CN113862162A - 一种球毛壳菌及其在制备防治小麦纹枯病药剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种球毛壳菌，球毛壳菌为球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)12CG5‑11菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月4日，保藏编号为CGMCCNo.19939，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为球毛壳菌Chaetomiumglobosum，以小米粒培养基发酵产球毛壳菌孢子液，并将其应用于制备防治小麦纹枯病的药剂中，田间试验结果表明在小麦播种期使用球毛壳菌12CG5‑11孢子液喷施后，对拔节期和成熟期小麦纹枯病的防效分别达47.83％和53.40％。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一种球毛壳菌及其在制备防治小麦纹枯病药剂中的应用。
背景技术
利用微生物菌剂拌种促进植物生长是目前热门的研究方向。植物体中的内生真菌，作为一种新的微生物资源及其产生的天然活性物质，已经得到了越来越多的关注。
球毛壳菌是毛壳属中的重要菌群，属于子囊菌亚门(Aseomyeotina)、核菌纲(Pyrenomyeetes)、球壳目(Sphaeriales)、黑孢壳科(Melanosporaceae)、毛壳菌属(Chaetomium spp.)，是常见的植物内生真菌，广泛分布于空气、土壤等多种自然环境中，该类微生物能定殖植物根部，促进植物的营养吸收，对多种植物病原菌有较好的拮抗作用，目前尚未有球毛壳菌防治田间小麦纹枯病的报道。
因此，如何提供一种可以防治田间小麦纹枯病的球毛壳菌并对其进行应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种球毛壳菌及其在制备防治小麦纹枯病药剂中的应用
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种球毛壳菌，所述球毛壳菌为球毛壳菌(Chaetomium globosum)12CG 5-11菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月4日，保藏编号为CGMCC No.19939，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为球毛壳菌Chaetomium globosum。
作为与上述技术方案相同发明构思，本发明还请求保护一种球毛壳菌孢子液的制备方法，包括下述过程：
1)将球毛壳菌12CG 5-11接种于PDA培养基中，25-28℃培养15d后，获得菌饼；
2)将菌饼接种到小米粒培养基中，25-28℃培养15d后转入灭菌的牛皮纸袋中继续培养7d，使后期含水量控制在6％以内，然后向培养基中加水洗搓，静置30-60min，用三层纱布过滤，得球毛壳菌孢子液。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述小米粒培养基制备方法为：将小米粒用水浸泡12h，然后装入发酵袋后灭菌1h，放置1-2d，再次灭菌30min，得小米粒培养基。
作为上述技术方案优选的技术方案，发酵培养过程为：25-28℃培养15d 后转入灭菌的牛皮纸袋中继续培养7d，使后期含水量控制在6％以内。
作为上述技术方案优选的技术方案，加水搓洗的具体过程为：将牛皮纸袋中的培养产物倒入无菌塑料发酵袋中，按照3mL/g的比例倒入无菌蒸馏水，反复揉搓后，静置30-60min，用三层无菌纱布过滤，然后倒入50mL离心管， 2000r/min下离心2分钟，弃掉上清，使孢子液浓度浓缩至2～4×108个/mL。
作为与上述技术方案相同发明构思，本发明还请求保护上述球毛壳菌在制备防治小麦纹枯病药剂中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种球毛壳菌12CG 5-11菌株，用灭菌后的小米粒进行发酵培养，25-28℃下培养21 天后，产孢量达1.25亿/克；田间试验结果表明在小麦播种期使用球毛壳菌 12CG 5-11孢子液喷施后，对拔节期和成熟期小麦纹枯病的防效分别达47.83％和53.40％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为麦粒和小米粒培养21天后球毛壳菌12CG 5-11的产孢量；其中，左图表示麦粒培养基，右图表示小米粒培养基。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种球毛壳菌株及其应用；其中，球毛壳菌 (Chaetomiumglobosum)12CG 5-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月4日，保藏编号为CGMCC No.19939，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为球毛壳菌 Chaetomium globosum。
实施例1球毛壳菌株的分离
于小麦灌浆期，在河南省长葛县采集小麦田中未发病的植株装纸袋中。样品置于4℃的冰箱保存。将样品根部冲洗干净，然后取小麦根部组织2-3cm，用体积分数75％无水乙醇表面消毒10-30s，质量分数1％NaClO消毒1.5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后，剪成0.5cm左右的小段，用无菌的镊子放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，原料组成为：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g及蒸馏水1000ml)平板上，在20℃下培养5-7天后，挑去边缘菌丝于新的PDA平板上生长，同样条件下5-7天后，挑取菌落均匀的菌丝块置于PDA斜面上培养，置于4℃保存。
