1623.)。与传统的合成聚合物相比，聚多肽具有许多优势，因为它们可以层层自组装以形成稳定的有序构象。根据氨基酸单体的侧链取代基的不同，聚多肽可以采用规则的二级结构(α-螺旋、β-片层、环形)(Soft Matter 2008,4(12),2383-2387；Biochemistry 1967,6(6),1616-1629.)。可以组装成非天然结构的聚多肽的合成对于高分子化学家来说是一个有吸引力的挑战。

关于聚多肽的合成方法，最经典的是通过α-氨基酸羧酸酐(NCA)单体的开环聚合(ROP)进行制备。尽管可以通过ROP方法容易地合成大规模的高分子量聚多肽，但是合成的聚多肽通常具有可控性不佳的分子量和宽的分子量分布(MWD)。众所周知，NCA的合成需要有毒有害物质的参与，且其对热和水汽的敏感性使其需要苛刻的储存条件，导致其自身的不稳定性和操作上的繁琐性。除此之外，普通的伯胺具有差的稳定性和强的碱性，易于被空气氧化，具有一定的保存期限，并且通常需要手套箱和低温保存来实现长期保存，因此导致处理和使用起来非常麻烦。市售的伯胺和PEG氨基等引发剂通常用于引发NCA聚合反应以制备均聚多肽或者含有起稳定作用的亲水链段PEG，以用于生物学应用的聚多肽，但引发剂通常比较昂贵且难以长期保存。在过去的几十年中，研究人员陆续开发了多种聚合技术和引发体系来制备聚多肽(Nature Communications 2018,9,10.)，比如稀土催化剂、金属络合物、伯胺盐酸盐、HMDS和LiHMDS等被用作引发剂，以实现NCA活性和可控聚合，或者使用伯胺引发剂在高真空下进行等。但是几乎以上所有办法都难以给出关于聚合产物的完美的质谱分析，通常或多或少地伴随一些杂质峰，说明还是存在一定的副反应。

NCA的ROP可以产生均聚多肽和共聚多肽，但是它们的广泛应用受到单体初始合成的限制。因为NCA单体的制备需要使用有毒有害的化学物质，例如光气及其衍生物。为了解决这些NCA单体的局限性，Endo等引入了一种“绿色”的制备聚多肽的方法，该方法使用受保护的活性α-氨基酸氨基甲酸酯衍生物作为NCA的前体，将其加热原位转化为相应的NCA，并在伯胺等作用下引发开环聚合。这种单体稳定性更高，且甚至可以在室温下储存在空气中数月之久，并且比NCA单体更易于处理。重要的是，聚合反应通过NCA在极性溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO))中发生，并在胺的存在下加速聚合。尽管该反应的机理依然比较复杂，但已成功地用于各种聚多肽的可控合成(J.Polym.Sci.Pol.Chem.2015,53(6),829-829；J.Polym.Sci.Pol.Chem.2010,48(19),4351-4355.)。但是伯胺引发NPC的聚合体系主要存在以下问题。聚合反应可能存在多种反应路径，所得聚合物端基不明确，可控制性差，分布宽，分子量可能高于设计值并且副反应很多。所得聚合物常具有双模或者多模GPC曲线，分布宽(1.36-2.51)，并且也很少得到干净的MALDI-TOF MS质谱，来表征获得的聚多肽。

发明内容

本发明解决了聚多肽合成方法学上的最重要的几个问题。NCA/NPCA聚合体系中存在的主要问题是，聚合反应的可控制性差，分布宽，分子量高并且副反应很多；很少获得理想的GPC曲线，很少用MALDI-TOF MS来表征获得的多肽；即使出现了一些相关新技术，但是质谱里面常伴随多种杂质。本发明的方法基于质子化胺基和NPCA单体，可以将其置于空气中并进行处理，并且包括小分子氨基和新发明的空气稳定的PEG₄₅-氨基。普通的伯胺具有差的稳定性和强的碱度，易于被空气氧化，具有一定的保存期限，并且通常需要手套箱和低温保存以长期保存。此外，处理和加工非常麻烦。市售的PEG氨基通常用于引发NCA聚合反应以制备稳定的亲水链段以用于生物学应用，但它们非常昂贵且难以长期保存，而本发明的质子化氨基在空气中稳定，甚至可以放置一年，ESI MS和MALDI-TOF MS均未观察到杂质。本发明的引发剂稳定，质子化的引发剂通常为固体，取用方便，且结构稳定，以新制备的PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-为例，所得引发剂的质谱极为干净，说明纯度极高，且基于本发明的方法可以设计出多种结构(如基于PEG的端基、聚合度等)的质子化氨基的NPCA聚合的引发剂，它们在空气中放置一年之后，质谱上依然没看到任何变质的部分，而市售的PEG-伯胺类引发剂几乎没有给出完美的质谱分析来说明其高纯度。无论是惰性气体保护，还是敞口聚合，本发明均实现了端基高保真度和拓扑结构可控的聚多肽的制备。质谱研究表明所得聚多肽基本只含有基于NAM机理的产物，所得分子量分布极窄(1.03-1.2)。

在一个方面，本发明提供了式I的质子化引发剂：

R₁-NH₃+^X- I

其中R₁表示伯胺的残基，并且X表示Cl^-、BF₄ ^-、ClO₄ ^-、Br^-、PF₆ ^-、CF₃COO^-或CH₃COO^-。

在一些实施方案中，R₁包括商用的伯胺和PEG-伯胺。

在一些实施方案中，R₁选自脂族伯胺残基或者芳族伯胺残基。在一些实施方案中，R₁选自任选取代的烷基(例如C_1-30烷基或C_1-12烷基)、任选取代的烯基(例如C_1-30烯基或C_1-12烯基)或任选取代的苯基。在一些实施方案中，R₁选自烷基、被卤素或苯基取代的烷基、烯基、被卤素或苯基取代的烯基、苯基、被卤素或烷基(例如C_1-20烷基或C_1-12烷基)取代的苯基。在一些实施方案中，R₁选自：

