CN113862295A - 一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点的应用 - Google Patents

一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点的应用，本发明发现了黄龙病菌鞭毛基体P‑ring蛋白作为效应子能够引起胼胝质沉积量显著，其抑制剂可用于防治柑橘黄龙病，在柑橘黄龙病防治领域具有很好的应用前景。同时，本发明利用酿酒酵母基因组小、培养简单、生命周期短、遗传操作稳定的特点，作为研究难培养菌CLas的效应子的模式生物。在酵母中过表达柑橘黄龙病菌效应子菌鞭毛基体P‑ring蛋白，扰乱了酿酒酵母的内在生理机能，导致酿酒酵母表型发生变化，抑制酵母细胞的增殖。同时在农杆菌介导下在本氏烟叶片中的瞬时表达，验证鉴定其可以诱导烟草叶片局部过敏性坏死及胼胝质沉积等植物防御反应。

Description

一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点 的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点的应用。
背景技术
柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter，Ca.L)属于α–变型菌纲(α-Proteobacteria)韧皮部杆菌属(Liberibacter)，是一种韧皮部专性寄生的革兰氏阴性细菌，其引起的柑橘黄龙病是世界范围内严重危害柑橘生产的重要病害之一。柑橘黄龙病菌可以感染所有柑橘品种和柑橘杂交种等芸香科植物，在柑橘生长周期的各个阶段都能被其感染，并最终导致树木死亡。植株感病初期新梢后新叶褪绿黄化，叶片黄绿相间呈斑驳状，中脉两侧斑纹不对称，类似缺素症状。染病一段时间后，叶片呈现出均匀黄化，叶片变厚，失去光泽，中脉和侧脉肿大。在感染后期，黄化症状会蔓延至整株，次年新生叶片小于前年，树势衰退、。果实在初期不显症，病势发展后，果实呈现红鼻果和青果两种典型症状，果肉汁少味淡，易脱落。柑橘果树发病几年后，叶片脱落的树枝从顶部向下干枯，直至死亡，严重影响了柑橘树的寿命。
通过对亚洲、美洲和非洲不同地区发现的黄龙病菌进行分析，根据16sDNA序列及进化分类分析将该病菌分为三个种：亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas)、非洲种(Candidatus.L.africanus，CLaf)和美洲种(Candidatus.L.americanus，Clam)。其中，亚洲种分布最为广泛，也是为害最为严重的。中国的柑橘黄龙病菌均为亚洲种，主要由柑橘木虱(Diaphorina citri)传播。目前黄龙病菌尚不能进行人工培养，难以进行传统的病原学研究，因此对其毒力机制的理解非常有限。黄龙病菌感染威胁世界范围内的柑橘经济产业，是目前最需要采取新型防控措施的柑橘类病原菌之一。
通过对柑橘黄龙病亚洲种菌株psy62的全基因组序列分析发现，柑橘黄龙病菌的基因组大小在1.23Mb左右，显著小于根瘤菌科的其他细菌。进一步研究显示柑橘黄龙病菌缺少或完全缺失几种生物合成途径、代谢酶和分泌系统。
其中，黄龙病菌基因组中缺少编码分泌毒力因子的重要途经III型分泌系统和Ⅳ型分泌系统及其效应因子的基因簇，但其拥有编码完整Sec分泌系统的基因，可以利用Sec分泌系统来释放效应因子。这些依赖Sec传递的效应因子含有N端分泌信号，能帮助其从病原菌细胞内转移至细胞外。以CLas中的保守基因编码的SDE1作为分子探针探究CLas毒力，研究结果表明，SDE1可与柑橘类木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶(PLCP)互相作用并抑制其活性。PLCP是一种增强植物防御反应的免疫相关蛋白酶，在易感病树木内其蛋白质大量累积，表明其参与柑橘的防御反应。在本氏烟草叶片细胞中短暂表达后，SDE1还会诱导淀粉形成和黄萎病。
CLas还有许多可能激活植物防御系统的PAMP的效应因子。CLas含有一个功能性的Fla基因，该基因编码一种鞭毛蛋白和钩状相关蛋白，该蛋白含有一段保守的flg22多肽序列。Fla在本氏烟中进行瞬时表达，能引起胼胝质沉积和细胞坏死，同时上调BAK1、STG1和植物先天免疫相关的基因。因此，CLas的鞭毛蛋白可能作为PAMP引发宿主对其的抗性。
因此，深入研究黄龙病菌效应子和寄主之间的相互作用及其生物学功能，进一步筛选能有效拮抗柑橘黄龙病菌的新型药物，对揭示柑橘黄龙病病原致病机理和发展新型黄龙病防控措施具有重要的理论和实际意义。CN201910663478.5公开了两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法，但是其适用于黄龙病生防菌，目前缺少一种筛选能有效拮抗柑橘黄龙病菌的新型药物的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一个柑橘黄龙病菌效应子作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物的靶点的应用。
