CN113906298A - 对腹膜癌扩散具有治疗意义的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测或确定患有腹膜癌扩散的受试者对纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI‑1)的抑制剂治疗的易感性的方法，其中所述方法包括确定腹水PAI‑1的浓度和确定磷酸化的肿瘤信号转导与转录活化因子3(STAT3)的水平。磷酸化STAT3的水平也可通过测量腹水中一种或更多种替代标记物(如IL‑6、IL‑10、CCL2、MMP9和ANGPT1)的浓度来确定。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月27日提交的新加坡临时申请号10201902763U的优先权，出于所有目的，其内容在此通过引用全部并入。
发明领域
本发明大体上涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及使用生物标志物用于癌症的检测、诊断和后续治疗。
发明背景
结肠直肠癌是全球第三大常见癌症和第四大常见癌症死亡原因，每年占据新增病例140万例及死亡60万例。因结肠直肠癌的死亡大多是由于在所有患者的15％中发生的伴随腹膜癌扩散(PC)的转移所致，其占所有转移的高达30％。尽管进行了姑息性全身化疗，与无腹膜累及的其他形式的转移性结肠直肠癌相比，结肠直肠腹膜癌扩散始终表现出具有明显较短的总生存期。
减瘤手术(CRS)和腹腔热灌注化疗(HIPEC)革新了腹膜癌扩散的治疗。减瘤手术是指一系列去除所有肉眼可见疾病的内脏切除和腹膜切除程序。然后，采用腹腔热灌注化疗剂的滴注根除残存的显微镜下存活病灶。减瘤手术与腹腔热灌注化疗的联合治疗方式大大提高了具有结肠直肠起源的腹膜癌扩散的患者的生存期。接受减瘤手术和腹腔热灌注化疗的患者的中位生存期为33个月，相比之下，单独接受全身化疗的患者的中位生存期为6至12个月。然而，尽管有了这一显著的改善，但仍需要做更多的工作，通过改进腹腔热灌注化疗方案来进一步改善具有结肠直肠腹膜癌扩散患者的治疗结果，因为手术不可能进一步改善患者结果了。
因此，需要改善患者分层，以改善治疗。
概述
在一方面，本公开涉及用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗患有腹膜癌扩散的受试者的方法，该方法包括在从受试者获得的样品中确定PAI-1的浓度和确定“信号转导与转录活化因子3”(STAT3)的磷酸化水平；向显示出(a)PAI-1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI-1浓度减少和STAT3磷酸化增加的受试者施用PAI-1抑制剂；其中将PAI-1浓度和STAT3磷酸化的增加和/或减少与参考值进行比较。
在另一方面，本公开涉及检测或确定患有腹膜癌扩散的受试者对用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗的易感性的方法，该方法包括在从受试者获得的样品中确定PAI-1的浓度和确定“信号转导与转录活化因子3”(STAT3)的磷酸化水平；其中如果受试者表现出(a)PAI-1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI-1浓度降低和STAT3磷酸化增加，则该受试者对该治疗易感；其中如果受试者表现出(c)PAI-1浓度降低和STAT3磷酸化降低，则认为该受试者对该治疗不易感；其中将PAI-1浓度和STAT3磷酸化水平的增加和/或降低与参考值进行比较。
在一方面，本公开涉及一组标志物，其用于用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗患有腹膜癌扩散的患者，或用于检测或确定患有腹膜癌扩散的患者对用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗的易感性，其中该组标志物包括PAI-1和一种或更多种STAT3磷酸化或p-STAT3的替代标志物。
在另一方面，本公开涉及一组标志物在本文所公开方法中的用途，其中该组包括PAI-1和一种或更多种STAT3磷酸化的替代标志物，或PAI-1和p-STAT3。
附图简要说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1显示的数据指示，无论组织学亚型如何，腹水的存在导致患者预后较差。(A)所有腹膜癌扩散患者的卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)生存曲线(P＝0.002)。(B)结肠直肠伴腹膜癌扩散患者的卡普兰-梅尔生存曲线(P＝0.001)。(C)卵巢伴腹膜癌扩散患者的卡普兰-梅尔生存曲线(P＝0.077)。
图2(A)无细胞腹水的添加以剂量依赖性方式增加癌细胞增殖。0.1％的无细胞腹水足以维持细胞活力而不增殖。(B)无细胞腹水处理显著增加癌细胞迁移。(C)无细胞腹水处理显著增加癌细胞在体外的细胞沉降，与补充血清的培养基无关(As：腹水，SFM：无血清培养基，FBS：胎牛血清)。
图3显示无细胞腹水处理后被显著上调的通路。(A)5％与0.1％无细胞腹水处理的腹膜癌扩散(PC)细胞系中被上调的通路。(B)在无细胞腹水处理的细胞中被上调的特定通路不是生存信号激活的通路中共有的。这些图显示，在用无细胞腹水处理癌细胞系时，发现几种信号通路上调，包括IL6-JAK-STAT3信号通路。这指示STAT3的活化在该疾病中起着重要作用。本图和上下文中提到的“处理”一词与下面定义章节中提供的“处理”的定义不同。在图3的上下文中，处理指的是在体外环境将细胞系模型暴露于从患者采集的无细胞腹水中。例如，在体外环境将癌细胞系暴露于5％无细胞腹水，并观察细胞的物理表型(例如增殖或迁移)或分子表型(例如基因表达变化)的变化。
图4(A)用5％无细胞腹水处理通过Tyr705处磷酸化激活STAT3。(B)5％不同组织学腹膜癌扩散(PC)亚型的无细胞腹水的处理导致STAT3活化，其中结肠直肠来源的无细胞腹水示出最高活化。
图5(A)结肠直肠原发性肿瘤及其匹配转移瘤中p-STAT3的代表性免疫组化染色。(B)与原发性肿瘤相比，STAT3活化在转移瘤中更为普遍(P：原发性肿瘤，M：转移瘤)。在本发明的背景中，整体上，该数据强调STAT3信号通路在转移瘤中比原发性肿瘤中上调更多，并且由此推断，转移瘤更依赖于STAT3信号传递。这反过来表明，与原发性肿瘤相比，转移瘤对STAT3抑制更易感。换句话说，靶向转移瘤中的STAT3信号传递可能比靶向原发性肿瘤更有效。
图6(A)条形图显示在用无细胞腹水处理的已建立的结肠直肠腹膜癌扩散细胞系模型中差异表达最多的上皮-间充质转化(EMT)基因。(B)在结肠直肠癌起源的无细胞腹水中，参与凝血途径的蛋白质最普遍。(C)对来自不同组织学亚型的腹膜癌扩散无细胞腹水进行的细胞因子阵列鉴定到来自结肠直肠腹膜癌扩散的无细胞腹水中丰富的PAI-1水平。
图7显示在癌症基因组图谱结肠直肠腺癌(TCGA COADREAD)群组(n＝345)中对PAI-1、STAT3和EMT表达的查询和生存分析。(A)PAI-1和STAT3表达之间的相关性。(B)PAI-1表达与EMT特征(signature)之间的相关性。(A-B)的相关性通过皮尔森相关系数检验确定。显示了线性回归线。(C)卡普兰-梅尔生存分析说明伴有高水平PAI-1、活化的STAT3信号传递和丰富的上皮-间充质转化(EMT)特征的结肠直肠癌中存活率最差。(P：PAI-1，S：STAT3信号传导，E：EMT特征)
图8(A)对用无细胞腹水处理的结肠直肠腹膜癌扩散(PC)细胞系进行的受体酪氨酸激酶(RTK)磷酸化阵列显示JAK未活化，暗示非经典STAT3活化机制。(B)蛋白印记验证显示JAK在无细胞腹水处理的细胞中无活性。
图9显示使用ELISA对(A)来自结肠直肠腹膜癌扩散(PC)的无细胞腹水(n＝55)和(B)来自不同组织学腹膜癌扩散(PC)亚型的无细胞腹水(n＝156)进行的筛选结果。测量腹水中的PAI-1水平和无细胞腹水处理后的癌细胞的p-STAT3(Y705)水平，并绘图以确定其相关性。PAI-1浓度以log2标度绘制。p-STAT3(Y705)水平显示为450nm(OD450)处的光密度读数。相关分析通过皮尔森相关系数检验确定。
图10将PAI-1和p-STAT3(Y705))水平的未转换值用于门控策略，以鉴定可能受益于PAI-1抑制的患者亚群。可以观察到三个不同的患者组——高PAI-1水平且高STAT3活化的患者，称为PAI-1旁分泌成瘾(PAI-1paracrine addicted)或PPA患者(右上象限)；低PAI-1水平但高STAT3活化的患者，称为辅激活因子主导(co-activators predominant)或CAP患者(左上象限)；和低PAI-1水平且低STAT3活化的患者，称为替代通路活化(alternativepathways activation)或APA患者(左下象限)。(A)结肠直肠腹膜癌扩散(PC)的无细胞腹水的PAI-1和p-STAT3门控。(B)不同组织学腹膜癌扩散(PC)亚型的无细胞腹水的PAI-1和p-STAT3门控。(C)用于将患者分层至三个不同组的PAI-1和p-STAT3临界值。(D)本分析中使用的无细胞腹水的群组。
图11显示了TM5441(PAI-1抑制剂)对三组不同的无细胞腹水处理的Colo-205细胞的影响。(A)PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组(黑色实线)、辅激活因子主导(CAP)组(黑色虚线)、替代通路活化(APA)组(灰色实线)和胎牛血清(FBS；对照组，灰色虚线)的代表性抑制剂剂量-反应曲线显示剂量-反应曲线左移，指示对PAI-1抑制的反应性。(B)对应于三个不同组的无细胞腹水对TM5441的差异化敏感性，，PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组(n＝18)对PAI-1抑制最敏感，接下来是辅激活因子主导(CAP)组(n＝59)和替代通路活化(APA)组(n＝17)。(C)本分析中使用的无细胞腹水群组。
图12显示各种药理抑制对三组不同的无细胞腹水处理的Colo-205细胞的影响。PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组(黑色实线)、辅激活因子主导(CAP)组(黑色虚线)、替代通路活化(APA)组(灰色实线)和胎牛血清(FBS；对照，灰色虚线)的代表性抑制剂剂量-反应曲线。相应的IC50值如插图所示，平均值±sd。(A)Tiplaxtinin(PAI-1抑制剂)剂量-反应曲线，(B)Napabucasin(STAT3抑制剂)剂量-反应曲线，(C)BEZ235(PI3K/mTOR双重抑制剂)剂量-反应曲线，和(D)丝裂霉素C(腹腔热灌注化疗(HIPEC)中使用的常规化疗剂–DNA交联剂)剂量-反应曲线。靶向PAI-1(无细胞腹水中的一种主要旁分泌因子)显示比靶向由无细胞腹水激活的下游信号通路、增殖途径或DNA合成更有效。
图13(A)受PAI-1抑制影响的信号通路通过在TM5441或DMSO溶媒存在下，用代表PAI-1旁分泌成瘾(PPA)(PC085)、辅激活因子主导(CAP)(PC249)的无细胞腹水或胎牛血清(FBS；对照)处理的癌细胞的RNA微阵列分析鉴定。PAI-1旁分泌成瘾(PPA)处理的细胞在抑制PAI-1后，IL6-JAK-STAT3信号通路显著下调。归一化的富集分数小于0指示通路抑制，分数大于0指示通路活化。(B)在不同浓度TM5441或DMSO溶媒(通过ELISA测定)存在下，通过ELISA测量的用PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水(PC085和PC383)、辅激活因子主导(CAP)无细胞腹水(PC249)和替代通路活化(APA)的无细胞腹水(PC010)处理的癌细胞证实，暴露于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水的细胞依赖PAI-1激活STAT3，因为它们需要较低浓度的TM5441抑制STAT3活化。
图14(A)改良的腹膜癌指数(PCI)示意图，用于评估腹膜癌扩散(PC)细胞系小鼠模型中的肿瘤负荷。该评分系统是对Klaver等人(KlaverY.L.B.,Hendriks T.,LommeR.M.L.M.,Rutten H.J.T.,Bleichrodt R.P.,de Hingh I.H.J.T.(2010)Intraoperativehyperthermic intraperitoneal chemotherapy after cytoreductive surgery forperitoneal carcinomatosis in an experimental model.British Journal ofSurgery.97:1874-80)和Sugarbaker(Sugarbaker P.H.(1998)Intraperitonealchemotherapy and cytoreductive surgery for the prevention and treatment ofperitoneal carcinomatosis and sarcomatosis.Seminars in Surgical Oncology.14:254-61)的腹膜癌扩散指数(PCI)评分的改良。
(B)在用PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水(PC085)、辅激活因子主导(CAP)的无细胞腹水(PC249)和胎牛血清(FBS；对照)处理的腹膜癌扩散(PC)细胞系小鼠模型中对PAI-1抑制的不同敏感性的体内验证。所示图像代表响应于PAI-1抑制或溶媒形成的腹膜转移。箭头指示可见的肿瘤。(C)通过改良的腹膜癌扩散指数(PCI)评分评估肿瘤负荷。与用辅激活因子主导(CAP)的无细胞腹水(PC249)和胎牛血清处理的小鼠相比，经PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水处理的小鼠响应于TM5441显著降低了肿瘤负荷(n＝5只小鼠/组)。
图15显示通过腹膜内(i.p.)滴注TM5441而有效抑制了暴露于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水(PC085)的腹膜癌扩散(PC)细胞系小鼠模型中腹膜肿瘤形成，但当口服时不抑制(n＝4只小鼠/组)。
图16匹配的患者无细胞腹水及其细胞成分用于生成患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)。(A)在PC383患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)和PC249患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)模型中形成的腹膜内肿瘤的代表性图像。箭头指示可见的肿瘤。(B)代表性苏木精和伊红(H&E)染色和免疫组化分析显示，患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤具有与对应患者肿瘤组织相似的组织学特征，且这些患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤为结肠源性(CK20+CK7-CDX2+)。比例尺，50μM。
