CN113913298A - 提高微藻生物量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高微藻生物量的方法，包括：将微藻细胞进行活化培养以获得种子液，在微藻培养基中添加胰蛋白胨及其类似替代物和/或酵母提取物及其类似替代物，将种子液接种于微藻培养基，调节pH为6.2‑8.5，进行兼养或异养培养。本发明操作方便，原料简单，在微藻原有培养基的基础上添加有机物，使得微藻由原来自养培养转化为兼养或异养培养，提高微藻生物量。

Description

提高微藻生物量的方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高微藻生物量的方法。
背景技术
微藻是指在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻类群体，是一类水生的单细胞光合自养微生物。由于微藻细胞生化组成和代谢途径的复杂性和多样性，细胞内可积累多糖、蛋白质、色素、脂类等物质，具有潜在的营养、药用和能源价值，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。其中雨生红球藻在细胞内能够大量合成积累虾青素，被确认为是自然界中合成和积累虾青素效率最高的生物。小球藻因为其细胞内含有大量的蛋白质、脂类、碳水化合物、矿物质、维生素、纤维素等营养，被应用于保健品、食品和饲料等领域。栅藻细胞内油脂含量高，可作为生物染料的来源。近期研究发现空星藻中含有虾青素等类胡萝卜素，作为海洋微藻可节约淡水，具有开发保健品的潜力。莱茵衣藻含有血红素、蛋白质等营养物质，在医学、酶制剂、食品方面具广泛应用。近年来，雨生红球藻、小球藻、螺旋藻、杜氏盐藻、空星藻等微藻已应用于规模的生产养殖中。
作为自养生物目前大多数微藻生产过程是以光合自养培养为主，自养条件下微藻生长受到光的限制，导致其在养殖过程中存在细胞活力低、生长缓慢、生物量低等问题，阻碍了微藻的规模产业化发展。为了解决这一难题，开发微藻兼养和异养养殖技术是微藻产业发展的趋势。兼养和异养培养是一种新型的微藻生物质生产方式，与传统的光自养培养相比具有效率高、可控性高、易于工业化生产的优势，解决了微藻养殖靠天吃饭的难题。因此开发提高微藻生物量的技术方法对于促进微藻产业发展具有重要作用。由于微藻细胞光合自养的自身局限性，仅少数几种微藻能够利用一种或者几种有机碳源，开发微藻普遍利用的有机物势在必行。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提高微藻生物量的方法，其操作方便，原料简单，在微藻原有培养基的基础上添加有机物，使得微藻由原来自养培养转化为兼养或异养培养，提高微藻生物量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高微藻生物量的方法，包括：将微藻细胞进行活化培养以获得种子液，在微藻培养基中添加胰蛋白胨及其类似替代物和/或酵母提取物及其类似替代物，将种子液接种于微藻培养基，调节pH为6.2-8.5，进行兼养或异养培养。
优选的是，所述微藻为红球藻、小球藻、栅藻、衣藻或空星藻。
优选的是，所述胰蛋白胨类似替代物为酪蛋白胨和/或蛋白胨。
优选的是，所述酵母提取物类似替代物为酵母粉和/或酵母浸膏。
优选的是，所述微藻培养基为BBM培养基、BG11培养基、TAP培养基、M11培养基或C培养基。
优选的是，微藻培养基中添加有培养液，培养液添加量为0.5-1mL/L，所述培养液包括卡那霉素2mg/mL和氨苄霉素100mg/mL。
优选的是，兼养培养采用密闭光生物反应器进行，密闭光生物反应器控制温度24-28℃，采用透光率50％的遮光布控制光照强度为45-200μmol/m2/s，兼养培养时，每天向密闭光生物反应器内鼓入含1％二氧化碳的混合空气。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明披露了胰蛋白胨和酵母提取物等有机物，大多数微藻可利用上述有机物进行兼养或者异养，相对于自养培养，提高了微藻的生物量。本发明可广泛使用于雨生红球藻、蛋白核小球藻、尖状栅藻、莱茵衣藻或空星藻HA-1(Coelastrum sp.HA-1)等微藻养殖，用于生产虾青素、食用蛋白、饲料蛋白、生物能源、胡萝卜素、矿物质、维生素、多糖等高价值产品，方法简便，经济高效，具有非常重要的应用价值和广阔的市场前景。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的实施例1、实施例9、对比例1的雨生红球藻细胞密度变化图；
图2为本发明的实施例2、实施例6、实施例10、对比例2的空星藻细胞密度变化图；
图3为本发明的实施例3、实施例7、实施例11、对比例3的尖状栅藻细胞密度变化图；
图4为本发明的实施例4、实施例8、对比例4的莱茵衣藻细胞密度变化图；
图5为本发明的实施例5、对比例5的蛋白核小球藻细胞密度变化图；
图6为本发明的实施例1-11、对比例1-5的细胞干重变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明所用雨生红球藻购于日本国立环境研究所，空星藻和尖状栅藻源于中国科学院天津工业生物技术研究所的实验室筛选，莱茵衣藻源于美国衣藻资源中心，蛋白核小球藻购于中国科学院淡水藻种库。
