CN113892484B - α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了α‑蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用。本发明发现了α‑蒎烯熏蒸能够促进三七种子提前萌发以及诱导三七产生抗病性，特别是对三七黑斑病的抗性。α‑蒎烯是天然产物，属植物源熏蒸剂，具有环保、低毒、可持续发展的效果，其来源丰富、获取成本低廉，因此可广泛应用于三七种植中。

Description

α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用

本申请是申请日为2021年05月18日、申请号为202110542601.5、发明名称为“α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及三七种植技术领域，具体而言，本发明涉及α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用。

背景技术

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)，别名田七、滇七、参三七、汉三七等，为多年生草本伞形目五加科人参属植物，具有止血散瘀、定痛消肿等良好功效，主要以块茎和花入药(国家药典委员会，2015；《全国中草药汇编(第三版)》，2014)。)。三七的药理成分复杂，具有止血、活血抗栓、抗炎、保肝护肝、保护心肌以及抗肿瘤的作用。

三七作为我国名贵中药材，其人工栽培历史已近400年。随着人们对三七需求的逐步提升，其种植规模也不断扩大。例如，云南省是我国三七的主要产区，每年三七的产量超过5万吨，产值接近千亿元，是云南省重大的经济支撑。但是，现代三七的农田生产模式主要是以照搬农作物的高产栽培模式为主，为了追求产量，大量的施用化肥和农药，甚至盲目的使用膨大剂。这种农田高产栽培模式并不符合三七的生长规律，大规模应用导致整个三七产业出现了品质低、农药重金属残留超标以及无地可种等重大难题。

此外，植物病害是影响农产品效益的重要因素之一。植物病原菌是一种生活在土壤、植物病残体中，条件适宜时从作物根部或茎叶部侵害作物而引起病害的微生物，以真菌为主。典型三七病原菌有：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)，链格孢属病原菌(Alternaria.spp)，土赤壳属病原菌(Ilyonectria.spp)，恶疫霉属病原菌(Phytophthora.spp)等。它们常引起三七黑斑、根腐、锈腐病。目前用于防治病害方法主要有化学处理和物理处理两种方法。化学处理往往使用一些高毒的化学熏蒸剂，其对环境的危害限制了其的使用，同时也会造成病原菌形成抗药性；而物理处理方法，如蒸汽灭菌等，也受到了成本过高的限制。

因此，亟待寻找能够有效提高三七品质、低毒、无污染的三七种植方法。

松针覆盖是三七种植的模式之一，本发明人在研究松针有效成分的过程中，首次发现了α-蒎烯在促进三七生长及诱导抗性中的作用，进而提出了本发明。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用。

α-蒎烯(α-Pinene)是一种天然存在的双环单萜类化合物，分子式为C₁₀H₁₆，可从松树等多种植物中获得，其结构如下：

α-蒎烯本身为无色透明液体，微溶于水，不溶于丙二醇、甘油，溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸等多数有机溶剂。α-蒎烯具有碳碳双键和碳环结构，丰富的化学结构使α-蒎烯能发生异构化、氧化、氢化、加成、酯化、聚合等一系列化学反应；并且其还具有松木、针叶及树脂样的气息，在化工、大气化学等领域是合成樟脑、冰片、松油醇、香料、树脂等化工产品的重要原料之一。此外，α-蒎烯还具有镇咳、祛痰、抗过敏及改善溃疡、抗真菌等作用。

本发明的一个目的，在于提供α-蒎烯在促进三七生长中的应用。

在一个优选的实施方案中，本发明提供α-蒎烯在促进三七种子萌发中的应用。

三七的种子属于典型的顽拗性种子，也就是在成熟发育期间不发生脱水，脱落时含水量较高，贮藏时不耐脱水的种子，并且还具有休眠特性，通常需要层积处理60d左右，完成胚后熟才能萌发，在浓度为25mg/L的外源赤霉素处理后，能缩短种子休眠时间，使三七提前出苗，但萌发率均比对照明显下降(崔秀明、王朝梁、李伟等，植物激素及生长调节剂对三七种子的效应[J].中药材，1994,(02):3-5,52)。另外，也有研究表明，植物激素赤霉素和脱落酸在调控三七种子萌发中起到了关键的作用，外源添加赤霉素，能够使得三七种子打破休眠，促进萌发(葛娜、杨玲、陈军文，不同浓度赤霉素和脱落酸对顽拗性三七种子后熟种胚发育和内源激素的影响[J].应用与环境生物学报，2020,26(03):574-581)。

