CN113896657A - 一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，包括如下步骤：步步骤一、氨基酸在二氧六环溶剂条件下，搅拌加入硫酸溶液、异丁烯，完全反应得到中间体I；步骤二、上步反应液在冰浴条件下，降温至0℃以下，加入氢氧化钠溶液，调节pH至9‑10，搅拌后反应完全得到中间体II；步骤三、上步反应液保持冰浴条件，加入Fmoc‑osu的二氧六环溶液，反应完全，采用稀盐酸酸化pH至3‑4，水相用乙酸乙酯溶液萃取，萃取后的有机相干燥，旋干，得到产物。同时还公开了一种该索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法及纯化方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
索马鲁肽是全球第一个也是唯一一个口服胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂药物，作为饮食控制和运动的辅助手段，以改善2型糖尿病成人患者的血糖控制。在全球糖尿病高发，患者对糖尿病药物需要长期依赖的情況下，口服药在给药途径上要比注射剂更易被患者接受，因为其在服药便捷之余，也能免去注射用药给患者带来的皮肤疼痛。因此索马鲁肽不仅具有市场价值，更具有社会意义。
Fmoc-Asp(Otbu)-OH和Fmoc-Glu(Otbu)-OH是生产索马鲁肽的基础保护氨基酸，其合成方法通常用叔丁醇在DCC和DMAP催化下分别和H-Asp-OH和H-Glu-OH反应，以实现远端羧基的保护。但反应中采用的叔丁醇保护效果不好，反应时间较长，且很难反应完全，产物极难分离提纯。我们拟对其合成工艺进行研发，通过工艺优化，降低生产成本，使得该基础氨基酸的生产工艺更具竞争优势。
发明内容
本发明目的在于提供一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法及纯化方法，本专利优化工艺，一方面可使反应顺利进行，大幅缩短反应时间。另一方面有利于产物的提纯，从而使成本显著降低，操作更加方便。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案实现：
本发明公开了一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，包括如下步骤：
步骤一、氨基酸在二氧六环溶剂条件下，搅拌加入硫酸溶液、异丁烯，完全反应得到中间体I；
步骤二、上步反应液在冰浴条件下，降温至0℃以下，加入氢氧化钠溶液，调节pH至9-10，搅拌后反应完全得到中间体II。
步骤三、上步反应液保持冰浴条件，加入Fmoc-osu的二氧六环溶液，反应完全，采用稀盐酸酸化pH至3-4，水相用乙酸乙酯溶液萃取，萃取后的有机相干燥，旋干，得到产物。
本发明的进一步的技术方案是：步骤一中，氨基酸为天门冬氨酸或谷氨酸。硫酸是强酸之一，在本发明中，采用硫酸作为强酸，主要是因为在硫酸的条件下，实现加成反应的进行。
本发明的进一步的技术方案是：步骤三中，氨基酸为天门冬氨酸时，最佳反应条件为：-5度冰浴，反应时间为2h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
本发明的进一步的技术方案是：步骤三中，氨基酸为谷氨酸时，最佳反应条件为：0度冰浴，反应时间为2.5h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
本发明的进一步的技术方案是：步骤三中，萃取用的有机溶剂为乙酸乙酯。乙酸乙酯作为常规溶剂，不仅价格便宜、实用，在本发明中乙酸乙酯的效果好。
还公开了一种索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，包括如下步骤：步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于70-100摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于15-25摄氏度下冷却结晶；步骤二，再加入有机溶剂，于70-100摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，步骤三，再加入有机溶剂，加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
本发明的进一步的技术方案是：所述步骤二中，有机溶剂为甲醇、乙腈得其中一种。
本发明的进一步的技术方案是：所述步骤三中，有机溶剂为甲醇、乙腈得其中一种。
本发明的进一步的技术方案是：所述步骤三中，洗涤溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚的其中一种。乙酸乙酯洗涤效果好。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：一、本发明优化工艺，一方面可使反应顺利进行，大幅缩短反应时间。另一方面有利于产物的提纯，从而使成本显著降低，操作更加方便。二、本发明的原材料成本低，反应条件温和、反应速度快，因此节约成本，优化后，成品可降低成本100元/kg以上，达到国内领先水平。三、本发明的纯化方法，操作简单，有机溶剂为常规的溶剂，且操作时间短，整体的效率高。四、采用本发明的方法后，获得的产品纯度高，现有技术中反应中采用的是用叔丁醇保护效果不好，反应时间较长，且很难完全保护住侧链羧基，产物很难分离得到较纯的产品，同时也没有较好的提纯方法。本发明的制备方法，使得制备得到的产品纯度较高，其次，采用的纯化方法，先将产物溶于盐酸，然后提纯后用环氧丙烷解除盐酸，实现提纯。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，包括如下步骤：