图17显示PAI-1抑制在沉溺于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水的体内小鼠模型中高度有效。(A)在DMSO溶媒或2mM TM5441存在下，将PAI-1旁分泌成瘾(PPA)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)(PC383)和辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)(PC249)用其匹配的无细胞腹水或胎牛血清(FBS)处理(n＝4只小鼠/组)。在处死小鼠后，通过称量所有可见肿瘤来量化肿瘤负荷。只有用匹配的PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水处理的PAI-1旁分泌成瘾(PPA)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)对PAI-1抑制敏感，并显示肿瘤负荷显著降低。(B)在DMSO溶媒或2mM TM5441存在下，将辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)(PC249)用其匹配的无细胞腹水或PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水(PC383)处理(n＝4只小鼠/组，例外是用PC249无细胞腹水和DMSO处理的组(n＝3))。暴露于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水的辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)变得对PAI-1抑制敏感，尽管在其匹配腹水存在下不敏感。
图18显示旁分泌扰动(paracrine perturbation)的建议模型，其可用于腹膜癌扩散(PC)的新治疗策略。
图19(A)选择p-STAT3替代生物标志物的候选物的工作流程。(B)基于系统配对相关分析的靶标优先次序。选择用ELISA验证的基因以粗体显示。其他代表TCGA COADREAD数据库中与STAT3的正相关不在前25％的基因，以及TM5441微阵列数据库中不在被下调/上调的的前25％中的基因。
图20显示经验证的p-STAT3的替代生物标志物的组(n＝70)。(A)p-STAT3与选定的p-STAT3替代生物标志物候选物IL6、IL10、CCL2、MMP9以及ANGPT1之间的相关性。通过ELISA测量每位患者的无细胞腹水中替代生物标志物的浓度，并针对STAT3磷酸化程度绘图(n＝70个样品/替代标志物)。相关性分析通过斯皮尔曼相关系数检验确定。(B)受试者工作特征(ROC)曲线，代表单个p-STAT3替代生物标志物正确分类PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)组或替代通路活化(APA)组的能力。(C)p-STAT3替代生物标志物的临界值，用于将样品分为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)组或替代通路活化(APA)组。(D)单个生物标志物和复合生物标志物的组合的分类准确度总结。如果样品的浓度高于临界值，则认为生物标志物阳性(+)。(E)可用于鉴定可能对PAI-1抑制敏感的患者的临界值汇总。
图21显示了p-STAT3的可选择的替代生物标志物的组(n＝40)，(A)p-STAT3与选定的p-STAT3替代生物标志物候选物TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44以及CXCL10之间的相关性。通过ELISA测量每位患者无细胞腹水中替代生物标志物的浓度，并针对STAT3磷酸化程度绘图(n＝40个样品/替代标志物)。相关分析通过斯皮尔曼相关系数检验确定。(B)受试者工作特征(ROC)曲线，代表单个p-STAT3替代生物标志物正确分类PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)组或替代通路活化(APA)组的能力。(C)由TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44以及CXCL10组成的复合生物标志物组的受试者工作特征(ROC)曲线。(D)使用在TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10分析中使用的匹配样品的IL6受试者工作特征(ROC)曲线(左)和包括IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44以及CXCL10的复合生物标志物组的受试者工作特征(ROC)曲线(右)。(E)单个生物标志物和复合生物标志物组的曲线下面积(AUC)汇总。
定义
如本文使用的，术语“水平”和“浓度”同义使用。
如本文使用的，术语“生物标志物”或“标志物”是指特定生物学性质、生化特征或方面的分子指示物，其可用于确定特定疾病或状况的存在或不存在和/或严重程度。换句话说，“生物标志物”被定义为反映疾病过程的活动性的实验室量度。生物标志物的实例是但不限于蛋白质、代谢物、基因、DNA和RNA。如本文所公开的生物标志物是指分离的生物标志物。评估这些生物标志物及其与病理学状况或疾病的相关性可以通过例如确定标志物存在或不存在、同一标志物在不同临床环境中表达水平的差异和/或患病样品和无病样品之间的对比分析来进行。
如本文使用的，术语“替代标志物”是指对体液中生物标志物水平的测量，所述水平指示有活性的生物学过程或信号通路，或疾病的临床病理学级别。例如，本文所述的替代标志物是指一种或更多种生物标志物，其可用作预期靶的替代物或代表。因此，如本文使用的，替代标志物还可指生物标记物组，其用作例如通过分析患者腹水得到的细胞中STAT3活化水平的替代参数。例如，如本文所示，本文列出的生物标志物可用作STAT3磷酸化的替代标志物。
如本文使用的，术语“PAI-1”是指纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)，也称为内皮纤溶酶原激活物抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(serpin E1)。PAI-1是一种由人丝氨酸蛋白酶抑制剂E1基因编码的蛋白质。PAI-1的主要功能是抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)，抑制负责裂解纤溶酶原以形成纤溶酶的酶。纤溶酶，自身独立地或联合基质金属蛋白酶，介导细胞外基质的降解。在这种情况下，PAI-1通过结合活性位点抑制尿激酶型纤溶酶原激活物，阻止纤溶酶的形成。另外的抑制通过PAI-1结合尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)/尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)复合物介导，导致后者降解。因此可以说PAI-1抑制丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)/尿激酶，因此是一种纤维蛋白溶解(降解血凝块的生理过程)的抑制剂。此外，PAI-1抑制基质金属蛋白酶的活性，其在恶性细胞经基膜侵袭中起关键作用。在人体中，PAI-1主要由内皮(血管内衬细胞)产生，但也由其他组织类型(如脂肪组织和基质组织)分泌。
如本文使用的，术语“PAI-1抑制剂”是指能够抑制或阻断纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)活性的化合物。各种化合物和药物并不局限于单一的作用，因此可认为是PAI-1抑制剂，即使它们在结构上有所不同。也就是说，PAI-1的抑制是这些化合物的综合特征。
如本文使用的，术语“腹水”是指腹部内液体的异常积聚。腹水的原因有很多，包括但不限于肝硬化、腹内癌、充血性心力衰竭和结核病。术语“腹水”也可指腹膜腔内的游离液体。如本文使用的，当指在处理背景下使用腹水时，例如，当将细胞培养物中的细胞暴露于无细胞腹水时，这指的是在体外使细胞接触获自受试者的无细胞腹水流体，以便阐明生物标志物水平的变化并观察细胞的分子或物理表型的总体变化。
如本文使用的，术语“无细胞腹水”是指来源于例如患者的腹水的上清液成分。本文所指的无细胞腹水是在减瘤手术(CRS)开始时或常规腹水抽取(穿刺)过程中从腹膜腔中采集的，且例如以2000g进行离心10分钟以将细胞成分与流体成分分离。使用0.22μm过滤器对流体成分进行过滤灭菌，使其适合下游实验。本领域技术人员应理解，可以使用本领域已知的其他灭菌方法以获得适合下游应用的无细胞腹水。
如本文使用的，术语“磷酸化”是指蛋白激酶藉以将磷酸基团从三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鸟苷(GTP)转移到氨基酸的一个或更多个游离羟基的过程。一般而言，磷酸化是信号级联和通路中使用的开关之一。根据被讨论的通路的背景，磷酸化可用作“开”或“关”转换器。作为STAT3磷酸化(在本公开中也称为“p-STAT3”)的一个实例，在STAT3信号传递中，STAT3上的关键氨基酸残基(如酪氨酸705)的磷酸化诱导STAT3二聚体的形成，然后所述STAT3二聚体转位到细胞核中以调节特定基因表达并触发细胞中的下游信号级联。
如本文使用的，术语“STAT3”是指信号转导与转录活化因子3，一种由STAT3基因编码的转录因子。响应于生长因子、激素和细胞因子，STAT3被上游受体激酶磷酸化，因此在易位到细胞核之前经受二聚化，在细胞核中STAT3二聚体充当转录激活子。然而，STAT3通路也可独立于上游受体激酶通过非典型通路激活(参见例如，Interferon Independent Non-Canonical STAT Activation and Virus Induced Inflammation(Viruses.2018年4月；10(4):196))。
如本文使用的，术语“p-STAT3活化水平”与术语“STAT3磷酸化”、“STAT3活化”或“STAT3磷酸化水平”互换使用。
如本文使用的，术语“样品”是指生物样品，其包括但不限于任何量的来自生物(living thing)或以前活着的生物的物质。此类生物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。此类物质包括但不限于体液，例如血液、血浆、腹水、血清、尿液，细胞、器官、肿瘤样品、活检样品、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结和皮肤。此类样品可从已知患有该疾病的受试者、被认为患有该疾病的受试者和无该疾病的受试者获得。本领域技术人员应理解，每种类型的样品需要不同的(预)处理步骤，然后才能够用于所要求保护的方法。通过各种实例，对于呈液体形式的样品，需要进行离心以分离细胞和可溶性成分。对于固体形式的样品，组织解离需要使用机械解离和酶处理的组合来进行，以产生单细胞悬液，可对其进行离心分离上清液和细胞成分。然后可以通过我们的体外和体内实验评估上清液/可溶性成分和细胞成分。本领域技术人员应该知道获得适于在本文所公开方法中使用的样品所需的方法。
如本文使用的，术语“腹膜癌扩散”是指癌症的腹腔内扩散，其中癌扩散的起源可以是源于腹腔内器官或源于腹膜(衬于大部分腹部器官的薄层组织)本身的恶性肿瘤。
如本文使用的，术语“减瘤手术(CRS)”是指通过一系列腹膜切除术和内脏切除术，完全去除腹腔内发现的肉眼可见肿瘤。
如本文使用的，术语“腹腔热灌注化疗”是指用于根除减瘤手术后留下的显微镜下病变的疗法，其包括将加热的化疗药物的溶液加入腹腔，持续60至90分钟。
如本文使用的，术语“旁分泌因子”是指由细胞分泌的可扩散和可溶性蛋白质，以通过旁分泌或自分泌相互作用调节相邻细胞或起源细胞中的细胞反应。此类旁分泌因子的实例包括但不限于白细胞介素6(IL6)、转化生长因子β(TGF-β)、Wnt蛋白、声波刺猬蛋白(SHH)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)。
如本文使用的，术语“致癌成瘾(oncogenic addiction)”是指细胞在暴露于某种旁分泌因子时导致细胞信号级联被激活的现象。例如，STAT3活化导致产生和分泌更多的同一旁分泌因子，导致正反馈回路(参见例如，图18)。这些细胞利用正反馈生物循环进行生长并激活通路活化，因此对该过程成瘾。以同样的逻辑，术语“对PAI-1致癌成瘾”是指PAI-1活化导致产生更多PAI-1，从而导致基于PAI-1的正反馈回路的情况。如果这种正反馈回路的产生被阻止，那些缺乏它们已习惯(即成瘾)的关键刺激物的细胞将会死亡。
详细描述
结肠直肠腹膜癌扩散中存在腹水预示预后不良。假设腹水是生物学相关的，并且可用于探索新疗法。利用肿瘤生物学来找出针对这种疾病的新治疗策略显示出巨大的临床影响。如本文所示，靶向结肠直肠腹膜癌扩散的主要信号通路的小分子抑制剂可用于临床环境。
因此，本文公开了能够对腹膜癌扩散患者进行靶向治疗的方法。本文还显示，例如，靶向主要信号通路的小分子抑制剂可用于治疗结肠直肠腹膜癌扩散，或这些抑制剂可用于以下临床环境：在新辅助治疗环境下，降低不是减瘤手术(CRS)和腹腔热灌注化疗(HIPEC，也称为IPHC-腹腔热灌注化疗)的候选患者的肿瘤负荷而使这些患者转变为减瘤手术和腹腔热灌注化疗的候选患者；在辅助治疗环境下，通过向高温腹腔化疗方案中添加小分子抑制剂来提高根除减瘤手术后残存的显微镜下病变的疗效；在姑息治疗环境下，减少腹膜疾病引起的衰弱症状；和预防性治疗环境中具有发展腹膜癌扩散的高风险的结肠直肠癌患者。
目前，对具有或患有腹膜癌扩散患者的唯一治愈形式或治愈标准是进行减瘤手术，并在手术结束时滴注腹腔热灌注化疗剂。然而，目前的腹腔热灌注化疗方案并未利用肿瘤生物学知识进行治疗，而仅使用细胞毒性药物形式的常规化疗。此外，有资格进行减瘤手术和腹腔热灌注化疗的患者仅占所有腹膜癌扩散患者的10％。
在本公开的范围内，已经鉴定了可以预测对腹膜内(IP)滴注PAI-1抑制剂(例如，但不限于TM5441)的治疗的反应的生物标志物。使用本文公开的方法，已经确定了被认为对这种疗法有反应的不同患者组。其中一组包括具有高浓度PAI-1(≥20ng/mL)且同时具有高STAT3活化(≥0.2OD450)的患者，不受理论约束，认为他们对PAI-1抑制高度易感。另一组包括具有与第一组相比PAI-1浓度较低(＜20ng/mL)、但高STAT3活化(≥0.2OD450)的患者。该组患者也被认为对PAI-1抑制易感。例如，这可以在具有高PAI-1水平并同时激活例如癌细胞中STAT3信号传递的腹水中看到。在临床背景下，腹腔内滴注PAI-1抑制剂可用于新辅助疗法、在腹腔热灌注化疗时、或甚至于姑息治疗环境下，因此为比那些符合进行减瘤手术和腹腔热灌注化疗的条件的患者多得多的患者提供了治疗选择。还认为PAI-1抑制剂可被雾化以用于姑息治疗环境，例如用于加压腹腔内气溶胶化疗(PIPAC)。
此外，生成的数据表明，该策略适用于结肠直肠腹膜癌扩散患者，并且也适用于具有其他组织学亚型的腹膜癌扩散的患者。
