CN113929744A

CN113929744A - 一种靶向Aβ42纤维体的类肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113929744A
Application number: CN202111034204.3A
Authority: CN
Inventors: 胡志远; 王子华; 孙梦琦
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113929744B

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种靶向Aβ42纤维体的类肽及其制备方法与应用。本发明的类肽包括：第一亚单元：半胱氨酸、第二亚单元：1,4‑丁二胺、第三亚单元：异丁胺、第四亚单元：乙醇胺、第五亚单元：糠胺、第六亚单元：异丁胺和第七亚单元：1,4‑丁二胺。本发明的类肽可以结合表面等离激元共振成像技术检测阿尔兹海默病或遗忘型轻度认知障碍，具有特异性高、灵敏度强的优点。此外，本发明可无创直接检测血液中的Aβ42纤维体含量，可通过识别血清中的AD标志物淀粉样蛋白进而对AD患者和正常人进行有效地区分，为诊断和监控阿尔茨海默症或遗忘型轻度认知障碍疾病进展和药物研发提供了新的液体活检方法与思路。

Description

一种靶向Aβ42纤维体的类肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，涉及一种靶向Aβ42纤维体的类肽及其制备方法与应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病之一，其临床表现包括进行性记忆障碍、认知功能障碍和语言障碍。目前，60岁以上人口中阿尔兹海默病患者占据1％，且发病率每五年翻一番，人数众多，这对患者和社会都带来了巨大的挑战。AD作为一种老年人的常见病、多发病和高负担疾病，已经成为全球科学家们最关注的领域之一。

不同淀粉样蛋白疾病发生病变的部位有所不同，主要涉及神经系统、心脏、肝脏、肾脏等。某些蛋白质单体本身无毒性或毒性很小，但它们可聚集成具有毒性作用的寡聚物(oligomer)或纤维状物(fibril)而引起一系列疾病，如β-amyloid(Aβ)可引起AD，α-synuclein可引起PD。阿尔茨海默氏病的发病机制尚不清楚，但最被广泛接受的假设涉及到β-淀粉样蛋白(Aβ)级联。根据这一假设，Aβ在大脑中的积累是导致阿尔茨海默氏症诱导和加重的主要原因。当Aβ聚集形成大脑沉积物时，它会导致神经退行性疾病，导致临床观察到的患者记忆和认知能力的丧失。Aβ是一种两亲性的分子，具有自组装和积聚的特性，该特性将会触发复杂的淀粉样级联病理反应并最终导致神经元的功能紊乱。Aβ在体内和体外都会自发地聚集成多种并存的物理类型。一种是寡聚体，由2-6个肽构成，寡聚体共价形成中间组合体，寡聚化是自然界中广泛存在的进化规律之一，寡聚化可以提高蛋白质的稳定性，增加局部蛋白浓度，赋予组装体变构协同性，并在分子识别过程中提供了高特异性；另一种是纤维体，高度可溶性的蛋白质逐渐转化为不溶性的丝状聚合物，其中含有特征的交叉β折叠的片状结构。这些丝状结构作为淀粉样纤维积累，随后沉积在受影响的脑细胞的细胞核或细胞质中或细胞外空间。Aβ的神经毒性已被归因于其原纤维形式。Aβ是通过β-和δ-分泌酶连续切割淀粉样前体跨膜蛋白(APP)形成的，其中最具病理生理学相关性的亚型是Aβ40和Aβ42。且已有的研究证实，Aβ42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成Aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用。Aβ42可以穿过血脑屏障，进入血液，因此可以通过监测血液中的Aβ42，实现对阿尔兹海默症的早期诊断。对于遗忘型轻度认知障碍也可通过Aβ42进行检测。

类肽，也称聚合N-取代-甘氨酸，是一类拟肽化合物，其侧链连接Nα而不是Cα上。类肽相比于多肽，具有以下几种优点：(1)较高的亲和性和选择性，类肽可以保持某种能够产生所期望性质的构象，可消除或避免不希望的性质；(2)高吸收性和代谢稳定性；(3)避免免疫原性；(4)既可制成受体激动剂，也可制成抑制剂或拮抗剂。由于类肽化合物具有良好的生物活性和药理性质，它能够有效地抑制活体实验中的恶化情况并且具有良好的细胞膜穿透性。类肽较好的药理性被越来越多研究人员所关注。

