CN113874065A - 用于皮肤和非皮肤药物递送的具有底切特征的微针阵列 - Google Patents

Abstract

本发明公开的方法涉及从包括柔性模具材料的生产模具形成微针阵列。所述生产模具包括多个腔，这些腔成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征。所述柔性材料具有足够的弹性，以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具中取出，而不损伤由模具限定的微针的形状的完整性，以及保持模具的完整性用于多次使用。微针可以具有多种几何结构并且可以包括不同的可溶性和不可溶性层，以及不同类型的背衬层。

Description

用于皮肤和非皮肤药物递送的具有底切特征的微针阵列

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年5月16日提交的美国临时申请62/848,939的权益，其全部内容通过引用的方式并入本申请。

技术领域

本公开内容涉及微针阵列，尤其涉及形成有底切特征的微针阵列，用于皮肤和非皮肤药物递送以及用于组织粘合贴片。

政府支持的致谢

本发明是在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号AR071277和AR074285下由政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

皮肤是一种易于接近的组织，具有许多不同的功能，例如用作保护屏障和热调节器。值得注意的是，皮肤还起活性免疫器官的作用。对于某些目的，例如免疫接种、癌症免疫疗法和过敏脱敏，皮肤可能是优选的解剖目标部位，因为它拥有大量的专职抗原呈递和免疫辅助细胞。大多数疫苗、免疫调节剂和抗癌药物都是使用皮下针头注射药物递送的。但是，使用传统注射器的药物递送有若干缺点。这些包括需要训练有素的医疗保健人员进行管理、针头恐惧症(trypanophobia)(即害怕针头)、患者依从性差、疾病传播和针刺损伤的风险以及冷链储存和运输的成本。

此外，肠胃外注射不能可重复且精确地将生物载荷递送至目标皮肤微环境。因此，通过常规注射施用的疫苗和药物可能导致次优功效。总的来说，这些因素阻碍了疫苗、抗癌药物或免疫调节剂的有效使用，并导致皮肤免疫接种和治疗策略效率低下。

发明内容

本文公开了各种方法和系统，这些方法和系统涉及制造微针阵列，尤其涉及形成有底切特征的微针阵列，用于皮肤和非皮肤药物递送，以及用于组织粘合贴片。

在以下描述的一些实施方案中，形成微针阵列的方法包括：形成柔性材料的生产模具，所述生产模具具有多个腔(cavity)，这些腔成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆(stem)、微针尖端(tip)、圆角基底(filleted base)和至少一个底切(undercut)特征；将至少一种生物活性材料引入第一可溶解材料中以提供生物可降解基质；将所述生物可降解基质递送到至少所述微针尖端部分中，所述微针尖端部分由所述生产模具的各自的腔所限定；在生产模具中形成包括所述生物可降解基质的多个微针；以及通过将微针拉出模具而从生产模具中取出微针。柔性材料可具有足够的弹性以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具取出，而不损伤由模具限定的微针形状的完整性。

在其它实施方案中，使用单次拉拔模具形成微针阵列，该模具包括背衬层、多个微针、和与第一可溶解材料组合以形成生物可降解基质的至少一种生物活性材料。所述多个微针各自具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征。

在其它实施方案中，一种形成模具的方法包括：生成包括具有至少一个底切特征的多个微针的微针阵列的3D-CAD图，使用3D-CAD图形成主微针阵列，形成主微针阵列的至少一个复制品(replica)，以及使用所述至少一个复制品形成微针阵列的生产模具。所述生产模具由柔性材料形成。

本发明的前述和其它目的、特征和优点将从以下参照附图进行的详细描述中变得更加明显。

附图简述

图1说明了示例性微针设计，在这些示例中，其具有带尖锐尖端的圆锥形头(conical head)、圆形底切杆和圆角基底。

图2A-C说明了形成有贴合性(conformable)背衬层的微针阵列。

图3A公开了示例性MNA的计算机辅助设计(CAD)图，其包括具有底切特征和圆角基底的尖锐针。

图3B公开了具有5x5针布置的示例性MNA的3D CAD图。

图4A公开了示例性MNA制造过程的流程图。

图4B图示了图4A中的示例性MNA制造过程的不同步骤。

图5A示出了使用3D直接激光写入创建的主MNA的光学显微镜图像。

图5B示出了通过两阶段微模制策略创建的主MNA的复制品的光学显微镜图像。

图5C示出了MNA生产模具中微针形孔的光学显微镜图像。

图5D示出了3D打印的主MNA上单个底切针的光学显微镜图像。

图5E示出了主MNA的复制品上的单个底切针的光学显微镜图像。

图6A示出了引入生物载荷(例如，OVA+Poly(I:C))的最终溶解(CMC/Treh)MNA的光学显微镜图像。

图6B示出了具有整合OVA的底切微针的溶解性的、尖端加载的PVP/PVA MNA的光学显微镜图像。

图6C示出了引入多柔比星(Doxorubicin)作为着色药物以促进成像的单个尖端加载的CMC/Treh底切微针的光学显微镜图像。

图7A示出了在微针尖端引入Texas Red标记的葡聚糖(大约40kDa分子量)的PVP/PVA MNA。

图7B示出了在微针的棱锥(pyramid)区域整合Allura Red R40染料(大约500Da分子量)的尖端加载的CMC/Treh MNA。

图7C示出了引入多种载荷，例如Texas Red标记的葡聚糖和Allura Red R40染料的尖端加载的PVP/PVA MNA。

图7D示出了引入多种载荷，例如Texas Red标记的葡聚糖和Alexa488标记的PLGA微粒(平均直径为10μm)的尖端加载的PVP/PVA MNA。

图8A说明了使用3D直接激光写入从IP-S光致抗蚀剂制造的不同微针设计。

图8B说明了具有圆角基底的打印微针的图像。

图9A示出引入Allura Red染料的PVP/PVA-MNA在人体皮肤施用前的光学显微镜图像。

图9B示出了活人皮肤样本上的Allura Red R40染料微针迹线的明亮视野显微镜图像。

图9C示出了引入Allura Red染料的PVP/PVA-MNA在人体皮肤施用后的光学显微镜图像。

图9D-I示出了来自尖端加载的CMC/Treh MNA的Alexa488-标记的Poly(I:C)和Alexa555-标记的OVA的皮内共同递送。20倍光学放大倍率。荧光显微镜合成图像示出了穿透表皮和真皮上部的递送腔，以及抗原和佐剂向目标皮肤微环境的递送。

图10A示出了整合Alexa555-OVA和Alexa488-Poly(I:C)两者的MNA的光学显微镜图像，荧光图像是引入两种载荷的棱锥头的代表性图示。

图10B示出了Alexa555-OVA和Alexa488-Poly(I:C)-加载的MNA在体内应用于所描绘的小鼠之后的代表性光学显微镜图像。

图10C和10D示出了使用新型MNA将Alexa488-Poly(I:C)和Alexa555-OVA有效共同递送至皮肤微环境。

图11A说明来自流式细胞术分析的代表性直方图，显示免疫接种和未免疫接种小鼠脾脏中剩余的CFSE标记细胞。

图11B示出了特异性细胞裂解(specific cell lysis)的量化，其中100％裂解对应于靶细胞的完全消除(平均值±SD，每组3只小鼠)。

图11C示出了OVA特异性IgG1和IgG2c抗体的血清浓度(条代表平均值，每组3只小鼠)。

发明详述

本文的详细说明描述了与微针阵列(MNA)的制造和使用相关的某些示例性实施方案。尽管示例性实施方案可能公开特定类型的MNA，但是应当理解，其它类型的MNA可以从所公开的系统和方法中受益。

