CN113876786A - 一种肝纤维化防治药物 - Google Patents

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Abstract

本申请是申请号为2021101975884、申请日为2021年02月22日、发明名称为“一种预防和/或治疗器官纤维化的组合物及其应用与制剂”的分案申请。本发明提供了露水草提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用，本发明研究发现，露水草提取物具有明显的治疗肝纤维化的效果，且属于天然植物来源药物，无任何副作用，适合内服外用，在开发抗肝纤维化类的医药产品方面具有很好的应用价值，为肝纤维化疾病的治疗提供一种新型、天然的药物来源。

Description

一种肝纤维化防治药物
本申请是申请号为2021101975884、申请日为2021年02月22日、发明名称为“一种预防和/或治疗器官纤维化的组合物及其应用与制剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地，露水草提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
任何原因只要能引起组织细胞损伤，均可导致组织细胞发生变性、坏死和炎症反应，如果损伤很小，损伤细胞周边正常实质细胞将发生增生修复，这种修复可完全恢复正常的结构和功能。然而如果损伤较大或反复损伤超出了损伤周围实质细胞的再生能力时，间质纤维结缔组织(细胞外基质)将大量增生对缺损组织进行修复，即发生纤维化(fibrosis)的病理改变。因此本质上纤维化是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。增生的纤维结缔组织虽然修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能。纤维化可发生于多种器官，如肺、肝、肾、腹膜、血管、胰腺、皮肤等，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，直接导致了器官功能的丧失，严重威胁人类健康和生命。据美国有关统计资料证明，该国因各种疾病而致死的病人中，接近45％可以归于组织纤维增生疾病。另外，呼吸道病毒感染相关疾病的发展也多有肺纤维化，如新型冠状病毒SARS-CoV-2感染重症可导致严重的肺纤维化。
公开号为CN107019697A的专利公开了尼达尼布在治疗纤维化疾病的应用，此外，也有研究表明单宁酸对CCl4诱导的肝纤维化小鼠具有显著的肝保护作用，可发挥一定的抗肝纤维化作用。但是，一方面应用局限，因为除了肝纤维化，机体多处器官均会发生纤维化；另一方面为了保证药效通常单宁酸的用量较大，成本较高，且难免存在一定的毒副作用。于是，寻求新的成本降低、抗器官纤维化效果提升的新的用药方案是目前的研究热点。
发明内容
本发明针对目前抗肝纤维化药物的有限，本发明旨在提供露水草提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用，本发明研究发现了露水草提取物具有明显的治疗肝纤维化的效果，且属于天然植物来源药物，无任何副作用，适合内服外用，在开发抗肝纤维化类的医药产品方面具有很好的应用价值，为肝纤维化疾病的治疗提供一种高效、安全的药物来源。
本发明的另一目的是提供一种包含露水草提取物的用于预防和/或治疗肝纤维化的口服液。
本发明的另一目的是提供一种包含露水草提取物的用于预防和/或治疗肝纤维化的片剂。
本发明的另一目的是提供一种包含露水草提取物的用于预防和/或治疗肝纤维化的喷剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种预防和/或治疗纤维化的露水草组合物，包括单宁酸和/或露水草提取物；所述露水草提取物为露水草水提物和/或露水草醇提物。
本发明上述预防和/或治疗纤维化的露水草组合物中，单宁酸(tannic acid)是一些植物的次生代谢产物，其在药物医学中又称鞣酸，是一种天然的植物多酚，广泛存在于五倍子植物中，它含有大量的羟基和羰基，是一种可溶性、多元酚类化合物，具有抗腹泻、抑菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗纤维化等生物学功能。
露水草提取物为鸭跖草科植物露水草Cyanotis arachnoidsC.B.Clarke提取的产物，主要成分为20-羟基蜕皮甾酮(β-蜕皮激素)，其主要作用为促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂，对人体也有促进蛋白质合成的作用，具有祛风活络、利湿消肿、退虚热、通经、止痛等功效，用于风湿性关节炎、四肢麻木等症状，促进蚕、虾、蟹生产脱皮，降低人体内胆固醇，降低血糖浓度等功效。
本发明研究结果显示，露水草提取物具有明显的治疗肝纤维化的效果，且将露水草提取物复配单宁酸后，抗纤维化功效得到了显著的提高，复配的组合物在对治疗肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化方面整体得到了显著的提升，协同增效。