本发明发现，用适宜浓度的α-蒎烯熏蒸处理三七种子，能够促进三七种子的萌发。当外源添加低浓度的α-蒎烯处理三七种子时，能够促进种子的提前萌发，特别是在50d-60d时，经处理的三七种子萌发率显著高于未处理的三七种子，前者甚至能达到后者的3倍乃至更多。而当用高浓度的α-蒎烯处理时，则显著抑制了三七种子的萌发，极端情况下还出现了三七种子不萌发的情形。可见，α-蒎烯对三七种子萌发具有低促高抑的性质，即低浓度下促进，高浓度下抑制。推测α-蒎烯可能是通过调节三七种子中激素含量，来打破三七种子休眠，促进其萌发的。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七生长促进剂，其包含α-蒎烯。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种促进三七生长的熏蒸剂，其包含α-蒎烯。

优选的，本发明所述三七生长促进剂、促进三七生长的熏蒸剂只包含α-蒎烯。

优选的，本发明所述三七生长促进剂、促进三七生长的熏蒸剂还包括辅料，以便于制剂。进一步地，α-蒎烯可与辅料制成气雾剂、喷雾剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂等剂型。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述应用包括对三七种子使用三七生长促进剂/促进三七生长的熏蒸剂/α-蒎烯进行熏蒸。优选的，本发明所述应用包括在密闭空间中对三七种子使用三七生长促进剂/促进三七生长的熏蒸剂/α-蒎烯进熏蒸。

本发明的另一个目的在于提供一种促进三七种子萌发的方法，所述方法包括对三七种子使用本发明所述的三七生长促进剂或促进三七生长的熏蒸剂进行熏蒸。优选的，所述方法包括在密闭空间中对三七种子使用本发明所述的三七生长促进剂或促进三七生长的熏蒸剂进行熏蒸。优选的，本发明所述方法使用α-蒎烯进行熏蒸。

优选的，所述三七种子包括未种植的三七种子和种植的三七种子。

在一个优选的实施方案中，熏蒸时α-蒎烯的用量为1～20μL/L(α-蒎烯体积/密闭空间体积)。

优选的，所述用量为1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L。所述用量优选为1～15μL/L，进一步优选5～10μL/L。

在一个优选的实施方案中，优选每1-10d补充添加一次三七生长促进剂/促进三七生长的熏蒸剂/α-蒎烯，每次补充添加时α-蒎烯的用量为1～20μL/L(α-蒎烯体积/密闭空间体积)。优选的，所述用量为1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L。所述用量优选为1～15μL/L，进一步优选5～10μL/L。

优选的，每次补充添加α-蒎烯的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

在本发明中，优选每1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d或10d补充添加一次三七生长促进剂/促进三七生长的熏蒸剂/α-蒎烯。

在一个优选的实施方案中，熏蒸的总时间为30～100d。优选的，熏蒸的总时间为30d、35d、40d、45d、50d、55d、60d、65d、70d、75d、80d、85d、90d、95d或100d。优选的，熏蒸的总时间为40～95d，进一步优选50～90d，更进一步优选60～90d。

本发明的另一个目的，在于提供α-蒎烯在三七诱导抗性中的应用。

近年来，利用诱导剂诱导植物自身产生抗病性是植物病害防治的发展方向之一。植物通常以两种抗性途径，抵御外界病原菌的侵染。一种是系统获得抗性(systemicacquired resistance,SAR)，主要由病原菌侵染诱导的植物体内SA(水杨酸)、ROS(活性氧)等积累进而诱使整个植株具有抗性(Riedlmeier M,Ghirardo A,Wenig M,etal.Monoterpenes support systemic acquired resistance within and betweenplants[J].The Plant Cell,2017,29(6):14401459；Pieterse C M,Van Der Does D,Zamioudis C,et al.Hormonal modulation of plant immunity[J].Annual reviewofcell and developmental biology,2012,28)。另一种为诱导系统抗性(inducedsystemic resistance ISR))，其特点是由非病原物诱导而使植物体产生抗性，目前研究发现，诱导系统抗性通常是由有益微生物介导下的JA(茉莉酸)和ET(乙烯)激素依赖型的防御途径(李玉龙，生防菌对两种作物病害的防治作用及机理[D].西北农林科技大学，2019)。

本发明发现，α-蒎烯在诱导三七抗病性上具有显著效果。通过用α-蒎烯熏蒸处理，三七产生了对例如叶部黑斑病的抗性，使得三七叶部的病斑面积显著减小，特别是在α-蒎烯浓度较低的情况下，在不同的诱导时间下均产生了明显的诱导抗性效果。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七诱导抗性剂，其包含α-蒎烯。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七诱导抗性的熏蒸剂，其包含α-蒎烯。