如本文所用，术语“生物制品”、“活性成分”、“生物载荷”或“生物活性材料”是指药物活性剂，例如镇痛剂、麻醉剂、抗哮喘剂、抗生素、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗真菌剂、抗高血压剂、抗炎剂、抗肿瘤剂、抗焦虑剂、酶活性剂、核酸构建体、免疫刺激剂、免疫抑制剂、疫苗等。生物活性材料可包括可溶性材料，不溶但可分散性材料，天然或配制的宏观、微米和纳米颗粒，和/或两种或更多种可溶性、可分散不溶性材料与天然和/或配制的宏观、微米和纳米颗粒的混合物。在这点上，虽然本文公开的许多MNA实例涉及疫苗和免疫接种，但任何其它合适的生物活性材料，例如上面讨论的那些，都可以用于新的MNA设计。

如本文所用，术语“预先形成”是指结构或元件在使用之前被制造、构造和/或形成为特定形状或构造。因此，预先形成的微针阵列的形状或构造是在将微针阵列的一个或多个微针插入患者体内之前的该微针阵列的形状或构造。

如本文所用，术语“底切”或“底切特征”是指被认为使用标准模制方法无法获得的凹陷表面，并且特别是指一种特征(例如，凹痕、突起或其它几何形状)，其限制或防止具有此特征的模制部件从传统的一体式模具中撤出。

本文描述的系统和方法及其各个组件不应被解释为以任何方式限于本文描述的特定用途或系统。相反，本公开内容针对单独的以及各种相互组合和子组合的各种公开实施方案的所有新颖和非显而易见的特征和方面。例如，如相关领域的普通技术人员基于本文公开的信息将认识到的，所公开的实施方案的任何特征或方面可以以相互组合和子组合的形式使用。此外，所公开的系统、方法及其组件不限于任何特定方面或特征或其组合，所公开的事物和方法也不要求存在任何一个或多个特定优点或要解决的问题。标题仅出于可读性的目的而提供，并且应当理解，一个部分中的元素和/或步骤可以与本公开中不同标题下的元素和/或步骤组合。

本申请中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。此外，术语“包括”意味着“包含”。此外，如本文所用，术语“和/或”是指该短语中的任何一项或多项的组合。此外，术语“示例性”意味着用作非限制性示例、实例或说明。如本文所用，术语“诸如”和“例如”引入了一个或多个非限制性实施方案、示例、实例和/或说明的列表。

虽然为了方便呈现以特定的、连续的顺序描述了一些公开的方法的操作，但是应当理解，这种描述方式包括重新排列，除非下面阐述的特定语言要求特定的排序。例如，顺序描述的操作在某些情况下可以被重新安排或同时执行。此外，为了简单起见，附图可能未示出所公开的事物和方法可以与其它事物和方法结合使用的各种方式。此外，描述有时使用诸如“提供”、“产生”、“确定”和“选择”之类的术语来描述所公开的方法。这些术语是对所执行的实际操作的高级描述。对应于这些术语的实际操作将根据特定实现而变化，并且本领域普通技术人员在受益于本公开内容时很容易辨别。

示例性微针阵列

与传统的基于针头的注射技术相比，微针阵列的使用具有许多优点。因为这个原因，由于皮肤的上述理论优势，使用微针阵列的皮肤疫苗接种或药物递送为有效免疫接种或癌症免疫治疗提供了可行且有吸引力的方法。

与局部递送方法不同，MNA物理穿透角质层，从而消除制剂复杂性并导致疫苗或药物在皮肤微环境中的局部沉积。与传统针头注射相比，微针对疼痛感受器友好，可实现微创无痛免疫接种。

除其它益处外，溶解性MNA可提供高效疫苗接种，因为它们具有更高的抗原加载能力、可调的释放动力学、制造简单和长期稳定性。这种MNA可以由水溶性聚合物制成，在插入皮肤时会溶解。MNA的微针优选在其干燥状态下足够强以穿透角质层，然后迅速溶解在皮肤的流体环境中，从而释放疫苗。将生物活性材料，例如疫苗，精确递送到皮肤微环境可以提高功效，从而与传统针头注射相比需要相对较低的剂量。

如下文更详细地公开的，具有包括可溶解和/或不可溶解材料的底切几何形状的微针可以通过本文所述的新方法和系统形成。

在一些实施方案中，新型MNA可以通过利用柔性生产模具材料的单步微模制工艺形成。这种柔性生产模具材料的使用允许生产一系列原本不可能的几何设计。柔性生产模具材料可包括，例如，任何弹性体或其它柔性材料，其允许移除具有所需设计(例如，具有所需量的底切和/或其它几何形状)的微针。模制各种原本难以通过模制来制造的几何形状的这种能力使得新颖和创新的功能分级MNA成为可能，例如图1中所示的那些，用于将各种生物活性材料靶向递送至皮肤和其它组织(例如心脏和眼部组织)。

图1说明了可以使用本文所述的方法和系统形成的不同结构的微针的示例。参照图1，四个不同的微针结构10、12、14、16显示在由柔性材料例如柔性弹性体形成的生产模具18中。

微针10形成有可溶性背衬层20、可溶性杆22和加载有生物活性材料的微针尖端24。因此，微针10整体由溶解性(或生物可降解)材料制成。生物活性材料可混入溶解性材料中，但优选位于如图1所示的针尖端，以提高递送效率。

如图1所示，微针10、12、14、16可以具有棱锥头形状，具有尖锐的尖端和通过圆角基底连接到背衬层的底切杆。圆角32可在组织插入期间提供改进的机械性能。

本文所述的MNA可由任何可模制的溶解性、生物可降解和/或生物相容性、不可溶性材料制成，包括羧甲基纤维素、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、麦芽糊精、蚕丝、葡萄糖、透明质酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚(乳酸)、光固化树脂及其组合，以引入任何生物活性材料，包括化妆品、皮肤填充剂、他汀(statins)、生长因子、止痛药、抗组胺剂、维生素、麻醉剂、抗衰老剂、小分子药物、半抗原、过敏原、抗炎剂、蛋白、多肽、微囊泡、外泌体(exosome)、多联体(polyplexes)(siRNA、shRNA、DNA载体复合物)、重组病毒载体(即，腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(VacciniaVirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)及其不同的血清型)、单克隆和多克隆抗体，以及活细胞或裂解细胞。

微针12形成有不可溶性背衬层26、不可溶性杆28和加载有生物活性材料的微针尖端24。这种功能分级的底切MNA设计可以用超过一种材料制造。例如，棱锥部分可以使用溶解性或生物可降解材料制造，而杆部分和背衬层由不可溶性材料制成，例如不可溶性生物相容性刚性聚合物(例如聚(甲基丙烯酸甲酯))、聚碳酸酯、VeroWhite和其它UV固化和热固化树脂)。

因此，微针12可提供机械性能增强的尖锐的针尖端，通过圆角基底能够成功穿透组织，棱锥头用作生物活性材料剂型，其中生物活性材料被引入到溶解性或降解性生物材料基质中。底切杆部分提高了穿透过程中的机械性能，同时确保了植入过程中的组织保留，不可溶性底切杆部分防止嵌入(embedded)的生物活性材料在制造和植入过程中的反向扩散。不可溶性背衬层还有助于防止可能导致背衬层过度弯曲并使MNA应用不理想的储存过程中的湿气吸收。