作为一种优选地可实施方法，所述露水草水提物的制备方法包括如下步骤：
S1.将露水草干燥粉碎，称取露水草粉末50g加入500mL水，回流提取2h。
S2.过滤，滤渣加入500mL水，回流提取2h，过滤，合并两次滤液。
S3.浓缩干燥，即得露水草水提物。
作为一种优选地可实施方法，所述露水草醇提物的制备方法为：
将露水草干燥粉碎，称取50g露水草粉末于500mL浓度为60vol％的乙醇溶液，回流提取1h，过滤，滤液浓缩干燥，即得。
优选地，所述单宁酸和露水草提取物的重量份数为：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份。
更优选地，所述单宁酸和露水草提取物的重量份数为：单宁酸19份、露水草提取物15份。
本发明还提供上述露水草组合物在制备预防和/或治疗器官纤维化药物中的应用。
本发明要求保护的露水草组合物在制备预防和/或治疗器官纤维化的药物时，包括但不限于，使用本发明的露水草组合物的有效量对患者给药，来制备用于预防或治疗纤维化引发的疾病，减轻纤维化引发的疾病症状，或者延缓纤维化引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
基于本发明上述组合物对机体并无毒副作用，也可用于制备保健品或食品用于日常服用，以预防特定人群的器官纤维化。因此，本发明还请求保护上述露水草组合物在制备预防器官纤维化的保健品或食品中的应用。
本发明要求保护的露水草组合物在制备预防器官纤维化的保健品或食品时，适宜于特定人群日常服用，具有调节机体功能，预防器官的纤维化，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害。
本发明要求保护的露水草组合物除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类动物等。另外一些动物的实例包括马、狗和猫等。
优选地，所述器官纤维化包括肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化。
优选地，所述药物为在所述预防和/或治疗器官纤维化的露水草组合物中加入药学上可以接受的辅料，制成不同的剂型。所述剂型可以为口服液、片剂、喷剂等。
本发明还提供了一种包含上述露水草组合物的用于预防和/或治疗纤维化的口服液。
优选地，所述口服液包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、抗氧化剂6～28份、甜味剂6～30份、抑菌剂6～25份、纯化水90～200份。
本发明提供的抗器官纤维化口服液的各个组分配伍合理，其中的单宁酸能够抑制TGF-β诱导的胶原-1和平滑肌α-肌动蛋白(SMA)的表达，起到抗纤维化的作用；露水草主要成分为20-羟基蜕皮甾酮(β-蜕皮激素)，其主要作用为促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂，对人体也有促进蛋白质合成的作用；抗氧化剂能够防止原药氧化，使得其稳定性良好；甜味剂能够改善服用者味觉感受，使得其适应性良好；抑菌剂能够有效防止口服液变质；纯化水作为溶剂起到溶解作用。得到的抗纤维化口服液具有显著的抗肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化的功效，有助于患者的治疗和康复，提高生存质量。
优选地，所述抗氧化剂可以为维生素C、维生素E、亚硫酸钠中的任一种。
优选地，所述甜味剂可以为阿斯巴甜或甜菊糖。
优选地，所述抑菌剂可以为迷迭香、丁香、鼠尾草中的任一种。
作为一种优选地可实施方式，上述口服液的制备方法包括如下步骤：
单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、抗氧化剂6～28份、甜味剂6～30份、抑菌剂6～25份、纯化水90～200份，按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、抗氧化剂、甜味剂、抑菌剂充分溶解于纯化水中，加纯化水至完全溶解，分装，即得。
本发明还提供了一种包含上述露水草组合物的用于预防和/或治疗器官纤维化的片剂。
优选地，所述片剂包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、填充剂9～30份、粘合剂9～28份、润滑剂2～25份。
本发明提供的抗器官纤维化片剂的各个组分配伍合理，单宁酸能够抑制TGF-β诱导的胶原-1和平滑肌α-肌动蛋白(SMA)的表达，起到抗纤维化的作用；露水草主要成分为20-羟基蜕皮甾酮(β-蜕皮激素)，其主要作用为促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂，对人体也有促进蛋白质合成的作用；填充剂能增容、增重，降低物料的成本，起到改善物料性能的作用；粘合剂能够借助其粘性能将两种分离的材料连接在一起，使得其有效调节粘度；润滑剂能够降低摩擦副的摩擦阻力、减缓其磨损，使得其具有良好润滑性能；得到的抗纤维化片剂具有显著的抗肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化的功效，有助于患者的治疗和康复，抑制器官功能的丧失，保护人的健康和生命。