实施例2DNA提取
将菌丝块挑取至PDA培养基上，20℃培养5-7天后，挑取5块边缘菌丝块均匀地放置到铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上。3-5天后用灭菌的小铁铲刮取菌丝，并用液氮速冻，存放在-20℃的冰箱里。提取DNA时，取出20-25mg 菌丝入预冷的1.5ml的EP管中；加入少许液氮用预冷的铁钉在EP管中将菌丝研磨至粉末；加入500μL Extraction Buffer(50mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，100mM EDTA(8.0))，在漩涡振荡器上振荡悬浮沉淀并混匀；然后加入预热的25μL(质量分数为20％)的十二烷基磺酸钠，颠倒混匀，在37℃水浴锅中放置1-3h；然后加入75μL的5M NaCl，颠倒混匀；加入65μL的 CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)溶液，65℃水浴30min；加入等体积的(700μL)Tris-酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，混匀，10000rpm， 4℃离心10min，将上清(550μL)转移至另一个EP管中；然后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇(330μL)，-20℃沉淀10分钟，10000rpm，4℃离心10 分钟，弃上清；沉淀用质量分数70％的乙醇洗涤两次，放入工作台风干 5-10min；干燥后的沉淀溶于适量的无菌ddH2O中，-20℃保存。
实施例3鉴定
本试验采用引物ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，如SE ID NO.1所示)和ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’，如SEQ ID NO.2 所示)扩增待测菌株的包含ITS1、5.8S rDNA和ITS2的DNA片段。体系参考Daval et al.(2010)。扩增反应条件：PCR反应程序为：95℃3min；95℃ 45s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR产物测序后，在NCBI中进行BLAST序列比对分析，序列比对结果为该菌株为球毛壳菌。该 ITS序列在NCBI上的登录号为OK287116，将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月4日，保藏编号为 CGMCC No.19939，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为Chaetomium globosum12CG 5-11。
PCR反应体系如表1所示；
表1
实施例4制备球毛壳菌12CG 5-11孢子液
1)将球毛壳菌12CG 5-11接种于PDA培养基中，25-28℃培养15d后，获得菌饼；
2)将菌饼接种到小米粒培养基中，25-28℃培养15d后转入灭菌的牛皮纸袋中继续培养7d，使后期含水量控制在6％以内，然后向培养基中加水洗搓，静置30-60min，用三层纱布过滤，得球毛壳菌孢子液。
其中，小米粒培养基制备方法为：将小米粒用水浸泡12h，然后装入发酵袋后灭菌1h，放置1-2d，再次灭菌30min，得小米粒培养基；
加水搓洗和浓缩的具体过程为：将牛皮纸袋中的培养产物倒入无菌塑料发酵袋中，按照3mL/g的比例倒入无菌蒸馏水，反复揉搓后，静置30-60min，用三层无菌纱布过滤，然后倒入50mL离心管，2000r/min下离心2分钟，弃掉上清，使孢子液浓度浓缩至2～4×108个/mL。
实施例5不同温度下球毛壳菌12CG 5-11生长速度比较
用无菌牙签挑取球毛壳菌12CG 5-11菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA，原料组成为：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g及蒸馏水1000ml) 平板上，在20℃下培养5-7天后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，接种在直径9cm的PDA平板中央，每个平板接种1个菌丝块，分别置于20℃、 25℃、28℃、30℃和35℃温度下培养，每个温度4个重复，每24h测量球毛壳菌菌落直径，至生长速度最快的温度下平板长满球毛壳菌菌落，计算不同处理球毛壳菌菌丝每日生长速度；如表2所示；
表2球毛壳菌12CG 5-11在不同温度下的生长速度比较
由表2可知，球毛壳菌的生长受温度影响较大，在20℃下，平均生长速度仅为0.29cm/天，随着培养温度的升高，菌丝生长速度加快。在25℃下，平均生长速度为0.54cm/天，在28℃下达到最高值，为0.76cm/天，随着温度的进一步升高，菌丝生长受到抑制，在35℃下，平均生长速度下降到0.16cm/ 天。25℃和28℃温度下，菌丝的平均生长速度与其他温度条件相比，在0.05 水平上均有显著性差异。因此球毛壳菌的适宜培养温度为25-28℃。
实施例6不同发酵配方培养后的产孢量比较