在一些实施方案中，式I的质子化引发剂为式II的质子化PEG-氨基引发剂：

其中n为1-20000。

在一些实施方案中，n为1-10000，例如1-5000，例如1-2000，例如1-1000，例如1-500，或例如1-200。

在一些实施方案中，n为22、44或112：

分别对应于常用的PEG-1k、PEG-2k和PEG-5k的质子化氨基衍生物。

在一些实施方案中，本发明提供了式III的星型四臂质子化引发剂

在一些实施方案中，本发明的质子化引发剂使用以下方法制备：将伯胺直接和相应的酸(例如HCl、HBF₄、HClO₄、HBr、HPF₆、CF₃COOH或CH₃COOH)混合反应(例如2h)，之后沉淀出来并且进一步在MeOH/Et₂O中多次重结晶，抽滤，通过乙醚多次洗涤除去液体伯胺等其他杂质，得到高纯度的质子化引发剂用于聚合。

在一些实施方案中，本发明的质子化PEG-氨基和星型四臂质子化引发剂使用以下方法制备：在无需柱色谱操作的情况下基于羟基和酰基叠氮加热原位生成异氰酸酯的高效化学反应制备如下所示的引发剂前体PEG-Boc或星型-Boc，将前体在相应的酸(HCl、HBF₄、HClO₄、HBr、HPF₆、CF₃COOH或CH₃COOH)的条件下脱去保护基Boc，得到带有不同反离子的质子化PEG-氨基引发剂或星型四臂质子化引发剂，其中所得产物不需要经过柱色谱等操作，直接沉淀到乙醚中，即可得到质谱表征极为干净且空气中长期稳定的产物。

在一个方面，本发明提供了式IV的N-苯氧羰基α-氨基酸单体(NPCA)

其中R₂为氨基酸的侧基。

在一些实施方案中，R₂为α-氨基酸和通过化学设计的其他各类功能性氨基酸的侧基。

在一些实施方案中，式IV的NPCA单体选自：

其中，NBDab为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基基苄基保护的2,4-二氨基丁酸(NBDab NPCA)；NBO为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基苄基保护的鸟氨酸(NBO NPCA)；NBK为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基苄基保护的赖氨酸(NBK NPCA)；CbzDab为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基基苄基保护的2,4-二氨基丁酸(CbzDab NPCA)；CbzO为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基苄基保护的鸟氨酸(CbzO NPCA)；CbzK为N-苯氧羰基保护的侧基邻硝基苄基保护的赖氨酸(CbzK NPCA)；Phe为N-苯氧羰基保护的苯丙氨酸(Phe NPCA)；BocDab为N-苯氧羰基保护的侧基叔丁氧羰基保护的2,4-二氨基丁酸(BocDab NPCA)；BocO为N-苯氧羰基保护的侧基叔丁氧羰基保护的鸟氨酸(BocO NPCA)；BocK为N-苯氧羰基保护的侧基叔丁氧羰基保护的赖氨酸(BocK NPCA)；Trp为N-苯氧羰基保护的色氨酸(Trp NPCA)；Gly为N-苯氧羰基保护的甘氨酸(Gly NPCA)；Ala为N-苯氧羰基保护的丙氨酸(Ala NPCA)；Leu为N-苯氧羰基保护的亮氨酸(Leu NPCA)；Ile为N-苯氧羰基保护异亮氨酸(Ile NPCA)；Val为N-苯氧羰基保护的缬氨酸(Val NPCA)；Pro为N-苯氧羰基保护的脯氨酸(Pro NPCA)；Met为N-苯氧羰基保护的甲硫氨酸(Met NPCA)；Ser为N-苯氧羰基保护的丝氨酸(Ser NPCA)；Gln为N-苯氧羰基保护的谷氨酰胺(Gln NPCA)；Thr为N-苯氧羰基保护的苏氨酸(Thr NPCA)；Cys为N-苯氧羰基保护的半胱氨酸(Cys NPCA)；Asn为N-苯氧羰基保护的天冬酰胺(Asn NPCA)；Tyr为N-苯氧羰基保护的酪氨酸(Tyr NPCA)；His为N-苯氧羰基保护的组氨酸(His NPCA)。

在一些实施方案中，本发明的NPCA单体通过以下方法制备：

在水相中加入氨基酸和NaHCO ₃，待氨基酸溶解后，将噻唑衍生物溶解于THF中，缓慢加入，室温反应2-3h。

优选地，氨基酸:NaHCO₃:苯氧羰基巯基噻唑的摩尔比为1:1:1至1:1.5:1.5。

该方法通过氨基酸的氨基和苯氧羰基巯基噻唑在水相中高效反应，使用弱碱性的NaHCO₃增强氨基酸内盐的溶解性和氨基去质子化。氨基酸的氨基和苯氧羰基巯基噻唑的反应很快，约3h即可实现单体制备，所得粗产物经过柱色谱分离之后产率可以达到82％，高于已知文献中的结果。除此之外，该方法条件温和，室温进行，采用弱碱性反应条件，没有HCl副产物生成。对所有氨基酸，包括各种不同侧基的单体的制备具有普适性，可应用于各类聚合用的普通氨基酸单体或者功能性氨基酸单体的制备。