微针14在形状上与微针12、14相似，但还包括另一个溶解性层30。例如，棱锥部分使用溶解性或生物可降解材料制成，并且在靠近杆/针尖端连接处提供一更快速溶解性层。溶解性层可以例如由小分子量的快速溶解性聚合物形成，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糊精或聚乙烯吡咯烷酮。杆部分的其余部分和背衬层可由不可溶性材料形成，例如不可溶性生物相容性刚性聚合物，例如丙烯酸酯化聚酯、环氧树脂、UV固化单体、树脂、硅树脂。

因此，微针14提供了机械性能增强的尖锐的针尖端，通过圆角基底能够成功穿透组织，棱锥头用作生物活性材料剂型，其中生物活性材料被引入溶解性或降解性生物材料基质中，底切杆部分提高了穿透过程中的机械性能，同时确保了植入过程中的组织保留，以及溶解性层和不溶解性层之间机械不匹配的快速溶解性层有助于棱锥尖端的快速分离。

微针16类似于微针14，但还包括贴合性背衬层34，其可以是不溶性的。特别地，微针16可形成有使用溶解性或生物可降解材料制成的棱锥部分，可如上所述形成快速溶解层，杆部分的其余部分可由不可溶性材料制成，并且背衬层可由贴合性材料制成，例如不可溶性贴合性聚合物(有机硅、UV固化聚合物、弹性体)。

因此，微针16可提供机械性能增强的尖锐的针尖端，通过圆角基底能够成功穿透组织，棱锥头用作生物活性材料剂型，其中生物活性材料被引入溶解性或降解性生物材料基质中，和底切杆部分提高了穿透过程中的机械性能，同时确保植入过程中的组织保留，与微针14一样，溶解性层和不溶解性层之间机械不匹配的快速溶解层可以促进棱锥尖端的快速分离，并且不可溶性底切杆部分防止嵌入的生物活性材料在制造和植入过程中的反向扩散。在该实施方案中，背衬层可以更好地贴合不均匀的皮肤形貌，并且如果是不可溶性的，它可以帮助防止可能导致背衬层过度弯曲并使MNA应用不理想的湿气吸收。

图2A-2C说明了具有微针52和贴合性背衬层34的微针阵列50弯曲以及在弯曲之后回复到原始状态，或至少为形状上比弯曲状态更接近原始状态的一种状态的能力。

应该理解的是，图1—以及在整个申请中—公开的特征的任何组合都被考虑在内。例如，微针16的贴合性背衬层和微针14、16的快速溶解性层30可以与本文公开的任何其它结构(例如，微针10、12)组合使用。

此外，本文公开的方法可用于制造完全由不溶解性材料形成的微针，用作涂布的MNA、组织粘合剂(贴片)和/或微刺(microbarb)。以前使用增材制造或机械微加工工艺制造不可溶性底切微刺或微针几何形状。但是，由于缺乏有效的微模制工艺，阻碍了这些几何形状的高通量制造。

MNA的微增材制造

在一些实施方案中，MNA可以使用增材制造(AM)形成，包括微增材制造(μAM)技术。本文描述的方法和系统可以允许具有很少微制造专业知识的医学研究人员从计算机辅助设计(CAD)绘图直接生成他们的MNA设计，而无减法制造过程的复杂要求。本文所述的μAM技术为制造专为有效的皮肤和非皮肤药物递送而设计的新型MNA提供了一种有效手段。

在本文公开的一些实施方案中，MNA设计包括独特形状的微米级针，其包括尖锐的棱锥头和带有圆角基底的底切杆以确保成功的皮肤穿透和保留。与传统的MNA不同，本文公开的MNA是通过具有3D直接激光写入的三维(3D)μAM方法制造的，其以无与伦比的简单性和设计能力水平为MNA领域提供了变革潜力。

如下文更详细描述的，在一些实施方案中，可以通过两步微模制方法以高保真度从机械强度高的可模制树脂获得主MNA的复制品。然后，这些复制品可用于制备生产模具，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)生产模具，从而能够制造具有底切微针的新型尖端加载的可溶性MNA。在一些实施方案中，所得MNA是具有真正底切特征的完全溶解性MNA，用于有效的皮肤药物递送。

如图1所示，在一些实施方案中，可以打印多个主MNA，快速获得主MNA的复制品，然后可以将多个复制品组装在一起以创建更大的MNA。

在一些实施方案中，MNA可以使用旋涂方法引入来自生物可溶性材料组合物(70％CMC/30％Treh)的模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin)(OVA)±模型佐剂Poly(I:C)。此外，拟议的MNA设计以及有利的模具材料，战略性地实现了直接制造步骤，而不会干扰模制过程。制造的MNA在穿透活人皮肤的角质层以将其生物载荷递送到皮肤微环境方面特别有效。这些独特的MNA满足了皮肤疫苗接种的有效皮肤渗透的几何和机械强度要求，从而为皮肤靶向的免疫接种策略提供了另一种有前景的方法。

示例性微针和阵列及其制造系统

图3A和3B说明了示例性微针阵列(MNA)(100)，其包括具有尖锐尖端的棱锥头(102)和底切杆部分(104)的微针。此外，微针包括圆角基底(106)。

本文公开的方法和系统能够从不同和广泛使用的溶解性微针材料，包括CMC、PVP、蚕丝、HA、CMC/海藻糖、CMC/葡萄糖、CMC/蔗糖、PVP/PVA和任何其它可模制生物可溶性组合物，实现具有底切特征的高质量、尖端加载的溶解性MNA的可重现性制造。

在该实施方案中，微针的高度(110)在50-1500μm之间，例如高度为750μm，并且棱锥头顶角(A)在10°-60之间，例如为30°。

在一个实施方案中，微针的杆部分可以具有在50-500μm之间的宽度(112)，例如150μm。杆部分(104)可以从三维(3D)棱锥头的底部区域延伸到微针的背衬层(108)，具有15-75μm，例如35μm的半径范围圆角连接(radius filleted connection)。棱锥头的底部区域的宽度(114)例如可以在100-400μm之间，例如250μm×250μm的底面积。

在一些实施方案中，阵列中微针之间的尖端到尖端距离(116)可以在100-800μm之间，例如650μm。在一些实施方案中，MNA可包括1-1000个微针，例如在面积为4.75mm×4.75mm的背衬层上呈5x5阵列配置的25个微针。

微针基底(106)处的圆角(fillet)可以帮助减少在尖角处相关的机械应力集中，进而提高制造过程和皮肤插入期间的微针性能。选择微针的顶角、宽度和高度以提供改进的皮肤插入力学并减少穿透失败。

底切或锚定特征可以在应用期间改善皮肤保持力，并且使用本文公开的新方法和系统可以在不干扰加工步骤的情况下实现，从而允许从模具中直接取出MNA。

本文描述的三维微增材制造(3D-μAM)方法允许从3D-CAD图创建独特的MNA设计。此外，3D-μAM可以使几乎没有或没有微制造专业知识的医学研究人员能够设计和制造具有应用导向优化的基于MNA的药物递送平台。

示例性制造系统和工艺在图4A的流程图中呈现，和在图4B中图解说明。如图4A和4B所示，该工艺可以包括以下步骤以产生新型快速溶解性MNA，同时实现高通量制造。首先，可以准备MNA设计的3D-CAD图(132)(工艺步骤120)。第二，可以通过使用不可溶性树脂(例如IP-S光致抗蚀剂)，由3D直接激光写入来从CAD图直接产生主MNA(134)(工艺步骤122)。3D-μAM制造系统可以是例如Nanoscribe 3D打印系统(136)。

