CN113846162A - 生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途 - Google Patents

生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途 Download PDF

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CN113846162A CN202111112233.7A CN202111112233A CN113846162A CN 113846162 A CN113846162 A CN 113846162A CN 202111112233 A CN202111112233 A CN 202111112233A CN 113846162 A CN113846162 A CN 113846162A
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Abstract

生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途，生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。本发明提供的生物标志物可以有效预测患者的预后，为进一步的治疗提供依据。

Description

生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，也造成人类寿命缩短，例如，肝癌会导致肝功能受损，其中，肝细胞癌(HCC)是全球前5位癌症杀手之一。肝切除术是最常用的治疗方法，可达到70％的5年生存率。由于肝癌的高恶性特征，其复发性、转移性是术后影响患者生存的主要因素。现有技术中缺乏对肝癌等癌症复发进行有效评估的生物标志物及其方法。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算癌症风险值的方法，包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测癌症风险的装置，包括：
表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。
依据上述实施例的生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途，本发明提供的生物标志物可以有效预测患者的预后，为进一步的治疗提供依据。
附图说明
图1为预测因子在原位肿瘤中的表达水平图。
图2为预测因子在正常肝组织(Liver，为TCGA数据库中的数据)、癌旁组织(Adjacent normal)、肝细胞癌(HCC)中基因表达的降维分析图。
图3为预测因子与患者的生存曲线分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
如本文所用，“生物标志物”(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。本文中，“生物标志物”、“预测因子”、“分子标志物”可互换使用。生物标志物具体可以为表达特定蛋白的特定基因。
对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。
生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平(分子、细胞、个体等)上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，可以是生态系统的异常变化。
如本文所用，术语“表达水平”等同于“表达谱，”“表达谱”是指从待测样本(例如肿瘤组织)获得的一种或多种蛋白(即基因产物)的表达水平。对于从待测样本中回收的基因产物，表达水平可以通过多种方法进行计算得到，例如，可以对待测样本(例如，可以是肿瘤组织样本)中的RNA进行逆转录，对逆转录后的DNA进行实时荧光定量PCR检测，结合参考基因(例如，可以是内参基因)，检测得到的循环数，然后计算得到相对表达量，也可以表示为每mL待测样本中特定多肽的质量或任何其他合适的单位。类似单位可用于从其他待测样本获得的基因产物。基因产物的表达可使用任何合适的方法(例如，如下所述)确定。通常对测量值进行归一化，以解释样本数量和质量、逆转录效率等方面的变化。当表达谱反映来自多个不同基因产物(例如，不同基因的RNA转录物，主要为mRNA转录物)的表达时，在生成或比较表达谱或参考谱时，可以赋予基因产物不同的权重。
Anxa1基因编码结合磷脂的膜定位蛋白。该蛋白质抑制磷脂酶A2并具有抗炎活性。已经在多种肿瘤中检测到该基因的功能丧失或表达。[由RefSeq提供，2014年12月]
膜联蛋白IV(ANX4)属于钙依赖性磷脂结合蛋白的膜联蛋白家族。虽然它们的功能仍未明确定义，但膜联蛋白家族的几个成员已经涉及沿胞吐和内吞途径的膜相关事件。ANX4与其家族其他成员具有45％至59％的同一性，并且具有相似的大小和外显子-内含子组织。A NX4从人胎盘中分离出来，编码一种可能与ATP相互作用的蛋白质，具有体外抗凝活性，还抑制磷脂酶A2的活性。ANX4几乎仅在上皮细胞中表达。已经发现了编码该基因的不同同种型的几种转录物变体。[由RefSeq提供，2016年3月]
ANXA4(膜联蛋白A4)是蛋白质编码基因。与ANXA4相关的疾病包括乳头状浆液性腺癌和卵巢透明细胞腺癌。其相关途径包括前列腺素的合成和调节。
CD90基因编码细胞表面糖蛋白和蛋白质免疫球蛋白超家族的成员。编码的蛋白质参与许多细胞类型的细胞粘附和细胞通讯，但特别是在免疫和神经系统的细胞中。编码的蛋白质被广泛用作造血干细胞的标记物。该基因可能在鼻咽癌中起肿瘤抑制剂的作用。选择性剪接导致多种转录物变体。[由RefSeq提供，2015年7月]
