CN113876969A - 一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，包括：预真空阶段，通过真空泵对灭菌器进行抽真空，使灭菌器内室压力达到‑50kPa～‑90kPa的负压状态；抽出灭菌器内的冷空气；升温阶段，将饱和压力蒸汽注入灭菌器内室，使灭菌室内的温度和压力上升并达到预设的工作温度；恒温阶段，通过调控灭菌室温度和压力，使之保持在工作温度和工作压力的范围内，恒温阶段灭菌温度为115℃～120℃，灭菌压力为75kPa～99kPa，灭菌时间为15分钟～30分钟；排气阶段，灭菌器将灭菌室内蒸汽排出完成灭菌；本发明有效降低灭菌压力和温度，最大限度保持了培养基的营养成分，工作压力不超过100kPa，不属于特种设备的范畴，操作者无需特种设备备案登记。
Description
技术领域
本发明涉及灭菌设备技术领域，特别地是一种用于液体培养基类的预真空 亚高压蒸汽灭菌工艺。
背景技术
压力蒸汽灭菌技术有着操作简便、不需要添加额外消毒剂等优点，除了医 疗行业之外，还在农业组培、食品加工生产、生物技术研究等领域有着广泛的 应用。
压力蒸汽灭菌是在密闭的容器内通过完全排除内部空气，通入高压蒸汽将 待灭菌物品升温至灭菌所需要的温度，然后保持恒温，将所有的微生物灭活的 灭菌方式。目前压力蒸汽灭菌一般采用脉动真空压力蒸汽灭菌(即通过多次重 复抽气/进蒸汽以达到排除空气目的的一种灭菌工艺方法，也可称之为预真空) 和下排冷式的压力蒸汽灭菌这两种灭菌方式。
对于植物组培或者科研中常用的密封瓶装(或袋装)的液体而言，在高压 蒸汽灭菌过程中，由于液体的沸点受外界压力的影响，如果瓶内液体在经过升 温后突然压力下降，其沸点也会随之下降从而暴沸，甚至从瓶内大量喷出而引 起“炸瓶”现象。因此，对于液体类的灭菌，不能采用脉动真空方式来排除冷 空气，而须采用下排冷方式，通过多次“注入压力蒸汽—排放蒸汽”的循环， 把冷空气完全置换，从而获得饱和蒸汽进行灭菌。
然而，传统的下排冷方式难以完全排除组培瓶内的空气，因此至少需要 121℃以上的温度灭菌20分钟以达到灭菌效果。对于液体培养基而言，由于瓶 内的冷空气不易排出，容易出现瓶内温度达不到灭菌所需温度，导致灭菌失败。 所以这种灭菌方式的灭菌效果并不稳定，往往需要提高灭菌温度或延长灭菌时 间，去保证灭菌效果。灭菌温度越高灭菌时间越长，培养液中的营养物质越容 易分解破坏。
由于采用抽真空的方法，比起用蒸汽排出冷空气，有着明显的节能效果。 因为在相同容积里，抽真空排除空气(采用真空泵)的功率比用加热管产生蒸 汽排除空气方法的功率比为1:10，节能效果十分明显。
此外，根据《特种设备安全技术规范》(TSG 21-2016)的相关要求，对于 工作压力在100kPa以上的压力容器，使用者须办理特种设备登记证后方可使 用。如前所述，目前市面上用于组培液体灭菌的压力蒸汽灭菌器普遍采用 121℃或以上的灭菌温度，其工作压力超过100kPa，故须按照特种设备的管理 规范要求进行制造和使用，大大增加了使用者的成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠稳定、工作压力在100kPa以下的应用于 液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，可以降低灭菌温度和压力，从而 保证灭菌效果，最大限度保持了培养基的营养成分。工作压力不超过100kPa， 不属于特种设备的范畴，操作者无需特种设备备案登记。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，包括以下步骤： 步骤S1、预真空阶段，通过真空泵对灭菌室进行抽真空，抽出灭菌室内的冷 空气，使灭菌器内室压力达到-50kPa～-90kPa的负压状态；
步骤S2、升温阶段，将饱和压力蒸汽注入灭菌器内室，使灭菌室内的温度和 压力上升；待灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度；
步骤S3、恒温阶段，当灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度时， 通过温度传感器、压力传感器和控制器来调控灭菌室温度和压力，使之保持在 工作温度和工作压力的范围内，恒温阶段灭菌温度为115℃～120℃，灭菌压 力为75kPa～99kPa，灭菌时间为15分钟～30分钟；
步骤S4、排气阶段，当恒温阶段达到预设的灭菌时间后，灭菌器将打开排气 阀，把灭菌器室内的压力蒸汽缓缓排出，直到灭菌室内外气压相等，此时即完 成灭菌。