本发明的第一个目的是提供一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种柑橘黄龙病菌的防治制剂。
本发明的第六个目的是提供柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物的靶点的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
1.利用遗传背景简单，易于培养的营养缺陷型酿酒酵母菌株W303-1A和酿酒酵母蛋白表达载体pYES3/CT建立异源表达系统，构建含CLa1305效应子的重组表达菌株，在酿酒酵母中异源表达黄龙病菌基因，观察酿酒酵母表型，判断潜在致病因子是否具有功能。
2.利用SignalP-5.0对psy62菌株的CLIBASIA 01305基因进行预测分析，并对其信号肽分泌功能加以实验验证。
3.将效应因子CLa1305构建至含35S Promoter的pCAMBIA 35S-eGFP双元表达载体上，转化至根瘤农杆菌GV3101菌株中。以6～8周龄的本氏烟草为实验材料，构建了基于本氏烟草的瞬时表达系统，将含重组质粒的农杆菌注射到烟草叶背面，以乙酰丁香酮作为信号分子诱导T-DNA整合到植物基因组上进行瞬时表达。对效应因子诱导的烟草叶片过敏性坏死反应、胼胝质沉积等植物防御反应进行了分析，鉴定该效应因子具有的生物学功能。
因此本发明要求保护以下内容：
一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
一种柑橘黄龙病菌的防治制剂，含所述的柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂和/或所述的柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂。
柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物靶点的应用。
以及，柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在筛选抑制柑橘黄龙病菌药物中的应用。
优选地，将含携带有柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的重组质粒的重组酵母与候选药物混合培养，检测重组酵母生长活性。
更优选地，将含有所述重组酵母的培养液用培养基稀释100倍后与候选药物混合培养。
进一步更优选地，候选药物在混合培养的体系中终浓度为33.33μM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现了黄龙病菌菌鞭毛基体P-ring蛋白作为效应子能够引起胼胝质沉积量显著，其抑制剂可用于防治柑橘黄龙病，在柑橘黄龙病防治领域具有很好的应用前景。同时，本发明利用酿酒酵母基因组小、培养简单、生命周期短、遗传操作稳定的特点，作为研究难培养菌CLas的效应子的模式生物。在酵母中过表达的柑橘黄龙病菌效应子菌鞭毛基体P-ring蛋白编码基因扰乱了酿酒酵母的内在生理机能，导致酿酒酵母表型发生变化，抑制酵母细胞的增殖。同时在农杆菌介导下在本氏烟叶片中的瞬时表达验证鉴定其可以诱导烟草叶片局部过敏性坏死及胼胝质沉积等植物防御反应。
附图说明
图1是CLa1305效应子抑制酿酒酵母细胞生长表型的结果图。
图2是CLa1305效应子抑制酿酒酵母细胞活力的结果分析图。
图3是利用SignalP 5.0预测CLa1305的信号肽结果分析图。
图4是CLa1305蛋白信号肽分泌功能验证的结果图。
图5是在烟草叶片中过表达CLa1305效应子引起的烟草叶片表皮细胞过敏性坏死结果图。
图6是在烟草叶片内过表达CLa1305效应子(图A)和空载对照(图B)后，叶片经苯胺蓝染色的胼胝质沉积显微镜图。
图7为有效抑制CLa1305效应子的化合物及其活性；Solvent control为添加浓度为33.33μM的溶剂对照，pYES为正对照，1305为负对照。(*，0.01＜P＜0.05；**，＜P＜0.01)
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1含CLa1305效应子的酵母表达菌株构建
1、PCR扩增目的片段
