CN113876696A - 可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用,属于鼻窦炎治疗领域,其中,可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法包括以下步骤:步骤一,将卵磷脂、胆固醇以及克拉霉素按4:1:0.2的重量比用超声波溶解于甲醇中,得到第一溶液;步骤二,将所述第一溶液溶液进行旋转蒸发,得到蜂巢状的薄膜;步骤三,将所述薄膜与预加热的PBS缓冲液进行水化和超声,得到克拉霉素脂质体;步骤四,将四臂巯基聚乙二醇粉溶于所述克拉霉素脂质体,并加入AgNO3溶液进行混合,得到透明的、可局部注射的克拉霉素水凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及鼻窦炎治疗领域,具体涉及一种可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用。
背景技术
慢性鼻鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)和急性鼻鼻窦炎(Acuterhinosinusitis,ARS)发病率高,每年美国发病人数达到了3100万,其中因CRS进行手术治疗的有5万人[1]。我国据2013年原卫生部发布的《国民健康调查报告》显示,当年各类型急慢性鼻鼻窦炎患者达到了3.5亿左右。有进一步专科的调查认为中国人群CRS总体患病率为8%[2],由此造成的患者生活质量下降和社会危害十分巨大。
目前CRS的治疗方法主要有抗菌、激素药物治疗和手术治疗等,但仍有30%以上的患者效果不理想[3]。克拉霉素(Clarithromycin,CAM)是治疗CRS推荐药物,欧洲CRS和鼻息肉立场文件EPOS2012[3]、中华医学会《中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南(2018)》均推荐CAM等大环内酯类药物(Macrolides antibiotics,MA)治疗不伴有鼻息肉型慢性鼻窦炎(CRSsNP),其有效率达到62.0-92.1%[4]。
CAM作为第二代14环MA,具有抗菌和抗菌外双重作用[5]。CAM的抗菌活性有两种机制:一是不可逆地结合到细菌核糖体50S亚基,阻断转肽位移;二是使tRNA提前从核糖体上分离。但CAM的抗菌外作用比较复杂,包含抗菌作用外的抗炎和免疫调节作用。CAM抑制炎性细胞及其炎性因子从而发挥抗炎作用;调节离子转运和MUC5AC、MAC5B黏蛋白黏液分泌调节气道分泌;抑制生物膜形成、抑制细菌群体感应;抗病毒效应;免疫调节效应;激素节省效应等等[6]。CAM的抗菌外作用中的抗炎作用最为突出,其是CAM有别于其他种类抗生素在治疗CRS中脱颖而出的根本。但CAM的抗炎作用的分子机制并不明确,对不同类组织中影响的炎性因子似乎还有所不同,相关信号通路也有不同报道(见下),值得进一步深入研究,如2017年中华内科杂志刊登的《大环内酯类药物的抗菌外作用与临床应用专家共识》,也认为目前CAM的抗炎作用的分子机制仍不清楚[7]。
通过对以往文献的回顾,有一些研究发现CAM发挥抗炎作用的效应细胞可能在吞噬细胞、中性粒细胞上,因为它们及其产物如细胞因子、氧化剂和酶等是炎症性疾病的主要因素,CAM对支气管扩张、弥漫性细支气管炎(Diffuse Panbronchiolitis,DPB)和慢性支气管炎等疾病有良好的反应。Radzikowska E在in vivo研究发现CAM可以降低DPB患者血清内IL-6、IL-8、TGF-β1水平[8];Suzaki H证实CAM下调外周血吞噬细胞IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的表达[9];Harada T发现CAM可以减少中性粒细胞向肺内的浸润来防止流感期间继发性细菌性肺炎(Secondarybacterialpneumonia,SBP)损伤[10]。Amado-Rodriguez L发现克拉霉素可减少中性粒细胞进入肺泡腔从而减轻呼吸机所致的肺损伤等等[11]。随着研究的深入,CAM对上皮细胞的抗炎作用也逐渐被认识起来。WallworkB研究发现CAM可以影响CRS黏膜的NF-κB和TGF-β[12],ex vivo实验中发现CAM下调鼻粘膜组织IL-5、IL-8、GM-CSF的表达[13],检测CAM干预过的鼻窦黏膜组织中NF-κB的p65亚基水平下降[14],Hirao S等发现CAM可以下调呼吸道上皮IL-1、IL-6、TNF-α的表达[15];在in vitro实验中,Shinkai M提出在呼吸道上皮细胞中,CAM可能通过抑制有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK),进而调控基因表达进程[16];CAM可以通过调节MAPK磷酸激酶1(MKP-1)来下调p38达到减少黏蛋白MUC5AC的表达[17],而MKP-1是重要的促炎因子[18];Tsugawa K研究在肾系膜细胞中,CAM对P38产生下调作用,再下调IL-8的表达[19]。