进一步地，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa；所述步骤S3中， 灭菌温度为118℃，灭菌压力为90kPa，灭菌时间为20分钟。
进一步地，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa；所述步骤S3中， 灭菌温度为115℃，灭菌压力为78kPa，灭菌时间为30分钟。
进一步地，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-50kPa；所述步骤S3中， 灭菌温度为120℃，灭菌压力为99kPa，灭菌时间为15分钟。
进一步地，该灭菌工艺适用于液体类培养基灭菌。
本发明的有益效果：
本发明通过在升温前作抽真空处理的方式，使水蒸汽能充分均匀地渗透灭 菌器内室各部位，达到杀灭微生物的作用，与传统的用于液体的下排冷灭菌方 式相比，所需的工作温度和工作压力更低、排冷空气更彻底、温度更均匀、灭 菌效果更稳定，而且更高效节能。其最高灭菌温度为120℃，最高工作压力为 99kPa，本发明采用低于100kPa的亚高压饱和蒸汽作灭菌介质，由于工作压 力不超过100kPa，因此采用该灭菌工艺的蒸汽灭菌器而不属于特种设备(压 力容器)的范畴，操作者无需特种设备备案登记。为农业组培、实验室研究等 非医疗行业提供了一种保证灭菌效果同时简化了备案程序的方案。同时，由于 本发明工艺降低了灭菌温度和压力，因此最大限度保持了培养基的营养成分。
附图说明
图1是本发明与传统下排式灭菌工艺的对比示意图。
图2是实施例一中采用3MTM压力蒸汽灭菌生物培养指示剂作指示物，以本 发明所提供的灭菌方法(115℃灭菌30分钟)作测试结果示意图。
图3是实施例二中采用3MTM压力蒸汽灭菌生物培养指示剂作指示物，以本 发明所提供的灭菌方法(120℃灭菌15分钟)作测试结果示意图。
图4是实施例三中采用以本发明所提供的灭菌方法对用于组培的液体培 养基灭菌后的生物测试结果示意图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意 下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实 施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
需要说明，在本发明中如涉及“第一”、“第二”的描述仅用于描述目的， 而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数 量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一 个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本 领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实 现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之 内。
一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，包括以下步骤： 步骤S1、预真空阶段，通过真空泵对灭菌室进行抽真空，抽出灭菌室内的冷 空气，使灭菌器内室压力达到-50kPa～-90kPa的负压状态；
步骤S2、升温阶段，将饱和压力蒸汽注入灭菌器内室，使灭菌室内的温度和 压力上升；待灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度；
步骤S3、恒温阶段，当灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度时， 通过温度传感器、压力传感器和控制器来调控灭菌室温度和压力，使之保持在 工作温度和工作压力的范围内，恒温阶段灭菌温度为115℃～120℃，灭菌压 力为75kPa～99kPa，灭菌时间为15分钟～30分钟；
步骤S4、排气阶段，当恒温阶段达到预设的灭菌时间后，灭菌器将打开排气 阀，把灭菌器室内的压力蒸汽缓缓排出，直到灭菌室内外气压相等，此时即完 成灭菌。
具体的，本实施例方案中，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa； 所述步骤S3中，灭菌温度为118℃，灭菌压力为90kPa，灭菌时间为20分钟。