以柑橘黄龙病亚洲种菌株psy62基因组DNA为模板扩增CLIBASIA——01305基因(CLa1305，编码鞭毛基体P-ring蛋白GenBank:ACT56849.1)片段，反应体系如表1所示，其中，上游引物F：CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGATTTTTCGTATAGCTTTTTTGATTTTTTC，下游引物R：TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTGAATTATAATCTCTGATTGAAGGGCGCCCG，。
表1 PCR反应体系：
Figure BDA0003129311190000051
PCR扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环，再72℃延伸5min，12℃保存。
2、连接转化
PCR反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，通过非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒将该片段连接到pYES3载体上，获得连接产物。取连接产物加入到DH5α感受态细胞进行热击转化涂板，37℃过夜培养。挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，选分子量大小正确的菌落摇菌后提取质粒，测序鉴定序列的正确性。
3、重组酵母菌株的构建
将序列正确的转化子的质粒pYES3-CLIBASIA-01305和pYES3空载分别采取用热击转化法转化至W303-1A感受态酿酒酵母细胞得到酵母菌株p-1305和pYES3，涂板于色氨酸缺陷培养基SD-T，30℃培养2d，挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，选分子量大小正确的菌落摇菌后提取质粒送去测序，序列正确的菌落进行摇菌，-80℃保存。
实施例2 CLa1305效应子对酿酒酵母细胞生长表型的影响检测
一、实验方法
从-80℃取出实施例1制备得到的酵母菌株p-1305，以及阳性对照菌株p-exoY(表达绿脓杆菌III型分泌系统分泌的毒蛋白ExoY)和阴性对照菌株携带pYES3空载体，分别在色氨酸缺陷板SD-T平板上划线活化，30℃培养2d后，取单菌落于3ml SD-T液体培养基中30℃过夜培养。取2ml过夜培养菌液，用双蒸水洗涤2次后，将菌液OD600调整为1.0。以10为梯度稀释5次，分别取15μl点于SD Trp抑制培养基和SC-Trp诱导培养基上，30℃培养2～3天，观察生长状况，拍照记录。
二、实验结果
结果如图1所示，同阳性对照p-exoY和阴性对照pYES3空载对照相比，CLa1305显著抑制酿酒酵母细胞的生长。
实施例3 CLa1305效应因子的表达对酵母细胞活力影响的测定
一、实验方法
将携带候选效应因子CLa1305和空载质粒的实施例1制备得到的酵母单菌落p-1305和pYES3分别在3ml抑制培养基SD-T中过夜培养，30℃，250rpm。取过夜培养菌液10000rpm，3min离心去上清，用新鲜SD-T培养基重悬，并将OD600调整为0.5。继续培养2h后，10000rpm，3min离心去上清，用SC-T培养基重悬，并将OD600调整为0.2，于30℃条件下培养55h。选取十个时间段分别取等量培养液稀释涂板于SD-T固体培养基上，连续稀释5个梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每组3个重复，取100μl菌液进行涂板，30℃培养48h后对单菌落进行计数。
二、实验结果
结果如图2所示，实验组(携带表达CLa1305的酵母株p-1305)菌株在培养基中生长5、10、20、24、和30小时的细胞浓度(cfu/ml)均显著低于对照组(携带空质粒pYES3)菌株，表明效应因子CLa1305在液体培养基中也有效抑制酵母细胞的增殖，影响酵母细胞的活力。
实施例4利用SignalP 5.0对CLa1305效应子进行信号肽预测
一、实验方法
将候选效应因子CLa1305氨基酸序列(GenBank：ACT56849.1)输入信号肽在线预测网站SignalP-5.0的检索框，提交后获得信号肽分析结果。
二、实验结果
结果如图3所示，该蛋白在20和21位氨基酸之间存在信号肽切割位点。因此，CLa1305可能通过信号肽分泌到胞外。
实施例5 CLa1305信号肽分泌功能的表达菌株构建
phoA是大肠杆菌中编码碱性磷酸酶的基因，在其N端有一段19aa的信号肽，可帮助碱性磷酸酶分泌至胞外，将BCIP水解成蓝色的底物，常被用来研究蛋白的胞外分泌特性。基于CLas的Sec元件与E.coli中的对应物具有28％～50％的一致性和52％～70％的相似性，并且CLas lepB编码的信号肽切割酶I与E.coli中的对应物有37％的一致性和57％的相似性，证明以E.coli为模型的碱性磷酸酶phoA分析确认CLas信号肽的方法是可行的(PrasadS,Xu J,Zhang Y,et al.SEC-Translocon Dependent Extracytoplasmic Proteins ofCandidatus Liberibacter asiaticus.Frontiers in Microbiology,2016,7(e84469):1989)。