因此，在一个实例中，腹膜癌扩散的亚型可以是但不限于结肠直肠腹膜癌扩散、小肠腹膜癌扩散、间皮瘤、子宫内膜腹膜癌扩散、胃腹膜癌扩散、卵巢腹膜癌扩散、阑尾腹膜癌扩散、胰腺腹膜癌扩散、尿路腹膜癌扩散和腹膜假性粘液瘤(PMP)。在另一个实例中，腹膜癌扩散是未知来源的。在一个实例中，腹膜癌扩散的亚型是结肠直肠腹膜癌扩散。
如本文使用的，当结合肿瘤、肿瘤样品或亚型使用术语“未知原发性”时，是指存在腹膜癌扩散，其中通过临床、放射学和病理学评估未能确定原发性肿瘤。这种不确定可能是由于例如但不限于以下的原因：原发性肿瘤的(小)尺寸不足以进行病理评估，或者外面的腹膜癌扩散将原发性肿瘤包裹，从而无法进行临床检测，或者缺乏具有高特异性的肿瘤标志物。
在本公开所公开的实验的背景下，术语“其他腹膜癌扩散(PC)组织学”是指起源于以下部位即肺、乳腺、腹膜、胃卵巢同步、小肠、尿路上皮和腭的腹膜癌扩散的组织学亚型。由于每个亚组中采集的样品数量很少，将这些样品归入“其他PC组织学”。
在一个实例中，腹膜癌扩散是恶性的。在另一个实例中，腹膜癌扩散是原发性肿瘤。在又一个实例中，腹膜癌扩散是转移瘤或继发性肿瘤。
在另一个实例中，公开了一种基于腹膜腔中腹水内PAI-1的水平，预测、确定或检测患有腹膜癌扩散的受试者对使用抗癌药物的治疗或在腹膜腔内滴注的抗癌治疗剂的易感性的方法。在不受理论约束的情况下，认为暴露于腹水的癌细胞中的STAT3活化允许鉴定出会受益于PAI-1抑制的患者亚组。
如本文使用的，术语“易感性”是指某事物(例如疾病)可能受其他事物(例如对所述疾病的治疗)影响的倾向性。这种影响可能是有利的，也可能是不利的，这取决于所述及的对象。例如，如果疾病对特定治疗敏感，那么所述疾病对特定治疗的易感性是有利影响。于是可以说该疾病对治疗易感(或敏感)。在另一方面，如果疾病对指定治疗不易感，则认为该疾病对所述治疗无反应或耐受。
如以上定义的，术语“预测易感性”是指某事物(例如疾病)可能受其他事物(例如对所述疾病的治疗)影响的倾向性。换句话说，预测癌症对特定治疗的易感性是确定癌症是否会对使用某种药物或抗癌药物的治疗或抗癌治疗有反应。值得注意的是，术语“确定易感性”并不等同于，例如，“进行预后”。前一个术语只关注疾病对特定药物或疗法的可能反应，而后者描述患者的临床结果，其由例如但不限于疾病稳定(获得这种状态后)的时间长度、总生存期和/或无病生存期的时间长度的参数定义。虽然在某些情况下，可能会关联一个术语对另一个术语的影响，也就是说，对指定治疗反应良好的疾病(即，该疾病对该治疗易感)可能会增加所述患者针对整体疾病进展获得积极预后的可能性，但这不能作为规则。如本领域技术人员将了解的，除了疾病对治疗的易感性之外，积极的预后取决于许多患者特定性因素，例如，治疗前患者的总体健康状况、代谢、饮食、(原发性)疾病的侵袭性、继发性疾病和/或感染等。
本文还公开了预测、确定或检测患有腹膜癌扩散的受试者对抗癌药物治疗或抗癌治疗的易感性的方法。
首先，从进行手术的腹膜癌扩散患者的临床数据中认识到，与没有临床上明显的腹水的患者相比，腹腔内存在临床上明显的腹水的患者预后较差。这种预后显著性与结肠直肠起源的腹膜癌扩散有关，尽管它不限于这种组织学亚型(图1)。值得注意的是，术语“预后较差”的比较依据如下：一组预后较差的患者是与那些在手术期间没有临床上明显的腹水的患者相比，在手术期间出现临床上明显的腹水的那些患者。如本文使用的，术语“临床上明显的腹水”是指在手术期间以诸如50ml或更大的体积存在的腹水。
用从患者采集的无细胞腹水对已建立的腹膜癌扩散的细胞系模型(Colo-205、HM3-TERT和LP9-TERT)进行的体外处理显示，在共培养模型中，基质细胞上集落的增殖、迁移和形成增加(图2)，指示腹膜癌扩散的细胞系模型模拟的肿瘤与其在体内环境中接近。
对用无细胞腹水处理的腹膜癌扩散细胞系的基因表达分析显示，STAT3通路被活化(图3)，指示STAT3的活化在该疾病中起重要作用。
对用无细胞腹水处理的细胞中的STAT3磷酸化的蛋白印迹分析显示，STAT3信号通路通过Tyr705磷酸化而活化(图4a)。对从不同组织学亚型采集的无细胞腹水的筛选显示，与来自其他解剖学来源的腹膜癌扩散相比，用从结肠直肠腹膜癌扩散采集的无细胞腹水处理细胞时，STAT3活化最为普遍(图4b)。因此，该数据显示，与来自其他解剖学来源的腹膜癌扩散的无细胞腹水相比，来自结肠直肠腹膜癌扩散的无细胞腹水诱导更高的STAT3活化率。此外，值得注意的是，从其他解剖来源的腹膜癌扩散中采集的无细胞腹水也可以活化STAT3信号传递。
从相同患者采集的与腹膜转移瘤相匹配的原发性结肠直肠癌的免疫组化显示，与原发性肿瘤相比，STAT3活化在转移瘤中更为普遍(图5)。因此，该数据显示，与剥夺原发性肿瘤的STAT3信号传递的策略相比，剥夺转移性细胞的STAT3信号传递的处理效果良好。这是因为STAT3活化在转移瘤中比在原发性肿瘤中更为普遍。如本文提供的数据所示，与STAT3信号传递未被PAI-1活化的肿瘤相比，其肿瘤因高PAI-1水平而具有高STAT3信号传递的患者亚群对PAI-1抑制更易感。在未显示任何STAT3信号传递活化的肿瘤中，这种情况更少。
用无细胞腹水处理已建立的结肠直肠腹膜癌扩散细胞系模型也导致上皮-间充质转化(EMT)标志物的富集(图6a)。在不同组织学来源的无细胞腹水上进行的无偏倚无细胞腹水质谱筛选连同细胞因子阵列确定了在结肠直肠腹膜癌扩散的无细胞腹水中凝血/溶栓因子的重要性(图6b)。还显示PAI-1(参与防止凝血)在来自结肠直肠腹膜癌扩散的无细胞腹水中高度富集(图6c)。这意味着，通过对无细胞腹水的蛋白质组学分析，例如，通过质谱或细胞因子阵列，发现凝血通路在结肠直肠腹膜癌扩散中富集。从标志物候选物的角度来看，也显示参与凝血级联反应的PAI-1极为丰富。因此，正在描述一种现象，其中癌细胞劫持活跃凝血通路的存在以进行致癌活化。换句话说，且在不受理论约束的情况下，认为腹膜腔内凝血通路活化的存在导致癌细胞中由凝血因子或参与防止凝血的因子引发的致癌性信号通路活化。这不意在描述腹部有血块的物理意义上的凝血。
发明人对癌症基因组图谱(TCGA)数据库的查询显示，具有高水平PAI-1的结肠直肠癌激活STAT3信号传递(图7a)，并显示上皮-间充质转化特征的富集(图7b)，并且具有最差的预后(图7c)。综上所述，已显示当将癌细胞暴露于腹水时，腹水中的PAI-1可导致这些癌细胞中STAT3活化，最终导致上皮-间充质转化(EMT)表型，这是造成生物侵袭性肿瘤的临床表现的原因，导致这些患者的预后不良。值得注意的是，在用无细胞腹水处理的细胞系中未发现JAK活化，表明腹水以非经典方式激活STAT3信号传递(图8)。这意味着在这种情况下，STAT3以非经典方式，而不是经典方式被激活。因此，在不受理论约束的情况下，认为其他激活物(例如PAI-1)，而不是STAT3的经典激活物，例如IL6，可将STAT3激活。
因此，在一个实例中，样品是但不限于腹水、血液、血清、尿液、引流液、手术引流液、液体体液、从细胞获得的上清液、从器官获得的上清液、从组织、淋巴获得的上清液、从淋巴结获得的上清液、液体活检样品和从活检样品获得的上清液。
从器官、组织等获得的上清液可指从例如提取后经浸渍、切碎、研磨或粉碎的器官样品获得的液体。或者，对于含有很少或没有液体的样品，可以在切碎之前或之后将样品置于临床兼容缓冲液中。产生的液体称为上清液，然后其可以用于下游以进一步分析。
在另一个实例中，样品是液体样品。在又一个实例中，本文公开的方法可以在一个或更多个样品上进行。例如，本文公开的方法可以在两个样品上进行。在另一个实例中，PAI-1浓度的确定或测量可在一个样品上进行，且STAT3活化(例如，通过磷酸化)水平的确定或测量可在另一个样品上进行。这些样品可能来自相同或不同的来源。在一个实例中，第一个样品可以是无细胞样品，第二个样品可以是含有细胞的样品。在另一个实例中，第一个样品可以是腹水，第二个样品可以是活检样品。在一个实例中，可在单个样品中测量PAI-1浓度和STAT3活化(例如，通过磷酸化或通过替代标志物)。换句话说，PAI-1浓度和STAT3活化的确定可以在单个样品上进行。
了解了在癌细胞通过旁分泌信号传递时PAI-1在STAT3活化的上游，在从腹膜癌扩散患者采集的无细胞腹水中系统地阐明了PAI-1的水平。已建立的腹膜癌扩散细胞系模型Colo-205也用这些无细胞腹水处理，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)阐明p-STAT3的水平，以确定STAT3活化的程度。对腹水中PAI-1的水平(log2；x轴)与STAT3磷酸化程度(导致STAT3活化)(y轴)作图，鉴定到腹水中的PAI-1水平与无细胞腹水处理细胞中的STAT3活化水平呈正相关，在结肠直肠腹膜癌扩散(PC)者的无细胞腹水的背景下以及在从其他组织学亚型的腹膜癌扩散(PC)者中采集的无细胞腹水的背景下均如此(图9a、b)。
然后用暴露于这些腹水的腹膜癌扩散(PC)细胞中相应的STAT3磷酸化程度分析无细胞腹水中未转化的PAI-1水平。将STAT3(Tyr705)的磷酸化水平设定为大于0.2(OD 450)作为活化的STAT3信号传递的定义，注意到所有PAI-1水平高于20ng/mL的样品均显示活化的STAT3信号传递。这一观察结果促成对三个(亚)组的定义，如下节所示。
首先，具有高PAI-1水平(即PAI-1水平超过20ng/ml)的腹水显示出严重依赖PAI-1来激活STAT3信号传导。将这些样品称为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)性的。用从这些患者采集的无细胞腹水处理细胞系导致高水平的STAT3磷酸化(高STAT3活性)。在不受理论约束的情况下，认为癌细胞中STAT3的活化可能完全依赖于从这组患者采集的无细胞腹水中的PAI-1水平，强调了对该通路的上游激活物的致癌成瘾现象。其次，将暴露于这些无细胞腹水的细胞中具有低PAI-1水平(即PAI-1水平低于20ng/ml)且具有活化STAT3信号传递的无细胞腹水称为辅激活因子主导的(CAP)。尽管具有低PAI-1水平，用从这些患者采集的无细胞腹水处理细胞系仍然导致高水平的STAT3磷酸化(高STAT3活性)。在不受理论束缚的情况下，认为在这组中，PAI-1和其他配体的组合可能激活STAT3信号传递。最后，具有低PAI-1水平(即PAI-1水平低于20ng/ml)且未能激活STAT3信号传递的无细胞腹水可能具有激活其他信号通路的配体。将这些样品称为替代通路活化(APA)。用从这些患者采集的无细胞腹水处理细胞系未导致显著水平的STAT3磷酸化(低STAT3活性)。图10a和10b强调，不同形式的无细胞腹水的分类适用于结肠直肠腹膜癌扩散起源的无细胞腹水以及其他组织学亚型的无细胞腹水。
为了证实这一理论，在来自3个不同亚组的无细胞腹水的存在下，用TM5441(PAI-1抑制剂)处理Colo-205细胞系，预期是暴露于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)性无细胞腹水的细胞对PAI-1抑制高度敏感。正如预测的那样，根据PAI-1和p-STAT3门控观察到对PAI-1抑制的不同敏感性(图11)。用另一种PAI-1抑制剂(Tiplaxtinin)处理也显示出相同的差异化反应趋势，强调PAI-1抑制是特异性的，且观察到的结果不是由于抑制剂的细胞毒效应造成的(图12a)。随后，对STAT3抑制剂(Napabucasin)、PI3K/mTOR双重抑制剂(BEZ235)和用于治疗结肠直肠腹膜癌扩散(PC)的腹腔热灌注化疗(HIPEC)中使用的常规化疗药物(丝裂霉素C)进行了测试，以比较其抑制PAI-1致癌成瘾与抑制由无细胞腹水激活的下游信号通路以及细胞增殖的疗效。研究发现，在无细胞腹水存在的情况下，直接靶向癌细胞是无效的，因为无细胞腹水促进了这些肿瘤细胞的化疗耐药性(图12b-d)。
为进一步考察参与确定对PAI-1抑制的敏感性的下游信号通路，在TM5441或DMSO溶媒存在下，对用代表PAI-1旁分泌成瘾(PPA)(PC085)、辅激活因子主导(CAP)(PC249)性的无细胞腹水，或胎牛血清(FBS；对照组)处理的Colo-205细胞进行RNA微阵列。基因集富集分析(GSEA)鉴定出，在PAI-1抑制后，PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组中的IL6-JAK-STAT3信号通路被明显下调(图13a)。这一发现与最初的假设一致，即PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组对PAI-1抑制的高度敏感归因于PAI-1-STAT3信号通路。类似地，在用这些无细胞腹水和TM5441处理的细胞中p-STAT3的测量值表明消除STAT3活化所需的不同浓度(图13b)。
作为这不仅仅是体外生物学观察现象的概念验证，将Colo-205细胞与无细胞腹水或胎牛血清(FBS)一起腹膜内注射到BALB/c裸鼠中，以创建腹膜癌扩散(PC)模型。这些小鼠用腹膜内(i.p.)注射TM5441进行治疗。与体外结果一致，在PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水处理的小鼠中观察到肿瘤负荷显著降低(图14)。然后在一个实例中，通过比较腹膜内注射和口服施用TM5441来评估最佳给药途径。在腹膜癌扩散(PC)小鼠模型中，腹膜内滴注TM5441在减少肿瘤负荷方面极大地优于口服施用(图15)。这一发现与在腹膜癌扩散(PC)患者中观察到的情况一致，其中通常认为全身性施用药物是无效的，因为腹膜-血浆屏障导致细胞毒性药物从血浆向腹膜肿瘤和腹水中的渗透减少。
随后，开发了两种患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)，一种来自PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组(PC383患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX))，一种来自辅激活因子主导(CAP)组(PC249患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX))，以更好地将PAI-1成瘾理论概括为腹膜癌扩散(PC)患者的表现形式(avatar)。对患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤的形态学评估显示印戒细胞形态学，类似于患者初始肿瘤的组织学。免疫组化染色还证实，患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤是结肠来源的(图16)。
当用TM5441治疗时，将PC383患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)小鼠暴露于来自同一患者的匹配的无细胞腹水引发了与溶媒对照组和与胎牛血清(FBS)组相比显著更好的肿瘤生长抑制。相比之下，暴露于其匹配患者的无细胞腹水并用TM5441治疗的PC249患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)小鼠显示与溶媒对照组相比肿瘤负荷未减少，类似于胎牛血清(FBS)组的肿瘤负荷(图17a)。当将PC249患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)小鼠暴露于来自PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组的无细胞腹水(PC383腹水)时，这些肿瘤细胞变得对PAI-1抑制易感，尽管在其自身匹配的无细胞腹水存在下对PAI-1抑制不易感(图17b)。综上所述，该信息描述了封闭的生物系统背景中的一种以前未知的致癌成瘾现象，其中肿瘤及其微环境与体循环分离。在这种背景下，旁分泌因子为通路活化提供了关键刺激物；旁分泌抑制提供了停止临界点(图18)。