阿尔兹海默症的可怕在于无法及时发现和预防，缺乏有效的普查手段，血液检测淀粉样蛋白浓度普查方法的出现，可以大大增强阿尔兹海默症的检出率。然而，脑脊液(CSF)和PET成像检查费用高、伤害大，很难在大众群体中被普及。目前，只能在临床症状较为明显时对阿尔兹海默症作出诊断，缺乏有效的早期检查方法和生化方面的检查手段。因此，寻找血液的检测方法和生物标记物成为研究焦点。高特异性的血液生物标记物可用于AD病理的检测，对于一线临床应用、促进临床试验招募和监测等方面都意义非凡。

因此，有必要开发一种低成本、高精准度的靶向Aβ42纤维体的类肽分子探针，以实现对阿尔兹海默症或遗忘型轻度认知障碍的早期诊断。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种可高特异性和灵敏度的靶向Aβ42纤维体的类肽及其制备方法与应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种类肽，所述类肽包括以下亚单元：第一亚单元：半胱氨酸、第二亚单元：1,4-丁二胺、第三亚单元：异丁胺、第四亚单元：乙醇胺、第五亚单元：糠胺、第六亚单元：异丁胺和第七亚单元：1,4-丁二胺。

所述类肽由上述亚单元依次连接形成。

本发明中，所述类肽为四亚甲基二胺-α-甲基苄胺-乙醇胺-3，4亚甲二氧基苄胺-α-甲基苄胺-四亚甲基二胺，其结构式如下所示：

Aβ42纤维体是通过聚集过程中存在由α螺旋向β折叠的过渡过程形成的，具有特定的三级结构，不易进行氨基酸分子间亲和配位，从而使得在欲找到可高精度靶向其的类肽时并不容易。本发明最终经反复研究获得了一种效果理想的靶向Aβ42纤维体的类肽。

本发明的小分子类肽选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行。其与Aβ42纤维体特异性结合，结合表面等离激元技术，能检测出血清中Aβ42纤维体的含量，可用于阿尔兹海默症或遗忘型轻度认知障碍的早期检测。可与其它检测技术联合使用，具有较好的研究前景和临床指导意义。

本发明还一种制备上述类肽的方法，其通过固相合成法合成所述类肽。

本发明的方法中包括：

(1)按照所述类肽的亚单元连接顺序，将所述类肽的第一亚单元连接至固相载体上；

(2)将溴乙酸在活化剂的活化下与连接至固相载体上的所述第一亚单元的氨基反应形成酰胺键；

(3)将所述类肽的第二亚单元的供体与步骤(2)得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成所述第二亚单元的连接；

(4)重复进行溴乙酸以及后续亚单元的连接步骤，直至完成所有亚单元的连接；

(5)从固相载体上将合成得到的类肽裂解下来得到所述类肽。

其中，在缩合剂和活化剂的作用下进行步骤(1)中将所述类肽的第一亚单元连接至固相载体上的步骤；优选，所述缩合剂为2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或1-羟基苯并三唑中的一种或多种；

和/或，步骤(3)中所述反应的温度为20-40℃，所述反应的时间为30min以上，优选50-150min；

和/或，步骤(5)中所述裂解时使用的裂解剂包括质量百分比如下的成分：92.5％三氟乙酸，2.5％乙二硫醇、2.5％超纯水和2.5％三异丙基硅烷。

本发明另提供一种检测试剂或药物组合物，其包括上述类肽或上述方法制备得到的类肽。

本发明的类肽在发病早期就可进行检测，且无需给病人造成创伤，而且检测准确性高，特异性好。

本发明的药物组合物还包含药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的一种或多种。

本发明再提供一种上述类肽或上述方法制备得到的类肽或上述检测试剂或药物组合物在制备检测、诊断或监控与β-淀粉样蛋白相关疾病的药物中的应用。

本发明的应用中，所述β-淀粉样蛋白为Aβ42纤维体；和/或，所述疾病为阿尔兹海默病或遗忘型轻度认知障碍。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明的类肽与Aβ42(β-淀粉样多肽)纤维体能特异性结合，且亲和力高，通过表面等离激元共振技术得到本发明的类肽与Aβ42的结合动力学常数中的平衡解离常数K_D为10^-8摩尔/升数量级；