优选的，本发明所述三七诱导抗性剂、三七诱导抗性的熏蒸剂只包含α-蒎烯。

优选的，本发明所述三七诱导抗性剂、三七诱导抗性的熏蒸剂还包括辅料，以便于制剂。进一步地，α-蒎烯可与辅料制成气雾剂、喷雾剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂等剂型。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述应用包括对三七种子或植株使用本发明所述的三七诱导抗性剂/三七诱导抗性的熏蒸剂/α-蒎烯进行熏蒸。优选的，本发明所述应用包括在密闭空间中对三七种子或植株使用本发明所述的三七诱导抗性剂/三七诱导抗性的熏蒸剂/α-蒎烯进行熏蒸。

本发明的另一个目的在于提供一种在三七中诱导抗性的方法，所述方法包括对三七种子或植株使用本发明所述的三七诱导抗性剂或三七诱导抗性的熏蒸剂进行熏蒸。优选的，所述方法包括在密闭空间中对三七种子或植株使用本发明所述的三七诱导抗性剂或三七诱导抗性的熏蒸剂进行熏蒸。优选的，本发明所述方法使用α-蒎烯进行熏蒸。

优选的，所述三七种子包括未种植的三七种子和种植的三七种子。

在一个优选的实施方案中，熏蒸时α-蒎烯的用量为0.05～20μL/L(α-蒎烯体积/密闭空间体积)。

优选的，所述用量为0.05μL/L、0.1μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L。所述用量优选为0.1～15μL/L，进一步优选1～10μL/L，更进一步优选5-10μL/L。

在一个优选的实施方案中，优选每1-5d补充添加一次三七诱导抗性剂/三七诱导抗性的熏蒸剂/α-蒎烯，每次补充添加时α-蒎烯的用量为0.05～20μL/L(α-蒎烯体积/密闭空间体积)。优选的，所述用量为0.05μL/L、0.1μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L。所述用量优选为0.1～15μL/L，进一步优选1～10μL/L，更进一步优选5-10μL/L。

优选的，每次补充添加α-蒎烯的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

在本发明中，优选每1d、2d、3d、4d或5d补充添加一次三七诱导抗性剂/三七诱导抗性的熏蒸剂/α-蒎烯。

在一个优选的实施方案中，熏蒸的总时间为0.5～10d。优选的，熏蒸的总时间为0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d或10d。优选的，熏蒸的总时间为1～3d，进一步优选1～2d。

在一个优选的实施方案中，本发明所述诱导抗性是指诱导三七产生抗病性。所述抗病性包括三七黑斑病。

有益效果：

本发明发现了α-蒎烯熏蒸能够促进三七种子提前萌发，还能够诱导三七产生抗病性，特别是对三七黑斑病的抗性。尤其是，在三七种植过程中使用5～20μL/L浓度的α-蒎烯处理既能够促进三七萌发也能够诱导三七产生抗病性。由于α-蒎烯是天然产物，属植物源熏蒸剂，具有环保、低毒、可持续发展的效果，其来源丰富、获取成本低廉，因此可广泛应用于三七种植中。

附图说明

图1：α-蒎烯对三七种子萌发的影响；

图2：α-蒎烯诱导三七抵抗黑斑病菌的效果。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：α-蒎烯促进三七种子萌发试验

采用密闭瓶栽沙培的方法进行：将100g灭菌的石英沙装于玻璃组培瓶中再次用烘箱141℃烘干4h灭菌。冷却后，加入18ml灭菌ddH₂O(双蒸水)，搅拌均匀后种上12粒三七种子。取15ml离心管的管盖置于石英砂上面，在管盖中各添加浓度为0、5、20、50和100μL/L(α-蒎烯体积/培养瓶体积)的α-蒎烯，盖上盖子。种植完成后统一放置于25℃的恒温温室，每7d补充添加一次α-蒎烯。当第50d时，开始调查出苗的情况，随后每10d调查一次，连续调查5次。试验结果示于图1中。

试验结果表明，外源添加5和20μL/L浓度的α-蒎烯处理，均能促进种子的提前萌发(种植后50d和60d)，5μL/L的α-蒎烯在种植的80天内，种子的萌发数量都高于对照。但是100μL/L高浓度α-蒎烯处理，显著的抑制了三七种子的萌发。说明α-蒎烯对三七种子萌发表现为低促高抑的现象，即低浓度表现为促进，高浓度表现为抑制。