第三，主MNA的快速和高保真复制品可以使用UV固化树脂(例如VeroWhitePlus、Tangoblack、Digital Materials)，使用两步微模制方法形成(工艺步骤124)。该方法可以包括弹性体负模(138)以形成主MNA的复制品(140)。

第四，可以在3D打印的MNA支架(holder)上创建具有多个主MNA复制品(例如，六个复制品)的MNA主模具(工艺步骤126)。3D打印的MNA支架(142)可以由例如树脂材料形成。将多个主MNA复制品在例如3D打印的MNA支架上组合在一起可以允许创建更大的MNA并提高生产率。

第五，MNA生产模具(144)可以使用微模制由弹性体PDMS制造(工艺步骤128)。第六，可以制造尖端加载的溶解性MNA(150)(工艺步骤130)。MNA可以具有底切微针，通过使用离心机的多步旋涂方法，引入了一种或更多种生物活性材料，例如疫苗或来自水溶性生物相容性材料(例如，CMC和Treh的组合物)的任何其它生物活性材料。

例如，可以将生物活性成分(例如，疫苗)旋涂到PDMS生产模具的尖端，并且可以将可溶性水凝胶(例如，CMC/海藻糖)旋涂到生产模具中，以用作微针的结构材料并形成MNA的背衬层。在一些实施方案中，主MNA、包括主MNA的复制品的MNA主模具和弹性体生产模具可以重复使用大量的加工周期，从而大大降低了具有独特设计的MNA的制造成本并提高了生产率。

图5A-5E示出了对应于不同制造或工艺步骤的最终产品。图5A示出了使用3D直接激光写入创建的主MNA(134)的光学显微镜图像，图5D示出了3D打印的主MNA(134)上的单个底切针的光学显微镜图像。具体来说，主MNA是通过3D直接激光写入由IP-S光致抗蚀剂制成的。IP-S是一种专为3D激光光刻设计的特殊材料，可为微米和纳米结构提供高分辨率和机械完整性。基于双光子聚合的3D激光光刻为制造具有光滑边缘和尖锐尖端的底切MNA设计提供了一种有效的方法，并且没有任何不需要的残留物(例如加工碎片)。

图5B示出了通过两阶段微模制策略创建的主MNA的复制品(140)的光学显微镜图像：弹性体模制与UV可固化微模制相结合，图5E示出了主MNA的复制品(140)上的单个底切针的光学显微镜图像。主MNA是使用两步微模制工艺生产的。IP-S主MNA用于通过弹性体模制制造PDMS柔性模具，然后使用PDMS模具通过UV可固化微模制制造几个VeroWhite MNA复制品。VeroWhite树脂是一种耐磨的丙烯酸基光敏聚合物，可用于3D Polyjet打印机。

为了实现新型MNA的可规模化(scalable)制造，然后使用MNA复制品来创建MNA主模具，该主模具包括多个MNA(例如，六个MNA复制品)。最终的MNA主模具在真空炉中进行后处理，以促进模具表面上的PDMS成功固化，由微针形孔组成的弹性体MNA生产模具然后由PDMS制成。图5C示出了MNA生产模具(144)中微针形孔的光学显微镜图像。

因此，这些工艺步骤连同3D直接激光写入的高几何能力导致可规模化且有效的MNA制造策略。此外，使用耐磨可模制材料快速复制3D打印的主MNA大大提高了生产力。使用不同微针和弹性体模具材料的其它底切特征，与本文所述的工艺和系统一致，也是可能的。

在制造具有六个MNA复制品的MNA主模具后，使用常规的三阶段制造策略，通过主模具到生产模具到最终的可溶性MNA来制造将疫苗整合在针尖端部分的溶解性MNA。

如下文更详细讨论的，在底切针的尖端部分中引入疫苗(10μg OVA±25μg Poly(I:C))的溶解性MNA是通过旋涂工艺由两种不同材料组合物(即CMC/海藻糖和PVP/PVA)制成。此外，制造了带有整合了着色模型药物(例如多柔比星)的底切微针的尖端加载的CMC/海藻糖MNA，以促进成像和证明与化学治疗剂的相容性。本文所述的系统和方法能够有效且快速地由不同可溶性材料组合物制造具有底切微针的尖端加载的溶解性MNA。

图6A示出了引入生物载荷(例如OVA+Poly(I:C))的最终溶解性(CMC/Treh)MNA的光学显微镜图像。图4B示出了具有整合OVA的底切微针的溶解性尖端加载的PVP/PVA MNA的光学显微镜图像，并且图4C示出了引入多柔比星作为着色药物以促进成像的单个尖端加载的CMC/Treh底切微针的光学显微镜图像。

实施例1-示例性MNA的制造

本文描述了用于产生MNA的示例性工艺。

主MNA的制造。独特的MNA设计直接从图1中所示的3D-CAD图创建，使用具有光聚合抗蚀剂IP-S的3D激光打印(Nanoscribe Photonic Professional，GT)。Nanoscribe打印系统配备有激光发生器、光学柜、连接到镜头以聚焦激光束的蔡司光学显微镜、用于引导激光束扫描的Galvo镜系统、用于精确运动控制的压电平台，以及用于执行3D打印的操作软件(Nanowrite)。整个系统放置在光学平台上，以消除打印过程中的振动。

为了制造主MNA，将MNA设计转换为‘STL’(StereoLithography)格式。随后，将STL文件加载到Nanoscribe系统的专用软件(DeScribe，德国)中以选择工艺条件(即切片、阴影(hatching)和分裂的距离)。最后，将STL文件转换为“GWL”(通用写入光刻(GeneralWriting Lithography))格式，以便在Nanowrite软件中导出，用于打印主MNA。主MNA使用XY平面中的Galvo-扫描模式和Z方向上的压电扫描模式制造。主MNA在工作范围内被分成220μm×220μm×200μm的区块，然后缝合在一起。激光功率和写入速度分别设置为100mW和6cm/s。分别使用了0.3μm和0.5μm的最小和最大切片距离。然后通过IP-S光致抗蚀剂的双光子聚合打印主MNA，使用波长为750nm的飞秒脉冲激光，使用独特的深液(deep-in-liquid)模式，目标(objective)为25x和NA0.8在Shell和Scaffold模式。

打印后，将主MNA在光致抗蚀剂溶剂丙二醇单甲醚乙酸酯(PGMEA)中显影30分钟，然后用异丙醇(IPA)漂洗5分钟。主MNA在空气中干燥后，置于16mW/cm2强度的UV(365nm)灯下30分钟，以进一步交联主体来加强MNA结构。

主MNA的复制。为了使用UV固化树脂以高保真度复制主MNA，进行了两阶段微模制方法。首先，使用微模制方法从聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造一个弹性体模具，该模具是主MNA的负片(negative)。使用PDMS的弹性体模制提供了高保真微米级结构的准确且可重复的复制。简而言之，将主MNA安装在直径为5cm的培养皿中，使用双组分可固化有机硅弹性体

184(Dow Corning)，通过将基材与固化剂以10:1

与固化剂的比例混合获得PDMS。随后，将混合物倒在安装在培养皿中的主MNA上并脱气15分钟。接下来，将带有脱气混合物的主MNA放入烘箱中，并在70℃下固化1小时。将固化的PDMS冷却至室温5分钟，然后与主MNA分离以获得PDMS负模。