目前对CAM在人鼻窦黏膜及其上皮细胞(Human nasal epithelial cells,HNEpC)发挥抗炎作用的研究鲜见,而鼻窦黏膜包括HNEpC是ARS、CRS这类鼻窦局限性病变重要的直接影响目标,对其展开相应研究十分必要。“One airway,one disease”[3],鼻腔鼻窦黏膜与上呼吸黏膜有均属于假复层纤毛柱状上皮的同源性,CRS和ARS与呼吸道其它疾病是紧密相连的[20],因此,我们期望借鉴前述呼吸系统和鼻窦研究的成果,对CAM是否在鼻窦黏膜及HNEpC中发挥抗炎作用及如何发挥作用的机制展开研究。
与研究口服药物全身应用对局部的影响不同,对鼻窦黏膜展开研究最直接的方法是采取窦腔注射的方式,在鼻窦局部使用药物。但由于传统的药液注射存在液体流失、一次性释放、作用时间短、需要反复穿刺注射等缺点,不符合实际的临床需求。
参考文献
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发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的,目的在于提供可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用。
本发明提供了一种可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,具有这样的特征,包括以下步骤:步骤一,将卵磷脂、胆固醇以及克拉霉素按4:1:0.2的重量比用超声波溶解于甲醇中,得到第一溶液;步骤二,将第一溶液溶液进行旋转蒸发,得到蜂巢状的薄膜;步骤三,将薄膜与预加热的PBS缓冲液进行水化和超声,得到克拉霉素脂质体;步骤四,将四臂巯基聚乙二醇粉溶于克拉霉素脂质体,并加入AgNO3溶液进行混合,得到透明的、可局部注射的克拉霉素水凝胶。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,步骤二中,旋转蒸发的转速为50r/min,温度为40℃。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,步骤三中,薄膜与PBS缓冲液的质量体积比为100mg:(20-500)ml,水化的转速为50r/min,温度为40℃,时间为2h,超声的频率为25KHZ-100KHZ,时间为1min-20min。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,四臂巯基聚乙二醇粉的纯度为96%,分子量为10kDa,四臂巯基聚乙二醇粉与克拉霉素脂质体的质量体积比为1mg:10μl。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,AgNO3溶液的浓度为0.05M,AgNO3溶液和克拉霉素脂质体的体积比为1:1。
本发明还提供了一种可局部注射的克拉霉素水凝胶,其特征在于:采用上述可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,鼻窦炎为急性鼻窦炎或慢性鼻窦炎。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,鼻窦炎为细菌性鼻鼻窦炎。
在本发明提供的可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,应用为将克拉霉素水凝胶注射到鼻窦区域,克拉霉素水凝胶发挥抗菌和抗炎作用,克拉霉素水凝胶所抗的细菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌ATCC6303以及流感嗜血杆菌。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用,因为该制备方法先将卵磷脂、胆固醇以及克拉霉素溶解于甲醇中并进行旋蒸得到薄膜,然后将该薄膜与预加热的PBS缓冲液进行水化和超声得到克拉霉素脂质体,最后将四臂巯基聚乙二醇粉溶于克拉霉素脂质体并加入AgNO3溶液,利用巯基与金属银离子高亲和力和可逆性结合的性质,从而得到的透明的、可局部注射的克拉霉素水凝胶。该克拉霉素水凝胶生物相容性好,可顺利携带药物、可注射、可在窦腔驻留、自身可以缓慢降解且注射后形成立体形态,可以充分接触窦腔各个壁达到药物均匀、缓释效果,适合临床鼻窦炎尤其是急性细菌性鼻鼻窦炎的治疗,并有助于后续对CAM是否在鼻窦黏膜及HNEpC中发挥抗炎作用及如何发挥作用的机制展开研究。
附图说明
图1是本发明的实施例3中水凝胶的形态学特性检测结果照片,其中,图1(A)和图1(C)分别表示CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel,且图4中的第一列图为各样品的实物照片,第二列为和第三列分别为不同放大倍数下的SEM图;
图2是本发明的实施例4中CAM-Lips@Hydrogel的注射器针头挤出照片;
图3是本发明的实施例4中水凝胶打孔后随时间变化的照片;
图4是本发明的实施例4中相邻水凝胶随时间变化的照片;
图5是本发明的实施例4中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的流变力学分析结果图,其中,图5(a)为CAM-Lips@Hydroge,图5(b)为Pure Hydrogel;