以大肠杆菌BL21基因组(以E.coli为模型的碱性磷酸酶phoA分析)DNA为模板扩增phoA基因片段，反应体系如表2，其中，引物P1为：TGCCGCGCGGCAGCCATATGAAACAAAGCACTATTGCACT，引物P2为：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGAGCGG。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003129311190000071
以BL21基因组DNA为模板扩增去信号肽的mphoA基因片段，反应体系如表3，其中，引物P3为TGCCGCGCGGCAGCCATATGCCAGAAATGCCTGTTCTGGAA，引物P2为：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGAGCGG。
表3 PCR反应体系：
Figure BDA0003129311190000072
以CLas基因组DNA为模板扩增CLa1305的信号肽片段(1305-sp)，
反应体系如表4所示，
其中，引物P4为：TGCCGCGCGGCAGCCATATGATTTTTCGTATAGCTTTTTT，
引物P5为：TTCCAGAACAGGCATTTCTGGTGCTGATATCTCATGCAA。
表4 PCR反应体系
Figure BDA0003129311190000081
以上反应的PCR扩增条件为：98℃预变性30s，98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，12℃保存。
PCR反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段phoA、mphoA和1305-sp。利用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒将phoA和mphoA分别和载体pET28a进行连接，1305-sp和mphoA通过非连接酶依赖型多片段快速克隆试剂盒连接进入载体pET28a。获得的连接产物加入DH5α感受态细胞进行热击转化37℃过夜培养。挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，选分子量大小正确的菌落摇菌，进行质粒抽提，并送测序。
将序列正确的转化子pET28a-phoA、pET28a-mphoA和pET28a-1305-sp-mphoA通过热击转化法转化到BL21菌株中，涂板于含50μg/ml卡纳抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，将PCR产物送去测序，选取序列正确的菌落进行摇菌，-80℃保存。
实施例6 CLa1305的信号肽分泌功能
一、实验方法
挑取实施例5得到的转化子pET28a-phoA、pET28a-mphoA和pET28a-1305-sp-mphoA分别转化到BL21菌株中的阳性克隆，于3ml含50μg/ml卡纳抗生素的LB液体培养基中，37℃培养3h，待OD600达到0.8时，用移液枪吸取3μl菌液点板至含75mM NaH2PO4、90μg/ml BCIP、0.2M IPTG、50μg/ml卡纳抗生素的LB固体板上，每组4个重复，37℃培养8h后观察拍照。在LB培养基中添加碱性磷酸酶显色底物BCIP和内源性磷酸酶活性抑制剂Na2HPO4，蓝色菌斑表示碱性磷酸酶在插入基因信号肽作用下被分泌至细胞外使显色底物变蓝，即融合蛋白信号肽具有分泌活性，白色菌斑则表示无信号肽作用。
二、实验结果
结果如图4所示，在IPTG的诱导下，含有CLa1305信号肽的单菌落(pET28a-1305-sp-mphoA)同正对照均呈蓝色，而缺少信号肽的负对照单菌落则呈白色，表明CLa1305的信号肽具有分泌活性。
实施例7含CLa1305双元载体的构建
一、实验方法
以柑橘黄龙病亚洲种菌株psy62基因组DNA为模板扩增CLa1305目的片段，反应体系同表1，其中引物P6为：TGCTCTAGAATGATTTTTCGTATAGCTTTTTTGATTTTTTC，和引物P7为：CGCGGATCCTTGAATTATAATCTCTGATTGAAGGGCGCCCG。
PCR扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环，再72℃延伸5min，12℃保存。
PCR反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，将该片段连接到pCAMBIA35S-eGFP载体的eGFP前面，获得连接产物。取连接产物加入到DH5α感受态细胞进行热击转化涂板，37℃过夜培养。挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，选分子量大小正确的菌落摇菌后提取质粒送去测序。