优选地，所述填充剂可以为淀粉、糊精、糖粉中的任一种。
优选地，所述粘合剂可以为阿拉伯胶、甲基纤维素、羟丙基纤维素中的任一种。
优选地，所述润滑剂可以为硬脂酸镁或氢化植物油。
作为一种优选地可实施方式，上述片剂的制备方法包括如下步骤：
S1.按照重量份称取各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、填充剂9～30份、粘合剂9～28份、润滑剂2～25份。
S2.将单宁酸、露水草提取物、填充剂混合均匀。
S3.加入粘合剂制成软材(以用手握之可成团块，手指轻压时又能散裂而不成粉状为度)，用手挤压过筛，所得颗粒应无长条、块状物及细粉。大量生产时通过颗粒机滚筒(或括板)的挤压，使软材通过筛孔，制得颗粒。
S4.采取湿粒干燥法，80℃条件下干燥(小量制备时，可用电热烘箱等干燥；大量生产时可用蒸汽烘房等干燥)。干燥后颗粒往往结团粘连，需进行过筛整粒，最后加入润滑剂，混匀后即可压片。即得。
本发明还提供了一种包含上述露水草组合物的用于预防和/或治疗器官纤维化的喷剂。
优选地，所述喷剂包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、助溶剂6～25份、抗氧剂6～20份、抑菌剂3～21份、纯化水100～180份。
本发明提供的抗器官纤维化外用喷剂的各个组分配伍合理，其中的单宁酸能够抑制TGF-β诱导的胶原-1和平滑肌α-肌动蛋白(SMA)的表达，起到抗纤维化的作用；露水草主要成分为20-羟基蜕皮甾酮(β-蜕皮激素)，其主要作用为促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂，对人体也有促进蛋白质合成的作用；助溶剂与药物形成络合物后可数倍甚至数十倍增加药物的溶解度；抗氧化剂能够防止原药氧化，使得其稳定性良好；抑菌剂能够有效防止喷剂变质；纯化水作为溶剂起到溶解作用；得到的抗纤维化喷剂具有显著的抗皮肤纤维化的功效，有助于患者的治疗和康复，提高生存质量，同时也能作为正常人日常防护和预防纤维化疾病的有效方法。
优选地，所述助溶剂可以为乙酰胺、水杨酸钠、苯甲酸钠中的任一种。
优选地，所述抗氧剂可以为亚硫酸钠、维生素C、维生素E中的任一种。
优选地，所述抑菌剂可以为丁香、迷迭香、鼠尾草中的任一种。
为一种优选地可实施方式，上述喷剂的制备方法包括如下步骤：
S1.按照重量份称取各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、助溶剂6～25份、抗氧剂6～20份、抑菌剂3～21份、纯化水100～180份。
S2.将单宁酸、露水草提取物、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂混合，加纯化水至完全溶解，分装至喷瓶内，即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了露水草提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用，本发明首次研究表明露水草提取物具有明显的治疗肝纤维化的效果，且属于天然植物来源药物，无任何副作用，适合内服外用，在开发抗肝纤维化类的医药产品方面具有很好的应用价值，为肝纤维化疾病的治疗提供一种新型、天然的药物来源。
此外，将露水草提取物复配单宁酸的组合后，其抗肝纤维化功效得到了显著的提升，实现在抗肝纤维化功效方面的协同增效，产生的综合抗肝纤维化能力截然不同，原料配伍精当，无任何副作用，适合内服外用，在开发抗肝纤维化类的医药产品方面具有很好的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1露水草水提物的制备
露水草水提取物的制备，按照如下步骤：
S1.将露水草干燥粉碎，称取露水草粉末50g加入500mL水，回流提取2h。
S2.过滤，滤渣加入500mL水，回流提取2h，过滤，合并两次滤液。
S3. 80℃浓缩干燥，得露水草水提物。
实施例2露水草醇提物的制备
露水草醇提取物的制备，按照如下步骤：
将露水草干燥粉碎，称取露水草粉末50g加入500mL浓度为60vol％的乙醇溶液，回流提取1h，过滤，滤液80℃浓缩干燥，即得露水草醇提物。
实施例3预防和/或治疗纤维化的露水草组合物
本实施提供了一系列预防和/或治疗纤维化的组合物：
组合物1：单宁酸12份、实施例1露水草提取物12份；
组合物2：单宁酸19份、实施例2露水草提取物15份；
组合物3：单宁酸25份、实施例1露水草提取物20份；
组合物4：单宁酸36份、实施例1露水草提取物24份；
组合物5：单宁酸45份、实施例1露水草提取物30份。
对比例1组合物