与NCA相比，本发明所获得的NPCA达到了克级制备，方法简单，具有所有α-氨基酸的通用性，且该过程不涉及光气等高毒物质。它是绿色环保且易于操作，并且是稳定的，可以直接重结晶。处理后，所获得的单体在数月内几乎没有变化。该单体稳定，对水和氧气不敏感，直接在通风橱中操作即可。并且其可在空气中储存数月依然稳定，不会发生自聚等反应。所涉及的结构具有可设计性，因此本发明可以高效地使用巯基噻唑衍生物合成多种功能性NPCA单体，产率高达82％。

在一个方面，本发明提供了一种利用本发明的质子化引发剂和N-苯氧羰基α-氨基酸单体制备聚多肽的方法：

其中m为1-800；R₁和R₂如本文所限定，

其中聚合的加热温度为50-80℃，例如70℃。

在一些实施方案中，m为例如1-700，例如1-600，例如1-500，例如1-400，例如1-300，例如1-200，例如1-100，例如1-50，例如1-40，例如1-30，例如1-20，或例如1-10。

在一些实施方案中，该方法可以用于制备均聚物、无规共聚物、星形聚合物、星形(多嵌段)、支化聚合物刷和线型多嵌段共聚物等各种拓扑结构的聚多肽。

具体地，该方法可以具体包括以下步骤：在手套箱中或者惰性气体保护下将单体NPCA和引发剂以化学计量比取好(例如摩尔比为1:1-800:1)，之后加入到反应瓶中，加入溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)等(例如DMAc)，使得单体和引发剂溶解，且初始的单体浓度[M]₀＝0.25M。之后置于手套箱/惰性气体保护下、高真空环境中或者直接在通风橱中敞口且不加任何防护措施，于50-80℃(例如70℃)下反应24-72h，反应时间长短取决于投料比目标聚合度。最终的聚合物沉淀到过量乙醚中离心除去上清液或者过滤，减压抽干即可得到终产物。

本发明实现了建立在以上两种稳定的单体和引发剂的基础上的活性可控聚合来制备聚多肽的方法。原理在于：氨基引发NPCA在加热过程中原位生成的NCA聚合，实现NCA的快速消耗，使得NCA的瞬时浓度很低。且端基氨基在聚合过程中处于休眠种(质子化)和活性种(去质子化)的平衡，抑制了氨基的碱性以及亲核性相关的副反应(活性单体机理、链转移、链终止等)。且原位生成的苯酚进一步抑制了氨基碱性相关的活性单体机制等副反应。不论是在惰性气体氛围还是长时间的敞口聚合体系，所得聚合物的质谱极为干净，只遵循NAM机理，抑制了文献已报道的办法的几乎所有可能的副反应，且所的聚合物分布宽度窄(1.03-1.2)，所得聚合物分子量接近于设计值。

本发明中的聚合的机理路径如下：

基于高度的可控性，该方法实现了各种拓扑结构和高保真度聚多肽的合成。此外，本发明的方法具有出色的可控性，并且聚合肽通过凝胶渗透色谱(GPC)证实多分散性(PDI)非常窄(1.03-1.2)。此外，本发明的聚合体系可以在敞口空气中加热和聚合。所得产物经MALDI-TOF MS质谱证实不含杂质，完全基于NAM机理，表明聚合不受水和氧的影响，没有副反应，可以通过在空气中的敞口聚合实验来实现聚肽的方便制备和摆脱对昂贵复杂实验条件的依赖。因此，GPC和MALDI-TOF MS质谱验证表明在惰性气体、真空以及敞口聚合中都仅遵循常规胺机理(NAM)，且分子量分布极窄(1.03-1.2)。

克级别的多肽制备及其良好的可控性可用于合成各种均聚多肽、无规共聚多肽、嵌段共聚多肽、支化聚多肽分子刷以及基于星形大分子引发剂的多嵌段(5嵌段)和9嵌段等顺序共聚物的一锅法制备。通过一系列的均聚和一锅法在敞口容器中制备多嵌段(9嵌段)共聚肽，证明了本发明系统的稳健性和操作简便性以及所得聚合物产物干净，无杂质，不要求苛刻的实验条件。

其中，除了上面的通用聚合方法外，本发明还提供了所涉及的各类拓扑结构聚多肽的制备方法。

在一些实施方案中，本发明提供了制备两亲嵌段共聚物的方法，其特点在于由引发剂(例如PEG-NH₃ ⁺Cl)加热引发NPCA聚合，所制备的两亲嵌段共聚物可包括均聚的两亲嵌段共聚物和两亲嵌段无规共聚物。

在一些实施方案中，本发明提供了制备无规共聚物的方法，其中使用引发剂引发各类NPCA一锅法制备式V的无规共聚物：

其中各R₂可以是相同的或不同的，例如各R₂可以是不完全相同的。

在一些实施方案中，本发明提供了制备顺序明确的多嵌段共聚物的方法，其中通过一锅法顺序加料多种单体并且进行顺序共聚来制备式VI的顺序明确的多嵌段共聚物：

其中各R₂可以是相同的或不同的，例如各R₂可以是不完全相同的。在一些实施方案中，聚合度范围为5-800。

其中一个典型的8嵌段两亲共聚物的结构如下：

其中一个典型的9嵌段共聚物的结构如下：

在一些实施方案中，本发明提供了制备聚多肽分子刷的方法，其中所述方法包括：通过质子化引发剂先引发第一单体的聚合，之后将所得聚合物用HCl脱去Boc得到侧基质子化氨基的大分子引发剂，然后引发第二单体的聚合，得到式VII的聚多肽分子刷。