患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)模型有两个成分。第一个成分是实体瘤，其通过使腹水中的细胞成分在宿主体内(通常在小鼠体内)形成结节而形成。第二个成分是从获得实体瘤的同一患者采集的无细胞腹水。将无细胞腹水与正在增殖的细胞成分共同注入小鼠体内。这是一种考虑了细胞的内在表型，以及腹膜腔内肿瘤的旁分泌环境的模型。
作为概念验证，即本文公开的方法能够将患者腹水细分类为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组、辅激活因子主导(CAP)组和替代通路活化(APA)组，寻求通过分析患者的无细胞腹水来鉴定细胞中STAT3活化的替代标志物。简而言之，通过对参与已知STAT3通路的所有基因进行搜集，从《京都基因和基因组百科全书》(KEGG)数据库中鉴定到STAT3相关基因。根据NCBI生物系统数据库中列出的细胞外基因以及通过无细胞腹水质谱分析确定的蛋白，选择分泌型STAT3相关蛋白。使用两个数据库进行转录组学比较，以对推定的STAT3替代标志物进行优先性排序，并确定PAI-1旁分泌成瘾(PPA)性无细胞腹水处理的细胞中响应于TM5441(PAI-1抑制)被下调和上调的基因。将基因从下调最多到上调最多进行排序，随后对候选基因进行系统的配对相关分析。如图19b所示，对每组的配对分析进行优先性排序，并基于文献综述从每组中选择代表性基因，以将选择简化为35个基因。根据对优先性顺序排序、来自Luminex测定数据的与p-STAT3的潜在良好相关性以及文献综述中候选基因在癌症发病机制中的重要性，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)选择靶标以进一步评估(图19)。在40至70名患者的群组中验证了这一点，鉴定到一个4-生物标志物组，该组可通过患者的无细胞腹水分析确定细胞中STAT3活化的水平(图20和图21)。这一发现也可以作为，例如，从PAI-1疗法中获益的患者的即时护理分层试剂盒的基础。
如上所述，本公开强调了腹膜癌扩散患者的无细胞腹水中PAI-1的示例性临界水平，并且当与暴露于这些无细胞腹水液体的癌细胞中的STAT3活化水平相结合时，鉴定了会受益于PAI-1抑制的患者亚组。
在一个实例中，PAI-1的浓度在0ng/ml至450ng/ml之间、10ng/ml至20ng/ml之间、15ng/ml至25ng/ml之间或19ng/ml至29ng/ml之间。在一个实例中，PAI-1的浓度在0ng/ml至17ng/ml之间。在另一个实例中，PAI-1的浓度在0ng/ml至20ng/ml之间。在另一个实例中，本发明背景中PAI-1的浓度或者小于20ng/ml，或者大于或等于20ng/ml。
在另一个实例中，通过磷酸化来衡量的STAT活化水平在0至1.7之间(按450nm处的光密度(OD450)测量的)。在一个实例中，通过磷酸化来衡量的STAT活化水平在0.01至1之间、0.1至0.5之间、0.05至0.19之间、0.18至0.26之间、0.24至0.48之间、0.35至0.5之间、约0.08、0.4至0.6之间、0.5至0.75之间、0.65至0.8之间、0.79至0.90之间、0.88至0.95之间、0.9至1之间、约0.1、约0.15、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25或约0.3(按450nm处的光密度(OD450)下测量的)。在另一个实例中，本发明背景中通过磷酸化来衡量的STAT活化水平或者小于0.2ng/ml(OD450)，或者大于20ng/ml(OD450)。
术语“0”(零)的述及包括作为基于这种理解的一个值，即当标志物的存在例如低于试剂盒或检测方法的检测限且因此不可测量时，也使用“0”。在这种情况下，观察值通常表示为“不适用(n.a.)”或“无(nil)”。
为了包括大多数PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品，选择60个PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品的低5％百分位的替代生物标志物值作为初始临界值(扩展数据，未显示)。对于MMP9，选择替代通路活化(APA)样品中具有最高值的生物标志物值，13ng/ml，以排除所有替代通路活化(APA)样品。基于3或4个初始临界值的组，过滤出52份PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品和2份替代通路活化(APA)样品作为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品(扩展数据，未显示)，分别对应于86.67％和80.0％的准确度。
为了提高准确度，选择了更严格的IL6和IL10临界值以排除假阳性替代通路活化(APA)样品，并选择了不太严格的CCL2和MMP9临界值以包括假阴性PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品。最终临界值如图20c所示。基于3或4个最终临界值的组，过滤出56份PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品和1份替代通路活化(APA)样品作为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品(扩展数据，未显示)，分别对应于93.33％和90.0％的准确度。该复合生物标志物组的总体准确度(及格≥3个生物标志物临界值)为92.86％(图20b)。
基于本文提供的信息，已经表明，基于逐步法和采用赤池信息量准则或贝叶斯信息准则的最佳子集法，单独的IL6是统计学上最稳健的STAT3磷酸化程度(p-STAT3)预测因子。一般而言，回归分析是评估一组自变量是否显著影响因变量的统计方法。逐步回归法是一种通过自动添加或删除单个预测因子并基于统计学显著性选择单一模型来拟合回归模型的方法。最佳子集回归法是使用一组指定的预测因子比较所有可能模型的方法，并显示出包含一个预测因子、两个预测因子等的最佳拟合模型。赤池信息量准则是对每个模型的样品外预测误差和相对质量的估计，从而提供模型选择的手段。贝叶斯信息准则是在有限的模型集中进行模型选择的准则，其基于似然函数，通过增加更多的参数来解决可能的过拟合问题。
例如，在997pg/ml时IL6的临界值可以以95％的准确度定义PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品，并以80％的准确度排除替代通路活化(APA)样品，相当于92.86％。进一步表明，总体预测准确度可随复合生物标志物组中所用生物标志物数量的增加而提高。例如，以3或4个阳性生物标志物为标准的IL6、IL10、CCL2和MMP9的组能够以93.33％的准确度鉴定PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)受试者，并以90％的准确度排除替代通路活化(APA)受试者，相当于92.86％的总体准确度。其他示例性组可遍布本说明书而找到。以上意味着，获得统计学上稳健结果所需的最小标志物数量是一种生物标志物(例如，IL6)。这些生物标志物可以是但不限于本文所列的生物标志物。在一个实例中，生物标志物组(panel或group)包括IL6。在一个实例中，在本文公开的方法中使用单一生物标志物，其中所述生物标志物是但不限于IL6(白介素6)、IL10(白介素10)、CCL2(趋化因子(CC基序)配体2；也称为单核细胞趋化蛋白1(MCP1)或小诱导型细胞因子A2(smallinducible cytokine A2))、MMP9(基质金属肽酶9，也称为92kDa Iv型胶原酶、92kDa明胶酶或明胶酶B(GELB))、TGFB1(转化生长因子β1)、POSTN(骨膜蛋白PN或成骨细胞特异性因子OSF-2)、VSIG4(含V-set和免疫球蛋白结构域4)、CD44和CXCL10(C-X-C基序趋化因子10，也称为γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)或小诱导型细胞因子B10)。在另一个实例中，在本文公开的方法中使用了两种生物标志物，其中所述两种生物标志物是但不限于以下组合：IL6和IL10；IL6和CCL2；IL10和CCL2；IL6和MMP9；IL10和MMP9；以及CCL2和MMP9。在又一个实例中，在本文公开的方法中使用了三种生物标志物，其中所述三种生物标志物是但不限于以下组合：IL6、IL10和CCL2；IL6、IL10和MMP9；IL6、CCL2和MMP9；IL10、CCL2和MMP9。在另一个实例中，在本文公开的方法中使用四种生物标志物，其中所述四种生物标志物是IL6、IL10、CCL2和MMP9。在又一个实例中，在本文公开的方法中使用了五种生物标志物，其中所述五种生物标志物是TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在另一个实例中，在本文公开的方法中使用了六种生物标志物，其中所述六种生物标志物是IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在另一个实例中，本文公开的组包括是但不限于以下的生物标志物：IL6；IL10；CCL2；MMP9；IL6和IL10；IL6和CCL2；IL10和CCL2；IL6和MMP9；IL10和MMP9；CCL2和MMP9；IL6、IL10和CCL2；IL6、IL10和MMP9；IL6、CCL2和MMP9；IL10、CCL2和IL6；以及IL10、CCL2和MMP9。
例如，四种替代生物标志物的临界值是通过筛选70例患者的无细胞腹水确定的。考虑到患者样本的灵活性，对每种生物标志物纳入了±5％临界值范围。因此，在一个实例中，本发明在涉及临界值时，是指具有±5％的缓冲或±2％的缓冲的特定临界值。
在一个实例中，将一个患者亚组或子集定义为具有介于0ng/ml至20ng/ml之间的PAI-1水平且p-STAT3活化水平低于0.2(OD450)。在另一个实例中，将一个患者亚组或子集定义为具有介于0ng/ml至20ng/ml之间的PAI-1水平且p-STAT3活化水平等于或大于0.2(≥0.2；OD450)。在另一个实例中，将患者亚组或子集定义为具有等于或大于20ng/ml(≥20ng/ml)的PAI-1水平且p-STAT3活化水平等于或大于0.2(≥0.2；OD450)。
在又一个实例中，将患者亚组或子集定义为具有介于0ng/ml至17ng/ml之间的PAI-1水平且p-STAT3活化水平低于0.2(OD450)。在另一个实例中，将患者亚组或子集定义为具有介于0ng/ml至17ng/ml之间的PAI-1水平且p-STAT3活化水平等于或大于0.2(≥0.2；OD450)。在另一个实例中，将患者亚组或子集定义为具有等于或大于17ng/ml(≥17)的PAI-1水平且p-STAT3活化水平等于或大于0.2(≥0.2；OD450)。
使用本文公开的方法鉴定的五个示例性替代标志物(在本例中为IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1)的浓度对STAT3磷酸化程度作图。所得图如图20所示。基于斯皮尔曼相关性分析(图20中的R)，选择IL6、IL10和CCL2作为STAT3磷酸化的替代生物标志物。尽管MMP9显示与磷酸化STAT3呈弱相关性，但PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品中MMP9的浓度显著高于替代通路活化(APA)样品中的浓度(未配对t检验，P＜0.05)。将MMP9作为替代生物标志物纳入有助于从PAI-1旁分泌成瘾(PPA)/辅激活因子主导(CAP)样品中排除替代通路活化(APA)样品。
因此，在一个实例中，基于PAI-1和p-STAT3的浓度来定义一个患者亚组或子集。如果p-STAT3用于确定待测受试者属于哪个患者亚组或子集(例如，与PAI-1结合使用)，则可选择性测量除p-STAT3以外的其他替代标志物。在另一个实例中，如果直接测量p-STAT3，则不再测量替代标志物。在另一个实例中，如果不使用p-STAT3来确定待测受试者属于哪个患者亚组或子集，则使用本文所列的替代标志物代替STAT3磷酸化直接测量。
在一个实例中，PAI-1浓度低于20ng/ml指示患者属于辅激活因子主导(CAP)或替代通路活化(APA)亚组。在另一个实例中，PAI-1浓度大于或等于20ng/ml指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)亚组。
在一个实例中，p-STAT3浓度小于0.2OD450指示患者属于替代通路活化(APA)亚组。在另一个实例中，至少0.2OD450或更高浓度的p-STAT3指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)或辅激活因子主导(CAP)亚组。
在一个实例中，如果显示患者具有至少20ng/ml或更高的PAI-1浓度和至少0.2OD450或更高的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组。
在一个实例中，如果显示患者具有小于20ng/ml的PAI-1浓度和至少0.2OD450或更高的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为辅激活因子主导(CAP)组。
在一个实例中，如果显示患者具有小于20ng/ml的PAI-1浓度和小于0.2OD450的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为替代通路活化(APA)组。
在一个实例中，如果显示患者具有至少20ng/ml或更高的PAI-1浓度和p-STAT3浓度升高，则将该患者亚组或子集定义为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组。
在一个实例中，如果显示患者具有小于20ng/ml的PAI-1浓度和p-STAT3浓度升高，则将该患者亚组或子集定义为辅激活因子主导(CAP)组。
在一个实例中，如果显示患者具有低于20ng/ml的PAI-1浓度和p-STAT3浓度降低，则将该患者亚组或子集定义为替代通路活化(APA)组。
在一个实例中，如果显示患者具有增加的PAI-1浓度和至少0.2OD450或更高的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组。
在一个实例中，如果显示患者具有降低的PAI-1浓度和至少0.2OD450或更高的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为辅激活因子主导(CAP)组。
在一个实例中，如果显示患者具有降低的PAI-1浓度和小于0.2OD450的p-STAT3浓度，则将该患者亚组或子集定义为替代通路活化(APA)组。
在一个实例中，使用一种或更多种替代标志物测量p-STAT3的浓度，其中所述替代标志物是但不限于IL6、CCL2、IL10、MMP9、TGFB1、POSTN、VISG4、CD44、CXCL10及其组合。