第二个工艺步骤使用PDMS负模具由UV固化树脂(

VeroWhiteplus-RGD835)制造正的(positive)MNA复制品。对于每个PDMS模具，将20μl液体(未固化)树脂倒入模具中，然后将模具放入离心机中，在4500RPM和20℃下将树脂填充到微针形孔中1分钟。然后将树脂在UV光(365nm)下以21.7mW/cm2强度从顶部和底部各固化5分钟，以固化基部和微针尖端两者。为了确保主MNA复制品的背衬层是平坦的，将50μl的UV固化树脂二次加载到PDMS模具上，这超出了可用的剩余体积。将载玻片放在模具顶部以除去多余的VeroWhite树脂，从而在基底上形成均匀的平坦表面。然后将液体树脂从顶部固化5分钟，然后脱模以获得主MNA的复制品。

MNA主模具的创建。为了促进溶解性MNA的规模化制造，MNA主模具是通过将MNA的六个复制品组装到由

使用高分辨率(16μm)Polyjet 3D打印系统(Objet Connex500多材料打印机)由不可溶性光聚合物(VeroWhite)制造的MNA支架上来创建的。MNA支架的3D模型使用SolidWorks 2018CAD软件产生，然后转换为‘STL’(立体光刻)文件格式。随后，专用软件(Objet Studio)将这个3D模型切成2D横截面层，创建一个发送到3D打印机系统的计算机文件。3D打印的MNA支架中的通道经过设计和制造，用作MNA生产模具中的凸起口袋，在旋涂过程中协助作为生物活性载荷(例如疫苗)和溶解性MNA的结构水凝胶材料的储液器。所产生的MNA主模具在真空烘箱中在80℃下烘烤过夜，以促进弹性体MNA生产模具的有效制造。

MNA生产模具的制造。包括微针形孔的MNA生产模具由常用的弹性体聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，如主MNA的复制所述。基材与固化剂以10:1

与固化剂的比例混合。随后，将混合物倒入置于直径为10cm的培养皿中的MNA主模具上并脱气15分钟。接下来，将带有脱气混合物的主模具放入烘箱中，在70℃下将PDMS固化1小时。将固化的PDMS冷却至室温后，将其与MNA主模具分离以制造PDMS MNA生产模具。

溶解性MNA的生产。为使用引入OVA±Poly(I:C)的底切微针制造尖端加载的溶解性MNA，使用包括羧甲基纤维素(CMC，cat#C5678，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和海藻糖(Treh，Cat#T9531，Sigma-Aldrich)的生物可溶性材料组合物。为了制备溶解性MNA的结构材料的水凝胶形式，CMC和Treh粉末分别以70％和30％的重量比充分混合。然后将该粉末混合物加入无内毒素的水(HyClone HyPure细胞培养级水)中并充分混合以达到30％w/w的溶质浓度。将制备的水凝胶在4℃下冷藏24小时，使混合物达到平衡。然后使用离心机(ThermoFisher Scientific Sorvall Legend XTR，带Swinging Bucket Rotor TX-750)通过多步旋涂技术制造具有独特设计的尖端加载的CMC/Treh-MNA。

首先，将5μL的OVA溶液(25mg/mL OVA在无内毒素的水中)分配到PDMS生产模具上的每个MNA上，并将生产模具在20℃和4500rpm下离心1分钟以填充微针形腔。一旦生产模具被填充，储液器中过量的OVA溶液被回收。生产模具再次在20℃和4500rpm下离心30分钟，以确保干燥的OVA载荷位于生产模具中针形腔的尖端部分。

对于整合OVA+Poly(I:C)的MNA，在加载OVA后，将5μL的Poly(I:C)溶液(62.5mg/mLPoly(I:C)在无内毒素的水中)分配到每个PDMS生产模具上的MNA，并将生产模具在20℃和4500rpm下离心1分钟以填充微针形腔。一旦生产模具被填充，储液器中过量的Poly(I:C)溶液被回收。生产模具再次在20℃和4500rpm下离心30分钟，以确保Poly(I:C)载荷也位于生产模具中针形腔的棱锥部分。将生物载荷定位在微针尖端后，将40μL水凝胶(30％w/w的70:30CMC:Treh)加载到PDMS生产模具上的每个MNA上，以填充生产模具中的微针形几何形状并形成MNA的背衬层。然后将加载水凝胶的生产模具在20℃和4500rpm下离心5小时，以获得加载有10μgOVA±25μg Poly(I:C)的溶解性MNA。由于MNA生产模具的特定几何形状，每个复制同时产生六个加载OVA±Poly(I:C)的溶解性MNA。

为了展示由另一种水溶性材料(即材料能力)制造具有底切微针的溶解性MNA，还使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯醇(PVA)的生物可溶性聚合物组合物(40％w/w 60:40PVP:PVA)制造具有不同生物载荷的MNA。使用明场光学显微镜对制造的主MNA、MNA的复制品、弹性体MNA生产模具和加载OVA±Poly(I:C)的溶解性MNA进行成像，以评估具有底切特征的新型微针的几何完整性。

使用示例性MNA的皮肤递送

离体人皮肤外植体的制备。人体皮肤外植体是从经历通过Pitt BiospecimenCore获得并根据匹兹堡大学医学中心指南使用的整形手术的去识别化健康供体制备的。组织在70％乙醇中漂洗，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗。使用Silver的微型皮肤移植刀(Padgett，Integra Miltex，Plainsboro，NJ)获得人类皮肤外植体(约1mm厚)，然后切成20mm×20mm的方块。所得人皮肤样品由未改变的表皮和下面的真皮薄层组成，并通过在气液界面处培养保持为正常生理状态下的外植体。

成像分析。为了评估MNA引导的皮内生物活性材料(例如疫苗)向活体人类皮肤外植体的递送，进行了许多成像分析。使用上述制造策略制造了整合着色载荷(即Allura RedR40染料)的尖端加载CMC/Treh-MNA。在将MNA应用于人类皮肤外植体之前，使用明场光学显微镜对MNA进行成像。

随后，将MNA应用于人皮肤外植体并在10分钟后移除。然后在明场显微镜下检查目标人体皮肤区域，以对从CMC/Treh-MNA沉积到人体皮肤中的着色生物载荷的图案进行成像。在人体皮肤应用后，还使用光学显微镜对剩余的MNA材料进行成像。为了进一步定性评估MNA引导的皮内疫苗递送到人类皮肤，制造包含Alexa555标记的OVA和Alexa488标记的Poly(I:C)的CMC/Treh MNA，应用于人类皮肤10分钟，然后移除。然后对目标人皮肤外植体进行组织学分析。简而言之，将MNA处理的人皮肤样品在2％多聚甲醛中固定，然后浸入蔗糖溶液中，24小时内更换3次该溶液。然后将组织切片在最佳切割温度(OCT)组织学化合物中快速冷冻，并冷冻切片成约10μm厚的切片。使用核DAPI荧光染料对切片的人体皮肤样品进行复染。然后使用Nikon透射荧光显微镜对染色切片进行成像，以检测人体皮肤横截面中的Alexa555-OVA和Alexa488-Poly(I:C)，并使用明场显微镜更好地展示角质层突破。

MNA引导的体内皮肤免疫接种

鼠畜。雌性C57BL/6J小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)并在8-10周龄时使用。小鼠在匹兹堡大学保持在无特定病原体的条件下，所有实验均按照实验动物管理和使用委员会(the institutional animal care and use committee，IACUC)指南进行。