步骤一、氨基酸在二氧六环溶剂条件下，搅拌加入硫酸溶液、异丁烯，完全反应得到中间体I；
步骤二、上步反应液在冰浴条件下，降温至0℃以下，加入氢氧化钠溶液，调节pH至9-10，搅拌后反应完全得到中间体II。
步骤三、上步反应液保持冰浴条件，加入Fmoc-osu的二氧六环溶液，反应完全，采用稀盐酸酸化pH至3-4，水相用有机溶剂萃取，萃取后的有机相干燥，旋干，得到产物。
步骤一中，氨基酸为天门冬氨酸或谷氨酸。硫酸是强酸之一，在本发明中，采用硫酸作为强酸，主要是因为在硫酸的条件下，实现加成反应的进行。
步骤三中，氨基酸为天门冬氨酸时，最佳反应条件为：-5度冰浴，反应时间为2h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
步骤三中，氨基酸为谷氨酸时，最佳反应条件为：0度冰浴，反应时间为2.5h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
步骤三中，萃取用得有机溶剂为乙酸乙酯。
实施例2
实施例1的索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，包括如下步骤：
步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于70-100摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于15-25摄氏度下冷却结晶；
步骤二，再加入甲醇或乙腈溶剂，于70-100摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，
步骤三，加入甲醇或乙腈溶剂溶解，再加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，乙酸乙酯、石油醚或者二氯甲烷洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
实施例3
通过对照试验确定其最优化合成条件：在Fmoc-Asp(Otbu)-OH的合成中，考察不同的反应温度、摩尔配比、反应时间等对反应的影响，提高产品收率及纯度，使工艺条件达到国内外先进水平。
1.1合成路线
1.2主要原料规格
| 原料名称 | 含量(％) | 规格 | |
| 1 | 天门冬氨酸 | 98 | 工业级 |
| 2 | 异丁烯 | 98 | 工业级 |
| 3 | 氢氧化钠 | 99 | 工业级 |
| 4 | 硫酸 | 99 | 工业级 |
| 5 | 二氧六环 | 98 | 工业级 |
| 6 | 无水硫酸钠 | 96 | 工业级 |
| 7 | 乙酸乙酯 | 98 | 工业级 |
| 8 | Fmoc-osu | 98 | 工业级 |
1.3操作步骤
(1)H2N-Asp(otbu)-Otbu的合成
在500ML的三口烧瓶中，加入天门冬氨酸26.6g，二氧六环200ml，搅拌器搅拌下加入硫酸，通入异丁烯，反应72h，反应过程中搅拌，中控，反应完全，下步待用。
(2)H2N-Asp(otbu)-OH的合成
上步反应液冰浴降温至0℃以下，缓慢加入20％氢氧化钠溶液调节ph＝9-10，搅拌器搅拌3h，中控，下步待用。
(3)Fmoc-Asp(Otbu)-OH的合成
保持冰浴，在上述溶液中加入Fmoc-osu的二氧六环溶液反应，中控，反应完全，用稀盐酸酸化ph＝3-4，水相用乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相采用乙酸乙酯洗涤，干燥，旋干，得到产物53.4g，总收率65％，纯度99.4％。
1.4工艺参数确定
(1)冰浴温度的确定
按“1.3-(3)”操作步骤进行冰浴，对冰浴温度做优化实验：
| 批号 | H2N-Asp(otbu)-OH(g) | 冰浴温度(度) | 反应产率(％) |
| 1 | 18.9 | -15 | 76 |
| 2 | 18.9 | -10 | 82 |
| 3 | 18.9 | -5 | 89 |
| 4 | 18.9 | 0 | 87 |
| 5 | 18.9 | 5 | 80 |
| 6 | 18.9 | 10 | 78 |
从表中数据可以看出-5度冰浴最好。
(2)反应时间的确定
按“1.3-(3)”操作步骤进行冰浴，冰浴温度-5度低温搅拌条件下，考虑反应时间对产率的影响。
| 批号 | H2N-Asp(otbu)-OH(g) | 反应时间(h) | 反应产率(％) |
| 1 | 18.9 | 1 | 77 |
| 2 | 18.9 | 1.5 | 85 |
| 3 | 18.9 | 2 | 90 |
| 4 | 18.9 | 2.5 | 89 |
| 5 | 18.9 | 3 | 86 |