(2)本发明类肽对血清中β-淀粉样蛋白具有高灵敏度，可以通过识别血清中的Aβ42纤维体对AD病人与正常人血液信号强度明显区分；

(3)本发明的类肽在阿尔兹海默症早期就可以检测，而且通过血液检测，无创，准确性高，特异性好。

综上所述，本发明的类肽可以结合表面等离激元共振成像技术(SPRi)检测阿尔兹海默病(AD)或遗忘型轻度认知障碍，具有特异性高、灵敏度强的优点。

此外，本发明可无创直接检测血液中的Aβ42纤维体含量，可以通过识别血清中的AD标志物淀粉样蛋白进而对AD患者和正常人进行有效地区分。因为目前缺乏对阿尔兹海默病早期快速检测的有效手段，本发明可以有效实现对Aβ42相关疾病如阿尔兹海默病和遗忘型轻度认知障碍的早期检测，为诊断和监控阿尔茨海默症和遗忘型轻度认知障碍疾病进展和药物研发提供了新的液体活检方法与思路。

本发明还具有高通量、低成本的特点。

附图说明

图1为Aβ42纤维体的原子力显微镜表征图。

图2为本发明的类肽与Aβ42纤维体结合的亲和力检测结果。

图3为本发明的类肽与Aβ42寡聚体结合的亲和力检测结果。

图4为本发明类肽对Aβ40，Aβ40纤维体(Aβ40F)，Aβ42和Aβ42纤维体(Aβ42F)特异性检测结果。

图5为本发明的类肽对AD病人与正常人血清信号的对比结果图，其中，NC代表正常人，MCI代表遗忘型轻度认知障碍病人，AD代表阿尔兹海默症病人。

图6为本发明类肽检测AD病人血清样本结果的受试者工作特性曲线分析(ROC)及曲线下面积AUC值。

图7为本发明类肽检测MCI病人血清样本结果的受试者工作特性曲线分析(ROC)及曲线下面积AUC值。

图6和图7中，Sen代表敏感性，Spe代表特异性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所提到的Aβ42，若无特殊说明均指β-淀粉样蛋白1-42。

下述实施例中的SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nm LED光源，CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个检测点上反射强度随时间的变化并记录为SPR曲线。

除非特殊说明，本文中的亚单元是指固相合成类肽中加入的原料胺。

除非特殊说明，本文中的“nM”是指“n mol/L”,“pM”是指“p mol/L”。PBST溶液指加入0.1％Tween的PBS溶液。

试剂：Rink Amide树脂、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(HBTU)和半胱氨酸购自吉尔生化有限公司(上海)；二氯甲烷(DCM)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、六氢吡啶、无水甲醇购自北京化工；N-甲基吗啡啉(NMM)、N,N’-二异丙基碳二亚(DIC)购自阿拉丁生化有限公司(上海)；溴乙酸购自迈瑞尔公司；异丁胺购自麦克林公司；苯乙胺，乙二胺，苄胺，甲酰胺，乙醇胺购自Innochem公司；N-BOC-1,4-丁二胺购自TCI公司；糠胺购自Innochem公司；三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tips)购自百灵威科技有限公司(北京)；色谱纯乙腈、色谱纯甲醇购自Fisher公司(美国)。

实施例1本发明类肽通过固相亚单元合成法合成

本实验例提供一种本发明的类肽及其合成方法。

具体方法如下：

1.树脂溶胀：取1g Rink Amide树脂置于合成管中，加入过量DMF室温摇床震荡1h，加入20％的六氢吡啶溶液脱保护后，交替使用DCM和DMF清洗3次。

2.半胱氨酸(cys)的偶联：根据树脂的量称取10倍过量的Cys，再将其与HBTU以等摩尔比混合溶于0.4mol/L NMM的DMF溶液中，充分溶解后加入装有树脂的合成管中，置于摇床之上震荡反应1h,加入20％的六氢吡啶溶液脱保护,交替使用DCM和DMF清洗3次。