<实施例1>
提高微藻生物量的方法，包括：使用C培养基培养雨生红球藻，在培养基中同时添加2g/L酵母提取物和4g/L胰蛋白胨，培养基调节pH至7.5，灭菌后以10％的接种量接种雨生红球藻种子液，放置于45μmol/m2/s光照条件下培养，培养温度25℃。
<实施例2>
提高微藻生物量的方法，包括：使用BG11培养基培养空星藻HA-1，在培养基中同时添加2g/L胰蛋白胨和1g/L酵母提取物，培养基调节pH至7，灭菌后以15％的接种量接种空星藻种子液，放置于80μmol/m2/s光照条件下培养，培养温度28℃。
<实施例3>
提高微藻生物量的方法，包括：使用M11培养基培养尖状栅藻，在培养基中同时添加2g/L酪蛋白胨，培养基调节pH至6.8，灭菌后以20％的接种量接种尖状栅藻种子液，放置于200μmol/m2/s光照条件下培养，培养温度26℃。
<实施例4>
提高微藻生物量的方法，包括：使用TAP培养基培养莱茵衣藻，在培养基中同时添加1g/L酵母粉，培养基调节pH至6.2，灭菌后以20％的接种量接种莱茵衣藻种子液，异养培养，培养温度26℃。
<实施例5>
提高微藻生物量的方法，包括：使用BBM培养基培养蛋白核小球藻，在培养基中同时添加2g/L蛋白胨和1g/L酵母浸膏，培养基调节pH至8.5，灭菌后以20％的接种量接种蛋白核小球藻种子液，异养培养，培养温度24℃。
<实施例6>
提高微藻生物量的方法，同实施例2，不同的是，微藻培养基中添加有培养液，培养液添加量为1mL/L，所述培养液包括卡那霉素2mg/mL和氨苄霉素100mg/mL。
<实施例7>
提高微藻生物量的方法，同实施例3，不同的是，微藻培养基中添加有培养液，培养液添加量为0.75mL/L，所述培养液包括卡那霉素2mg/mL和氨苄霉素100mg/mL。
<实施例8>
提高微藻生物量的方法，同实施例4，不同的是，微藻培养基中添加有培养液，培养液添加量为0.5mL/L，所述培养液包括卡那霉素2mg/mL和氨苄霉素100mg/mL。
<实施例9>
提高微藻生物量的方法，同实施例1，不同的是，兼养培养采用密闭光生物反应器进行，密闭光生物反应器控制温度25℃，采用透光率50％的遮光布控制光照强度为45μmol/m2/s，兼养培养时，每天向密闭光生物反应器内鼓入含1％二氧化碳的混合空气。
<实施例10>
提高微藻生物量的方法，同实施例2，不同的是，兼养培养采用密闭光生物反应器进行，密闭光生物反应器控制温度28℃，采用透光率50％的遮光布控制光照强度为80μmol/m2/s，兼养培养时，每天向密闭光生物反应器内鼓入含1％二氧化碳的混合空气。
<实施例11>
提高微藻生物量的方法，同实施例3，不同的是，兼养培养采用密闭光生物反应器进行，密闭光生物反应器控制温度24℃，采用透光率50％的遮光布控制光照强度为200μmol/m2/s，兼养培养时，每天向密闭光生物反应器内鼓入含1％二氧化碳的混合空气。
<对比例1>
提高微藻生物量的方法，同实施例1，不同的是，培养基中不添加酵母提取物和胰蛋白胨。
<对比例2>
提高微藻生物量的方法，同实施例2，不同的是，培养基中不添加酵母提取物和胰蛋白胨。
<对比例3>
提高微藻生物量的方法，同实施例3，不同的是，培养基中不添加酪蛋白胨。
<对比例4>
提高微藻生物量的方法，同实施例4，不同的是，培养基中不添加酵母粉。
<对比例5>
提高微藻生物量的方法，同实施例5，不同的是，培养基中不添加蛋白胨和酵母浸膏。
<提高微藻生物量的测定试验>
1、采用血球计数板计数法和差重法测定实施例1-11、对比例1-5的细胞密度的变化以及细胞干重，细胞密度的变化如表1所示，细胞干重如表2所示。
表1
Figure BDA0003325884790000051
Figure BDA0003325884790000061
由表1可以看出，实施例1、实施例9、对比例1的细胞密度如图1所示，通过结果发现，在培养基中添加胰蛋白胨和酵母提取物可以促进细胞的生长，提高雨生红球藻的细胞密度，增大生物量，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够进一步提高雨生红球藻的细胞密度。
由表1可以看出，实施例2、实施例6、实施例10、对比例2如图2所示，通过结果发现，在培养基中添加胰蛋白胨和酵母提取物可以促进细胞的生长，提高空星藻的细胞密度，增大生物量，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高空星藻的细胞密度，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够更进一步提高空星藻的细胞密度。
由表1可以看出，实施例3、实施例7、实施例11、对比例3如图3所示，通过结果发现，在培养基中添加酪蛋白胨可以促进细胞的生长，提高尖状栅藻的细胞密度，增大生物量，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高尖状栅藻的细胞密度，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够更进一步提高尖状栅藻的细胞密度。