图6是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的溶胀结果图,其中,
图6(a)为CAM-Lips@Hydroge,图6(b)为Pure Hydrogel;
图7是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的体外降解结果图,其中,图5(a)为CAM-Lips@Hydroge,图5(b)为Pure Hydrogel;
图8是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel的HPLC缓释分析结果图;
图9是本发明的实施例6中将CAM-Lips@Hydrogel注射到兔子的上颌窦腔后的观察结果图;
图10是本发明的实施例6中3组兔子的鼻窦给药前后的CT影像;
图11是本发明的实施例7中4组兔子上颌窦黏膜表面的分泌物中细菌鉴定结果图;
图12是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后的抑菌平板实验结果图;
图13是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后的药敏试剂盒检测结果图,其中,图13F为CAM-Lips@Hydrogel治疗前,图13G为CAM-Lips@Hydrogel治疗后;
图14是本发明的实施例6中药敏试验CAM折点标准;
图15是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后检出的肺炎链球菌的药敏试验折点,其中,图15A为CAM-Lips@Hydrogel治疗前,图15B为CAM-Lips@Hydrogel治疗后;
图16是本发明的实施例6中各组兔子上颌窦的形态图及上颌窦黏膜HE染色图,其中,图16A-图16D分别为Ctrl组、Sham组、Gel组、CAM组,图16F为各组兔子黏膜下白细胞计数比较图,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001;
图17是本发明的实施例6中各组兔子的上颌窦黏膜IHC结果,其中,图17A是IHC图,
图17B是IHC评分比较图,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001;
图18是本发明的实施例6中各组兔子的上颌窦黏膜多项指标检测结果图,图18A为Real-time PCR检测,图18B为Western Blot检测,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,以下实施例结合附图对本发明可局部注射的克拉霉素水凝胶、其制备方法及应用作具体阐述。
<实施例1>
实施例1提供了一种可局部注射的克拉霉素水凝胶及其制备方法。
可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法包括以下步骤:
步骤一,将卵磷脂、胆固醇以及克拉霉素(CAM)按4:1:0.2的重量比用超声波溶解于甲醇中,得到第一溶液。
步骤二,将第一溶液溶液转至旋转蒸发器中,在转速为50r/min、温度为40℃的条件下进行旋转蒸发,于容器底部得到蜂巢状的薄膜。
步骤三,将上述薄膜与预加热的1×PBS缓冲液进行混合,然后在转速为50r/min、温度为40℃的条件下水化2h,然后进行超声,得到克拉霉素脂质体,记作CAM-Lips。其中,薄膜与PBS缓冲液按照质量体积比为100mg:100ml的比例混合,超声的频率为70KHZ,时间为10min。
步骤四,将四臂巯基聚乙二醇(4-ARM-PEG)粉溶于CAM-Lips,并加入0.05M的AgNO3溶液进行混合,得到透明的、可局部注射的克拉霉素水凝胶,记作CAM-Lips@Hydrogel。其中,4-ARM-PEG粉的纯度为96%,分子量为10kDa,4-ARM-PEG粉与CAM-Lips的质量体积比为1mg:10μl。CAM-Lips与AgNO3溶液的体积比为1:1。
<实施例2>
实施例2提供了一种作为对照使用的可局部注射的水凝胶,其制备方法如下:
将4-ARM-PEG粉溶于去离子水中,并加入0.05M的AgNO3溶液进行混合,得到透明的、可注射的水凝胶,记作Pure Hydrogel。其中,4-ARM-PEG粉的纯度为96%,分子量为10kDa,4-ARM-PEG粉与去离子水的质量体积比为1mg:10μl。去离子水与AgNO3溶液的体积比为1:1。
<实施例3>
实施例3为对实施例1和实施例2所制备得到的水凝胶的形态学特性进行检测。
将实施例1至实施例3所制备得到的CAM-Lips@Hydrogel、CAM+BUD-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel进行冻干处理,然后利用导电胶固定在铜台上,并喷涂一层薄薄的金,再利用扫描电镜(SEM)观察水凝胶的物理形貌特征。