其中第一单体选自BocK、BocO或BocDab，分别对应x＝1、2或3；

R₂表示第二单体中的氨基酸残基，例如可以涉及上述任意一种以上的单体或者以上多种单体的组合；

m₁和m₂各自独立地为1-800。

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施方案的基于2,4-二氨基丁酸的NPCA单体(NBDab)的核磁共振氢谱和质谱的表征结果。

图2示出了根据本发明一个实施方案的基于鸟氨酸的NPCA单体(NBO)的核磁共振氢谱和质谱的表征结果。

图3示出了根据本发明一个实施方案的基于鸟氨酸的NPCA单体(NBO)在空气中稳定以及可大量制备的示意图。

图4示出了根据本发明一个实施方案的4-[(叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酰叠氮化物的核磁共振氢谱和碳谱的表征结果。

图5示出了根据本发明一个实施方案的PEG-NH₃ ⁺Cl^-引发剂及其表征和引发NPCA聚合的结果。

图6示出了根据本发明一个实施方案的正丁胺四氟硼酸盐引发剂的核磁共振氢谱、碳谱和氟谱的表征结果。

图7示出了根据本发明一个实施方案的质子化星型引发剂的核磁共振氢谱的表征结果。

图8示出了根据本发明一个实施方案的质子化氨基引发剂引发可控NPCA聚合的凝胶渗透色谱结果。

图9示出了本发明的质子化氨基和伯胺引发NPCA聚合的凝胶渗透色谱对比，以及质子化氨基引发NPCA聚合的MALDI-TOF质谱。

图10示出了根据本发明一个实施方案的聚多肽分子刷的凝胶渗透色谱和核磁氢谱谱图。

图11示出了根据本发明一个实施方案的星型5嵌段聚多肽的制备及其结果。

图12示出了根据本发明一个实施方案的PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-引发顺序加料的NPCA单体共聚制备八嵌段序列聚多肽的结果。

图13示出了根据本发明一个实施方案的质子化氨基在敞口条件下引发NPCA进行均聚和多嵌段共聚合的MALDI-TOF质谱和凝胶渗透色谱结果。

具体实施方式

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

首先，利用巯基噻唑中间体可以高产率合成各种NPCA单体。

其次，基于稳定的质子化引发剂，来引发稳定的NPCA进行聚合。并利用质谱、GPC和核磁等来研究其聚合动力学和聚合机理。并比较了相对于传统伯胺引发剂的优势。

进一步，实现各种均聚、无规共聚、嵌段共聚、多嵌段一锅法顺序共聚以及制备聚多肽刷、星型五嵌段共聚多肽来实现端基高保真度以及拓扑结构聚多肽的合成与设计。

通过敞口体系的聚合可操作性来说明聚合体系的高度可控性和对水氧不敏感性。通过质谱、GPC以及多嵌段(9嵌段)顺序一锅法制备来进行说明。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制

实施例

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

聚乙二醇单甲醚(PEO₄₅-OH；M_n～2.0kDa，M_w/M_n＝1.04；平均聚合度，DP为45)购自厦门sino-PEG生物技术有限公司。Boc-Gln-OH、Z-Gln-OH、L-苯丙氨酸、四丁基氢氧化铵(40重量％甲醇溶液)、氯化氢的甲醇溶液(4.0M)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)、4-(氨基甲基)苯甲酸和碳酸二苯酯购自安耐吉化学有限公司，并直接使用。L-鸟氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和氢溴酸购自阿拉丁试剂有限公司。H-Lys(Boc)-OH和(二乙酰氧基碘)苯(PIDA)购自上海九鼎化工有限公司。H-Orn(Boc)-OH购自吉尔生化，四氟硼酸-乙醚络合物(50-55wt％HBF₄)购自百灵威科技公司。无水N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)购自Thermo Fisher Scientific Inc.，并在使用前存放在氮气手套箱中。正丁胺购自Sigma-Aldrich，并在使用前通过氢化钙(CaH₂)干燥和蒸馏纯化。正丁胺盐酸盐购自东京化学工业株式会社，并在使用前从乙醚/MeOH中重结晶。溴化锂(LiBr)购自Sigma-Aldrich。L-色氨酸、叠氮化二苯磷酰(DPPA)、乙酸钠(NaOAc)、氢氧化钠(KOH)、碳酸钾(K₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、二月桂酸二丁锡(DBTL)、硫酸钠(NaSO₄)、1,4-二氧六环、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、乙腈(MeCN)、四氢呋喃(THF)、甲醇、正己烷、丙酮、乙醇、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯、五水合CuSO₄、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、吡啶、季戊四醇、六氟磷酸、高氯酸、三乙胺(TEA)以及所有其他试剂/溶剂均购自国药控股化学试剂有限公司。去离子水用Milli-Q SP水处理系统(Millipore)处理，比电阻率为18.4MΩcm。

实施例1：NBDab的合成

制备Boc-Gln-OH(15.0g，60.9mmol，1.0eq)在THF(320mL)和水(80mL)中的溶液混合物，预冷却至～4℃。加入PIDA(23.54g，73.09mmol，1.2eq)。搅拌8小时后，将反应混合物蒸发至干，将残余物溶于水(250mL)中，并用EA(3×60mL)萃取。丢弃有机层，并将水层蒸发至干。将残余物用冷氯仿洗涤3次，并在真空下干燥，将获得的浅黄色固体NB-1直接用于下一步骤(9.91g，产率：74.56％)。