体内IVIS成像。使用C57BL/6J小鼠展示使用新型溶解性MNA的体内皮内疫苗递送。使用上述制造策略产生整合了Alexa555标记的OVA和Alexa488标记的Poly(I:C)的尖端加载CMC/Treh-MNA，并将其应用于通过异氟醚吸入暂时麻醉10分钟的小鼠的腹部。接下来，取出MNA，让小鼠恢复正常活动。对OVA +Poly(I:C)加载的MNA在体内应用之前和之后进行成像。在IVIS 200体内成像系统(PerkinElmer)上使用滤波器对MNA处理的小鼠进行成像，以检测MNA应用部位的荧光标记Poly(I:C)和OVA。使用Living Image软件(PerkinElmer)对图像进行后处理。

细胞介导和体液免疫应答。为了说明使用新型MNA的皮肤疫苗接种，如上所述制备了整合10μg OVA±25μg Poly(I:C)的尖端加载的CMC/Treh MNA。通过使用MNA(10μg OVA±25μg Poly(I:C)MNA应用于腹部右侧和左侧，每只小鼠两个MNA)皮肤疫苗接种，或通过两次肌肉内注射PBS中的10μg OVA到后肢腓肠肌，对小鼠进行免疫接种，或小鼠未作处理(即纯真的

在第0天和第7天进行免疫接种，分别作为初始剂量和加强剂量。然后使用成熟的技术在加强剂量后5天测定小鼠的体内OVA特异性细胞毒性T细胞活性和OVA特异性抗体应答。

对于OVA特异性抗体应答，从心脏穿刺处死时的麻醉小鼠中收集血液，并使用BDMicrotainer血清分离管(BD Biosciences，San Jose，CA)分离血清。通过间接ELISA测量血清中的OVA特异性IgG1和IgG2c抗体。Costar EIA/RIA板(Corning Inc.，Corning，NY)通过用OVA(100μg/mL，在0.5M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，pH 9.6；Sigma)在4℃下培养过夜涂布。用PBS中的0.05％Tween20洗涤该板(3x)，并在37℃下用PBS中的1％山羊血清封闭1小时。血清样品和标准品(来自Cayman Chemical，Ann Arbor，MI的抗OVA IgG1；来自Chondrex，Redmond，WA的抗OVA IgG2c)用1％山羊血清稀释，加入板中，并在37℃下培养2小时。洗涤(3x)后，将板在37℃下与生物素化二级抗体(山羊抗小鼠IgG1或IgG2c，1:20000，1％山羊血清中；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)培养1小时。然后洗涤板(3x)并与链霉亲和素-HRP(1:1000，1％山羊血清中；BD Biosciences)一起培养30分钟。再次洗涤板(3x)并在室温下与4,4',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物(Sigma)一起培养2-3分钟，然后用1.0M H2SO4淬灭反应。对于所有ELISA，使用SpectraMax 340PC酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取450nm(OD450)处的吸光度，并根据标准曲线计算血清浓度。

为了评估OVA特异性细胞毒性T细胞(CTL)活性，对来自纯真

小鼠的脾细胞用2μg/ml OVA257-264(SIINFEKL)肽脉冲(pulse)1小时，或不脉冲。用高浓度羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，10μM)洗涤和染色经抗原脉冲的脾细胞，而未脉冲的脾细胞用低浓度CFSE(1μM)在37℃下标记15分钟。将脉冲的靶细胞和未脉冲的对照细胞(每个107个)的1:1混合物静脉内(IV)注射到免疫接种小鼠和纯真小鼠中。过继转移后20小时，分离小鼠脾脏，并通过流式细胞术比较抗原脉冲和未脉冲群来评估靶细胞的杀伤，以量化高CFSE标记的SIINFEKL脉冲靶的OVA特异性杀伤。计算特异性裂解，并表示为最大裂解的百分比，如％裂解＝{1-[(来自纯真小鼠的平均CFSE低/CFSE高比率)/(来自疫苗接种小鼠的CFSE低/CFSE高比率)]}×100。

皮内和非皮肤用途

除了皮肤疫苗接种之外，本文所述的MNA可用于广泛的皮内和非皮肤(例如，眼和心脏组织)药物递送应用。如图7A-D所示，在旋涂工艺中，可以使感兴趣的生物载荷位于微针的最尖端(即棱锥的一部分)，或者整个棱锥区域可以根据剂量要求加载生物载荷。图7A示出了在微针尖端引入了Texas Red标记的葡聚糖(大约40kDa分子量)的PVP/PVA MNA，而图7B示出了在微针的棱锥区域整合Allura Red R40染料(大约500Da分子量)的尖端加载的CMC/Treh MNA。

此外，可以执行多个重复的旋涂步骤以制造具有底切微针的高质量MNA，在其棱锥区域中包含多种载荷(图7C和7D)。图7C示出了引入多种载荷例如Texas Red标记的葡聚糖和Allura Red R40染料的尖端加载的PVP/PVA MNA，图7D示出了尖端加载的PVP/PVA MNA，其中引入多种载荷，例如Texas Red标记的葡聚糖和Alexa488标记的PLGA微粒(平均直径10μm)。

因此，所提出的方法和新颖的MNA设计与用于几种皮肤和非皮肤应用的单一和组合疗法兼容。重要的是，相同的生产模具可用于有效地制造具有底切微针的溶解性MNA数个循环(例如，图7A和7C分别示出了在使用t的第一个和第十二个循环后获得的MNA)。最重要的是，目前的研究证明了单(OVA)和多载荷(OVA+Poly(I:C))MNA的体内皮肤疫苗接种应用。

如在本文所述的系统和方法中使用的增材制造或3D打印提供了3D复杂几何形状的准确且可再现的制造，而没有设计限制，并且提供高度的设计灵活性和控制。使用这里的系统和方法，可以实现最佳应用驱动的药物递送系统的快速设计到制造周转。

不同的针几何形状

如上所述，本文公开的系统和方法为MNA设计提供了前所未有的设计灵活性水平。为了说明3D直接激光写入的几何能力范围，微针设计被制造为具有不同的几何形状。

图8A-8B显示该技术能够以高保真度制造各种微针几何形状，以实现应用驱动的优化。此外，如图8A-8B所示，它允许大范围的设计变化，包括高度、宽度、顶角和微针的几何形状，而不需要复杂和定制的工艺步骤。因此，该技术为应用驱动的独特MNA设计的设计和制造铺平了道路。

基于MNA的皮内疫苗递送至人皮肤

为了评估具有底切针的新型MNA的皮肤生物载荷递送特性，使用所提出的制造策略制造了尖端加载有Allura Red R40染料的MNA。如上所述制备人皮肤外植体。将加载有Allura Red R40染料的MNA应用于活的人类皮肤外植体，并在10分钟后移除。这些MNA在应用之前(图9A)和之后(图9B)的图像分别说明了高质量的MNA和微针的完全溶解。MNA嵌入的载荷(例如，Allura Red R40染料)在目标皮肤中的相应沉积物如图9C中所示。

通过角质层将疫苗成功递送到富含免疫细胞的皮肤微环境中对于有效的皮内免疫接种至关重要。为了从解剖学上评估OVA和Poly(I:C)向人体皮肤的递送，将引入了Alexa555标记的OVA和Alexa488标记的Poly(I:C)二者的CMC/Treh MNA应用于人体皮肤外植体10分钟，然后取出。使用Nikon透射荧光显微镜对目标人体皮肤进行冷冻切片和成像。组织学证明微针腔穿透表皮进入真皮(图9G)，以及荧光标记的OVA和Poly(I:C)递送至目标人体皮肤微环境(图9D-I：DAPI核染色，Alexa488标记的Poly(I:C)、Alexa555标记的OVA、明场、3种不同荧光颜色的叠加、所有荧光图像分别与明场图像的合并图像)。在图9D-I中，比例尺对应于100μm。