| 6 | 18.9 | 3.5 | 83 |
从表中数据可以看出最佳反应时间为2h。
(3)Fmoc-osu投料比的确定
按“1.3-(3)”操作步骤进行冰浴，冰浴温度-5度低温搅拌2小时，研究Fmoc-osu投料比对产率的影响。
| 批号 | H2N-Asp(otbu)-OH(g) | Fmoc-osu投料比(摩尔比) | 反应产率(％) |
| 1 | 18.9 | 1∶0.8 | 70 |
| 2 | 18.9 | 1∶0.85 | 75 |
| 3 | 18.9 | 1∶0.9 | 87 |
| 4 | 18.9 | 1∶0.95 | 92 |
| 5 | 18.9 | 1∶1 | 92 |
| 6 | 18.9 | 1∶1.1 | 89 |
从表中数据可以看出H2N-Asp(otbu)-OH与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
1.5小试结论
从以上实验结果可知：第三步-5度冰浴2h，H2N-Asp(otbu)-OH与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95；总收率最高达到65％。
实施例4
实施例3的一种索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，包括如下步骤：
步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于70摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于15摄氏度下冷却结晶；
步骤二，再加入甲醇溶剂，于70摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，
步骤三，加入甲醇溶剂溶解，再加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，乙酸乙酯洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
实施例5
实施例3的一种索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，包括如下步骤：
步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于100摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于25摄氏度下冷却结晶；
步骤二，再加入乙腈溶剂，于100摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，
步骤三，加入乙腈溶剂溶解，再加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，二氯甲烷洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
实施例6
实施例3的一种索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，包括如下步骤：
步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于70-100摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于20摄氏度下冷却结晶；
步骤二，再加入乙腈溶剂，于85摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，
步骤三，加入乙腈溶剂溶解，再加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，石油醚洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
实施例7
研究Fmoc-Glu(Otbu)-OH通过对照试验确定其最优化合成条件：在Fmoc-Glu(Otbu)-OH的合成中，考察不同的反应温度、摩尔配比、反应时间等对反应的影响，提高产品收率及纯度，使工艺条件达到国内外先进水平。
2.1合成路线
2.2主要原料规格
| 原料名称 | 含量(％) | 规格 | |
| 1 | 谷氨酸 | 98 | 工业级 |
| 2 | 异丁烯 | 98 | 工业级 |
| 3 | 氢氧化钠 | 99 | 工业级 |
| 4 | 硫酸 | 99 | 工业级 |
| 5 | 二氧六环 | 98 | 工业级 |
| 6 | 无水硫酸钠 | 96 | 工业级 |
| 7 | 乙酸乙酯 | 98 | 工业级 |
| 8 | Fmoc-osu | 98 | 工业级 |
2.3操作步骤
(1)H2N-Glu(otbu)-Otbu的合成
在500ML的三口烧瓶中，加入谷氨酸29.4g，二氧六环200ml，搅拌下加入硫酸，通入异丁烯，反应65h，中控，反应完全，下步待用。
(2)H2N-Glu(otbu)-OH的合成
上步反应液降温零度，缓慢加入20％氢氧化钠溶液调节ph＝9-10搅拌3h，中控，下步待用。
(3)Fmoc-Glu(Otbu)-OH的合成