NB-2的合成。在冰水浴中向搅拌的NB-1(8.0g，36.7mmol，1.0eq)和H₂O(100mL)的溶液中滴加NaOH水溶液(1.0M)以调节溶液pH值约为10。加入新合成的氯甲酸邻硝基苄基酯(9.48g，43.99mmol，1.2eq)，并将反应混合物在室温下在黑暗中搅拌过夜。反应完成后，将溶液用2.0N HCl调节至pH～2-3，并用EA(3×100mL)萃取。将有机相在减压下蒸发至干，并将残余物通过硅胶上的柱色谱进一步纯化，使用PE/EA(2/1，v/v)作为洗脱剂。真空干燥后，获得目标产物，为稠固体(9.17g，产率：63.0％)，将NB-2直接用于下一步。

NB-3的合成。向NB-2(8.0g，0.02mol，1.0eq)在二氯甲烷(DCM，100mL)中的溶液中缓慢加入TFA，并使反应混合物在环境温度下在黑暗中搅拌。通过TLC监测反应进程，直到原料完全消耗为止。用饱和碳酸钠水溶液将溶液的pH调节至～9，然后用DCM(3x50 mL)萃取。保留水相，并将溶液的pH调节至～7。在冰水浴中冷却后，通过过滤收集形成的沉淀物。真空干燥后，获得NB-3，为白色固体粉末(4.85g，产率：81.1％)。

前体NBDab的合成。NB-3(2.0g，6.73mmol，1.0eq)、去离子水(8mL)和碳酸钠(0.71g，6.73mmol，1.0eq)的混合物在50℃下搅拌，逐滴加入(S)-1,3-苯并噻唑-2-基-O-苯基硫代碳酸酯(2.03g，7.40mmol，1.1eq)的THF(24mL)溶液。剧烈搅拌反应混合物，并通过TLC(EA洗脱液，Rf～0.5)监测进程。约3小时后，将混合物用30mL碳酸氢钠水溶液(20wt％)稀释。蒸发掉有机溶剂后，将混合物过滤。剩余的水相用2.0N HCl酸化至pH～3，并用EA(3×200mL)萃取。有机层用无水硫酸钠干燥并过滤。蒸发所有溶剂后，将粗产物通过硅胶柱色谱法进一步纯化，使用DCM/EA(2/1，v/v)作为洗脱剂。通过从正己烷/EA混合物中重结晶进一步纯化产物，得到前体NBDab(图1)，为白色粉末(2.15g，收率：80.1％)。

实施例2：NBO的合成

向圆底烧瓶中加入L-鸟氨酸盐酸盐(15.0g，88.97mmol，1.0eq)和去离子水(500mL)。在0℃下，向该混合物中缓慢加入氢氧化钠(7.11g，177.9mmol，2.0eq)。接下来，添加5水合CuSO₄(11.12g，44.5mmol，0.5eq)，将反应混合物在室温搅拌6h，然后将其冷却至0℃。在冰水浴中，加入在THF(80mL)中的氯甲酸邻硝基苄酯(23.01g，106.8mmol，1.2eq)，以及碳酸氢钠(8.96g，106.8mmol，1.2eq)。将其在室温下搅拌过夜，将形成的蓝色固体残余物通过过滤收集，用水洗涤，干燥，并立即用于随后的步骤中，将上述中间产物在80℃下于700mL水中分散于剧烈搅拌的悬浮液中。90℃下，加入EDTA(25.72g，76.51mmol，0.86eq)，将反应混合物搅拌几分钟，直到大部分固体溶解到溶液中，过滤。滤饼用热水洗涤，冷却至室温后，产物开始重结晶并从溶液中沉淀出来。通过抽滤收集固体产物，并用水(3×80mL)，THF(3×80mL)和乙醚(3×80mL)洗涤。为了进一步纯化，将获得的白色固体溶解在酸性水性介质(pH 2.0，200mL)中，并过滤除去不溶的残余物，并将滤液的pH调节至约7.4。过滤新形成的白色沉淀物，得到呈白色粉末的产物(23.6g，产率：85.2％)。

前体NBO的合成(方案S4)。将2-硝基苯甲氧基羰基保护的鸟氨酸NBOP(10.0g，32.12mmol，1.0eq)在80mL水和碳酸钠(3.4g，32.12mmol，1eq)中的混合物中加热至50℃，逐滴加入(S)-1,3-苯并噻唑-2-基-O-苯基硫代碳酸酯(10.15g，35.33mmol，1.10eq)的THF(240mL)溶液。剧烈搅拌混合物，并通过TLC(EA，R_f＝0.7)监测反应进程。3小时后，将反应混合物用300mL碳酸氢钠水溶液(20wt％)稀释。然后通过旋转蒸发除去有机溶剂，并滤出沉淀物。接着，用2.0N HCl将水层酸化至pH～3，并用EA(3×300mL)萃取。合并有机层，并用无水硫酸钠干燥。除去所有溶剂后，将残余物通过硅胶柱色谱法进一步纯化，使用DCM/EA(2/1，v/v)作为洗脱剂。将获得的粗产物从正己烷/EA中重结晶，得到前体NBO(图2和图3)，为白色粉末(11.3g，收率：81.6％)。

实施例3：4-[(叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酰叠氮的合成

在THF(200mL)和水(50mL)的混合物中搅拌4-(氨基甲基)苯甲酸(5.0g，32.02mmol，1.0eq)和Boc酸酐(7.69g，35.22mmol，1.1eq)。在冰水浴中冷却至0℃后，添加饱和NaHCO₃水溶液，直到溶液的pH值更改为～8。将反应混合物在环境温度下搅拌16小时，TLC显示原料完全消耗。减压除去THF后，加入200mL水，使用2M HCl将溶液pH调节至～2-3，通过抽滤收集形成的沉淀，用水(100mL)和二乙醚(3x100 mL)洗涤。然后真空干燥，得到目标化合物，为白色固体(7.51g，产率：90.6％)。