在一个实例中，使用包括IL6、CCL2、IL10、MMP9、TGFB1、POSTN、VISG4、CD44和CXCL10的一组标志物来定义一个患者亚组或子集。在另一个实例中，使用包括IL6、CCL2、IL10和MMP9的一组标志物来定义一个患者亚组或子集。在又一个实例中，使用包括PAI-1和pSTAT3的一组标志物来定义一个患者亚组或子集。
在一个实例中，IL6的临界值是浓度997pg/ml。在另一个实例中，IL10的临界值是浓度15pg/ml。在另一个实例中，CCL2的临界值是浓度450pg/ml。在又一个实例中，MMP9的临界值是浓度3ng/ml。在上述实例中，浓度等于或大于每个标志物的特异性临界值指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组。换句话说，对于相应标志物，本文所示的值也可称为临界值或“(+)”。相反，如果所确定的浓度低于上述相同标志物的参考临界值，则相应标志物可指示为“(-)”。
在一个实例中，使用包括IL6、CCL2、IL10和MMP9的一组标志物来定义一个患者亚组或子集，其中任何2个标志物的组合显示浓度低于临界值则指示患者属于替代通路活化(APA)亚组。
在一个实例中，使用包括IL6、CCL2、IL10和MMP9的一组标志物来定义一个患者亚组或子集，其中任何3个标志物的组合显示浓度高于临界值则指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组。
在另一个实例中，使用包括IL6、CCL2、IL10和MMP9的一组标志物来定义一个患者亚组或子集，其中所有4个标志物显示浓度高于临界值则指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)。
在另一个实例中，使用包括TGFB1、POSTN、VSIG4、CCD44和CXCL10的一组标志物来定义一个患者亚组或子集，其中所有5个标志物显示浓度高于临界值则指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组。
在又一个实例中，使用包括IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CCD44和CXCL10的一组标志物来定义一个患者亚组或子集，其中所有6个标志物显示浓度高于临界值则指示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组。
在另一个实例中，先确定p-STAT3的浓度，然后确定PAI-1的浓度。
在一个实例中，如果基于p-STAT3的浓度测量结果显示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组，则PAI-1浓度小于20ng/ml指示受试者属于辅激活因子主导(CAP)亚组。如果基于p-STAT3的浓度测量结果显示患者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)亚组，则PAI-1浓度度为至少20ng/ml或更高指示受试者属于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)亚组。如果基于p-STAT3的浓度测量结果显示患者属于替代通路活化(APA)亚组，则PAI-1浓度低于20ng/ml指示受试者属于替代通路活化(APA)亚组。如果基于p-STAT3的浓度测量结果显示患者属于替代通路活化(APA)亚组，则PAI-1浓度为至少20ng/ml或更高指示受试者属于未确定的亚组。
在另一个实例中，将一个患者亚组或子集定义为具有小于997pg/ml的IL6浓度、小于450pg/ml的CCL2浓度、小于15pg/ml的IL10浓度和小于3ng/ml的MMP9浓度。该组称为如本文所定义的替代通路活化(APA)组。
在另一个实例中，将一个患者亚组或子集定义为具有等于或大于997pg/ml(≥997pg/ml)的IL6浓度、等于或大于450pg/ml(≥450pg/ml)的CCL2浓度、等于或大于15pg/ml(≥15pg/ml)的IL10浓度和等于或大于3ng/ml(≥3ng/ml)的MMP9浓度。该组统称为如本文所定义的PAI-1旁分泌成瘾(PPA)和辅激活因子主导(CAP)组。
在一个实例中，本文公开的方法可以在治疗环境中进行，该治疗环境是但不限于新辅助治疗环境、辅助治疗环境、姑息治疗环境和预防性治疗环境。在另外一个实例中，本文公开的方法可以在一种或更多种环境下对同一受试者进行。
如本文使用的，术语“环境”是指评估生物标志物的时间和治疗的时机。例如，术语“新辅助治疗环境”意指在患者接受手术之前已经抽取腹水，并且腹水是通过经皮引流手术抽取的。在确定患者的易感性后，将提供适当的治疗(取决于患者落入哪一组，即PAI-1旁分泌成瘾(PPA)、辅激活因子主导(CAP)、替代通路活化(APA)组)。在辅助治疗环境中，在手术前插入引流管以从腹腔内抽取腹水。在确定患者的易感性后，将在腹腔热灌注化疗(HIPEC)期间提供适当的治疗(取决于患者属于哪一组，即PAI-1旁分泌成瘾(PPA)、辅激活因子主导(CAP)、替代通路活化(APA)组)。在姑息治疗环境中，患者不接受任何手术并抽取腹水进行分析。患者接受相应的姑息治疗(取决于患者属于哪一组，即PAI-1旁分泌成瘾(PPA)、辅激活因子主导(CAP)、替代通路活化(APA)组)。
在另一个实例中，使用替代标志物进行STAT3活化(或磷酸化)水平的确定或测量。在另一个实例中，通过测量一种或更多种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。或者，还可以通过直接测量磷酸化的STAT3的浓度来确定STAT3磷酸化水平。本领域技术人员应理解，STAT3磷酸化不能直接例如在液体样品中确定，因为磷酸化发生在细胞内。因此，当在液体形式中测量STAT3磷酸化水平时，在体外、体内和临床环境中必须已经使暴露于无细胞腹水的细胞进行细胞裂解。使用例如酶联免疫吸附试验(ELISA)或能够确定所述水平的任何其他方法确定所得样品中STAT3磷酸化水平。可以使用本领域技术人员已知的方法进行细胞裂解，他们能够确定哪种方法最适合于手中的样品。
在另一个实例中，通过测量一种或更多种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在又一个实例中，还可以通过测量腹水或肿瘤活检中存在的细胞成分的p-STAT3水平来确定STAT3磷酸化水平(p-STAT3)。在另一个实例中，可以通过直接测量磷酸化的STAT3的浓度和通过测量一种或更多种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化的水平。
如本文使用的，术语“替代标志物”指可用于替代预期靶标或作为预期靶标的代表的一种或更多种(生物)标志物。术语“生物标志物”可以并且可以与本公开中的术语“替代标志物”互换使用。例如，如本文所公开的，可以通过确定IL6的水平来测量STAT3活化水平。在一个实例中，替代标志物和预期靶标之间的关系可以是成比例的，意味着替代标志物水平或浓度的升高或降低被理解为具有相同的预期靶标水平或浓度的升高或降低。这种关系也可以是线性的。然而，也可能存在与预期靶标呈反比例关系的替代标志物。
在一个实例中，用于确定STAT3活化(或磷酸化)水平的替代标志物可以是但不限于表1中所列的一种或更多种标志物。
在一个实例中，通过测量至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，通过测量至少3种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，这3种标志物可以是但不限于IL6、IL10和CCL2。在一个实例中，通过测量至少4种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，这4种标志物可以是但不限于IL6、IL10、CCL2和MMP9。在一个实例中，通过测量至少5种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，这5种标志物可以是但不限于TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在一个实例中，通过测量至少6种替代标志物的浓度来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，这6种标志物可以是但不限于IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在一个实例中，使用一种替代标志物进行本文公开的方法。在另一个实例中，使用2种替代标志物进行本文公开的方法。在另一个实例中，使用3种替代标志物进行本文公开的方法。在另一个实例中，使用4种替代标志物进行本文公开的方法。在另一个实例中，使用5种替代标志物进行本文公开的方法。在另一个实例中，使用6种替代标志物进行本文公开的方法。举例来说，例如，生物标志物组将测量限定数量的生物标志物的浓度。在一个实例中，该组包括或由IL6、IL10、CCL2和MMP9组成。在本文公开的方法中，为了将患者样品定义为PAI-1旁分泌成瘾的(PPA)/辅激活因子主导的(CAP)，样品中检测到的替代标志物的值必须通过为每种替代标志物定义的对应临界值。例如，在4种标志物的组中，4种替代标志物中至少有3种必须通过其对应临界值。例如，在2种标志物的组中，根据所选择的标志物，至少一种生物标志物或两种生物标志物都必须通过其对应临界值。例如，在3种标志物的组中，根据所选择的标志物，至少两种生物标志物或所有生物标志物都必须通过其对应临界值。例如，在4种标志物的组中，根据所选择的标志物，至少3种生物标志物或所有生物标志物都必须通过其对应临界值。示例性组见图20D。
表1：用于确定STAT3活化水平的推定替代标志物的非穷举列表
图19a提供了p-STAT3替代标志物的选择工作流程的概述。简而言之，且如前所述，通过搜寻参与已知STAT3通路的所有基因，从《京都基因和基因组百科全书》(KEGG)数据库中确定STAT3相关基因。根据NCBI生物系统数据库中列出的细胞外基因以及通过无细胞腹水质谱分析确定的蛋白，选择分泌型STAT3相关蛋白。使用两个数据库进行转录组学比较，以对假定的STAT3替代标志物进行优先性排序。数据库1用于确定癌症基因组数据库(TCGA)结肠直肠癌(COADREAD)数据集中与STAT3呈正相关的基因。基因以与STAT3最正相关到最不相关排列。数据库2来源于对暴露于TM5441的PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水处理的细胞的微阵列分析，以确定PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水处理的细胞中响应于TM5441(PAI-1抑制剂)被下调和上调的基因。上调的基因也值得关注，因为这些基因被认为代表响应于PAI-1抑制而参与拯救机制的基因。同样，基因以下调最多到上调最多排列。随后对候选基因进行系统配对相关分析，通过重点关注数据库1中与STAT3呈正相关的前1％和25％的基因，以及数据库2中下调最多和上调最多的前1％和25％的基因。如图19b所示，对每组的配对分析进行优先性排序，并基于文献综述从每组中选择代表性基因，以将潜在靶标列表减少到35个基因。基于对优先顺序排序、来自Luminex测定数据的与p-STAT3的潜在良好相关性以及来自文献综述的候选基因在癌症发病机制中的重要性，选择了10个靶标，用酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步评估。使用斯皮尔曼相关分析，无细胞腹水中各替代标志物的浓度与无细胞腹水处理的细胞中的p-STAT3水平相关。
因此，本文公开的替代标志物可以基于其与STAT3的相关性来选择。与无细胞腹水处理样品或阴性对照中的相同标志物相比，也可以基于其上调或下调来选择本文公开的替代标志物。一旦排序(例如，按患病率、优先性或任何其他标准)，这些标志物可以是但不限于基于上述标准列出的所有标志物的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。例如，可选择与STAT3呈正相关的标志物的前1％中的标志物。在另一个实例中，可选择与STAT3磷酸化呈负相关的标志物的前1％中的标志物。如本文使用的，正相关是指替代标志物与其靶标之间的比例关系。因此，负相关是指替代标志物与其靶标之间的反比例(或相反)关系。例如，正相关意味着靶标浓度的升高导致替代标志物浓度的升高。正相关也可能意味着靶标浓度的降低导致替代标志物浓度的降低。相反，负相关意味着靶标浓度的升高导致替代标志物浓度的降低。与对照或任何其他基准相比，标志物也可以在被上调或下调的标志物的前1％或25％中选择。
在另一个实例中，替代标志物根据其上调和/或下调选择。这种上调或下调可基于例如已用PAI-1抑制剂处理的样品中这种标志物的水平来确定。
本领域技术人员将很容易理解，可以出于本文所列以外的原因和标准选择标志物，例如，显示与STAT3无任何明显相关性但显示对例如多变量分析具有显著影响的标志物。还要理解，例如，可以对初始标志物池应用多个标准，以缩小范围并获得替代标志物的最终列表。
在选择的10个靶标中，5个示例性候选替代标志物(IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1)在70例患者样品上得到验证，并成功鉴定到示例性复合生物标志物组。例如，这种复合生物标志物组可由作为STAT3的替代生物标志物的四种靶标(IL6、CCL2、IL10和MMP9)组成。该示例性组的总体准确度为92.86％。
此外，在40例患者样品中验证了5种候选替代标志物(TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10)，其产生如图21所示的结果。该示例性复合生物标志物组产生曲线下面积(AUC)值为0.83(P＝0.001)。将IL6与该复合生物标志物组相结合，得到曲线下面积(AUC)为0.98(P＜0.0001)。
因此，在一个实例中，替代标志物可以是但不限于以下一种或更多种：LUM、ANGPT1、IL1B、POSTN、TNC、MMP9、MMP2、TIMP3、DCN、VSIG4、CXCL5、CD36、ANGPT2、SERPINB5、IL6、CCL2、LEP、VCAM1、CCL8、ITGAM、THBS1、FN1、COL5A1、MXRA5、C3、CXCL10、TGFB1、CD44、TIM3、TNFSF13B、CEACAM1、LAMB1、IL10、IL5、IL22。在又一个实例中，替代标志物可以是但不限于以下一种或更多种：IL6、IL10、CCL2、MMP9、ANGPT1、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在另一个实例中，替代标志物可以是但不限于以下一种或更多种或全部：IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1。在另一个实例中，替代标志物可以是但不限于以下一种或更多种或全部：IL6、IL10、CCL2和MMP9。在另一个实例中，替代标志物之一是IL6。在又一个实例中，所使用的替代标志物的组合或组(group or panel)包括IL6。