在上述溶液中加入Fmoc-osu的二氧六环溶液反应，中控，反应完全，用稀盐酸酸化ph＝3-4，水相用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，旋干，得到61.2g，总收率72％，纯度99.3％。
2.4工艺参数确定
(1)冰浴温度的确定
按“2.3-(3)”操作步骤进行冰浴，对冰浴温度做优化实验：
| 批号 | H2N-Glu(otbu)-OH(g) | 冰浴温度(度) | 反应产率(％) |
| 1 | 20.3 | -10 | 74 |
| 2 | 20.3 | -5 | 83 |
| 3 | 20.3 | 0 | 90 |
| 4 | 20.3 | 5 | 88 |
| 5 | 20.3 | 10 | 86 |
| 6 | 20.3 | 10 | 78 |
从表中数据可以看出0度冰浴最好。
(2)反应时间的确定
按“2.3-(3)”操作步骤进行冰浴，冰浴温度0度低温搅拌条件下，考虑反应时间对产率的影响。
| 批号 | H2N-Glu(otbu)-OH(g) | 反应时间(h) | 反应产率(％) |
| 1 | 20.3 | 1 | 77 |
| 2 | 20.3 | 1.5 | 85 |
| 3 | 20.3 | 2 | 90 |
| 4 | 20.3 | 2.5 | 92 |
| 5 | 20.3 | 3 | 86 |
| 6 | 20.3 | 3.5 | 83 |
从表中数据可以看出最佳反应时间为2.5h。
(3)Fmoc-osu投料比的确定
按“2.3-(3)”操作步骤进行冰浴，冰浴温度0度低温搅拌2.5小时，研究Fmoc-osu投料比对产率的影响。
| 批号 | H2N-Glu(otbu)-OH(g) | Fmoc-osu投料比(摩尔比) | 反应产率(％) |
| 1 | 20.3 | 1∶0.8 | 72 |
| 2 | 20.3 | 1∶0.85 | 78 |
| 3 | 20.3 | 1∶0.9 | 85 |
| 4 | 20.3 | 1∶0.95 | 90 |
| 5 | 20.3 | 1∶1 | 90 |
| 6 | 20.3 | 1∶1.1 | 88 |
从表中数据可以看出H2N-Glu(otbu)-OH与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
2.5小试结论
从以上实验结果可知：第三步0度冰浴2.5h，H2N-Glu(otbu)-OH与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95；总收率最高达到72％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、氨基酸在二氧六环溶剂条件下，搅拌加入硫酸溶液、异丁烯，完全反应得到中间体I；
步骤二、上步反应液在冰浴条件下，降温至0℃以下，加入氢氧化钠溶液，调节pH至9-10，搅拌后反应完全得到中间体II；
步骤三、上步反应液保持冰浴条件，加入Fmoc-osu的二氧六环溶液，反应完全，采用稀盐酸酸化pH至3-4，水相用乙酸乙酯溶液萃取，萃取后的有机相干燥，旋干，得到产物。
2.如权利要求1所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：步骤一中，氨基酸为天门冬氨酸或谷氨酸。
3.如权利要求1所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：步骤三中，氨基酸为天门冬氨酸时，最佳反应条件为：-5度冰浴，反应时间为2h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
4.如权利要求1所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：氨基酸为谷氨酸时，最佳反应条件为：0度冰浴，反应时间为2.5h，中间体II与Fmoc-osu最佳投料比为1∶0.95。
5.如权利要求1所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：步骤三中，萃取用的有机溶剂为乙酸乙酯。
6.一种权利要求1-5所述的索马鲁肽保护氨基酸的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一，将上述制备方法得到的索马鲁肽保护氨基酸加入浓盐酸，于70-100摄氏度下搅拌，溶解，得到盐酸盐溶液；于15-25摄氏度下冷却结晶；步骤二，再加入有机溶剂，于70-100摄氏度下搅拌，洗涤，过滤得到高纯度盐酸盐溶液，步骤三，再加入有机溶剂，加入环氧丙烷解除盐酸，过滤，洗涤，得到高纯度索马鲁肽保护氨基酸。
7.如权利要求6所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤二和步骤三中，有机溶剂为甲醇、乙腈的其中一种。
8.如权利要求6所述的一种索马鲁肽保护氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤三中，洗涤溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚的其中一种。
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