将序列正确的转化子及pCAMBIA35S-eGFP空载分别采取热击转化法转化至GV3101感受态细胞，涂于含100μg/ml卡那抗生素和50μg/ml利福平抗生素的LB平板上，28℃培养2d，挑取平板上长出的单菌落进行菌落PCR，选分子量大小正确的菌落摇菌后提取质粒送去测序，序列正确的菌落进行摇菌，-80℃保存。
在此，将转化序列正确的转化子及pCAMBIA35S-eGFP空载的GV3101重组农杆菌菌株分别命名为p35S-1305-eGFP和p35S-eGFP。
实施例8 CLa1305效应子引起的烟草细胞过敏性坏死检测
一、实验方法
从-80℃取出实施例7制备得到的农杆菌菌株(p35S-1305-eGFP和p35S-eGFP)，分别在含100μg/ml卡纳抗生素和50μg/ml利福平抗生素的LB平板上划线活化，28℃培养2～3d。取单菌落于3ml含50μg/m利福平抗生素和100μg/ml卡纳抗生素的LB培养基中，28℃、250rpm培养12h。
取1ml过夜培养物加入25ml含相应抗生素的LB中，同时加入20μM乙酰丁香酮，28℃、250rpm再培养12h。将菌液5000×g离心15min后，用含100μM AS的重悬液洗涤菌体3次，将OD600值调整至0.6，室温静置2～3h。侵染烟草叶片之前，将6～8周龄的烟草在白光下放置1h，使叶片气孔张开。用去掉针头的1ml注射器，将菌液注射到烟草叶片背面，选择从顶部起第3～4片叶片，于黑暗中放置2～3h。将侵染后的烟草转移至培养箱，3d后观察结果并拍照。
二、实验结果
结果如图5所示，设立pC35S-eGFP空载体为阴性对照组，显示效应子CLa1305在烟草叶片内的瞬时表达能引起烟草细胞呈现明显的免疫坏死斑，而阴性对照无明显坏死反应。
实施例9含CLa1305效应子的农杆菌感染烟草叶片后的胼胝质沉积检测
一、实验方法
侵染方法同实施例8，选取分别被p35S-1305-eGFP和p35S-eGFP侵染4d后的烟草叶片，剪取注射孔附近1cm×1cm的小方块叶片。
将叶片置于叶片脱色溶液(150ml无水乙醇和50ml乙酸混合液)中2.5h，使叶片脱去叶绿素。用滤纸吸掉叶片上的水分，依次转至70％乙醇和50％乙醇，分别浸泡2h。然后转至10％NaOH浸泡2h。取出叶片，用去离子水漂洗3～4次。将叶片放至0.01％苯胺蓝溶液中染色2h。然后用去离子水漂洗3～4次，用Leica倒置荧光显微镜进行观察并拍照。
二、实验结果
结果如图6所示，与pC35S-eGFP空载对照组(图B)进行比较，CLa1305效应子(图A)在烟草叶片内引起胼胝质沉积量显著。
实施例10利用CLa1305效应子筛选具有抗柑橘黄龙病的化合物
利用酿酒酵母研究细菌毒力蛋白的方法已被证明是一种有效的替代细菌感染的模型，且酿酒酵母非常适合于筛选小分子抑制剂来抑制过表达蛋白。在以酿酒酵母建立的异源表达系统中筛选到CLa1305效应子能有效抑制酵母细胞的生长。本实施例将以Cla1305效应子为靶标筛选能够抑制效应蛋白活性的抑制剂。
一、实验方法
1、菌株及质粒
所用菌株为酿酒酵母W303-1A(基因型：MATa ura3-1 leu2-3,112trp1-1 his3-11,15can1-100 ade2-1)，载体为酵母表达载体pYES3/CT(表达载体含Amp抗性基因)，实施例1制备的pYES3-CLIBASIA-01305(pYES3携带CLIBASIA 1305全长，参见实施例1)，以上菌株和载体均为实验室保存。
2、小分子化合物的筛选
筛选所用到的化合物来源为：国家小分子化合物资源中心(National CompoundResource Center)的502个从天然植物等来源中分离的单体化合物及4406个从植物和微生物中获取的未知活性天然产物；550个APExBIO的L1039系列的天然产物，购于上海伟寰生物科技有限公司；1058个TOPSCIENCE的L6000系列的天然产物，购于上海陶素生化科技有限公司；华南农业大学崔紫宁课题组提供的75个合成化合物。化合物均溶解在二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中，且平均纯度大于95％。这些天然产物具有含黄酮类、生物碱类在内的30多种化合物类型，结构多样性丰富。
3、基于酵母细胞活性的效应子抑制剂的初筛
以酿酒酵母W303-1A为模型，从6042个化合物中初步筛选对酵母生长产生抑制作用的化合物。以100μL的体系进行化合物筛选，具体步骤如下：
(1)活化含目的基因pYES3-CLa1305和对照pYES3/CT的W303-1A菌株，取单菌落于3mL SD-Trp培养液中，30℃，250rpm培养过夜。