将麦粒和小米粒分别用水浸泡12h，装入发酵袋后灭菌1h，放置1-2天后，再次灭菌30min。将球毛壳菌12CG 5-11接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25℃下培养15天后，将菌饼接种到上述两种发酵培养基上，每袋接种一个培养皿的菌饼量，封袋后将菌饼揉碎，并与发酵培养基混合均匀。25℃温度下培养14天和21天后，分别统计产孢量。具体方法为：对每袋发酵料进行称重，加一定量的水洗搓，静置30-60min后，用三层纱布过滤，得到球毛壳菌12CG 5-11孢子液，用血球计数板统计孢子浓度，用如下公式获得产孢量：结果如表3和图1；
表3两种发酵培养基在培养不同时期的产孢量比较
由表3可知，球毛壳菌在小米粒培养基上产孢量较大，在14天已达到0.40 亿/每克，21天后达到1.25亿/克；在麦粒培养基上培养14天产孢量为0.06 亿/克，21天为0.11亿/克。图1为分别用麦粒和小米粒培养21天的球毛壳菌 12CG 5-11产孢情况，用小米粒培养基产生的孢子量明显多于麦粒培养基。因此球毛壳菌12CG 5-11的适宜培养条件为用小米粒培养基培养21天。
实施例7培养后期干燥处理对杂菌的控制作用
在球毛壳菌发酵培养的后期，含水量需要进行控制，过高会引起杂菌率升高。本实验比较了发酵培养后期两种不同含水量条件下的杂菌率，在培养 15天后，将部分发酵料置于灭过菌的牛皮纸袋中继续培养，对照则继续在塑料发酵袋中培养，7天后，测定两种处理下的含水量和杂菌率。含水量测定方法为取出少量发酵料称重(鲜重)，烘箱80℃下干燥3h，再次称重(干重)，含水量公式如下。杂菌率测定方法根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 2321-2013的方法，称取10g发酵料加入装有100mL无菌水的锥形瓶中静置 20min，经过10倍系列稀释后，吸取0.1mL菌悬液，加至PDA平板上，无菌涂布棒进行涂布，25℃下培养3天，观察并记录杂菌数和有效活菌数(未发现有霉菌及其他真菌杂菌)，杂菌率公式如下：
含水量(％)＝(鲜重-干重)/鲜重×100
杂菌率(％)＝杂菌数/(杂菌数+有效活菌数)×100
表4发酵培养15天后不同含水量条件下培养后杂菌率比较
| 处理 | 含水量(％) | 杂菌率(％) |
| 干燥处理 | <6 | 0 |
| 对照 | >75 | >90 |
由表4可知，发酵培养15天后转入牛皮纸袋继续培养到21天时，含水量降低到6％以内，杂菌率为0，而空白对照含水量高达75％以上，杂菌率为90％以上。说明发酵培养15天后转入牛皮纸袋可以使发酵料后期保持干燥状态，有效控制杂菌含量。
实施例8球毛壳菌孢子液喷施对田间小麦纹枯病的防治效果
田间防治小麦纹枯病试验在南阳市唐河县周庙村进行，于2020年11月7 日播种小麦品种郑麦119。2020年11月8日喷施球毛壳菌12CG 5-11孢子液，将浓缩的、存放于4℃的球毛壳菌12CG 5-11孢子液加水稀释至浓度为 1×107个/mL，按照每平方米0.5L的用量进行喷施，以清水喷施作为对照，每小区面积20m2，设置4个重复。分别于2021年3月20日(小麦拔节期) 和5月31日(小麦成熟期)调查纹枯病发病情况。调查方法按照国标GB/T17980.108—2004的方法，即每小区对角线五点取样，每点调查100株，记录发病情况，分级方法为，0级：不发病；1级：叶鞘发病但茎杆不发病；3级：叶鞘发病，并侵入茎，但茎杆病斑环茎不足1/2；5级：茎杆病斑环茎超过1/ 2，但不倒伏或折断；7级：枯死、倒伏、枯白穗；防治效果见表5；
表5球毛壳菌孢子液喷施对田间小麦纹枯病的防治效果
| 拔节期病指 | 防效(％) | 成熟期病指 | 防效(％) | |
| 12CG5-11孢子液 | 1.80±0.32 | 47.83 | 26.16±1.58 | 53.40 |
| 空白对照 | 3.45±0.35 | 56.14±3.88 | ||
| 显著性 | 0.013 | 0.002 |
由表5可知，喷施12CG 5-11孢子液后，小麦在拔节期和成熟期纹枯病的病情指数均显著降低，分别为1.80和26.16，而空白对照分别为3.45和56.14。喷施球毛壳菌孢子液对小麦拔节期纹枯病防效为47.83％，对小麦成熟期纹枯病防效为53.40％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种球毛壳菌，其特征在于，所述球毛壳菌为球毛壳菌(Chaetomium globosum)12CG5-11菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月4日，保藏编号为CGMCC No.19939，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为球毛壳菌Chaetomium globosum。
2.一种球毛壳菌孢子液的制备方法，其特征在于，包括下述过程：
1)将球毛壳菌12CG 5-11接种于PDA培养基中，25-28℃培养15d后，获得菌饼；
2)将菌饼接种到小米粒培养基中，25-28℃培养15d后转入灭菌的牛皮纸袋中继续培养7d，使后期含水量控制在6％以内，然后向培养基中加水洗搓，静置30-60min，用三层纱布过滤，得球毛壳菌孢子液。
3.根据权利要求2所述的一种球毛壳菌孢子液的制备方法，其特征在于，所述小米粒培养基制备方法为：将小米粒用水浸泡12h，然后装入发酵袋后灭菌1h，放置1-2d，再次灭菌30min，得小米粒培养基。
4.根据权利要求2所述的一种球毛壳菌孢子液的制备方法，其特征在于，加水搓洗和浓缩的具体过程为：将牛皮纸袋中的培养产物倒入无菌塑料发酵袋中，按照3mL/g的比例倒入无菌蒸馏水，反复揉搓后，静置30-60min，用三层无菌纱布过滤，然后倒入50mL离心管，2000r/min下离心2分钟，弃掉上清，使孢子液浓度浓缩至2～4×108个/mL。
5.权利要求2-4任一所述的球毛壳菌孢子液在制备防治小麦纹枯病药剂中的应用。
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