图1是本发明的实施例3中水凝胶的形态学特性检测结果照片,其中,图1(A)和图1(C)分别表示CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel,且图4中的第一列图为各样品的实物照片,第二列为和第三列分别为不同放大倍数下的SEM图。
如图1所示,通过SEM观察水凝胶的孔结构,发现CAM-Lips@Hydrogel的表面可以清晰地观察到载药脂质体(图1(A)中箭头所指位置处),说明我们的水凝胶系统能够有效地载药。
<实施例4>
实施例4为对实施例1和实施例2所制备得到的水凝胶的可注射性和流变学特性进行检测。
一、可注射性检测
图2是本发明的实施例4中CAM-Lips@Hydrogel的注射器针头挤出照片。
如图2所示,l注射器针头的挤出实验结果表明,CAM-Lips@Hydrogel可顺利经过Φ0.45mm的注射针头挤出,挤出后CAM-Lips@Hydrogel呈现出立体胶状。
二、流变学特性
1、在水凝胶上打了一个Φ3mm的孔,观察随着时间变化孔洞的变化情况。同时,制备四种不同颜色的水凝胶,它们相邻在一起,观察随着时间变化水凝胶的变化情况。
图3是本发明的实施例4中水凝胶打孔后随时间变化的照片;图4是本发明的实施例4中相邻水凝胶随时间变化的照片。
如图3和图4所示,180s后,水凝胶中的孔洞消失,四个水凝胶形成一个统一的水凝胶,没有明显的界面。
2、对水凝胶进行应力-应变的振荡测量,以确定破坏水凝胶胶络使其转变到溶液状态所需的临界应变值。
图5是本发明的实施例4中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的流变力学分析结果图,其中,图5(a)为CAM-Lips@Hydroge,图5(b)为Pure Hydrogel。
如图5所示,当应力小于1%时,这两种水凝胶保持凝胶状态,并且储能模量(G‘)大于损耗模量(G“)。CAM-Lips@Hydrogel(G’≈2200Pa)的储能模量明显大于和Pure Hydrogel(G‘≈1500Pa)。这表明药物的加入提高了水凝胶的交联密度。随着剪应力的增加,水凝胶的储能模量逐渐减小,当剪应力达到500%时,水凝胶呈现流动状态。
<实施例5>
实施例5为对实施例1和实施例2所制备得到的水凝胶的溶胀性能、降解性能以及药物缓释性能进行检测。
一、溶胀测试
首先移取200μl的水凝胶预溶液在PTFE的模具中成胶待水凝胶完全成胶后,称量水凝胶的质量为W0,将三组水凝胶样品,每组四个重复样,浸泡在2ml去离子水中,37℃孵育24h。每个时间点的质量记为Wt,水凝胶的溶胀率Swelling ratio=(Wt-W0)/W0×100%。
图6是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的溶胀结果图,其中,图6(a)为CAM-Lips@Hydroge,图6(b)为Pure Hydrogel。
如图6所示,CAM-Lips@Hydrogel溶胀率分别为111.21±3.74%。因此,我们的CAM-Lips@Hydrogel水凝胶具有较低的膨胀率,这有利于注射后的空洞的可塑性填充。此外,它也不会导致过度肿胀,从而对粘膜造成过大的压力。
二、体外降解试验
水凝胶制作完成后,将初始水凝胶样品冻干质量记为Wa,随后将水凝胶充分溶胀24h后,继续在37℃去离子水中,温和摇晃孵育不同的时间,在不同时间点水凝胶的冻干质量记为Wb,水凝胶体外降解速率可以根据下面的公式计算:Degradation ratio=(Wa-Wb)/Wa×100%。
图7是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel以及Pure Hydrogel的体外降解结果图,其中,图5(a)为CAM-Lips@Hydroge,图5(b)为Pure Hydrogel。
如图7所示,Pure Hydrogel在第7天完全降解,而CAM-Lips@Hydrogel在第7天的初始质量为24.19±3.83%。
三、药物缓释试验
将200μl的水凝胶浸泡在1ml的pH=7.4的PBS缓冲液中,120r/min,37℃的恒温摇床孵育。在间隔不同的时间点,我们移取500μl的释放溶液,并补加500μl的新鲜PBS。利用高效液相色谱(HPLC)对水凝胶中释放出的样品进行定量分析。
图8是本发明的实施例5中CAM-Lips@Hydrogel的HPLC缓释分析结果图。
如图8所示,在最初的24h内,CAM-Lips@Hydrogel出现了明显的突释性释药效应。CAM-Lips@Hydrogel释药7d后的释放率为87.73±2.87%。
<实施例6>
实施例6为实施例1和实施例2所制备得到的水凝胶的体内治疗试验。
本实施例使用23只新西兰雄兔,体重2.0-2.5公斤,平均体重2.38公斤,购自海军军医大学动物实验中心。动物实验遵循国际伦理指南和国家卫健委实验动物管理和使用指南。
兔随机分组,其中3只为正常对照组(Ctrl组,6侧鼻窦);6只为假手术组(Sham组,12侧鼻窦);6只为Pure Hydrogel组(Gel组,12侧鼻窦);6只为CAM-Lips@Hydrogel组(CAM组,12侧鼻窦);还有2只用于做CAM-Lips@Hydrogel上颌窦体内降解试验。
一、急性细菌性鼻窦炎(ABRS)兔模型制作。