3.后续亚单元连接：根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL3.2mol/L的DIC，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M 1,4丁二胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上。

4.先加DMF，交替使用DCM和DMF清洗3次。根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL 3.2mol/L的DIC(缩合剂)，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M异丁胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上。

5.先加DMF，交替使用DCM和DMF清洗3次。根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL 3.2mol/L的DIC(缩合剂)，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M乙醇胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上。

6.先加DMF，交替使用DCM和DMF清洗3次。根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL 3.2mol/L的DIC(缩合剂)，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M糠胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上。

7.先加DMF，交替使用DCM和DMF清洗3次。根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL 3.2mol/L的DIC(缩合剂)，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M异丁胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上。

8.先加DMF，交替使用DCM和DMF清洗3次。根据树脂的量加入5mL 2mol/L溴乙酸的DMF溶液和5mL 3.2mol/L的DIC(缩合剂)，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应15min以上。充分清洗后加入2M 1,4丁二胺溶液，微波加热5s，37℃恒温摇床震荡反应30min以上，再加入10mL无水甲醇摇床震荡15min，抽干并真空干燥。

9.裂解与脱保护：将收缩完毕的树脂转移至棕色小瓶，加入包含92.5％TFA、2.5％EDT、2.5％H₂O、2.5％Tis的裂解液，置于磁力搅拌器搅拌2小时。取上清液使用氮吹仪吹干备用。

10.纯化：使用Waters e2695 HPLC色谱系统，4.6*150mm,kromasil C18色谱柱，按如下条件纯化。

流动相A：0.1％TFA的乙腈；

流动相B：0.1％TFA的H₂O；

梯度洗脱：

流速：1.0mL/min；检测波长：214nm。最后纯化冻干的类肽纯度为97％。

实施例2Aβ42寡聚体和纤维体的制备

本实施例进行Aβ42寡聚体和纤维体的制备。具体步骤如下：

(1)单体化处理：在通风橱中，将2mg Aβ42单体粉末(购自吉尔生化(上海)有限公司)溶于1ml冷却的HFIP(六氟异丙醇)中，超声30min，室温孵育2h，使Aβ42充分溶解，置于通风橱中挥发。风干后形成透明的Aβ肽膜，储存在-20℃冰箱中待用；

(2)寡聚体制备：将单体化处理后的Aβ42加l％DMSO(二甲基亚砜)助溶，溶解在PBS溶液中。之后在4℃12000rpm条件下离心30min，取上清液。现用现制；

(3)纤维体制备：将单体化处理后的Aβ42加l％DMSO(二甲基亚砜)助溶，溶解在PBS溶液中，然后放置在37°恒温摇床，孵育48小时即可获得纤维体。

(4)原子力显微镜(AFM)鉴定：

将制备得到的Aβ42寡聚体和纤维体的制成品稀释100倍，分别滴加在洁净的云母片上，室温条件下静置10min，再用去离子水轻轻冲洗，去除盐离子，用吸耳球吹干；将制备好的上述Aβ42样品置于AFM下观察。图像在处理软件Nanoscale中进行平整化处理。结果如图1所示，可以从中看出本实施例得到了良好的Aβ42纤维组装体。

实施例3类肽与β-淀粉样多肽Aβ42寡聚体和纤维体之间的结合能力测试

本实施例对实施例1制备得到的类肽和实施例2制备得到的Aβ42寡聚体和纤维体的结合能力进行检测。

具体步骤如下：

1.类肽芯片的制备：吸取实施例1中制备的类肽溶液滴在SPRi检测用芯片指定区域，每个点溶液体积为0.3ul，每个样重复三个点。

2.孵育：将点样的芯片放在湿盒中，4℃冰箱孵育过夜；

3.清洗：将孵育后的芯片分别用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，再用去离子水清洗10min两次；