具体的，本实施例方案中，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa； 所述步骤S3中，灭菌温度为115℃，灭菌压力为78kPa，灭菌时间为30分钟。
具体的，本实施例方案中，所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-50kPa； 所述步骤S3中，灭菌温度为120℃，灭菌压力为99kPa，灭菌时间为15分钟。
具体的，本实施例方案中，该灭菌工艺适用于液体类培养基灭菌。
为了更显浅地理解本发明与传统下排式灭菌工艺的对比，本文在图1中列 出了这两种灭菌工艺上的差异示意图。如图1A所示，传统的下排式灭菌工艺 的工作压力始终在正压范围，通过多次的“注入压力蒸汽—排放蒸汽”的循环 来排出灭菌器内的冷空气，然后恒温灭菌。本发明提供的预真空亚高压灭菌工 艺如图1B所示，与传统的下排式灭菌工艺的区别在于，在升温前先作一次抽 真空，使灭菌器内的压力降至负压，从而抽出冷空气，然后再注入压力蒸汽， 使灭菌室的温度和压力上升，最终使饱和蒸汽达到工作压力来恒温灭菌。同时， 由于这种灭菌工艺只在液体升温前作一次抽真空处理，在液体升温后并没有对 灭菌室抽真空，因此不会引起液体的暴沸现象。
本发明的灭菌工艺依次经过预真空、升温、恒温、排气共4个工作阶段， 最终完成灭菌。在预真空阶段中，通过真空泵把灭菌器内室抽至负压状态(-50 kPa～-90kPa)；在升温阶段中，饱和压力蒸汽注入灭菌器内室，使灭菌室温 度和压力上升；当灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到了预设的工作温度时，灭菌 过程进入恒温阶段，这时通过温度传感器、压力传感器和控制器来调控灭菌室 温度和压力，使之保持在工作温度和工作压力的范围内，时间为15分钟～30 分钟；当恒温阶段达到预设的灭菌时间后，灭菌器将打开排气阀，把灭菌室内 的压力蒸汽缓缓排出，直到灭菌室内外气压相等，此时即完成灭菌。
本发明的灭菌工艺与传统的下排冷灭菌方式相比，所需的工作温度和工作 压力更低、排冷空气更彻底、灭菌效果更稳定，而且更高效节能。其最高灭菌 温度为120℃，最高工作压力为99kPa，因此应用该液体灭菌工艺的灭菌器不 属于特种设备(压力容器)的范畴，无需按特种设备的管理要求办理使用登记。 经测试，该方式对嗜热脂肪杆菌有非常好的杀灭效果。本发明采用低于100kPa (相对压力)的亚高压饱和蒸汽作灭菌介质，由于工作压力在100kPa以下， 因此采用该灭菌工艺的蒸汽灭菌器不属于压力容器的范畴；此外，由于该工艺 降低了灭菌压力和温度，因此最大限度保持了培养基的营养成分。
实施例一：选用容积为500L的亚高压蒸汽灭菌器作试验对象。试验前， 往灭菌器内室堆满容积约300mL的组培玻璃瓶，每瓶装入约50mL蒸馏水用 作模拟培养液，并往放置在靠近灭菌室门的四个角落及灭菌室中央处的组培玻 璃瓶内各放入一支3MTM压力蒸汽灭菌生物培养指示剂(试验菌种为嗜热脂肪 杆菌)。本次灭菌的工作温度为115℃，最大真空度为-90kPa，灭菌时间为30 分钟。
灭菌器开始工作后，先进行一次抽真空操作，把灭菌器内室压力降至-90 kPa，随后加注蒸汽升温至115℃(此时内室压力为78kPa)。恒温恒压30分 钟后结束灭菌，把生物指示剂取出，连同作为阳性对照的指示剂(未经灭菌操 作)一起，按指示剂说明书捏碎安瓿管，放置在专用的恒温培养器中，58℃恒 温培养48小时后观察结果。
结果如图2所示，培养48小时后，阳性对照组呈黄色，提示里面的嗜热 脂肪杆菌没有灭活；而经本发明所提供的灭菌方法处理的试验组均呈紫色，提 示里面的嗜热脂肪杆菌均彻底灭活，说明该方案可行。
实施例二：选用容积为800L的亚高压蒸汽灭菌器作试验对象。试验前， 往灭菌器内室堆满容积约300mL的组培玻璃瓶，每瓶装入约50mL蒸馏水用 作模拟培养液，并往放置在靠近灭菌室门的四个角落及灭菌室中央处的组培玻 璃瓶内各放入一支3MTM压力蒸汽灭菌生物培养指示剂(试验菌种为嗜热脂肪 杆菌)。本次灭菌的工作温度为120℃，最大真空度为-50kPa，灭菌时间为15 分钟。
灭菌器开始工作后，先进行一次抽真空操作，把内室压力降至-50kPa，随 后加注蒸汽升温至120℃(此时内室压力为99kPa)。恒温恒压15分钟后结 束灭菌，把生物指示剂取出，连同作为阳性对照的指示剂(未经灭菌操作)一 起，按指示剂说明书捏碎安瓿管，放置在专用的恒温培养器中，58℃恒温培养 48小时后观察结果。
结果如图3所示，培养48小时后，阳性对照组呈黄色，提示里面的嗜热 脂肪杆菌没有灭活；而经本发明所提供的灭菌方法处理的试验组均呈紫色，提 示里面的嗜热脂肪杆菌均彻底灭活，说明该方案可行。