Sham组,Gel组,CAM组的全部18只兔子用于制作ABRS模型。制作过程如下:
步骤1、兔子鼻部用电动剃刀去毛备皮。在封闭式气体麻醉箱中采用异氟烷气体麻醉,手术时间控制在15分钟内,4%异氟烷8L/min流量诱导麻醉5分钟,然后维持2%浓度4L/min流量。
步骤2、75%酒精消毒兔鼻背部皮肤,1%利多卡因(含少量肾上腺素)局部浸润注射。沿鼻背中线纵行切开皮肤,向两侧分离皮下组织至暴露上颌窦前壁和侧壁。
步骤3、先行右侧手术,沿上颌窦前壁和侧壁交界处切开5mm长切口,即可进入上颌窦腔,用少量可降解止血棉堵住上颌窦自然口,然后向上颌窦腔内注射0.2ml 1MCF浓度的肺炎链球菌(肺炎链球菌标准株,S.pneumoniae,ATCC6303)。
步骤4、用同样的方法行左侧上颌窦手术,然后关闭切口,缝合皮肤。2周后,ABRS兔模型就成功建立了。
二、兔上颌窦水凝胶体内降解试验
2只兔子采用上述同样的麻醉和手术方式,进入上颌窦腔,用少量可降解止血棉堵住上颌窦自然口,然后向上颌窦腔内注射1ml的CAM-Lips@Hydrogel,关闭切口。其中的1只兔子24小时后用手术电钻上颌窦前壁钻孔,采用STORZ 0°电子纤维耳镜进行观察;另1只兔子在2周后用同样的方法观察上颌窦腔。
图9是本发明的实施例6中将CAM-Lips@Hydrogel注射到兔子的上颌窦腔后的观察结果图。
如图9所示,0°电子纤维耳镜(德国STORZ)显示,CAM-Lips@Hydrogel在上颌窦腔内24h后保持三维胶体半固体形态,与上颌窦各内壁完全接触(图9B)。2周后,CAM-Lips@Hydrogel大部分降解,仅有少量残留在上颌窦壁粘膜表面(图9C),这与水凝胶体外降解试验结果一致,表明该水凝胶的降解适合于ABRS的治疗。
三、局部给药治疗
在ABRS兔模型建模手术2周后,将Sham组、Gel组以及CAM组的24只兔子用同样的麻醉方式麻醉,进行局部给药治疗。同样手术方式沿原上颌窦前、侧壁交界处切口进入上颌窦腔,此时可见上颌窦内充满脓性分泌物,清除脓性分泌物并用生理盐水冲洗上颌窦腔。
Sham组不做后续处理;Gel组向腔内注射1ml Pure Hydrogel;CAM组向腔内注射1ml CAM-Lips@Hydrogel。
1、全身不良反应的观察
对局部给药治疗后的各组兔子每天观察全身不良反应,包括是否出现精神倦怠、走路不协调、瘙痒抓背、食量减少、腹泻、呕吐。
我们持续观察接受局部给药治疗后的各组兔子,这些兔子在治疗后2周内均未出现精神倦怠、走路不协调、瘙痒抓背、腹泻、呕吐等不良反应症状,这证实了局部给药治疗不会产生全身用药的副作用。
2、CT检查
Sham组、Gel组以及CAM组的18只兔子分别在局部给药治疗前和治疗2周后行320排薄层CT鼻窦平扫检查。CT机型号:ToshibaAquilion ONE 320slice CT,1mm薄层扫描,3D重建采用Vitrea2影像处理工作站。
图10是本发明的实施例6中3组兔子的鼻窦给药前后的CT影像。
如图10所示,经过3D重建后,取水平位CT影像进行观察,窗宽(WW):95-100,窗位(WL):490-500。比较各组各个体自身局部给药治疗前后的图像,可以清楚地看到,在局部给药治疗后,Sham组(图10D)和Gel组(图10E)的兔子各组鼻窦包括上颌窦内的密度增高影无明显改善,CAM组(图10F)在局部给药治疗后兔子的鼻窦包括上颌窦内的密度增高影明显减轻或消散。该对比证明局部给药治疗后鼻窦内的感染和炎症得到了有效的控制。
3、细菌检测和药敏试验
第一次取样是在局部给药治疗时,对Sham组、Gel组以及CAM组取样,在生理盐水冲洗上颌窦腔后,用无菌棉拭子刮取上颌窦黏膜表面的分泌物送检。第二次取样是在局部给药2周后,对所有4组兔子取样,用空气栓塞法无痛处死所有4组兔子,实施颈动脉放血,用生理盐水冲洗上颌窦腔后,用无菌棉拭子刮取上颌窦黏膜表面的分泌物送检。
3.1、细菌鉴定
使用德国Bruker MALDI-TOF细菌鉴定质谱仪进行,具体步骤参照说明书。
图11是本发明的实施例7中4组兔子上颌窦黏膜表面的分泌物中细菌鉴定结果图。
如图11所示,Ctrl组未检出肺炎链球菌(S.pneumoniae)。局部给药治疗前的Ctrl组、Gel组以及CAM组,均检出肺炎链球菌,检出率100%(每组n=12)。局部给药治疗2周后,Sham组和Gel组检出率100%(每组n=12),CAM组25%(n=12)。CAM组组与Sham组和Gel组相比,肺炎链球菌检出率明显下降(P<0.05),提示载药材料能有效地清除致病菌。分析CAM组有少部分仍能检出肺炎链球菌是由于受相邻鼻窦譬如筛窦感染的影响,细菌可以从之前受感染影响的相邻的其他鼻窦回输上颌窦,而这部分病例虽然可以检出肺炎链球菌,但随着主要病灶上颌窦黏膜炎症消退、窦口重新开放、局部微环境的改善,病变也逐步好转。