本对比例提供了一系列组合物：
组合物6：单宁酸3份、实施例1露水草提取物9份；
组合物7：单宁酸4份、实施例2露水草提取物11份；
组合物8：单宁酸12份、实施例1露水草提取物34份。
实验例1组合物1～5的急性毒性试验
(1)实验方法
采取急性毒性最大耐受量法进行试验。设置空白组和组合物1～5(1.1g/mL)共六组，选择检疫合格的SPF级ICR小鼠60只，雄雌各半，按性别体重采用区段随机方法分组，每组10只，给药前禁食12h以上，空白组不给药，组合物1～5组在试验时以0.5mL/10g体重进行一次性灌胃给药。给药当天，尤其在给药后0～4h内密切观察并记录各组动物的中毒表现和特点、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等。然后每天观察2次，即上、下午各1次，连续观察14天。分别于给药前及给药后第7天、第14天，使用电子天平对小鼠体质量进行称量。所有小鼠在试验结束后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死，并予以大体解剖，肉眼观察脏器的位置、大小、色泽、粘连等情况，并检查脏器表面和切面的质地、积液及肿瘤等异常改变。在试验过程中若有非计划死亡的动物(包括濒死动物)，均应进行大体解剖。
(2)实验结果
1、小鼠一般活动状况
给药前和14天观察期间，空白组和组合物1～5六组小鼠自主活动如常，未见异常和死亡现象。
2、小鼠中毒症状及死亡情况
整个试验期间未见小鼠异常及死亡现象。
3、体质量变化情况
分别于给药前、给药后第7天和第14天称重，结果与空白组比较，组合物1～5五组小鼠体重变化无显著性差异，且体质量增长在正常范围内，说明经口灌服组合物1～5对ICR小鼠体质量增长无明显影响，具体见表1。
表1组合物1～5对小鼠体重量的影响
Figure BDA0003302974960000081
4、大体解剖检查结果
两组小鼠各器官表面和切面均未见明显异常情况。
实验例2组合物1～5的长期毒性试验
(1)实验方法
以组合物2为例。将80只大鼠随机分为4组各20只，分别为对照组、组合物2高剂量组(760mg/kg)、中剂量组(380mg/kg)，低剂量组(190mg/kg)。每天给药1次，于给药3个月和停药2周(恢复期)后各组分别处死10只大鼠进行指标检测。组合物1、组合物3、组合物4、组合物5分组同上述方法。后进行如下实验。
每天观察大鼠皮表、黏膜、分泌物和排泄物是否正常，同时记录大鼠的一般表现、中毒表现以及死亡情况。每7d记录一次大鼠的饮水量、采食量和体重。第30天和第45天均对一定数量的大鼠进行采血和剖检，检测血液学和血液生化指标，血液学指标包括：白细胞(WBC)及中性粒细胞(NE)、嗜酸性粒细胞(EO)、嗜碱性粒细胞(BA)、淋巴细胞(LY)、单核细胞(MO)的分类计数，红细胞(RBC)和血红蛋白(hb)等；血液生化指标包括：丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶，AST)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和甘油三酯(TG)等。称取各组大鼠主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠和生殖器官)的重量并计算脏器系数，对照组和高剂量组大鼠进行病理学检查。
(2)实验结果
1、体重变化
试验期间，所有组别大鼠精神状态良好，饮水和食欲正常，大小便正常，毛色柔顺光洁。试验组和空白组体重增长趋势无显著差异。
2、血常规与血液生化检测
在给药3个月后，组合物1～5的高、中、低剂量组SD大鼠血常规和血液生化检测与对照组比较无明显差异。
3、组织病理学变化
第30天和第45天各组脏器系数比较无差异显著性。眼观各组大鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾、胃、小肠、睾丸和卵巢脏器表面未见明显异常；试验组和空白组的各组织切片未见明显病变。
实验例3抗肺纤维化实验
一、细胞实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例1露水草提取物进行抗肺纤维化实验，具体方法为：
(1)细胞培养
采用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素双抗、葡萄糖浓度4.5g/L的高糖DMEM培养基培养肺成纤维细胞，细胞置于37℃含5％CO2孵育箱，2d更换一次细胞培养液。于细胞密度80％～90％时，采用胰酶消化、重悬细胞进行传代。
(2)细胞分组处理
观察细胞生长状态良好后，将细胞消化、重悬，按每孔3000细胞的密度将成纤维细胞接种于黑色96孔板上。细胞接种24h后每孔加入10ng/mL TGF-β1，建立细胞肺纤维化模型。继续培养72h。
给药组：待细胞贴壁后，分别给予单宁酸、露水草提取物、组合物1、组合物2、组合物3、组合物4、组合物5、组合物6、组合物7、组合物8。给药浓度分别设置为低浓度1.56μg/mL、中浓度6.25μg/mL、高浓度25μg/mL，各组给药后将96孔板避光置于细胞孵育箱，继续培养24h。