在冰水浴中向4-[(叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酸(7.0g，27.86mmol，1.0eq)在THF(100mL)中的搅拌悬浮液中加入DPPA(9.20g，33.43mmol，1.2eq)和TEA(3.04g，30.09mmol，1.08eq)。将反应混合物在室温搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程；反应过程通过HPLC进行。反应完成后，减压蒸发溶剂，并将粗残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，使用PE/EA(6/1，v/v)作为洗脱剂。真空除去溶剂，得到目标产物(图4)，为白色晶体(6.32g，产率：82.1％)。

实施例4：PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-的合成

在本实施例中，n＝44。

将PEG₄₅-OH(3.0g，1.47mmol，1eq)、4-[(叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酰叠氮化物(528.01mg，1.91mmol，1.3eq)、DBTL(60μL)和甲苯(100mL)加入到两口圆底烧瓶中，共沸蒸馏出约60mL的甲苯后，将混合物在85℃下搅拌6h。减压除去所有溶剂后，将粗产物溶解在THF(10mL)中，并沉淀到二乙醚(200mL)中。收集沉淀物，并且将溶解-沉淀循环重复3次。真空干燥后，获得白色粉末状的PEG₄₅-胺-Boc(2.86g，收率：86.0％)。

将PEG₄₅-胺-Boc(400mg，0.175mmol，1.0eq)称重到含有MeOH(5mL)的10mL圆底烧瓶中。然后加入HCl的MeOH溶液(4.0M)(306.3μL，1.225mmol，7.0eq)。在25℃下搅拌6小时后，减压除去溶剂，将粗产物溶解在THF(4mL)中，并沉淀到二乙醚中；沉淀出乙酸乙酯。收集沉淀物，并将溶解-沉淀循环重复3次。真空干燥后，获得白色粉末状产物(286mg，产率：74.8％)，引发剂的表征及其引发聚合的结果示于图5中。

实施例5：n-BuNH₃ ⁺BF₄ ^-引发剂的合成。

将正丁胺(200mg，27.3mmol，1.0eq)溶解于四氟硼酸-乙醚络合物(442.8mg，2.73mmol，1eq)中，然后过滤，收集粗产物，用乙酸乙酯重结晶两次，高真空干燥后，得到白色固体产物(232.9mg，收率：53.0％)。储存在-20℃，表征结果示于图6中。

实施例6：Boc保护的四臂星型氨基的合成

将季戊四醇(200.0mg，1.468mmol，1.0eq)和4-[(叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酰基叠氮化物(2.11g，7.64mmol，5.2eq)以及催化量的四氢呋喃酯加入到圆底烧瓶中。加入DBTL(40uL)和无水甲苯(20mL)。共沸蒸馏出所有溶剂后，加入20mL无水甲苯，并在室温下进行另一轮共沸蒸馏。然后加入无水NMP(20mL)，并将混合物在85℃搅拌6h。将反应混合物倒入EA(600mL)中，并用水(3×160mL)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，并在减压下除去溶剂。粗产物经硅胶柱色谱纯化，使用PE/DCM(1/1，v/v)作为洗脱剂，并在减压下进一步干燥，得到目标产物(图7a)，为浅黄色油状物(1.40g，收率：84.4％)。

实施例7：质子化的四臂星形氨基引发剂的合成

用于制备四臂星形star-NH₃ ⁺Cl^-引发剂的典型程序如下所述。向圆底烧瓶中，加入Boc保护的四臂星胺(1.0g，0.886mmol，1.0eq)和甲醇(5mL)，然后加入4.0M的HCl的甲醇溶液(7.96mmol，9.0eq)。将混合物在室温搅拌6小时。将混合物直接沉淀到EA(100mL)中，并通过离心收集产物。在真空下干燥后，获得最终产物(图7b)，为白色粉末(554mg，产率：71.5％)。

实施例8：质子化胺引发的NPCA前体的典型聚合

在使用前，将所有NPCA前体和引发剂在室温下真空干燥至少24小时，并存储在N₂气氛中。以下为在手套箱中使用n-BuNH₃ ⁺Cl^-引发剂聚合NBO前体的通用步骤。将NBO前体置于反应瓶中，并加入无水DMAc。然后以不同的单体和引发剂的摩尔比([M]₀/[I]₀)(范围是1-800)添加质子化胺引发剂，同时保持[M]₀恒定为0.25M。举例如下，将反应混合物在70℃的手套箱中搅拌不同的持续时间。以[M]₀/[I]₀＝100的比率为例，将NBO前体(100mg，0.23mmol，100eq)置于反应瓶中，并溶解在DMAc(860uL)中。然后加入n-BuNH₃ ⁺Cl^-引发剂(溶解于DMAc中，6mg/mL)(42.4uL，0.0023mmol，1.0eq)，将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌72h聚合完成后，将溶液混合物沉淀到过量的冷的乙醚中，并在真空烘箱中干燥，得到PNBO，为淡黄色固体(产物的相关表征参见图8a和图9)。

实施例9：由PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-引发的NBO前体的聚合

在手套箱中，将NBO前体(100mg，0.23mmol)放入玻璃反应瓶中，并溶于DMAc(900uL)中，初始单体浓度[M]₀为0.25M。PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-以不同的[M]₀/[I]₀进料比加入，将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌，聚合完成后，将反应液通过沉淀到过量的乙醚中，离心收集，并在真空干燥箱中干燥获得多肽嵌段共聚物产物(表征结果示于图8b、8c和8d)。