此外,如图11所示,Ctrl组多杀巴斯德菌(P.multocida)检出率50%(n=6),阴沟肠杆菌(E.cloacae)未检出。其他三组在局部给药治疗前多杀巴斯德菌检出为Sham组33.33%(n=12),Gel组33.33%(n=12),CAM组33.33%(n=12);阴沟肠杆菌检出为Sham组16.67%(n=12),Gel组0%(n=12),CAM组8.33%(n=12)。局部给药治疗后多杀巴斯德菌检出为Sham组75%(n=12),Gel组58.33%(n=12),CAM组33.33%(n=12);阴沟肠杆菌检出为Sham组41.67%(n=12),Gel组16.67%(n=12),CAM组8.33%(n=12)。多杀巴斯德菌为兔呼吸道系统常见定值菌,一般不存在于人体[2][3],阴沟肠杆菌是一种条件致病菌,它在宿主机体机能下降时致病[4],上述这两种细菌不是人ABRS的主要致病菌,它们在兔模型中被检出与兔自身特点有关,它们对大多数抗生素包括CAM均不敏感[5]。这两种细菌不影响兔ABRS的疗效。
3.2、平板抑菌圈实验
对CAM组用治疗前后检测出的肺炎链球菌0.5MCF菌液均匀涂布5%羊血MH平板,然后加入200μl的CAM-Lips@Hydrogel,37℃孵育24小时,观察抑菌圈并测量直径。
图12是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后的抑菌平板实验结果图。
如图12所示,CAM-Lips@Hydrogel对治疗前检测出的肺炎链球菌抑菌环直径为31.1±3.3mm(图12B),对治疗后检测出的肺炎链球菌抑菌环直径为32.2±3.4mm(图12C)。
3.3、药敏试验
使用法国bioMérieuxATB Strep CLSI药敏试剂盒对检测出的肺炎链球菌进行药敏试验,具体步骤参照试剂盒的说明书。
图13是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后的药敏试剂盒检测结果图,其中,图13F为CAM-Lips@Hydrogel治疗前,图13G为CAM-Lips@Hydrogel治疗后。
如图13所示,CAM组治疗前、后的肺炎链球菌的平均MIC均小于0.25。
图14是本发明的实施例6中药敏试验CAM折点标准;图15是本发明的实施例6中CAM-Lips@Hydrogel治疗前后检出的肺炎链球菌的药敏试验折点,其中,图15A为CAM-Lips@Hydrogel治疗前,图15B为CAM-Lips@Hydrogel治疗后。
如图14和图15所示,药敏试验证明了经过CAM-Lips@Hydrogel治疗后肺炎链球菌(标准株,ATCC6303)未产生耐药。
3、HE染色
局部给药治疗2周后,上述细菌检测取样后接着对上颌窦黏膜取样,尽量完整地剥离并取出上颌窦黏膜,然后在冰台上操作,将一部分留做后续试验。
一部分用4%多聚甲醛浸泡过夜固定,自动脱水剂脱水,用石蜡包埋法固定,5μm连续薄层切片,用苏木精-苏丹红(HE)染色,观察其粘膜纤毛形态、炎性粒细胞浸润、腺体增生等情况。其中对白细胞计数采用每个样本切片上取黏膜下观察10个高倍视野(×400),统计阳性细胞数/总细胞数(每个视野百分比),再取平均数。
图16是本发明的实施例6中各组兔子上颌窦的形态图及上颌窦黏膜HE染色图,其中,图16A-图16D分别为Ctrl组、Sham组、Gel组、CAM组,图16F为各组兔子黏膜下白细胞计数比较图,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001。
如图16所示,局部给药治疗2周后,对包括Ctrl组在内的各组动物打开上颌窦,观察形态。作为正常对照,Ctrl组的上颌窦窦腔清洁,无明显分泌物,黏膜颜色淡红,无水肿(图16A);Sham组和Gel组上颌窦腔内充满脓性分泌物,上颌窦黏膜充血、水肿严重(图16B,图16C);CAM组上颌窦没有脓性分泌物,上颌窦黏膜充血、水肿情况轻微(图16D)。
各组上颌窦黏膜HE染色显示出:Ctrl组的上颌窦黏膜纤毛排列整齐,黏膜结构正常(图16A),炎性细胞平均占比4.6±0.7%,与其他各组相比P<0.05;Sham组和Gel组上颌窦黏膜纤毛部分脱落、方向杂乱,基底膜增厚,黏膜上皮下大量炎性细胞如中性粒细胞和淋巴细胞浸润,腺体增生(图16B,图16C),Sham组炎性细胞平均占比44.6±4.4%,Gel组炎性细胞平均占比44.4±4.6%;CAM组上颌窦黏膜纤毛无明显脱落,上颌窦黏膜基底膜增厚较轻,黏膜下少量炎性细胞如中性粒细胞和淋巴细胞浸润,少量腺体增生(图16D),CAM组炎性细胞平均占比25.7±5.2%,与Sham组和Gel组相比P<0.05(图16F)。
以上结果表明,CAM组能明显抑制和改善感染和炎症反应,减轻窦口粘膜水肿。
5、免疫组化(IHC)、Real-time PCR检测分析、WesternBlot检测分析
为进一步验证CAM-Lips@Hydrogel的抗炎作用,采用IHC、Real-time PCR以及Western Blot检测肺炎链球菌诱导的上颌窦粘膜中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的变化。
5.1、免疫组化
过程如下:
步骤1、用石蜡包埋组织切片行IHC检查,切片脱蜡,用3%过氧化氢酶处理10分钟消除内源性酶,然后用阻断缓冲液阻断1h。
步骤2、切片孵育一抗4℃过夜(一抗anti IL-1βat 1:200,anti IL6 at 1:200,anti IL8 at 1:200,anti TNF-αat 1:200),然后切片。