对照组：与给药组比，区别在于不给药。
空白对照组：与给药组比，区别在于不加TGF-β1也不给药。
为避免系统误差。每组设计6个复孔，每组实验重复3次。
(3)CCK8检测
采用CCK8进行细胞增殖率检测。按照试剂盒说明操作，每孔加入10％浓度的CCK8试剂10μL，2h后，采用酶标仪450nm波长检测细胞OD值。
(4)细胞存活率
按每组检测细胞OD值计算细胞存活率。细胞存活率＝(给药组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100％
2、实验结果
肺成纤维细胞存活率结果如下表2所示。
表2异常增殖肺成纤维细胞存活率(％)
Figure BDA0003302974960000101
从表2可以看出，在抑制异常增殖肺成纤维细胞存活率方面，组合物1～5比组合物6～8、单独使用单宁酸或露水草提取物时，异常增殖肺成纤维细胞存活率低，表明两者通过适当的配比，联合使用时具有协同降低肺成纤维细胞存活率的效果。
二、动物实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例1露水草提取物进行抗肺纤维化实验。
具体方法为：
(1)动物分组：
SPF级Wistar大鼠，按体重随机分为12组，每组30只。分别为假手术组、模型组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组、组合物6组、组合物7组、组合物8组、单宁酸组、露水草提取物组。
(2)模型制备：
实验动物购入后常规饲养，适应环境7d。实验时以10％水合三氯乙醛3mL/kg腹腔注射将动物麻醉，使其仰卧固定于鼠板，颈部剪毛。常规消毒皮肤，无菌操作下做长约0.5-1cm的颈中切口。逐层剥离暴露气管，然后抬高鼠板头端，使其与实验台面成30～35°角。在直视下用1mL注射器刺入气管，尽量接近气管分叉处，保持针头与气道方向一致，快速推注注射用盐酸博来霉素(BLEOCIN)加生理盐水溶液0.2mL(BLEOCIN每支15mg，使用前以生理盐水配制成浓度为5mg/mL，按5mg/kg体重给药)后，立即拔出针头，竖立鼠板，保持大鼠直立体位，左右来回旋转3min，使药液尽可能到达两侧肺部，分布均匀。缝合皮肤，连续3d腹腔注射青霉素溶液，防止伤口感染，待动物自然苏醒后置笼内常规饲养。其中，假手术组大鼠手术操作方法与其它各组相同，只是手术后气管内注入等量生理盐水代替盐酸博来霉素。
(3)给药
各组大鼠自气管内注入盐酸博来霉素建模后第2日起每天灌胃给药1次。均给予190mg/(kg·d)的组合物1～8，以及单独的单宁酸、露水草提取物，连续用药28d。
(4)标本采集
分别于造模后第7天、第14天和第28天给药后1h，每组随机选取10只动物，处死后剖取右侧肺组织，按每克肺组织加9mL生理盐水，制成10％组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清。
(5)检测指标方法
采用分光光度法检测肺组织SOD活力。
2、实验结果
表3肺纤维化动物模型肺组织SOD活性
Figure BDA0003302974960000121
从表3可以看出，本实验结果表明，模型组三批动物肺组织中SOD活性在造模后明显低于假手术组。SOD活性随造模时间延长而降低。说明模型动物肺组织中抗自由基的保护系统功能有所降低，间接促进肺纤维化的形成。组合物1～5动物肺组织中SOD活性与同期模型组比较均明显增高；说明组合物1～5在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中，通过增加肺组织中SOD活性，使肺纤维化进程得到抑制。组合物6～8的效果比单宁酸和露水草提取物的好，但是比组合物1～5的差，表明单宁酸和露水草提取物两者需要通过适当的配比，才能实现协同增强肺纤维化动物模型肺组织SOD活性的效果。
实验例4抗肝纤维化实验
一、细胞实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例1露水草提取物进行抗肝纤维化实验。
具体方法为：
(1)细胞培养
采用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素双抗、葡萄糖浓度4.5g/L的高糖DMEM培养基培养肝成纤维细胞，细胞置于37℃含5％CO2孵育箱，2d更换一次细胞培养液。于细胞密度80％～90％时，采用胰酶消化、重悬细胞进行传代。
(2)细胞分组处理
观察细胞生长状态良好后，将细胞消化、重悬，按每孔3000细胞的密度将成纤维细胞接种于黑色96孔板上。细胞接种24h后每孔加入10ng/mL TGF-β1，建立细胞肝纤维化模型。培养72h后。
给药组：待细胞贴壁后，分别给予单宁酸、露水草提取物、组合物1、组合物2、组合物3、组合物4、组合物5、组合物6、组合物7、组合物8。给药浓度分别设置为低浓度1.56μg/mL、中浓度6.25μg/mL、高浓度25μg/mL，各组给药后将96孔板避光置于细胞孵育箱，继续培养24h。