这些图像一起表明，所呈现的独特MNA满足了无故障(failure-free)人体皮肤渗透(即，突破角质层和有活力的表皮)的几何(即，尖锐的尖端和光滑的边缘)和机械强度要求，并且在皮肤的水性环境中有效溶解的材料要求，从而提供有效的皮肤药物和疫苗递送平台。

MNA引导的体内皮肤免疫接种

为了在小鼠体内研究使用新型MNA的皮内疫苗递送，如上所述制造具有引入了Alexa555标记的OVA和Alexa488标记的Poly(I:C)二者的高保真底切微针的CMC/Treh MNA。在应用之前，Alexa555-OVA+Alexa488-Poly(I:C)MNA使用明场光学显微镜和落射荧光显微镜成像(图10A)。然后将MNA应用于小鼠并在10分钟后移除。应用后剩余的MNA材料也使用明场光学显微镜成像(图10B)。针对Alexa488-Poly(I:C)和Alexa555-OVA二者，使用带滤波器的IVIS 200活动物成像系统对MNA处理的小鼠进行成像。Poly(I:C)和OVA的MNA引导共递送分别显示在图10C和10D。这些图像一起证明了新型MNA在小鼠体内的成功应用，以及进而MNA引导的有效皮肤药物和疫苗通过新的MNA设计递送。

在证明疫苗在体内成功皮内递送后，我们专门评估了MNA嵌入的抗原±佐剂的免疫原性，并将MNA免疫接种与通过临床常见的肌内(IM)注射途径进行的疫苗接种进行了比较。为此，如上所述，使用10μg OVA±25μg Poly(I:C)每个MNA来制造CMC/Treh MNA。我们和其他人之前已经表明，溶解性MNA整合蛋白可以保持其完整性。为了免疫接种，对于通过腹部进行IM和MNA免疫接种的小鼠，遵循方法部分中描述的疫苗接种方案。分别使用标准的体内裂解试验和ELISA对OVA特异性细胞毒性T细胞(CTL)和抗体应答进行量化。用MNA进行皮肤疫苗接种引发了强大的抗原特异性细胞免疫应答(图11A-B)。正如预期的那样，从纯真或未免疫接种的小鼠中回收到等量的抗原脉冲(CFSE高)靶细胞和未脉冲(CFSE低)靶细胞(图11A)，从而表明不存在抗原特异性细胞裂解活性。相比之下，抗原脉冲靶细胞的特异性裂解在免疫接种小鼠中显著增强，如OVA脉冲靶的存活率低于未脉冲靶所示的。具体而言，虽然在IM-OVA免疫接种的小鼠中观察到两个群体恢复的最小差异(图11A)，但用OVA-MNA免疫接种的小鼠在体内表现出更大的OVA特异性裂解，和显著地(与IM-OVA相比)更低的相比于未脉冲靶的OVA脉冲靶存活率和恢复率(图11A)。用OVA+Poly(I:C)免疫接种进一步改善了疫苗接种的性能(图11A)。通过标准技术对抗原特异性裂解的量化证实MNA免疫接种引发了有效的CTL免疫(图11B)，这通过包含佐剂Poly(I:C)得到进一步改善。相比之下，相对于未免疫接种的对照，IM免疫接种诱导了低水平的应答。总之，这些结果表明，这些MNA可以有效地将抗原±佐剂递送到皮肤内富含APC的微环境中，以诱导有效的CTL免疫应答。

除了CTL免疫之外，用MNA进行皮肤疫苗接种还引发了强大的抗原特异性体液免疫应答(图11C)。虽然用MNA和IM二者进行疫苗接种的小鼠会产生IgG应答，但用溶解性MNA进行疫苗接种的小鼠的IgG滴度显著更高，从而表明MNA技术在免疫接种工作中的重要性。最终，所提出的新型MNA提供了一个独特的机会，可以将嵌入的抗原±佐剂特异和精确地输送到皮肤内的特定微环境。例如，我们和其他人已经证明皮肤富含树突状细胞和其它抗原呈递细胞(APC)，这对疫苗诱导的免疫诱导至关重要。因此，使用MNA靶向皮肤APC通常是一种有效的疫苗接种策略，特别是用于诱导细胞介导的免疫应答，包括预防或治疗许多感染性疾病和癌症至关重要的CTL应答。因此，所提出的MNA技术可以实现与广泛的疫苗接种策略相关的能力。

因此，具有底切微针的新型溶解性MNA的开发和应用提供有效的皮内疫苗接种。独特的MNA设计包括棱锥头和带有圆角基底的底切杆区域。产生底切MNA的制造方法战略性地涉及3D激光打印和许多微模制工艺。使用不同的生物相容性和水溶性聚合物，成功且可重复地制造了具有引入了无数生物载荷的底切针的可溶性MNA。重要的是，3D激光打印前所未有的几何能力水平在应用驱动的MNA设计中得到了证明，适用于多种皮肤和非皮肤药物递送应用。引进的具有底切特征的新型MNA满足了人类和小鼠无故障皮肤渗透的强度要求，并成功地将其生物载荷递送到目标皮肤微环境。重要的是，使用模型抗原加载的MNA(OVA-MNA)的皮肤疫苗接种比通过传统肌肉注射(IM-OVA)获得的抗原特异性细胞和体液免疫应答更强效。最重要的是，相对于基于IM的疫苗接种，MNA引导的抗原(OVA)与佐剂(Poly(I:C))共同递送提高了疫苗的免疫原性，用作增强的MNA引导的皮肤疫苗接种。总之，所提出的方法提供了一种有效的方法，可以为广泛的皮肤和非皮肤药物递送应用制造新型溶解性MNA。

鉴于可以应用所公开的发明原理的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅是本发明的优选示例，不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由权利要求限定。因此，我们要求将落入这些权利要求的范围和精神内的所有内容作为我们的发明。

Claims (46)

1.一种形成微针阵列的方法，包括：

形成柔性材料的生产模具，该生产模具包括多个腔，这些腔被成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征，

将至少一种生物活性材料引入第一可溶性材料中以提供生物可降解基质，

将所述生物可降解基质递送到至少所述微针尖端部分中，所述微针尖端部分由生产模具的各自的腔所限定；

在生产模具中形成包括生物可降解基质的多个微针；和

通过将微针拉出模具，从生产模具中取出微针，

其中，柔性材料具有足够的弹性以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具中取出，而不损伤由模具限定的微针形状的完整性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个底切特征是直接在所述微针尖端下方。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述杆由所述第一可溶性材料形成。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述杆由不可溶性材料形成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多个微针阵列的形成包括将第二可溶性材料提供到所述生产模具中，以在与所述微针尖端相邻的杆部分处形成溶解性层。

6.根据权利要求5的方法，其中所述溶解性层的第二可溶性材料选自比包含生物活性材料的所述生物可降解或生物可溶性基质溶解得更快的材料。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，进一步包括形成背衬层，该背衬层邻近所述杆的下部。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述背衬层由所述可溶性材料形成。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述背衬层由不可溶性材料形成。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述背衬层由贴合性材料形成。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一可溶性材料包括羧甲基纤维素、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糊精、蚕丝、透明质酸、聚(乙烯醇)、聚乙二醇、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚(乳酸)或其组合。