(2)取2mL过夜培养物，10000×g离心1min。用ddH2O重悬菌体，洗涤2～3次。
(3)用SC-Trp培养液重悬菌体，并将OD600值调整为1.0。
(4)将受试化合物0.33μL和用SC-Trp培养基稀释100倍后的酵母菌株共100μL混合液，用多通道移液器分装至96微孔板中，使化合物终浓度为33.33μM。
(5)设立含0.33％DMSO的菌液为对照组，pYES3空载表达菌株为阴性对照，pYES3-CLa1305效应子表达菌株为阳性对照。用封口膜将96孔板四周封住，30℃、250rpm振荡培养48h。
(6)用酶标仪测量在600nm处的吸光度，检测细胞生长活性。
根据所测的吸光值计算受试化合物对酵母生长的恢复程度，计算公式如下：
Figure BDA0003129311190000111
注：TEST，为pyes3-CLa1305效应子过表达菌株+受试小分子化合物；CONTAR，为pyes3-CLa1305效应子过表达菌株+DMSO；CONVEC，为pyes3空载体过表达菌株+DMSO。
当生长恢复数值大于30％时，认为该药物对恢复酵母生长有作用。
4、基于酵母细胞活性的效应子抑制剂的复筛
将初筛中生长回复数值(Growth restoration％)达到30％～80％之间的化合物挑出来进行第二次复筛，共挑选出196个化合物。筛选方式同上一步。
二、实验结果
携带效应子CLa1305质粒的酵母菌株，在半乳糖的诱导下表达的效应蛋白CLa1305可以抑制酵母活性和生长速率。本实验将以CLa1305效应子为靶标筛选能够抑制效应蛋白CLa1305活性的抑制剂。
将待筛选的化合物加入到诱导培养基内与携带效应子CLa1305质粒的酵母菌株进行共培养，震荡培养48h后，通过吸光度法(OD600)对细胞生长活性进行检测。在获得的小分子化合物中进行筛选，通过计算生长恢复数值百分比得出，在初次筛选中的化合物中有部分化合物对含效应子CLa1305的酵母的生长有不同程度的恢复作用，生长回复数值在30％～80％之间。
对初筛获得的化合物进行复筛，通过对酵母生长恢复数值的计算，筛选对效应子CLa1305存在不同程度的抑制作用的化合物，部分化合物的抑制效果如图7所示：其中化合物二的效果最为显著，生长恢复指数高达93％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用，其特征在于，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
2.一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在防治柑橘黄龙病中的应用，其特征在于，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
3.一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用，其特征在于，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
4.一种柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂在制备防治柑橘黄龙病的制剂中的应用，其特征在于，所述柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在NCBI GenBank的登录号为ACT56849.1。
5.一种柑橘黄龙病菌的防治制剂，其特征在于，含有权利要求1中所述的柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的抑制剂和/或权利要求2中所述的柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白的编码基因的抑制剂。
6.柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白作为筛选抗柑橘黄龙病菌药物的靶点的应用。
7.柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白在筛选抑制柑橘黄龙病菌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将含携带有柑橘黄龙病菌鞭毛基体P-ring蛋白编码基因的重组质粒的重组酵母与候选药物混合培养，检测重组酵母生长活性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将含有所述重组酵母的培养液用培养基稀释100倍后与候选药物混合培养。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，候选药物在混合培养的体系中终浓度为33.33μM。
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