因此，在一个实例中，替代标志物是但不限于IL6、IL10、CCL2、MMP9、ANGPT1、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在另一个实例中，替代标志物是但不限于IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1。在又一个实例中，替代标志物是但不限于IL6、IL10、CCL2和MMP9。在另一个实例中，替代标志物包括IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1。在另一个实例中，替代标志物至少包括IL6、IL10、CCL2和MMP9。在另一个实例中，替代标志物是但不限于IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。在又一个实例中，替代标志物是但不限于TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。
从这组患者得出的结论是，无细胞腹水(从患者亚组采集)激活其他信号通路，从而维持癌细胞。还注意到，当建立的细胞系模型暴露于这些无细胞腹水时，似乎没有任何具有高PAI-1水平的无细胞腹水与低水平的STAT3磷酸化相关。这进一步表明PAI-1激活STAT3。万一该称述不正确，人们将观察到高PAI-1水平的腹水样品，当细胞暴露于这些无细胞腹水时，这些样品不会激活STAT3信号传递。然而，当细胞暴露于具有高PAI-1水平的无细胞腹水时，这些腹水样品确实激活STAT3信号传递，这一事实支持并奠定了本文所公开的方法。综上所述，鉴定到具有高PAI-1水平的无细胞腹水的患者子集或亚组，已显示高PAI-1水平驱动癌细胞的STAT3活化。在不受理论约束的情况下，认为如果癌细胞的旁分泌STAT3活化依赖于这些腹水中的PAI-1水平，这会导致对单个上游配体的致癌成瘾现象。也就是说，当认为细胞对腹水中PAI-1的配体抑制高度易感时，患者的无细胞腹水具有高PAI-1和激活的STAT3信号传递。这种PAI-1的配体抑制可以通过例如腹腔滴注PAI-1抑制剂来进行。
接下来，将Colo-205(一种已建立的结肠直肠腹膜癌扩散细胞系模型)系统地暴露于从患者身上采集的无细胞腹水中，然后用TM5441(PAI-1抑制剂)处理这些细胞。如图11所示，Colo-205的旁分泌活化导致对TM5441的敏感性不同。从患者采集的腹水(认为这些患者的癌细胞中的STAT3活化依赖于无细胞腹水中的PAI-1水平)最易受到TM5441的抑制，证实了暴露于这些无细胞腹水的癌细胞对PAI-1致癌性成瘾的发现。换句话说，此处显示的数据指示，例如，当细胞暴露于PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组的无细胞腹水时，这些细胞依赖腹水激活其内的STAT3信号传递。当无细胞腹水中的PAI-1被阻断(配体抑制)时，细胞内的STAT3信号传递受到抑制，细胞死亡。例如，暴露于辅激活因子主导(CAP)组的无细胞腹水的细胞的STAT3活化对PAI-1的依赖性较低，但仍可能出现反应。同时，暴露于替代通路活化(APA)组的无细胞腹水的细胞不依赖PAI-1且不激活STAT3，因此对PAI-1抑制不易感。
因此，在一个实例中，公开了检测或确定患有腹膜癌扩散的受试者对PAI-1抑制剂治疗的易感性的方法，该方法包括在从受试者获得的样品中确定纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的浓度和确定“信号转导与转录活化因子-3”(STAT3)的磷酸化水平；其中所述受试者如果表现出(a)PAI-1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI-1浓度降低和STAT3磷酸化增加，则受试者对治疗易感；其中将所述增加和/或降低与从参照组获得的样品中测量的PAI-1浓度和STAT3磷酸化水平相比较。
使用通过PAI-1激活旁分泌STAT3信号传递的无细胞腹水在体内小鼠模型中的验证证实了对腹膜内滴注TM5441的敏感性(图14、图15和图17)。PAI-1抑制剂的一些实例已显示与PAI-1中的s4A结合。基于s4A位置的3D构象，通过计算机模拟虚拟筛选鉴定出PAI-1抑制剂的前体(Izuhara等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2008；28:672-677)。这些前体与PAI-1的s4A位置的对接模型之前已有报道(Izuhara等人，Journal of CerebralBlood Flow&Metabolism(2010)30,904–912)。在一个实例中，PAI-1抑制剂与PAI-1中的s4A位置结合。在另一个实例中，PAI-1抑制剂是一种抗癌治疗剂或抗癌药物。在另一个实例中，如本文所公开的，与患有相同疾病的患者相比，施用PAI-1抑制剂导致PAI-1活性的抑制。
在又一个实例中，抗癌治疗或抗癌药物是但不限于小分子、化疗剂、肽、抗体、其组合和联合治疗。在另一个实例中，抗癌药物是但不限于TM5441(5-氯-2-[[2-[2-[[3-(3-呋喃基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]乙酰基]氨基]苯甲酸钠盐；CAS 1190221-43-2)、TM5007(N，N-双[3，3'-羧基-4，4'-(2，2'-噻吩基)-2,2'-噻吩基]己二酰胺；CAS号：342595-05-5)、TM5275(5-氯-2-[[2-[2-[4-(二苯基甲基)-1-哌嗪基]-2-氧代乙氧基]乙酰基]氨基]-苯甲酸钠盐；CAS 1103926-82-4)、Tiplaxtinin(2-(1-苄基-5-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1H-吲哚-3-基)氧代乙酸；CAS 393105-53-8)、ZK4044及其衍生物。各种抗癌药物的示例结构如下所示：
在另一个实例中，PAI-1抑制剂被腹膜内施用。
在另一个实例中，公开了用于用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗患有腹膜癌扩散的患者，或用于检测或确定患有腹膜癌扩散的患者对用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗的易感性的一组标志物，其中该组标志物包括PAI-1，和一种或更多种STAT3磷酸化或p-STAT3的替代标志物。在一个实例中，公开了一组标志物在本文所指方法中的使用，其中所述组包括PAI-1和一种或更多种STAT3磷酸化的替代标志物，或PAI-1和p-STAT3。在一个实例中，该组包括PAI-1以及IL6、IL10、CCL2和MMP9中的一种或更多种或全部。在另一个实例中，该组包括PAI-1以及IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1中的一种或更多种或全部。在又一个实例中，该组包括PAI-1以及TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10中的一种或更多种或全部。在另一个实例中，该组包括PAI-1以及IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10中的一种或更多种或全部。
在另一个实例中，公开了PAI-1抑制剂在制造用于治疗腹膜癌扩散的药物中的用途，其中所述药物将施用于被确定属于一个患者组的受试者，该患者组被确定对PAI-1抑制的治疗易感。在另一个实例中，如本文所公开的，通过测量PAI-1浓度和STAT3磷酸化(p-STAT3)，并将测量值与如本文所公开的临界值进行比较，来确定受试者的易感性。
在本发明的上下文中，术语“施用(administering)”和该术语的变体包括“施用(administer)”和“施用(administration)”，包括通过任何合适的方式使本发明的化合物或组合物与生物体或任何相关表面接触，将本发明的化合物或组合物应用、递送或提供给生物体或任何相关表面。
如本文使用的，术语“治疗”是指治疗疾病状态或症状、防止疾病形成或以其他方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病进展或其他不良症状的任一用途和所有用途。
在本说明书的上下文中，术语“治疗有效量”和“诊断有效量”在其含义内包括足够但无毒的量的本发明化合物或组合物，以提供期望的治疗或诊断效果。所需的确切量将因受试者而异，取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗状况的严重程度、所施用的特定药物、施用模式等因素。因此，无法具体指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
采用Tiplaxtinin(PAI-1抑制剂)进行的体外验证强调了，抑制PAI-1Michaelis复合物是细胞如何对PAI-1致癌成瘾的潜在机制。采用Napabucasin(STAT3抑制剂)治疗强调了，单独STAT3抑制是无用的，因为Michaelis复合物可能激活除STAT3信号传导外的其他信号级联。采用PI3K/mTOR双重抑制剂或丝裂霉素C(诱导DNA损伤)治疗强调了，当癌细胞暴露于腹水驱动的旁分泌活化时，这些药物缺乏效用(图12)。因此，在一个实例中，通过测量PAI-1对尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)/组织型纤溶酶原激活物(tPA)复合物的浓度来确定PAI-1的浓度。在另一个实例中，通过测量无细胞腹水中PAI-1的浓度来确定PAI-1的浓度。在另一个实例中，通过测量活性和/或休眠(latent)形式的PAI-1和/或与包括但不限于尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、玻连蛋白及其组合的复合物来确定PAI-1的浓度。在另一个实例中，通过直接测量或以一种或更多种复合物测量PAI-1的浓度来确定PAI-1的浓度。也就是说，PAI-1不必需与诸如尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)/组织型纤溶酶原激活物(tPA)或其他蛋白质形成复合物来产生下游效应。在又一个实例中，通过测量已建立的结肠直肠腹膜癌扩散细胞系模型中的p-STAT3水平来确定STAT3磷酸化水平。在一个实例中，用无细胞腹水处理结肠直肠腹膜癌扩散的细胞系模型。在另外一个实例中，通过测量用无细胞腹水处理的结肠直肠腹膜癌扩散细胞系模型的p-STAT3水平来确定STAT3磷酸化水平。
在另一个实例中，公开了用PAI-1抑制剂治疗患有腹膜癌扩散的受试者的方法，该方法包括在从受试者获得的样品中确定纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的浓度和确定“信号转导与转录活化因子-3”(STAT3)的磷酸化水平；向显示出(a)PAI-1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI-1浓度降低和STAT3磷酸化增加的受试者施用PAI 1抑制剂；其中将所述增加和/或降低与从参照组获得的样品中测量的PAI-1和STAT3磷酸化水平相比较。
在一个实例中，PAI-1抑制剂是抗癌药物。
在本文公开的方法中，对照组是指一组患有腹膜癌扩散的受试者。在另一个实例中，对照组是一组未患腹膜癌扩散但存在良性肿瘤的患者。
对本文公开的实验所得的值进行比较导致对本文公开的参考值(也称为临界值)的定义，其已针对待测量的每个标志物确定。以相对的、定性的方式(例如，一种标志物的浓度大于或小于其他标志物的浓度)或以定量的方式(例如，将X值与Y值进行比较)进行测量值和临界值之间的比较。由于测量的性质，参考值或临界值也可以包括特定值附近的缓冲。例如，具有2％缓冲的临界值意味着，如果临界值为10，则缓冲将导致测量允许的范围为9.8到10.2。根据临界值的背景，也可以仅在一个方向上应用缓冲。例如，如果临界值为至少10，则2％的缓冲将导致9.8的值也是可接受的。如果临界值为不大于10，则2％的缓冲将导致10.2的值也是可接受的。在另一个实例中，缓冲可以是所讨论的临界值的3％、4％或5％。在另一个实例中，缓冲可以是所讨论的临界值的5％。在另一个实例中，缓冲可以是所讨论的临界值的2％。
在本申请的范围中还设想了用于检测本文公开的标志物、替代物或其他的系统。例如，这种检测系统能够诊断或检测或预测患者或受试者患腹膜癌扩散的可能性。因此，如本文所述的生物标志物可并入诊断工具、检测系统、诊断方法、预测方法或确定患者患腹膜癌扩散的可能性的方法中。示例性检测系统可包括，例如，接收部分，用于接收来自疑似患腹膜癌扩散的患者的样品，其中所述样品疑似包含本公开的一种或更多种生物标志物，以及检测部分，其包括能够检测本公开的一种或更多种生物标志物的一种或多种物质。该系统中使用的样品可以是但不限于本文公开的样品类型。
为了帮助检测本公开的生物标志物，检测系统可以包括能够结合或特异性结合本文公开的任何生物标志物的物质。例如，此类物质可以是生物特异性捕获试剂，例如识别生物标志物和/或其变体的抗体(或其抗原结合片段)、相互作用的融合蛋白、适体或亲和体(其是基于三螺旋束蛋白结构域的非免疫球蛋白来源的亲和蛋白)。在使用时，该物质可以例如与固相结合，其中所述生物标志物可以通过本领域已知的方法，例如质谱分析，或者通过从生物特异性捕获试剂中洗脱生物标志物并使用本领域已知的方法检测被洗脱的生物标志物，例如传统的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或通过表面增强激光解吸/电离(SELDI)被检测到。例如，该检测系统被包括在生物芯片、测试条或微量滴定板上。
已基于腹膜癌扩散患者的致癌成瘾概念鉴定到指示治疗的伴随生物标志物(companion biomarker)。已鉴定的激活STAT3和其他信号通路的生物标志物是凝血级联的一部分。换句话说，手术后凝血级联的活化可以刺激癌细胞的生长。还认为，凝血或纤溶级联反应的过度活化是致癌的，对这两个过程的抑制已显示出潜在的治疗相关性。此外，2个结肠直肠腹膜癌扩散细胞系经无细胞腹水处理后的基因表达分析显示STAT3信号传递被活化。此外，对无细胞腹水(n＝13)的验证实验表明，STAT3与结肠直肠腹膜癌扩散最相关。临床上，TCGA数据库(n＝345)中具有STAT3和上皮间充质转化(EMT)活化的结肠直肠癌患者预后较差。有趣的是，受体酪氨酸激酶阵列未显示JAK激酶磷酸化，表明STAT3信号传导的非典型活化。细胞因子阵列和质谱法鉴定了独立于JAK激酶的潜在STAT3激活配体，包括POSTN、CD24和CD44。在体外和体内环境下，使细胞系暴露于无细胞的处理显示出对上游非典型STAT3激活剂的抑制剂的敏感性。
本文说明性描述的发明可以在没有本文未具体公开的任何一个要素或多个要素、一个限制条件或多个限制条件的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“包含(containing)”等应扩展且不受限制地解读。此外，本文中使用的术语和表达已用作描述性而非限制性的术语，并且在这些术语和表达的使用并不意图排除所示和所描述特征的任何等同特征或其部分，但是应当认识到，在本发明要求保护的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对公开的本文中体现的发明进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。