对照组：与给药组比，区别在于不给药。
空白对照组：与给药组比，区别在于不加TGF-β1也不给药。
为避免系统误差。每组设计6个复孔，每组实验重复3次。
(3)CCK8检测
采用CCK8进行细胞增殖率检测。按照试剂盒说明操作，每孔加入10％浓度的CCK8试剂10μL，2h后，采用酶标仪450nm波长检测细胞OD值。
(4)细胞存活率
按每组检测细胞OD值计算细胞存活率。细胞存活率＝(给药组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100％
2、实验结果
肝成纤维细胞存活率结果如下表4所示。
表4异常增殖肝成纤维细胞存活率(％)
Figure BDA0003302974960000131
Figure BDA0003302974960000141
从表4可以看出，在降低异常增殖肝成纤维细胞存活率方面，组合物1～5比组合物6～7、单独使用单宁酸或露水草提取物的效果都好，异常增殖肝成纤维细胞存活率低，表明二者在适当的配比下联合使用时具有协同降低异常增殖肝成纤维细胞存活率的效果。
二、动物实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例1露水草提取物进行抗肝纤维化实验，具体方法为：
(1)动物分组
SPF级小鼠，按体重随机分为12组，每组30只。分别为假手术组、模型组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组、组合物6组、组合物7组、组合物8组、单宁酸组、露水草提取物组。
(2)造模
采用经典的CCl4诱导法，建立小鼠肝纤维化模型：将CCl4与橄榄油按体积比1∶1配制成油溶液后进行小鼠皮下注射，注射体积为3mL/kg，每周2次(间隔3d)，连续注射6周。空白对照组小鼠同法注射等体积橄榄油。
(3)给药
各组小鼠建模后第2日起每天灌胃给药1次。均给予190mg/(kg·d)的组合物1～8，连续用药28d。
(4)标本采集
分别于造模后第7天、第14天和第28天给药后1h，每组随机选取10只动物，处死后剖取肝组织，按每克肝组织加9mL生理盐水，制成10％组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清。
(5)检测指标方法：采用分光光度法检测肝组织SOD活力。
2、实验结果
表5肝纤维化动物模型肝组织SOD活性
Figure BDA0003302974960000151
从表5可以看出，本实验结果表明，模型组三批动物肝组织中SOD活性在造模后明显低于假手术组。SOD活性随造模时间延长而降低。说明模型动物肝组织中抗自由基的保护系统功能有所降低，间接促进肝纤维化的形成。组合物1～5动物肝组织中SOD活性与同期模型组比较均明显增高，其效果显著好于给药组合物6～8以及单独给药单宁酸或露水草提取物，说明组合物1～5在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中，通过增加肝组织中SOD活性，使肝纤维化进程得到抑制。
实验例5抗皮肤纤维化实验
一、细胞实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例2露水草提取物进行抗皮肤纤维化实验，具体方法为：
(1)细胞培养
采用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素双抗、葡萄糖浓度4.5g/L的高糖DMEM培养基培养皮肤成纤维细胞，细胞置于37℃含5％CO2孵育箱，2d更换一次细胞培养液。于细胞密度80％～90％时，采用胰酶消化、重悬细胞进行传代。
(2)细胞分组处理
观察细胞生长状态良好后，将细胞消化、重悬，按每孔3 000细胞的密度将皮肤成纤维细胞接种于黑色96孔板上。细胞接种24h后每孔加入10ng/mL TGF-β1，建立细胞皮肤纤维化模型，继续培养24h。
给药组：待细胞贴壁后，分别给予单宁酸、露水草提取物、组合物1、组合物2、组合物3、组合物4、组合物5、组合物6、组合物7、组合物8。给药浓度分别设置为低浓度1.56μg/mL、中浓度6.25μg/mL、高浓度25μg/mL，各组给药后将96孔板避光置于细胞孵育箱，继续培养24h。
对照组：与给药组比，区别在于不给药。
空白对照组：与给药组比，区别在于不加TGF-β1也不给药。
为避免系统误差。每组设计6个复孔，每组实验重复3次。
(3)CCK8检测
按照试剂盒说明操作，每孔加入10％浓度的CCK8试剂10μL，2h后，采用酶标仪450nm波长检测细胞OD值。
(4)细胞存活率
按每组检测细胞OD值计算细胞存活率。细胞存活率＝(给药组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100％
2、实验结果
皮肤成纤维细胞存活率结果如下表6所示。
表6异常增殖皮肤成纤维细胞存活率(％)
Figure BDA0003302974960000161
Figure BDA0003302974960000171