Gpc3基因编码细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由被可变数量的硫酸乙酰肝素链取代的膜相关蛋白核心组成。磷脂酰肌醇蛋白聚糖相关的整合膜蛋白聚糖家族(GRIPS)的成员含有通过糖基磷脂酰肌醇键锚定在细胞质膜上的核心蛋白。这些蛋白质可能在控制细胞分裂和生长调节中起作用。由该基因编码的蛋白质可以结合并抑制CD26的二肽基肽酶活性，并且它可以在某些细胞类型中诱导细胞凋亡。该基因的缺失突变与Simpson-Golabi-Behmel综合征(也称为Simpson畸形综合征)有关。选择性剪接导致多种转录物变体。[由RefSeq提供，2009年9月]
Gpc3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)是蛋白质编码基因。与Gpc3相关的疾病包括Simpson-Golabi-Behmel综合征、1型和Wilms肿瘤1。其相关途径包括硫酸软骨素/硫酸皮肤素代谢和通过VEGFR2-通用级联发展VEGF信号传导。与该基因相关的基因本体论(GO)注释包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合和肽基二肽酶抑制剂活性。该基因的一个重要同源基因是Gpc5。
Ccnd2基因编码的蛋白质属于高度保守的细胞周期蛋白家族，其成员的特征在于通过细胞周期的蛋白质丰度的显着周期性。细胞周期蛋白作为CDK激酶的调节剂起作用。不同的细胞周期蛋白表现出不同的表达和降解模式，这有助于每个有丝分裂事件的时间协调。该细胞周期蛋白与CDK4或CDK6形成复合物，并作为复合物的调节亚基，其活性是细胞周期G1/S转换所必需的。已显示该蛋白与肿瘤抑制蛋白Rb相互作用并参与磷酸化。小鼠同源基因的敲除研究表明该基因在卵巢颗粒和生殖细胞增殖中的重要作用。在卵巢和睾丸肿瘤中观察到该基因的高水平表达。该基因的突变与巨脑-多小脑回-多指-脑积水综合征3(MPPH3)有关。[由RefSeq提供，2014年9月]
Afp基因编码甲胎蛋白，甲胎蛋白是胎儿生命中卵黄囊和肝脏产生的主要血浆蛋白。成人中的甲胎蛋白表达通常与肝癌和畸胎瘤相关，并且对于治疗晚期胃癌具有预后价值。但是，在没有明显病理的个体中也可能发现甲胎蛋白的遗传持久性。该蛋白被认为是血清白蛋白的胎儿对应物，甲胎蛋白和白蛋白基因在4号染色体上以相同的转录方向串联存在。甲胎蛋白以单体以及二聚体和三聚体形式存在，并结合铜、镍、脂肪酸和胆红素。羊水中甲胎蛋白的水平用于测量蛋白质的肾脏损失以筛查脊柱裂和无脑。[由RefSeq提供，2019年10月]
根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
我们通过原位肿瘤的转录组测序和蛋白芯片分析，发现在原位肿瘤中高表达的基因Anx a1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp，综合分析这些基因的表达水平能有效地预测患者的预后，为进一步的治疗提供依据。还可以构建包含用于检测上述6种基因的试剂的检测试剂盒，用于辅助诊断患者肝细胞肝癌的术后预后。
在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因的表达水平。
在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因相对于参考基因的表达水平。
在一实施例中，所述参考基因包含在细胞中组成型、稳定表达的基因。
在一实施例中，所述参考基因包含内参基因。
在一实施例中，所述内参基因包括不限于Gapdh基因、Actin基因、Tubulin基因中的至少一种。
在一实施例中，所述生物标志物用于评估癌症复发的风险。
在一实施例中，所述复发包括用药后复发、术后复发中的至少一种。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。
在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。
肝细胞性肝癌：癌细胞排列形成实性团块状，周围富有扩张的血窦。癌细胞境界不清，大小较一致，浆宽。核单个，类圆形，异形性不明显。核分裂象少见。
肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。遗传、表观遗传改变、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、吸烟、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危险因素。肝癌预后差的原因是复发率和转移率高。移植是治疗肝癌最有效的方法，但在移植过程中，肿瘤复发率和转移率较高。无论是由于肿瘤负担还是肝功能不好，70％以上的晚期患者不适合移植。
在一实施例中，根据待测样本中所述基因的相对表达量，计算风险值，根据所述风险值，评估受试者复发的风险。
在一实施例中，根据所述风险值与阈值的大小关系，评估受试者复发的风险。
在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险，表明预后可能不乐观，需要积极复查、密切关注肿瘤状况；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
在一实施例中，所述阈值可以为100。阈值可以通过自测的样本数据和/或数据库中的样本数据而确定。
在一实施例中，所述风险值＝[RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)]×α，α为非零常数，RQ表示靶基因相对于参考基因的相对表达量。
α为经验常数，可以根据自测序的样本数据和/或TCGA数据库中的测序数据得到α值。
在一实施例中，RQ＝2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(待测样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)-(对照样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)。
在一实施例中，所述PCR循环数是通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测得到。