实施例2：α-蒎烯诱导三七植株产生抗病性

采用密闭空间熏蒸法进行：首先挑选移栽后长势较好的三七盆栽，将土壤表面的杂草清除，并浇透水分放置1天，随后用保鲜袋将盆套住，使三七只有地上部份能与α-蒎烯接触，避免α-蒎烯对土壤的影响。将处理好的三七盆栽分别放置于透明塑料密封培养箱，再分别使用0、0.1、1、5、20和50μL/L(α-蒎烯体积/培养箱体积)的处理浓度处理1d、2d和3d的诱导时间，每天补充一次α-蒎烯。三七种苗经过α-蒎烯诱导后，叶面挑战接种黑斑病菌(Alternaria panax)SL17的菌饼，移至于透明塑料培养箱内保湿培养，接种3d发病后采集病斑叶片，使用Epson Perfection V850Pro扫描仪扫描病叶，并使用Adobe Photoshop软件截取并计算诱导处理与对照处理的相对病斑面积，评价α-蒎烯诱导三七抗性的效果。试验结果示于图2中，其中，(A)代表对照处理；(B)代表5μL/L的α-蒎烯处理。(C)、(D)和(E)分别表示不同浓度的α-蒎烯诱导1d，诱导2d和诱导3d时三七的相对病斑面积。数据以均值±标准误的形式表示，不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one-way ANOVA，Duncan’smultiple range test，P<0.05)。

上述试验中，由于已用保鲜袋将三七盆载的盆套住，避免了α-蒎烯对土壤的影响，因此能够确定熏蒸处理时α-蒎烯作用于三七本身，而非作用于种植三七的土壤以及其根际微生物群落。因此，所述试验结果能够表明，0.1和1μL/L的α-蒎烯熏蒸处理时在不同的诱导时间下，诱导三七对叶部黑斑病的抗性的程度较低(图2，C，D，E)。相比之下，增加α-蒎烯的浓度至5μL/L时，发现具有明显的诱导抗性效果，并且在不同的诱导时间下(诱导1d，2d和3d)，都具有显著的诱导抗性效果，相对病斑面积分别为对照(CK，即未使用α-蒎烯熏蒸)的52.65％、54.44％和31.22％(图2，C，D，E)。在更高α-蒎烯浓度的情况下，20μL/L的α-蒎烯诱导1d和2d有显著的诱抗活性，而50μL/L的高浓度α-蒎烯诱导抗性效果不显著(图2，C，D，E)。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (18)

1.α-蒎烯在诱导三七抗性中的应用，所述应用为对三七种子或植株使用α-蒎烯进行熏蒸，其中，所述熏蒸在密闭空间中进行，熏蒸时α-蒎烯体积/密闭空间体积为5~20μL/L。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α-蒎烯与辅料一起制成熏蒸剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述熏蒸剂中α-蒎烯与辅料制成气雾剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，熏蒸时α-蒎烯体积/密闭空间体积为5-10μL/L。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，每1-5d补充添加一次α-蒎烯，每次补充添加的α-蒎烯体积/密闭空间体积为5~20μL/L，每次补充添加α-蒎烯的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，每次补充添加的α-蒎烯体积/密闭空间体积为5-10μL/L。

7.根据权利要求1-4、6任一项所述的应用，其特征在于，熏蒸的总时间为0.5~10d。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，熏蒸的总时间为1~3d。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，熏蒸的总时间为1~2d。

10.在三七中诱导抗性的方法，所述方法为对三七种子或植株使用α-蒎烯进行熏蒸，其中，所述熏蒸在密闭空间中进行，熏蒸时α-蒎烯体积/密闭空间体积为5~20μL/L。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述α-蒎烯与辅料一起制成熏蒸剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述熏蒸剂中α-蒎烯与辅料制成气雾剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，熏蒸时α-蒎烯体积/密闭空间体积为5-10μL/L。

14.根据权利要求10-13任一项所述的方法，其特征在于，每1-5d补充添加一次α-蒎烯，每次补充添加的α-蒎烯体积/密闭空间体积为5~20μL/L，每次补充添加α-蒎烯的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，每次补充添加的α-蒎烯体积/密闭空间体积为5-10μL/L。

16.根据权利要求10-13、15任一项所述的方法，其特征在于，熏蒸的总时间为0.5~10d。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，熏蒸的总时间为1~3d。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，熏蒸的总时间为1~2d。

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