4.封闭：将芯片完全浸没在5％的脱脂牛奶溶液(PBST稀释)中，4℃冰箱封闭6h以上。然后再次重复上一步清洗步骤，清洗后用氮气吹干芯片表面；

5.压片：利用压片机将芯片和盖片粘在一起，在压片机上压制20min后取出，即可得到用于表面等离激元共振成像技术检测的类肽芯片。

6.SPRi上机：(1)将压制完成的芯片放置在高通量生物分子相互作用仪的指定位置，添加折射率油在棱镜表面，测定表面等离激元共振角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点。(2)流动相配置：将制备好的Aβ42寡聚体和纤维体溶解在PBST溶液中分别配成5个浓度梯度，分别为100nM，10nM，1nM，100pM，10pM，然后取1mL各浓度Aβ42溶液作为流动相放置在指定区域。(3)重生液和清洗液的配置：重生液是0.5(w/v)磷酸盐缓冲液溶液，清洗液是加入0.1％Tween的PBS溶液；(4)SPRi检测过程中，660nm平行光通过耦合棱镜，经由芯片金表面的反射最终被CCD摄像机接收。缓冲液和样品流动相经由非搏动塞泵注射进入相互作用腔室与芯片表面的样品点阵进行接触。每个操作循环包含以下4个步骤：

1.1×PBST缓冲液以2μL/s的流速清洗点阵和芯片表面，得到稳定的基线；

2.以2μL/s的流速让样品流动相通过点阵500s，使其充分结合；

3.以2μL/s的流速用1×PBST对点阵及芯片表面进行300s清洗，除去非特异性吸附；

4.以2μL/s的流速用0.5(w/v)磷酸盐缓冲液溶液对点阵及芯片表面进行300s重生。

以上所有操作在4℃恒温条件下完成，利用Data Analysis Module对结合信号进行实时记录和分析，利用BIA evaluation 4.1软件对动力学过程进行分析并拟合得到结合解离常数。

如图2所示，经分析可得，本发明类肽与Aβ42纤维体的亲和力K_D＝2.34E-8M，具有很强的亲和力，同时该结果也表明本发明类肽具有高灵敏度检测特性，能够检测到Aβ42皮摩尔级别的变化。

如图3所示，经分析可得，本发明类肽与Aβ42寡聚体的亲和力K_D＝4.24E-4M，说明二者基本没有特异性结合。

实施例4类肽特异性检测

本实施例对本发明实施例1制备得到的类肽的特异性进行检测。具体方法如下：

SPRi上机：(1)将压制完成的芯片(参见实施例3)放置在高通量生物分子相互作用仪的指定位置，添加折射率油在棱镜表面，测定表面等离激元共振角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点。(2)流动相配置：将对照组PBST、Aβ40寡聚体、Aβ40纤维体、Aβ42寡聚体配置成浓度为100nM的溶液，然后各取1mL作为流动相放置在指定区域。Aβ40寡聚体、Aβ40纤维体的制备方法参见实施例2中的Aβ42寡聚体、Aβ42纤维体制备方法，区别仅在于制备原料为Aβ40单体粉末(购自吉尔生化(上海)有限公司)。(3)重生液和清洗液的配置：重生液是0.5(w/v)磷酸盐缓冲液溶液，清洗液是加入0.1％Tween的PBS溶液；(4)SPRi检测过程中，660nm平行光通过耦合棱镜，经由芯片金表面的反射最终被CCD摄像机接收。缓冲液和样品流动相经由非搏动塞泵注射进入相互作用腔室与芯片表面的样品点阵进行接触。每个操作循环包含以下4个步骤：

1. 1×PBST缓冲液以2μL/s的流速清洗点阵和芯片表面，得到稳定的基线；

2.以2μL/s的流速让样品流动相通过点阵500s，使其充分结合；

以上所有操作在4℃恒温条件下完成，利用Data Analysis Module对结合信号进行实时记录和分析，利用BIA evaluation 4.1软件对动力学过程进行分析。