从表6可以看出，在降低异常增殖皮肤成纤维细胞存活率方面，组合物1～5比组合物6～8、单独使用单宁酸或露水草提取物的效果好，异常增殖皮肤成纤维细胞存活率低，表明单宁酸和露水草提取物在合适的配比下联合使用时，具有协同降低异常增殖皮肤成纤维细胞存活率的效果。
二、动物实验
1、实验方法
本实验为将实施例3和对比例1制备得到的组合物1～8，单宁酸、实施例2露水草提取物进行抗皮肤纤维化实验。
具体方法为：
(1)动物分组
SPF级6周龄雄性BALB/c小鼠，按体重随机分为12组，每组30只。分别为假手术组、单纯磷酸盐缓冲液(PBS)组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组、组合物6组、组合物7组、组合物8组、单宁酸组、露水草提取物组。
(2)模型制备
空白对照组小鼠不予任何处理；单纯PBS组和组合物组小鼠背部皮肤分别皮下注射100μL PBS、博来霉素(1mg/mL)。
(3)给药
各组小鼠用博来霉素建模后第2日起每天皮肤给药2次。均给予190mg/(kg·d)的组合物1～8，连续用药28d。
(4)标本采集
分别于造模后第7天、第14天和第28天给药后1h，每组随机选取10只动物，肉眼观察小鼠背部皮肤变化，观察结束后处死小鼠，取背部皮肤组织，按每克皮肤组织加9mL生理盐水，制成10％组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清。
(5)检测指标方法：采用分光光度法检测皮肤组织SOD活力。
2、实验结果
表7皮肤纤维化动物模型皮肤组织SOD活性
Figure BDA0003302974960000181
从表7可以看出，本实验结果表明，模型组三批动物皮肤组织中SOD活性在造模后明显低于假手术组。SOD活性随造模时间延长而降低。说明模型动物皮肤组织中抗自由基的保护系统功能有所降低，间接促进皮肤纤维化的形成。给药组合物1～5的动物皮肤组织中SOD活性与同期模型组比较均明显增高；说明组合物1～5在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中，通过增加皮肤组织中SOD活性，使皮肤纤维化进程得到抑制。组合物6～8的效果比单宁酸和露水草提取物的好，但是比组合物1～5的差，表明单宁酸和露水草提取物两者需要通过适当的配比，才能实现协同增强皮肤纤维化动物模型皮肤组织SOD活性的效果。
实施例4预防和/或治疗纤维化的口服液1
1、本实施例提供了一种口服液，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、维生素C12份、阿斯巴甜9份、迷迭香10份、纯化水200份。
2、制备方法
(1)将露水草干燥粉碎，称取露水草粉末50g加入500mL水，回流提取2h；过滤，滤渣加入500mL水，回流提取2h，过滤，合并两次滤液；80摄氏度浓缩干燥，得露水草水提物。
(2)按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、维生素C、阿斯巴甜、迷迭香，混合加纯化水至完全溶解，分装，即得口服液。
实施例5预防和/或治疗纤维化的口服液2
1、本实施例提供了一种口服液，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、维生素E18份、甜菊糖8份、丁香11份、纯化水150份。
2、露水草水提物制备方法同实施例4；
按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、维生素E、甜菊糖、丁香，混合加纯化水至完全溶解，分装，即得口服液。
实施例6预防和/或治疗纤维化的口服液3
1、本实施例提供了一种口服液，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、亚硫酸钠15份、阿斯巴甜6份、鼠尾草12份、纯化水90份。
2、露水草水提物制备方法同实施例4；
按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、亚硫酸钠、阿斯巴甜、鼠尾草，混合加纯化水至完全溶解，分装，即得口服液。
实施例7预防和/或治疗纤维化的片剂1
1、本实施例提供了一种片剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、淀粉21份、阿拉伯胶13份、硬脂酸镁8份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例1。
(2)将单宁酸、露水草提取物、淀粉混合均匀。
(3)加入阿拉伯胶制成软材(以用手握之可成团块，手指轻压时又能散裂而不成粉状为度)，用手挤压过筛，所得颗粒应无长条、块状物及细粉。大量生产时通过颗粒机滚筒(或括板)的挤压，使软材通过筛孔，制得颗粒。
(4)采取湿粒干燥法，80℃条件下干燥(小量制备时，可用电热烘箱等干燥；大量生产时可用蒸汽烘房等干燥)。干燥后颗粒往往结团粘连，需进行过筛整粒，最后加入硬脂酸镁，混匀后即可压片。即得。