如本申请中所使用的，单数形式“一个/种(a，an)”和“所述(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。例如，术语“遗传标志物”包括多个遗传标志物，包括其混合物和组合。
如本文使用的，术语“约”，在制剂的成分浓度的背景下，通常是指规定值的±5％，更典型地是规定值的±4％，更典型地是规定值的±3％，更典型地是规定值的±2％，甚至更典型地是规定值的±1％，且甚至更典型地是规定值的±0.5％。
遍布本公开，可以以范围格式公开某些实施方案。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应认为对范围例如从1至6的描述具有具体公开的子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多广，这都适用。
本文还可以广泛和概括性地描述某些实施方案。属于该概括性公开的每个较窄的物种和亚属分组也形成本公开的一部分。这包括伴随条件或否定限制地对本实施方案的概括性描述，所述条件或否定限制将任何主题从该属中移除，而不管所去除材料是否在本文中具体叙述。
本发明已在本文中被广泛和概括性地描述。属于该概括性公开的每个较窄的物种和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括伴随条件或否定限制地对本发明的概括性描述，所述条件或否定限制将任何主题从该类中移除，而不管所去除材料是否在本文中具体叙述。
其他实施方案在以下权利要求和非限制性实例的范围内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的亚组被描述。
实验部分
材料和方法
患者招募、生物样本采集和处理
确定并招募了在新加坡国家癌症中心接受腹膜癌扩散治疗的患者。根据SingHealth中央机构审查委员会(CIRB参考号：2015/2479/F)批准的研究方案，获得了所有患者的知情同意。所有实验均按照相关指导原则和规定进行。将术后采集的肿瘤标本系统地分成多个块。立即将一份速冻在液氮中，并储存在-80℃冰箱中，而将另一份固定在福尔马林中，以构建福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的块。剩余组织在实验室进行处理，以建立原代细胞系和患者来源的异种移植物。将在减瘤手术(CRS)开始时或常规腹水抽取(穿刺)过程中从腹膜腔采集的腹水以2000g离心10分钟，以分离细胞成分与流体成分。使用0.22μm过滤器对流体成分进行过滤灭菌，使其适合下游实验。腹水的细胞成分用于下游测定并生成患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)模型。
细胞系
人转移性结肠癌细胞系Colo-205和SNU-C1购自美国典型培养物保藏中心，并在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素和1％抗真菌剂的RPMI培养基中培养。人正常腹膜间皮细胞系LP9/TERT和HM3/TERT购自布列根和妇女医院细胞培养中心，并在含有15％补铁新生小牛血清、0.4μg/mL氢化可的松、10ng/mL表皮生长因子、1％青霉素-链霉素和1％抗真菌剂的M199/M106中培养。实验前，所有细胞在无血清培养基中生长过夜。
主要临床终点
主要临床终点是总生存期(OS)。将OS定义为从手术到死亡的时间，不管病因如何。绘制卡普兰-梅尔曲线，比较存在或不存在腹水的5年总生存期(OS)。存在腹水是指腹腔内积液超过50mL。采用对数秩检验确定曲线比较的统计学意义。
增殖测定
将总共5000个细胞/孔接种在96孔板中，并在补充有不同浓度无细胞腹水的无血清RPMI培养基中生长。在第0天和第5天，采用CellTitreGlo测定(Promega,Madison,US)评估细胞增殖。这些实验分三次进行，并重复3次。
细胞迁移测定
将Colo-205或SNU-C1细胞血清饥饿24小时，然后用3种不同的细胞培养基(无血清RPMI、补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI或补充有5％无细胞腹水的无血清培养基)处理24小时。然后将预处理的细胞以600,000个细胞/孔的密度接种到6孔transwell迁移测定中。transwell板的内腔填充有无血清培养基，外腔填充10％胎牛血清(FBS)培养基。允许细胞迁移24小时。这些实验分三次进行，并重复3次。
细胞沉降测定
将总共70,000个细胞/孔的LP9/TERT或HM3/TERT接种在12孔板中，并在完全培养基中生长至融合以形成饲养层。随后，使间皮饲养层处于血清饥饿状态，然后与癌细胞共培养。将35,000个细胞/孔的Colo-205或SNU-C1接种到3种不同培养基(无血清RPMI、补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI或补充有5％无细胞腹水的无血清RPMI)的每个孔中，并孵育24小时。用完全培养基轻轻洗涤5次，去除未贴附的癌细胞。计算在每个孔的三个区域中沉淀的平均细胞数。最终沉降的细胞数通过三次测定的平均值确定。
基因表达分析
为了评估用无细胞腹水处理后被上调的信号通路，将Colo-205和SNU-C1细胞用5％和0.1％的无细胞腹水处理24小时。为了评估受PAI-1抑制影响的信号通路，在DMSO溶媒或27.25μM TM5441存在下，将Colo-205细胞用代表PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组、辅激活因子主导(CAP)组的无细胞腹水或胎牛血清(FBS；对照组)处理24小时。按照制造商的说明，使用Qiagen小量提取试剂盒(Qiagen，CA，USA)分离总RNA。根据制造商的方案，使用AffymetrixGeneChip Genome U133 Plus 2.0微阵列平台(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行基因表达分析。将微阵列数据上传到免费编程软件R(R统计计算基础(R Foundation forStatistical Computing)，维也纳，奥地利)进行处理和归一化。基因集富集分析(GSEA)用于使用GSEA图形用户界面(GUI)软件(http://www.broadinstitute.org/gsea/)评估显示上调和下调的基因富集。
蛋白质免疫印迹
将Colo-205或SNU-C1细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后用5％的患者无细胞腹水处理24小时。第二天，收获细胞并于冰上在补充有Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific Inc.)的M-PER(哺乳动物蛋白提取试剂，Thermo Scientific Inc.)中裂解1小时。将裂解物在4℃以14,000g离心20分钟，获得澄清的上清液。使用Bradford蛋白测定试剂(Bio-Rad)确定蛋白质浓度。计算蛋白质的特定量(STAT3和肌动蛋白为5μg；磷酸-STAT3(Tyr705)和磷酸-STAT3(Ser727)为25μg；JAK1、JAK2、磷酸-JAK1(Tyr1022/Tyr1023)和磷酸-JAK2(Tyr1007/Tyr1008)为10μg)，并将其等份加入0.2mL的薄壁PCR管中。使裂解物在97℃变性5分钟，并在Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液(24.76mM Tris、191.83mM甘氨酸和0.1％SDS)中的10％聚丙烯酰胺凝胶中分离，然后转移到Tris/甘氨酸/甲醇转移缓冲液(24.76mM Tris、191.83mM甘氨酸和20％甲醇)中的0.45μm硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。将膜在含5％脱脂牛奶的含0.1％吐温20的1x PBS(PBST)中于室温封闭1小时，然后用一抗印迹1.5小时。一抗的稀释度为：1:2,000STAT3(Cell Signaling Technology；#4904)；1:1,000磷酸-STAT3(Tyr705)(Cell Signaling Technology；#9145)；1:1,000磷酸-STAT3(Ser727)(Cell Signaling Technology；#94994)；1:1,000JAK1(Santa CruzBiotechnology；sc-277)；1:1,000磷酸-JAK1(Tyr1022/Tyr1023)(Santa CruzBiotechnology；sc-16773)；1:1,000JAK2(Santa Cruz Biotechnology；sc-294)；1:1,000磷酸化JAK2(Tyr1007/Tyr1008)(Santa Cruz Biotechnology；sc-16566)以及1:100,000β-actin(Sigma Aldrich；A1978)。在PBST中洗涤4次(每次洗涤5分钟)后，将印迹与抗兔或抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)连接的二抗(GE Healthcare Life Sciences；NA934或NA931)在室温下孵育30分钟。在PBST中再洗涤4次后，将Pierce SuperSignal West Dura持久性底物(Thermo Scientific Inc.)加到印迹中，并在室温孵育5分钟。使多余的液体滴下，将印迹包裹在聚乙烯中，以曝光于
放射自显影胶片(Santa Cruz Biotechnology，CA)。使用GS-800TM校准的密度计(Bio-Rad)扫描图像。
免疫组化(IHC)
使用基于色原的免疫组化(IHC)染色，对来自具有匹配的原发性肿瘤和转移瘤的腹膜癌扩散(PC)病例的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本进行鉴定和询问。按照制造商的建议，使用Bond Max Autostainer(Leica Microsystems，Ltd，Milton Kynes，UK)进行所有免疫组化(IHC)染色。将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的块切成4μm厚的切片，并安装在载玻片上。优化并使用兔抗磷酸化STAT3(Tyr705)单克隆抗体(#9145L，Cell SignallingTechnology，马萨诸塞州，US，1:50，pH9，30分钟)。由两名事先不知晓临床数据的独立评分员对载玻片进行评估，并基于每张载玻片中肿瘤上皮成分内阳性染色的百分比确定染色结果。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品也从患者来源的腹水依赖性异种移植(PDADX)肿瘤中收集，并用抗CK7、CK20和CDX2的抗体进行探测，以确认所形成的患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤的组织学和起源。兔抗CK7单克隆抗体(#31-1167-00，RevMabBiosciences，美国加利福尼亚州，1:200，pH9，20分钟)、兔抗CK20多克隆抗体(HPA024309，Sigma Aldrich，美国密苏里州，1:200，pH9，20分钟)和兔抗CDX2单克隆抗体(#12306，CellSignaling Technology，美国马萨诸塞州，1:100，pH9，20分钟)被优化并用于免疫组化(IHC)染色。
质谱法
对从良性浆液性囊腺纤维瘤患者(n＝1)的无细胞腹水和结肠直肠腹膜癌扩散患者(n＝3)的恶性无细胞腹水的可溶性和外泌体成分中分离的蛋白质进行质谱分析。简而言之，对消化的肽的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析是使用Thermo Scientific Inc.的Orbitrap Elite和和偶联来自Thermo Scientific Inc.的Dionex UltiMate 3000UHPLC系统的QExactive质谱仪(Bremen，德国)进行的。
细胞因子分析
由105种细胞因子组成的Proteome Profiler Human Cytokine阵列(ARY022B,R&DSystems，美国明尼阿波利斯)用于分析血浆(n＝1)、来自良性浆液性囊腺纤维瘤患者的良性无细胞腹水(n＝1)以及来自结肠直肠腹膜癌扩散(n＝4)、胃腹膜癌扩散(n＝1)和卵巢腹膜癌扩散(n＝1)患者的恶性无细胞腹水。使用Bradford蛋白质测定(Biorad，Hercules，US)对液体中所有蛋白质的浓度定量，并按照制造商的说明将等量的蛋白质与膜阵列一起孵育。
上皮-间充质转化(EMT)基因分析
使用包含84个EMT相关基因的RT2 Profiler PCR阵列(Qiagen,CA,USA)进行上皮-间充质转化(EMT)基因分析。使用RNeasy提取试剂盒(Qiagen)从完整培养基和5％无细胞腹水中生长24小时的Colo-205和SNU-C1细胞中提取RNA。使用RT2第一链试剂盒(Qiagen)合成cDNA，并使用RT2 SYBR Green Mastermixes(Qiagen)进行逆转录聚合酶链式反应。使用Qiagen的Gene Globe数据分析中心工具对结果进行分析。
磷酸-受体酪氨酸激酶(RTK)分析
使用人RTK磷酸化抗体阵列(RayBiotech，GA，US)对受体酪氨酸激酶(RTK)的磷酸化进行分析，允许同时检测细胞裂解物中71种不同的人RTK的相对磷酸化水平。从用5％无细胞腹水或10％胎牛血清(FBS)处理24小时的Colo-205和SNU-C1的细胞裂解物中提取蛋白质。使用Bradford蛋白质测定(Biorad，Hercules，US)确定总蛋白质浓度，并按照制造商的说明使用40μg蛋白质进行磷酸-RTK分析。
癌症基因组数据库(TCGA)生存分析
使用卡普兰-梅尔总生存期(OS)曲线分析确定癌症基因组数据库(TCGA)结肠直肠腺癌(COADREAD)数据集(n＝345)中调节PAI-1、STAT3和上皮-间充质转化(EMT)的预后意义。基于递归分类确定的临界值，将患者分层为高(P+，≥3.071)或低(P-，＜3.071)PAI-1表达、高(S+，≥0.074)或低(S-，＜0.074)STAT3表达，和高(E+，≥0.096)或低(E-，＜0.096)上皮-间充质转化(EMT)表达。由于样本量小(n＜20)，将四种亚型(P-S-E+、P+S-E-、P+S-E+、P+S+E-)从分析中排除。使用对数秩检验进行统计学显著性检验。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