如图4所示，相对于对照组PBST、Aβ40寡聚体、Aβ40纤维体、Aβ42寡聚体，在SPRi中类肽与Aβ42纤维体有明显的结合信号，证明类肽具有很高的特异性。

实施例5类肽对AD血清信号的检测

本实施例利用表面等离子体共振成像技术测试本发明实施例1制备得到的类肽检测AD病人血清、遗忘型轻度认知障碍(MCI)病人血清与正常人血清的效果，具体步骤如下：

根据实施例3记载的方法，制作同样的类肽芯片，安装在SPR仪器上，测定角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μl/s,选择PBST为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入AD病人、MCI病人与正常人的血清(用1×PBS按1：2000稀释)，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸进行重生。

检测结果如图5所示，本发明类肽可以明显区分AD病人与正常人(Normal，NC)及遗忘型轻度认知障碍(MCI)。

AD病人和正常人血清样本结果的受试者工作特性曲线如图6所示，对照组(正常人)与阿尔兹海默症组的AUC值为0.926。

MCI病人和正常人血清样本结果的受试者工作特性曲线如图7所示，根据MCI病人和正常人的血清样本结果的受试者工作特性曲线计算获得的AUC值为0.871。

曲线下面积越大，说明诊断准确性越高。

上述结果表明本发明类肽在检测阿尔兹海默症和遗忘型轻度认知障碍有较好的灵敏度和特异性。

综上所述，本发明的类肽是一种与Aβ42纤维体有很高亲和力的类肽，并且具有较高的特异性和灵敏度，为阿尔兹海默症和遗忘型轻度认知障碍的体外早期筛查提供了新的选择。

对比例1

本对比例提供两种类肽Pep3和Pep4，并对它们与Aβ42纤维体结合的效果进行验证。

Pep3和Pep4的结构如下：

它们的制备方法与实施例1相同，区别仅在于，在制备Pep3时，步骤(2)、(3)中，所用的亚单元依次是半胱氨酸，精氨酸，苄胺，苯乙胺，乙二胺，异丁胺，异丁胺。纯化后的纯度为95％。

在制备Pep4时，步骤(2)、(3)中，所用的亚单元依次是半胱氨酸，赖氨酸，乙二胺，苯乙胺，甲酰胺，异丁胺，异丁胺。纯化后的纯度为95％。

本对比例通过与实施例3相同的方法，对Pep3和Pep4和Aβ42纤维体的结合能力进行测试。结果表明，Pep3和Pep4与本发明实施例1中制备的类肽结构类似，但却与Aβ42纤维体没有明显的结合能力。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了对本发明的任何改进必须依赖上述所选用的原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围内。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种类肽，其特征在于，所述类肽包括以下亚单元：第一亚单元：半胱氨酸、第二亚单元：1,4-丁二胺、第三亚单元：异丁胺、第四亚单元：乙醇胺、第五亚单元：糠胺、第六亚单元：异丁胺和第七亚单元：1,4-丁二胺。

2.根据权利要求1所述的类肽，其特征在于，所述类肽为四亚甲基二胺-α-甲基苄胺-乙醇胺-3，4亚甲二氧基苄胺-α-甲基苄胺-四亚甲基二胺，其结构式如下所示：

3.一种制备权利要求1或2所述的类肽的方法，其特征在于，通过固相合成法合成所述类肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：

(5)从固相载体上将合成得到的类肽裂解下来得到所述类肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在缩合剂和活化剂的作用下进行步骤(1)中将所述类肽的第一亚单元连接至固相载体上的步骤；优选，所述缩合剂为2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或1-羟基苯并三唑中的一种或多种；

和/或，步骤(3)中所述反应的温度为20-40℃，所述反应的时间为50-150min；

6.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的类肽或权利要求3-5任一项所述的方法制备得到的类肽。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的类肽或权利要求3-5任一项所述的方法制备得到的类肽。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的一种或多种。

9.权利要求1或2所述的类肽或权利要求3-5任一项所述的方法制备得到的类肽或权利要求6所述的检测试剂或权利要求7或8所述的药物组合物在制备检测、诊断或监控与β-淀粉样蛋白相关疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述β-淀粉样蛋白为Aβ42纤维体；和/或，所述疾病为阿尔兹海默病或遗忘型轻度认知障碍。