步骤3、在暗室室温下在抗体稀释缓冲液中与二抗孵育1小时,PBS冲洗后加DAB显色液显色,加苏木素复染细胞核。
步骤4、每张切片随机取不同部位的10个高倍视野(×400),辨认阳性细胞和染色强度。计数每100个细胞中,阳性细胞/总细胞数所占比,取平均数。<5%:0分;5%-25%:1分;25%-50%:2分;50%-75%:3分;>75%:4分。染色强度计分为无色:0分;淡黄色:1分;棕黄色:2分;棕色:4分。将阳性细胞计分和染色强度计分相乘得到总分。
图17是本发明的实施例6中各组兔子的上颌窦黏膜IHC结果,其中,图17A是IHC图,图17B是IHC评分比较图,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001。
如图17所示,通过检测发现,Ctrl组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的IHC平均评分分别为0.72±0.12、0.25±0.37、0.08±0.2、0.32±0.49,明显低于其他任何组(P<0.05);Sham组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的IHC平均评分分别为5.38±1.11、4.3±1.01、3.93±0.97、5.38±1.65;Gel组分别为6.93±0.65、4.43±1.04、3.93±1.01、6.14±1.55;CAM分别为2.80±1.00、1.75±0.40、1.01±0.47、2.67±0.86。CAM组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的IHC平均评分低于Sham组和Gel组(P<0.05)。
5.2、Real-time PCR检测分析
过程如下:
步骤1、称取上颌窦黏膜新鲜组织100mg,放入研磨管中,装入预冷的研磨架上,上机50Hz研磨30s;
步骤2、加入1ml Trizol试剂,振荡混匀,裂解10min,12000rpm离心10min取上清做为样本;
步骤3、采用Real-timePCR法测定IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA水平。Machine:Roche480II,RTreagentKit:TAKARARR047A,TBGreenqPCRkit:TAKARARR420A.根据TAKARA公司RR047A操作说明书进行,反应结束后确认扩增和融解曲线,进行数据分析,所有实验重复3次。
引物
IL-1β
ForwardPrimer5’-CTGCAACACCTGGGATGACT-3’
ReversePrimer5’-GGTTGGGGTCTACACTCTCC-3’
IL-6
ForwardPrimer5’-CTACCGCTTTCCCCACTTCA-3’
ReversePrimer5’-CAGGTCTCATTATTCACCGCC-3’
IL-8
ForwardPrimer5’-ACCCCAAGGAAAAGTGGGTG-3’
ReversePrimer5’-TATCAGGCAGCCCTACGACA-3’
TNF-α
ForwardPrimer5’-AGCCCACGTAGTAGCAAACC-3’
ReversePrimer5’-TGAGTGAGGAGCACGTAGGA-3’
5.3、WesternBlot检测分析
过程如下:
步骤1、将获取的上颌窦黏膜新鲜组织块用剪刀剪碎,用冷PBS洗涤3次,剪成小块置于匀浆管中,加入1-2个4mm的磁珠,加入10X组织体积裂解试剂后放入组织研磨机,60Hz,60s研磨。
步骤2、将匀浆完成的样本管取出,冰浴10min。12000rpm离心10min,收集上清,即为总蛋白溶液。
步骤3、用BCA测蛋白浓度。
步骤4、将蛋白溶液加入5*蛋白上样缓冲液(4:1),金属浴100℃变性5min,分装入SDS-PAGE进行电泳。
步骤5、电泳结束后转PVDF膜,用5%的脱脂牛奶(配0.1%TBST)将转好的膜在脱色摇床上封闭1h。
步骤6、用5%脱脂牛奶(TBST溶解)稀释一抗,antiIL-1βat1:200,antiIL-6at1:200,anti IL-8at 1:200,anti TNF-αat 1:200,GAPDH at 1:2000,4℃孵育过夜。
步骤7、在室温下,脱色摇床上洗三次(TBST),5min/次。二抗7000倍(TBST)室温下孵育60min,脱色摇床上洗三次(TBST),5min/次。
步骤8、在暗室中操作,在曝光匣上贴两层透明薄膜,将PVDF膜放于两层薄膜之间(蛋白面朝上),加入预混的ECL溶液,1-2min后去残液,盖上上面的一层薄膜曝光。
步骤9、曝光后的胶片显影,定影。然后将胶片扫描后存档,用PhotoShop整理,系统分析计算目标带的光密度值(使用Image J软件)。所有实验重复3次。
图18是本发明的实施例6中各组兔子的上颌窦黏膜多项指标检测结果图,图18A为Real-time PCR检测,图18B为Western Blot检测,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,▲:分别VS其它各组,p<0.001。