实施例8预防和/或治疗纤维化的片剂2
1、本实施例提供了一种片剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、糊精22份、甲基纤维素15份、硬脂酸镁7份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例1。
(2)将单宁酸、露水草提取物、糊精混合均匀。
(3)加入甲基纤维素制成软材(以用手握之可成团块，手指轻压时又能散裂而不成粉状为度)，用手挤压过筛，所得颗粒应无长条、块状物及细粉。大量生产时通过颗粒机滚筒(或括板)的挤压，使软材通过筛孔，制得颗粒。
(4)采取湿粒干燥法，80℃条件下干燥(小量制备时，可用电热烘箱等干燥；大量生产时可用蒸汽烘房等干燥)。干燥后颗粒往往结团粘连，需进行过筛整粒，最后加入硬脂酸镁，混匀后即可压片。即得。
实施例9预防和/或治疗纤维化的片剂3
1、本实施例提供了一种片剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、糖粉23份、羟丙基纤维素16份、氢化植物油10份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例1。
(2)将单宁酸、露水草提取物、糖粉混合均匀。
(3)加入羟丙基纤维素制成软材(以用手握之可成团块，手指轻压时又能散裂而不成粉状为度)，用手挤压过筛，所得颗粒应无长条、块状物及细粉。大量生产时通过颗粒机滚筒(或括板)的挤压，使软材通过筛孔，制得颗粒。
(4)采取湿粒干燥法，80℃条件下干燥(小量制备时，可用电热烘箱等干燥；大量生产时可用蒸汽烘房等干燥)。干燥后颗粒往往结团粘连，需进行过筛整粒，最后加入氢化植物油，混匀后即可压片。即得。
实施例10预防和/或治疗纤维化的喷剂1
1、本实施例提供了一种喷剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、乙酰胺13份，亚硫酸钠13份、丁香11份、纯化水180份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例2；
(2)按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、乙酰胺、亚硫酸钠、丁香混合，加纯化水至完全溶解，分装至喷瓶内，即得。
实施例11预防和/或治疗纤维化的喷剂2
1、本实施例提供了一种喷剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、水杨酸钠15份，维生素C 21份、迷迭香12份、纯化水150份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例2；
(2)按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、水杨酸钠，维生素C、迷迭香混合，加纯化水至完全溶解，分装至喷瓶内，即得。
实施例12预防和/或治疗纤维化的喷剂3
1、本实施例提供了一种喷剂，包括以下重量份的各组分：单宁酸19份、露水草提取物15份、苯甲酸钠8份，维生素E14份、鼠尾草17份、纯化水100份。
2、制备方法
(1)露水草提取物同实施例2；
(2)按照上述重量份将单宁酸、露水草提取物、苯甲酸钠，维生素E份、鼠尾草混合，加纯化水至完全溶解，分装至喷瓶内，即得。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.露水草提取物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肝纤维化为CCl4诱导的肝纤维化。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述露水草提取物为露水草水提物和/或露水草醇提物。
4.一种预防和/或治疗肝纤维化的口服液，其特征在于，含有权利要求1所述露水草提取物。
5.根据权利要求4所述口服液，其特征在于，包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、抗氧化剂6～28份、甜味剂6～30份、抑菌剂6～25份、纯化水90～200份。
6.一种预防和/或治疗肝纤维化的片剂，其特征在于，含有权利要求1所述露水草提取物。
7.根据权利要求6所述片剂，其特征在于，包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、填充剂9～30份、粘合剂9～28份、润滑剂2～25份。
8.一种预防和/或治疗肝纤维化的喷剂，其特征在于，含有权利要求1所述露水草提取物。
9.根据权利要求8所述喷剂，其特征在于，包括以下重量份的各组分：单宁酸12～45份、露水草提取物12～30份、助溶剂6～25份、抗氧剂6～20份、抑菌剂3～21份、纯化水100～180份。
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