由表1可以看出，实施例4、实施例8、对比例4如图4所示，通过结果发现，在培养基中添加酵母粉可以促进细胞的生长，提高莱茵衣藻的细胞密度，增大生物量，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高莱茵衣藻的细胞密度。
由表1可以看出，实施例5、对比例5如图5所示，通过结果发现，在培养基中添加蛋白胨和酵母浸膏可以促进细胞的生长，提高蛋白核小球藻的细胞密度，增大生物量。
表2
Figure BDA0003325884790000062
Figure BDA0003325884790000071
由表2可以看出，实施例1、实施例9、对比例1的细胞密度如图6所示，通过结果发现，在培养基中添加胰蛋白胨和酵母提取物能够提高细胞干重，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够维持并改善密闭光生物反应器环境，相较于常规兼养能够迅速进入指数生长期，进一步提高细胞干重。
由表2可以看出，实施例2、实施例6、实施例10、对比例2如图6所示，通过结果发现，在培养基中添加胰蛋白胨和酵母提取物可以提高细胞干重，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高细胞干重，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够维持并改善密闭光生物反应器环境，相较于常规兼养能够迅速进入指数生长期，更进一步提高细胞干重。
由表2可以看出，实施例3、实施例7、实施例11、对比例3如图6所示，通过结果发现，在培养基中添加酪蛋白胨可以更，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高细胞干重，兼养培养采用特定的密闭光生物反应器进行，能够维持并改善密闭光生物反应器环境，相较于常规兼养能够迅速进入指数生长期，更进一步提高细胞干重。
由表2可以看出，实施例4、实施例8、对比例4如图6所示，通过结果发现，在培养基中添加酵母粉可以提高细胞干重，微藻培养基中添加特定的培养液，能够进一步提高细胞干重。
由表2可以看出，实施例5、对比例5如图6所示，通过结果发现，在培养基中添加蛋白胨和酵母浸膏可以提高细胞干重。
2、测定实施例2-4、6-8的细胞内物质含量(总糖、总蛋白、叶绿素、β胡萝卜素)，用苯酚硫酸法测定总糖的含量，用考马斯亮蓝法测定总蛋白的含量，用分光光度法测定叶绿素、β胡萝卜素的含量，如表3所示。
表3
含量mg/L 总糖 总蛋白 叶绿素 β胡萝卜素
实施例2 77.10 62.01 3.81 0.35
实施例3 82.91 52.26 3.70 0.14
实施例4 60.91 35.52 2.16 0.57
实施例6 91.20 79.42 4.41 0.62
实施例7 78.63 82.63 3.76 0.44
实施例8 58.34 40.66 2.98 0.82
由表3可以看出，实施例6-8相较于实施例2-4，微藻培养基中添加特定的培养液，能够提高总糖、总蛋白、叶绿素、β胡萝卜素，说明该培养液能够促进微藻营养成分的累积，具有广泛适用性，这区别于现有的抗生素组合无菌处理，只能对个别的微藻产生影响。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.提高微藻生物量的方法，其特征在于，包括：将微藻细胞进行活化培养以获得种子液，在微藻培养基中添加胰蛋白胨及其类似替代物和/或酵母提取物及其类似替代物，将种子液接种于微藻培养基，调节pH为6.2-8.5，进行兼养或异养培养。
2.如权利要求1所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，所述微藻为红球藻、小球藻、栅藻、衣藻或空星藻。
3.如权利要求1所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，所述胰蛋白胨类似替代物为酪蛋白胨和/或蛋白胨。
4.如权利要求1所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，所述酵母提取物类似替代物为酵母粉和/或酵母浸膏。
5.如权利要求1所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，所述微藻培养基为BBM培养基、BG11培养基、TAP培养基、M11培养基或C培养基。
6.如权利要求1-5任一项所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，微藻培养基中添加有培养液，培养液添加量为0.5-1mL/L，所述培养液包括卡那霉素2mg/mL和氨苄霉素100mg/mL。
7.如权利要求6所述的提高微藻生物量的方法，其特征在于，兼养培养采用密闭光生物反应器进行，密闭光生物反应器控制温度24-28℃，采用透光率50％的遮光布控制光照强度为45-200μmol/m2/s，兼养培养时，每天向密闭光生物反应器内鼓入含1％二氧化碳的混合空气。
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