实施例10：质子化PEG₄₅-b-PLys₃₀引发的多肽刷的合成

在手套箱中，将BocK前体(100mg，0.273mmol，32eq)放入玻璃反应瓶中，并溶于DMAc(1.0mL)中。加入PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-(18.96mg，0.0085mmol，1.0eq)。将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌。～24小时后聚合完成，将反应混合物沉淀到过量的乙醚中。在真空烘箱中干燥后，获得PEG₄₅-b-PBocK₃₀(85.3mg，产率：72.7％)；通过¹H NMR分析确定PBocK嵌段的聚合度(DP)。接下来，将PEG₄₅-b-PBocK₃₀(40mg)溶解在二氧六环(5mL)中的2M HCl中。将反应混合物在室温下搅拌6小时，然后沉淀到过量的乙醚中。随后离心和在真空烘箱中干燥，得到质子化的PEG₄₅-b-PLys₃₀二嵌段共聚物(24.72mg，产率：78.26％)，其用作多肽刷合成的大分子引发剂(图10a)。

在手套箱中，将NBO前体(200mg，0.464mmol)放入玻璃反应瓶中，并溶解在无水DMAc(1.9mL)中。然后加入PEG₄₅-b-PLys₃₀(8.708mg，0.0384mmol质子化的侧基胺基)。将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌。聚合完成约48小时后，将反应混合物沉淀到过量的乙醚中，并在真空烘箱中进一步干燥，得到目标多肽刷(图10a和10b)，为淡黄色固体(163.32mg，收率：78.2％)。

实施例11：制备星型五嵌段共聚多肽

通过质子化四臂星形胺(star-NH₃ ⁺Cl^-)作为引发剂通过NPCA前体的一锅顺序聚合合成四臂星形嵌段共聚多肽。在氮气保护的手套箱中，将NBO前体(50mg，0.1159mmol)放在玻璃反应瓶中，并溶解在DMAc中，以达到的单体浓度[M]₀为0.25M。然后加入引发剂质子化四臂星形胺star-NH₃ ⁺Cl^-(3.62mg，0.00414mmol)。将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌。在第一嵌段的聚合完成之后，添加在DMAc中溶解好的的NBO前体(42.9mg，0.09944mmol)，进料单体浓度为0.25M，作为第二嵌段的反应单体，将混合物在70℃搅拌直至聚合完成。按照相似的程序进行第三次，第四次和第五次单体进料，并保持单体浓度为0.25M，即NBO前体(47.5mg，0.110mmol)、NBK前体(83.38mg，0.187mmol)和NBK前体(83.25mg，0.187mmol)连续加入反应瓶中，每个嵌段反应24h，各嵌段的产物表征参见图11。通过沉淀到过量的乙醚中并在真空烘箱中干燥，获得了最终的四臂星形嵌段共多肽，为浅黄色固体。

实施例12：顺序一锅法合成八嵌段聚多肽

在本实施例中为PEG₄₅。R₁-R₁₀分别对应于NBK、NBO、NBDab、Phe、NBDab、NBO、NBK的NPCA的侧基，分别归属于聚合物嵌段2-8对应的的单体。

通过使用PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-作为引发剂的一锅顺序聚合来合成PEG-KODabFDabOK八嵌段共聚多肽。在手套箱中，将NBK前体(100mg，0.22mmol)前体放入玻璃反应瓶中，并溶于DMAc中，以达到[M]₀的进料单体浓度0.25M。PEG₄₅-NH₃ ⁺Cl^-(49.85mg，0.022mmol)，并将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌。聚合完成后，将其他单体进料(DMAc溶液，0.25M)按以下所述顺序依次加入反应瓶中：第三嵌段的NBO前体(84.8mg，0.196mmol)，NBDab前体(73.8mg，0.178mmol)对于第四嵌段，Phe前体(46.2mg，0.162mmol)用于第五嵌段，NBDab前体(62.8mg，0.153mmol)用于第六嵌段，NBO前体(60.9mg，0.141mmol)用于第七嵌段，NBK前体(59.3mg，0.133mmol)。每次扩链后，取等分试样的聚合溶液用于GPC和¹H NMR分析(结果示于图12中)。最终的八嵌段共聚多肽PEG₄₅-b-PNBK₁₀-b-PNBO₁₀-b-PNBDab₁₀-b-PPhe₁₀-b-PNBDab₁₀-b-PNBO₁₀-b-PNBK₁₀(PEG-KODabFDabOK)，通过沉淀到过量的乙醚中并在真空烘箱中干燥，得到淡黄色固体。具体结构如下：

实施例13：n-BuNH₃ ⁺Cl^-在暴露于空气中的开放容器中引发的NPCA前体的聚合

将NBK前体置于反应瓶中并溶于无水DMAc中。然后以不同的[M]₀/[I]₀摩尔比添加质子化胺引发剂，同时保持[M]₀恒定为0.25M。将反应混合物在70℃的手套箱中搅拌不同的持续时间。以50的[M]₀/[I]₀比率为例，将NBK前体(100mg，0.23mmol，100eq)置于反应瓶中并溶解在DMAc(860uL)中。然后加入n-BuNH₃ ⁺Cl^-引发剂(在DMAc中为6mg/mL)(42.4uL，0.0023mmol，1.0eq)，反应混合物直接暴露在空气中(即没有塞子，没有任何惰性气体保护)，将反应混合物在手套箱中于70℃搅拌72h聚合完成后，将溶液混合物沉淀到过量的冷乙醚中，并在真空烘箱中干燥，得到PNBO，为淡黄色固体，相关产物的表征参见图13a和13b。