12.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二可溶性材料包括小分子量快速溶解性聚合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二可溶性材料为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糊精、聚乙烯吡咯烷酮或其组合。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述贴合性材料为不溶性聚合物，其可以挠曲、变形或弯曲以贴合不均匀的皮肤形态。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物活性材料包括两种或更多种生物活性材料。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种生物活性材料包括化妆品、真皮填充剂、他汀、生长因子、止痛剂、抗组胺剂、维生素、麻醉剂、抗衰老剂、小分子药物、半抗原、过敏原、抗炎剂、蛋白质、肽、微囊泡、外泌体、多联体(siRNA、shRNA、DNA载体复合物)、重组病毒载体(即，腺病毒、慢病毒、痘苗病毒、腺相关病毒和它们的不同血清型)、单克隆和多克隆抗体、以及活细胞或裂解细胞。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述多个微针的形状包括圆形方尖碑(circular obelisk)、方形方尖碑(square obelisk)、斜面方尖碑(bevel obelisk)、方形杆上棱锥、杆上箭头形状、方形方尖碑(square obelisk)杆上棱锥头、圆形方尖碑(circular obelisk)杆上圆锥形头、方形方尖碑(square obelisk)、45°棱锥或30°棱锥。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多个微针进一步包括在所述背衬层和所述杆的交叉处的圆角部分。

19.通过权利要求1-18中任一项所述的方法形成的微针阵列。

20.一种使用单次拉拔模具形成的微针阵列，包括：

背衬层；

多个微针；和

与第一可溶性材料组合以形成生物可降解基质的至少一种生物活性材料，

其中，所述多个微针各自具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征。

21.根据权利要求20所述的微针阵列，其中所述底切特征位于所述杆和所述微针尖端的交叉处。

22.根据权利要求20或21所述的微针阵列，其中所述杆由所述第一可溶性材料形成。

23.根据权利要求20或21所述的微针阵列，其中所述杆由不可溶性材料形成。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的微针阵列，其中所述多个微针各自包含第二可溶性材料，该第二可溶性材料在邻近所述微针尖端的杆部分处形成快速溶解性层。

25.根据权利要求24所述的微针阵列，其中所述溶解性层的第二可溶性材料选自比包含所述生物活性材料的生物可降解基质溶解得更快的材料。

26.根据权利要求20-25所述的微针阵列，其中所述背衬层由所述可溶性材料形成。

27.根据权利要求20-25所述的微针阵列，其中所述背衬层由不可溶性材料形成。

28.根据权利要求20-27所述的微针阵列，其中所述背衬层由贴合性材料形成。

29.根据权利要求20-28所述的微针阵列，其中所述第一可溶性材料包括羧甲基纤维素、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糊精、蚕丝、透明质酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙烯醇)、聚乙二醇或其组合。

30.根据权利要求24或25所述的微针阵列，其中所述第二可溶性材料包括小分子量快速溶解性聚合物。

31.根据权利要求30所述的微针阵列，其中所述第二可溶性材料为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糊精或其组合。

32.根据权利要求28所述的微针阵列，其中所述贴合性材料是可弯曲以贴合不均匀皮肤形态的不溶性聚合物。

33.根据权利要求20-32所述的微针阵列，其中所述至少一种生物活性材料包括两种或更多种生物活性材料。

34.根据权利要求20-33所述的微针阵列，其中所述一种或更多种生物活性材料包括化妆品、真皮填充剂、他汀、生长因子、止痛剂、抗组胺剂、维生素、麻醉剂、抗衰老剂、小分子药物、半抗原、过敏原、抗炎剂、蛋白质、肽、微囊泡、外泌体、多联体(siRNA、shRNA、DNA载体复合物)、重组病毒载体(即，腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、腺相关病毒和它们不同的血清型)、单克隆和多克隆抗体、以及活细胞或裂解细胞。

35.根据权利要求20-34所述的微针阵列，其中所述多个微针的形状包括圆形方尖碑(circular obelisk)、方形方尖碑(square obelisk)、斜面方尖碑(bevel obelisk)、方形杆上棱锥、杆上箭头形状、方形方尖碑(square obelisk)杆上棱锥头、圆形方尖碑(circular obelisk)杆上圆锥形头、方形方尖碑(square obelisk)、45°棱锥或30°棱锥。

36.根据权利要求20-35所述的微针阵列，其中所述多个微针进一步包括在所述背衬层和所述杆的交叉处的圆角部分。

37.一种形成模具的方法，包括：

产生包括具有至少一个底切特征的多个微针的微针阵列的3D-CAD图；

使用所述3D-CAD图形成主微针阵列；

形成所述主微针阵列的至少一个复制品；和

使用所述至少一个复制品形成所述微针阵列的生产模具，

其中，所述生产模具由柔性材料形成。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述柔性材料具有足够的弹性以允许在单次拉拔中从所述生产模具取出模制的微针阵列，而不损伤由所述生产模具限定的所述多个微针的形状的完整性。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述至少一个复制品包括多个复制品，并且所述生产模具的形成包括形成微针阵列支架，和在所述微针阵列支架上将所述多个复制品组合在一起。

40.根据权利要求27-38中任一项所述的方法，其中所述微针阵列支架由树脂材料形成。

41.一种形成组织粘合贴片的方法，包括：

形成柔性材料的生产模具，该生产模具包括多个腔，这些腔被成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征，

将至少一种生物活性材料引入第一可溶性材料中以提供生物可降解基质，

将所述生物可降解基质递送到至少所述微针尖端部分中，所述微针尖端部分由所述生产模具的各自的腔限定；

在生产模具中形成包括生物可降解基质的多个微针；和

通过将微针拉出模具，从生产模具中取出微针，

其中，柔性材料具有足够的弹性以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具中取出，而不损伤由模具限定的微针的形状的完整性。

42.一种形成组织粘合贴片或微刺阵列的方法，包括：

形成柔性材料的生产模具，该生产模具包括多个腔，这些腔被成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征，

将至少一种生物活性材料引入第一可溶性材料中以提供生物可降解基质，

将所述生物可降解基质递送到至少所述微针尖端部分中，所述微针尖端部分由生产模具的各自的腔所限定；

在生产模具中形成包括所述生物可降解基质的多个微针；和

通过将微针拉出模具，从生产模具中取出微针，

其中，所述柔性材料具有足够的弹性以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具中取出，而不损伤由模具限定的微针的形状的完整性。

43.一种形成微针阵列的方法，包括：

形成柔性材料的生产模具，该生产模具包括多个腔，这些腔被成形为限定多个各自的微针，每个微针具有杆、微针尖端、圆角基底和至少一个底切特征，

在所述生产模具中形成多个微针；

通过将微针拉出模具，将微针从生产模具中取出；和

用生物活性成分涂布所述多个微针的至少一部分，

其中，所述柔性材料具有足够的弹性以允许在单次拉拔中将模制的微针阵列从生产模具中取出，而不损伤由模具限定的微针的形状的完整性。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，通过浸涂、空气喷涂或它们的组合，用所述生物活性成分涂布所述微针。

45.一种使用根据权利要求20-36之一形成的任何微针阵列的方法，该方法包括：

将所述微针阵列应用于目标皮肤区域，以皮内递送所述至少一种生物活性成分。

46.一种使用根据权利要求20-36之一形成的任何微针阵列的方法，该方法包括：

将所述微针阵列应用于非皮肤组织，以将所述至少一种生物活性成分递送到非皮肤组织。

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