实施例三：选用容积为1200L的亚高压蒸汽灭菌器作试验对象。试验前， 往灭菌器内室堆满容积约300mL的耐热塑料组培瓶，每瓶装入约50mL液体 培养基。本次灭菌的工作温度为118℃，最大真空度为-90kPa，灭菌时间为20 分钟。
灭菌器开始工作后，先进行一次抽真空操作，把内室压力降至-90kPa，随 后加注蒸汽升温至118℃(此时内室压力为90kPa)。恒温恒压20分钟后结 束灭菌，把组培瓶取出，并选取一个放置在靠近灭菌室排汽口处(温度最低点) 的组培玻璃瓶，在超净工作台中操作，从中取100μL组培液均匀涂布在LB 固体培养基上，在37℃的恒温环境下培养一周。其余经灭菌处理的组培玻璃 瓶静置一周后观察结果。
结果如图4A所示，经亚高压蒸汽灭菌器灭菌处理后的培养液在放置一周 后依然清澈透明，肉眼未见有霉菌斑或漂浮物；图4B的LB固体培养基中同 样未见任何菌落生长，说明本发明的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺适用于组培用 培养液的灭菌。
本发明通过在升温前作抽真空处理的方式，使水蒸汽能充分渗透灭菌器内 室，达到杀灭微生物的作用，与传统的用于液体的下排冷灭菌方式相比，所需 的工作温度和工作压力更低。由于工作压力不超过100kPa，故而不属于特种 设备(压力容器)的范畴，操作者无需特种设备备案登记。为农业组培、实验 室研究等非医疗行业提供了一种保证灭菌效果同时简化了备案程序的方案。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具 体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只 适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依 据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述， 本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (5)
1.一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、预真空阶段，通过真空泵对灭菌室进行抽真空，抽出灭菌室内的冷空气，使灭菌器内室压力达到-50kPa～-90kPa的负压状态；
步骤S2、升温阶段，将饱和压力蒸汽注入灭菌器内室，使灭菌室内的温度和压力上升；待灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度；
步骤S3、恒温阶段，当灭菌室内的饱和蒸汽的温度达到预设的工作温度时，通过温度传感器、压力传感器和控制器来调控灭菌室温度和压力，使之保持在工作温度和工作压力的范围内，恒温阶段灭菌温度为115℃～120℃，灭菌压力为75kPa～99kPa，灭菌时间为15分钟～30分钟；
步骤S4、排气阶段，当恒温阶段达到预设的灭菌时间后，灭菌器将打开排气阀，把灭菌器室内的压力蒸汽缓缓排出，直到灭菌室内外气压相等，此时即完成灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，其特征在于：所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa；所述步骤S3中，灭菌温度为118℃，灭菌压力为90kPa，灭菌时间为20分钟。
3.根据权利要求1所述的一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，其特征在于：所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-90kPa；所述步骤S3中，灭菌温度为115℃，灭菌压力为78kPa，灭菌时间为30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，其特征在于：所述步骤S1中，灭菌器内室压力为-50kPa；所述步骤S3中，灭菌温度为120℃，灭菌压力为99kPa，灭菌时间为15分钟。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于液体培养基类的预真空亚高压蒸汽灭菌工艺，其特征在于：该灭菌工艺适用于液体类培养基灭菌。
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2021
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