实施例14：在空气中敞口顺序一锅法合成9嵌段聚多肽

本实施例中，R为n-Butyl，为正丁胺盐酸盐引发剂。R₁-R₉分别对应于CbzO、NBK、Trp、CbzO、NBK、Trp、CbzO、NBK、Trp的NPCA的侧基，分别归属于PCbzO₁₀-b-PNBK₁₃-b-PTrp₂₅-b-PCbzO₃₄-b-PNBK₂₉-b-PTrp₂₅-b-PCbzO₂₃-b-PNBK₂₉-b-PTrp₃₀(OKWOKWOKW)聚合物嵌段1-9对应的的单体。具体步骤如下。

在暴露于空气中的开放容器中合成，使用n-BuNH₃ ⁺Cl^-引发剂通过一锅顺序聚合制备九嵌段共聚物。将CbzO前体(50mg，0.129mmol)放入玻璃反应瓶中，并溶于DMAc(250uL)中，使得[M]₀为0.25M。n-BuNH₃ ⁺Cl^-(浓度6mg/mL于DMAc，0.0125mmol)，将玻璃反应瓶直接暴露于空气中，不加塞子，将反应混合物在通风橱中于70℃搅拌。将第二个嵌段的前体NBK(60mg，0.135mmol)(溶于DMAc中；0.25M)加入反应瓶中，继续在70℃搅拌，直到新加入的NBK前体完全聚合。类似地，按照以下顺序将单体进料(在DMAc中先溶解好，浓度为0.25M)加入反应瓶中：Trp前体(60mg，0.185mmol)，CbzO前体(100mg，0.259mmol)，NBK前体(100mg，0.112mmol)，Trp前体(37mg，0.114mmol)，CbzO前体(37mg，0.096mmol)，NBK前体(50mg，0.112mmol)和Trp前体(60mg，0.185mmol)。每次扩链后，将反应混合物的取样少量以进行进一步的¹H NMR和GPC分析(结果参见图13c和13d)。最终的非嵌段共多聚肽PCbzO₁₀-b-PNBK₁₃-b-PTrp₂₅-b-PCbzO₃₄-b-PNBK₂₉-b-PTrp₂₅-b-PCbzO₂₃-b-P NBK₂₉-b-PTrp₃₀(OKWOKWOKW)，通过沉淀到过量的乙醚中并在真空烘箱中干燥过夜，获得淡黄色固体形式的产物。具体结构如下：

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (27)

1.一种利用质子化引发剂和N-苯氧羰基α-氨基酸单体制备聚多肽的方法：

其中所述质子化引发剂选自：

(1)式I的质子化引发剂

R₁-NH₃ ⁺X^- 式I

其中R₁表示伯胺的残基，并且X表示Cl^-、BF₄ ^-、ClO₄ ^-、Br^-、PF₆ ^-、CF₃COO^-或CH₃COO^-。

(2)式II的质子化PEG-氨基引发剂：

其中n为1-20000，

(3)式III的星型四臂质子化引发剂

并且

其中所述N-苯氧羰基α-氨基酸单体为式IV的N-苯氧羰基α-氨基酸单体

其中R₂表示氨基酸的侧基；

其中m为1-800；

其中反应温度为50-80℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中R₁选自脂族伯胺残基或芳族伯胺残基。

3.根据权利要求1所述的方法，其中R₁选自任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的苯基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中R₁选自烷基、被卤素或苯基取代的烷基、烯基、被卤素或苯基取代的烯基、苯基、被卤素或烷基取代的苯基。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述烷基是C_1-30烷基。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述烷基是C_1-12烷基。

7.根据权利要求1所述的方法，其中R₁选自：

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述N-苯氧羰基α-氨基酸单体选自：

9.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-10000。

10.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-5000。

11.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-2000。

12.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-1000。

13.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-500。

14.根据权利要求1所述的方法，其中n为1-200。

15.根据权利要求1所述的方法，其中n为22、44或112。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述单体与所述引发剂的摩尔比为1:1-800:1。

17.根据权利要求1所述的方法，其中反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)。

18.根据权利要求1所述的方法，其中反应溶剂是N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)。

19.根据权利要求1所述的方法，其中反应时间为24-72h。

20.根据权利要求1所述的方法，其中反应在惰性气体、真空或敞口条件下进行。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应温度为70℃。

22.根据权利要求1所述的方法，其中使用多种单体一锅法制备式V的无规共聚多肽：

其中各R₂是相同的或不同的，m为5-800。

23.根据权利要求1所述的方法，其中通过一锅法顺序加料多种单体并且进行顺序共聚来制备式VI的顺序明确的多嵌段共聚物：

其中各R₂是相同的或不同的，聚合度范围为5-800。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述顺序明确的多嵌段共聚物为下式的8嵌段两亲共聚物：

或

下式的9嵌段共聚物：

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚多肽为式VII的聚多肽分子刷：

所述方法包括：通过质子化引发剂先引发第一单体的聚合，之后将所得聚合物用HCl脱去Boc得到侧基质子化氨基的大分子引发剂，然后引发第二单体的聚合，

其中

所述第一单体选自BocK、BocO或BocDab，

其中x分别为1、2或3；

R₂独立地表示所述第二单体中的氨基酸残基，所述第二单体选自：

；

并且

m₁和m₂各自独立地为1-800。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述N-苯氧羰基α-氨基酸单体通过以下过程制备：

在水相中加入氨基酸和NaHCO₃，待氨基酸溶解后，将噻唑衍生物溶解于THF中，缓慢加入，室温反应2-3h。

27.根据权利要求26所述的方法，其中氨基酸:NaHCO₃:苯氧羰基巯基苯并噻唑的摩尔比为1:1:1至1:1.5:1.5。

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