如图18所示,Real-time PCR检测Ctrl组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA水平低于其他任何组(P<0.05);CAM组8IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA水平低于Sham组和Gel组(P<0.05)。WesternBlot检测在蛋白质水平上进一步验证了结果(P<0.05)。
6、统计分析
实验数据用SPSS 16.0软件(美国IBM)进行分析,多样本本组数据的描述用平均值±标准差。细菌检测数据分析采用Chi-square test;实验室检测项目HE、IHC、Real-timePCR、Western Blot的数据分析采用ANOVA或WelchANOVA(方差不齐时);两两数据比较使用LSD或者Tamhane’s posthoc检验(当方差不齐时)。以P<0.05判定为差异有统计学意义。
实施例4至实施例6的试验结果表明:
水凝胶纳米材料CAM-Lips@Hydrogel具有局部可注射、自愈合、药物缓释、膨胀系数适中等理化特性,注射后形成立体形态,可在窦腔驻留,自身可以缓慢降解,十分适合ABRS的治疗需求。
CAM-Lips@Hydrogel对肺炎链球菌有较好的抗菌效果。除了抗菌作用,它还有良好的抗炎作用,对于减轻鼻窦黏膜水肿效果显著。
在传统的治疗方法中,口服或鼻腔喷雾糖皮质激素(GC)往往与全身抗生素联合使用,希望能减轻ABRS的症状[6][7]。然而,口服GC不适合糖尿病、消化性溃疡、骨质疏松和严重高血压等患者[8][9][10][11]。鼻腔喷雾GC在鼻窦口阻塞的情况下不容易进入窦腔。我们实验通过水凝胶载体,将荷载药物注射到上颌窦腔内,有效地作用于病变部位,避免了全身用药的副作用和鼻腔喷雾的缺点。
上述实施方式为本发明的优选案例,并不用来限制本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,将卵磷脂、胆固醇以及克拉霉素按4:1:0.2的重量比用超声波溶解于甲醇中,得到第一溶液;
步骤二,将所述第一溶液溶液进行旋转蒸发,得到蜂巢状的薄膜;
步骤三,将所述薄膜与预加热的PBS缓冲液进行水化和超声,得到克拉霉素脂质体;
步骤四,将四臂巯基聚乙二醇粉溶于所述克拉霉素脂质体,并加入AgNO3溶液进行混合,得到透明的、可局部注射的克拉霉素水凝胶。
2.根据权利要求1所述的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,其特征在于:
其中,步骤二中,所述旋转蒸发的转速为50r/min,温度为40℃。
3.根据权利要求1所述的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,其特征在于:
其中,步骤三中,所述薄膜与所述PBS缓冲液的质量体积比为100mg:(20-500)ml,
所述水化的转速为50r/min,温度为40℃,时间为2h,
所述超声的频率为25KHZ-100KHZ,时间为1min-20min。
4.根据权利要求1所述的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,其特征在于:
其中,所述四臂巯基聚乙二醇粉的纯度为96%,分子量为10kDa,所述四臂巯基聚乙二醇粉与所述克拉霉素脂质体的质量体积比为1mg:10μl。
5.根据权利要求1所述的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法,其特征在于:
其中,所述AgNO3溶液的浓度为0.05M,
所述AgNO3溶液和所述克拉霉素脂质体的体积比为1:1。
6.一种可局部注射的克拉霉素水凝胶,其特征在于:采用权利要求1-5中任意一项所述的可局部注射的克拉霉素水凝胶的制备方法制备而成。
7.一种可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用。
8.根据权利要求7所述可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用,其特征在于:
其中,所述鼻窦炎为急性鼻窦炎或慢性鼻窦炎。
9.根据权利要求7所述可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用,其特征在于:
其中,所述鼻窦炎为细菌性鼻鼻窦炎。
10.根据权利要求7所述可局部注射的克拉霉素水凝胶在治疗鼻窦炎中的应用,其特征在于:
其中,所述应用为将克拉霉素水凝胶注射到鼻窦区域,
所述克拉霉素水凝胶发挥抗菌和抗炎作用,
所述克拉霉素水凝胶所抗的细菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌ATCC6303以及流感嗜血杆菌。
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PB01 | Publication | ||
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