使用R&D Systems的人Quantikine ELISA试剂盒对无细胞腹水中PAI-1(DSE100)、IL6(D6050)、IL10(D1000B)、CCL2(DCP00)、MMP9(DMP900)、ANGPT1(DANG10)、TGFB1(DB100B)和CXCL10(DIP100)的浓度进行定量。使用R&D Systems的人DuoSet ELISA试剂盒对无细胞腹水中的POSTN(DY3548B)和CD44(DY7045-05)浓度进行定量。使用RayBiotech的ELISA对无细胞腹水中的VSIG4(ELH-VSIG4-1)浓度进行定量。根据制造商的说明，对所有样品进行2次技术重复。使用ELISA(7305C和7300C，Cell Signalling Technology，美国马萨诸塞州)检测总STAT3和磷酸-STAT3(Tyr705)。从用5％无细胞腹水处理24小时的Colo-205和SNU-C1的细胞裂解物中分离蛋白质。在所有实验中，按照制造商的说明，使用25μg蛋白进行总STAT3和p-STAT3(Y705)的ELISA。
体外药物处理
将总共5,000个细胞/孔接种在96孔板中，并使其在补充有5％无细胞腹水的无血清RPMI培养基中或完全培养基中生长24小时，然后用不同浓度的TM5441(PAI-1抑制剂)、Tiplaxtinin(PAI-1抑制剂)、Napabucasin(STAT3抑制剂)、BEZ235(PI3K/mTOR双重抑制剂)和丝裂霉素C(用于腹腔热灌注化疗(HIPEC)的化疗剂)处理72小时。采用CellTitreGlo测定(Promega,Madison,US)评估细胞增殖。这些实验分三次进行，并重复至少3次。
患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)的生成
所有小鼠实验均按照SingHealth机构动物护理和使用委员会批准的方案进行(IACUC参考号：2017/SHS/1295)。将从腹膜癌扩散患者采集的腹水以2000g离心10分钟，以浓缩细胞成分并分离液体成分。将1mL细胞沉淀与1mL腹水重悬，并将400μL混合物腹膜内植入到6周龄的BALB/c裸鼠(n＝5只小鼠)中，以生成患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)第0代(P0)。对于后续传代，使用手术刀片将患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤切成小片，并使其通过18-G注射器针头。将切好的肿瘤与相匹配的患者腹水以1:1的比例重悬，并将其腹膜内植入6周龄的BALB/c裸鼠(n＝10只小鼠)中。
体内PC细胞系小鼠模型的药物治疗
为了体内确定不同易感性腹水组中抑制PAI-1的疗效，将5×106个Colo-205细胞与代表PAI-1旁分泌成瘾(PPA)组、辅激活因子主导(CAP)组的无细胞腹水或胎牛血清(FBS)共同注射到6至8周龄的BALB/c裸鼠(雌性，n＝5只小鼠/组)的腹腔中，并腹膜内施用1.75mMTM5441进行治疗。腹水和药物治疗通过每3天腹膜内注射含TM5441的400μL 5％无细胞腹水或10％胎牛血清进行，持续21天。3周后，处死小鼠，并基于改良的腹膜癌扩散指数(PCI)评分对肿瘤负荷定量，并以总腹膜癌扩散指数(PCI)评分表示。基于每个区域的评分总和计算总腹膜癌扩散指数(PCI)评分，范围从0至39。
为确定最佳药物浓度及药物递送方式，选取总共16只6-8周龄雌性BALB/c裸鼠进行实验。对每只小鼠腹膜内注射5×106个Colo-205细胞。将小鼠分为4组，并给予如下处理：(i)含1％DMSO的5％无细胞腹水，(ii)含1mM TM5441的5％无细胞腹水，(iii和iv)含2mMTM5441的5％无细胞腹水。通过每3天腹膜内注射(i-iii)和口服(iv)400μL含DMSO溶媒/药物的5％无细胞腹水进行治疗，最多21天。3周后，处死小鼠，基于改良的腹膜癌扩散指数(PCI)评分对肿瘤负荷定量，并以总腹膜癌扩散指数(PCI)评分表示。基于每个区域的评分总和计算总腹膜癌扩散指数(PCI)评分，范围从0至39。
患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)的药物治疗
匹配患者的无细胞腹水及其细胞成分用于生成患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)，以更好地概括腹膜癌扩散患者的重要特征。将PAI-1旁分泌成瘾(PPA)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤(100mg)腹膜内植入到16只雌性BALB/c裸鼠中，并将辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤(100mg)腹膜内植入到16只雌性BALB/c裸鼠中。然后将PAI-1旁分泌成瘾(PPA)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)和辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)分为4组，并给予如下处理：(i)含1％DMSO的5％PAI-1旁分泌成瘾(PPA)或辅激活因子主导(CAP)的无细胞腹水，(ii)含2mM TM5441的5％PAI-1旁分泌成瘾(PPA)或辅激活因子主导(CAP)的无细胞腹水，(iii)含1％DMSO的10％胎牛血清(FBS)，和(iv)含2mM TM5441的10％胎牛血清(FBS)。通过每3天腹膜内施用进行治疗，持续21天。在处死小鼠后，通过称量所有可见肿瘤来对肿瘤负荷定量。
为了确定对PAI-1抑制的易感性是否依赖于无细胞腹水而不是肿瘤，用PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水处理患者的无细胞腹水对PAI-1抑制无反应的辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)。简而言之，将辅激活因子主导(CAP)患者来源的腹水依赖性异种移植物(PDADX)肿瘤(100mg)腹膜内植入到16只雌性BALB/c裸鼠中。将小鼠分为4组，并给予如下处理：(i)含1％DMSO的5％辅激活因子主导(CAP)无细胞腹水，(ii)含2mM TM5441的5％辅激活因子主导(CAP)的无细胞腹水，(iii)含1％DMSO的5％PAI-1旁分泌成瘾(PPA)的无细胞腹水，和(iv)含2mM Tm5441的5％PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水。通过每3天腹膜内施用进行治疗，持续21天。在处死小鼠后，通过称量所有可见肿瘤来对肿瘤负荷定量。
p-STAT3替代标志物选择
通过搜寻参与已知STAT3通路的所有基因，从《京都基因和基因组百科全书》(KEGG)数据库中确定STAT3相关基因。基于NCBI生物系统数据库中列出的细胞外基因以及在无细胞腹水的质谱分析中鉴定的蛋白，选择分泌型STAT3相关蛋白。使用2个数据库进行转录组学比较，以对推定的STAT3替代标志物进行优先性排序。第一个数据库用于确定TCGACOADREAD数据集中与STAT3呈正相关的基因。将基因从与STAT3最正相关到最不相关排列。第二个数据库来源于对暴露于TM5441的PAI-1旁分泌成瘾(PPA)无细胞腹水处理的细胞的微阵列分析，以确定在PPA无细胞腹水处理的细胞响应于PAI-1抑制而被下调和上调的基因。上调基因也值得关注，因为这些基因可能代表参响应于对PAI-1抑制而参与拯救机制的基因。同样，基因以下调最多到上调最多排列。随后对候选基因进行系统配对相关分析，通过重点关注数据库1中与STAT3呈正相关的前1％和前25％的基因，以及数据库2中下调最多和上调最多的前1％和前25％的基因。对每组的配对分析进行优先性排序，并基于文献综述从每组中选择代表性基因，以简化为35个基因。基于优先性排序、来自Luminex测定数据的与p-STAT3的潜在良好相关性以及来自文献综述的候选基因在癌症发病机制中的重要性，选择了10个靶标，用ELISA进一步评估。使用斯皮尔曼相关分析，无细胞腹水中各替代标志物的浓度与腹水处理的细胞的p-STAT3水平相关。
Claims (26)
1.一种用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗患有腹膜癌扩散的受试者的方法，所述方法包括
确定PAI-1的浓度，并确定从所述受试者获得的样品中“信号转导与转录活化因子3”(STAT3)的磷酸化水平；
向显示(a)PAI-1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI 1浓度降低和STAT3磷酸化增加的受试者施用PAI-1抑制剂；
其中将PAI-1浓度和STAT3磷酸化的增加和/或降低与参考值进行比较。
2.一种检测或确定患有腹膜癌扩散的受试者对用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗的易感性的方法，所述方法包括确定PAI-1的浓度，并确定从受试者获得的样品中“信号转导与转录活化因子3”(STAT3)的磷酸化水平；
其中如果受试者显示(a)PAI 1浓度增加和STAT3磷酸化增加，或(b)PAI 1浓度降低和STAT3磷酸化增加，则所述受试者对所述治疗易感；
其中如果受试者显示(c)PAI-1浓度降低和STAT3磷酸化降低，则认为所述受试者对治疗不易感；
其中将PAI-1浓度和STAT3磷酸化水平的增加和/或降低与参考值进行比较。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过直接测量和/或以一种或更多种复合物测量PAI-1的浓度来确定PAI-1的浓度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过测量一种或更多种替代标志物的浓度，和/或通过直接测量STAT3磷酸化的浓度来确定STAT3磷酸化的水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述替代标志物选自由以下组成的组：IL6、IL10、CCL2、MMP9、ANGPT1、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的方法，其中所述替代标志物选自由以下组成的组：IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述替代标志物选自由以下组成的组：IL6、IL10、CCL2和MMP9。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述替代标志物包括IL6、IL10、CCL2、MMP9及ANGPT1；或者其中所述替代标志物至少包括IL6、IL10、CCL2和MMP9。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中所述替代标志物选自由以下组成的组：IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述替代标志物选自由以下组成的组：TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PAI-1抑制剂是抗癌药物或抗癌疗法。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗癌药物或抗癌疗法选自由以下组成的组：小分子、化疗剂、肽、抗体、其组合和联合疗法。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述抗癌药物选自由以下组成的组：TM 5441(5-氯-2-[[2-[2-[[3-(3-呋喃基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]乙酰基]氨基]苯甲酸钠盐；CAS 1190221-43-2)、TM5007(N，N-双[3，3'-羧基-4，4'-(2，2'-噻吩基)-2，2'-噻吩基]己二酰胺；CAS 342595-05-5)、TM5275(5-氯-2-[[2-[2-[4-(二苯基甲基)-1-哌嗪基]-2-氧代乙氧基]乙酰基]氨基]-苯甲酸钠盐；CAS 1103926-82-4)、tiplaxtinin(2-(1-苄基-5-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1H-吲哚-3-基)氧代乙酸；CAS 393105-53-8)、ZK4044及其衍生物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PAI-1抑制剂经腹膜内施用。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腹膜癌扩散选自由以下组成的组：结肠直肠腹膜癌扩散、小肠腹膜癌扩散、间皮瘤、子宫内膜腹膜癌扩散、胃腹膜癌扩散、卵巢腹膜癌扩散、阑尾腹膜癌扩散、胰腺腹膜癌扩散、尿路上皮癌扩散和腹膜假性粘液瘤(PMP)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为固体样品或液体样品。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：腹水、血液、血清、尿液、引流液、手术引流液、从细胞获得的上清液、从器官获得的上清液、从组织、淋巴获得的上清液、从淋巴结获得的上清液、液体活检样品和从活检样品获得的上清液。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在选自由以下组成的组的治疗环境中进行：新辅助治疗环境、辅助治疗环境、姑息治疗环境和预防性治疗环境。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中参考组包括患有腹膜癌扩散的受试者。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与患有相同疾病的患者相比，施用PAI-1抑制导致PAI-1活性被抑制。
21.一组标志物，其用于治疗被“纤溶酶原激活物抑制1”(PAI-1)的抑制剂治疗的患有腹膜癌扩散的患者，或用于检测或确定患有腹膜癌扩散的患者对用“纤溶酶原激活物抑制剂1”(PAI-1)的抑制剂治疗的易感性，其中该组标志物包括PAI-1，和一种或更多种STAT3磷酸化或p-STAT3的替代标志物。
22.一组标志物在权利要求1-19中任一项所述方法中的用途，其中所述组包括PAI-1和一种或更多种STAT3磷酸化或PAI-1和p-STAT3的替代标志物。
23.根据权利要求21所述的组或根据权利要求22所述的用途，其中所述组包括PAI-1以及IL6、IL10、CCL2和MMP9中的一种或更多种或全部。
24.根据权利要求21和23所述的组或根据权利要求22-23所述的用途，其中所述组包括PAI-1以及IL6、IL10、CCL2、MMP9和ANGPT1中的一种或更多种或全部。
25.根据权利要求21所述的组或根据权利要求22所述的用途，其中所述组包括PAI-1以及TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10中的一种或更多种或全部。
26.根据权利要求21和25所述的组或根据权利要求22和25所述的用途，其中所述组包括PAI-1以及IL6、TGFB1、POSTN、VSIG4、CD44和CXCL10中的一种或更多种或全部。
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