在一实施例中，所述参考基因包含内参基因。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
在一实施例中，α可以为2。
在一实施例中，所述待测样本包括肿瘤组织样本。
在一实施例中，所述对照样本包括正常组织样本。
在一实施例中，所述正常组织样本包括癌旁组织样本，为实体组织块。
根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。
在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算癌症风险值的方法，包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。该风险值为中间结果，并且，待测样本为离体样本，因此，计算患癌风险值的方法不属于疾病的诊断、治疗方法。
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(待测样本中靶基因PC R循环数-参考基因PCR循环数)-(对照样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。
在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌。
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
在一实施例中，所述风险值＝[RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)]×α，α为非零常数，RQ表示靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测癌症风险的装置，包括：
表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(待测样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)-(对照样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。
在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌。
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
在一实施例中，所述风险值＝[RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)]×α，α为非零常数，RQ表示靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。
在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
在一实施例中，还包括信号采集模块，用于采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(待测样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)-(对照样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。
在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌。
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
在一实施例中，所述风险值＝[RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)]×α，α为非零常数，RQ表示靶基因相对于参考基因的相对表达量。
在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。
在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。
实施例1
本实施例提供的试剂盒包含：
Trizol裂解液(Invitrogen，15596-026)；
RNAse-free匀浆器；
RNAse-free 1.5毫升管；
氯仿；
异丙醇；
洗涤液(使用RNAse-free水配制的75％乙醇)；
RNAse-free水；
逆转录试剂混合物(10μL/管，TAKARA，RR047A)；
Q-PCR试剂混合物(TAKARA，639676)；
引物稀释液(含有引物的水溶液)。
操作方法如下：
1、肿瘤样本制备：对于有多个肝癌灶点的患者，每个灶点取一块肿瘤(50毫克/份)，总取3个灶点；对于少于3个肝癌灶点的患者，则随机取3个肿瘤块(50毫克/份)；肿瘤组织标记为HCC1、HCC2、HCC3。随机取3块癌旁组织(50毫克/份)，标记Nor1、Nor2、Nor3。
2、用消毒灭菌的剪刀将组织尽可能剪碎，加入200微升Trizol裂解液。
3、用移液枪将上述组织碎片裂解液混合物转移至RNAse-free匀浆器中，将组织碎片磨碎直到没有明显颗粒状组织。
4、加入800微升Trizol裂解液，将组织裂解液转移到新的RNAse-free 1.5毫升管，用移液枪反复吹打10次，混匀，常温静置5分钟。
5、向组织裂解液中加入200微升氯仿，盖上盖，上下用力摇动使液体混匀，常温静置5分钟。
6、将上述组织裂解液于4℃、12000×g条件下离心20分钟。
7、离心结束后，用移液枪吸取上清200微升到新的RNAse-free 1.5毫升管。
8、向上述上清中加入200微升异丙醇，盖上盖，上下摇动使液体混匀，常温静置10分钟。
9、将上述液体于4℃、12000×g条件下离心10分钟。
10、去掉上清液，管底可见白色沉淀，向沉淀中加入500微升洗涤液，盖上盖，上下用力摇动试管3次。
11、将上述液体于4℃、6000×g条件下离心5分钟。
12、去掉上清液，将试管开盖置于通风橱10分钟。
13、加入50～100微升RNAse-free水，60℃水浴5分钟。
14、高速离心试管1分钟，收集液体于管底。
15、测量RNA浓度，置于冰盒或4度冰箱待用。
步骤1～15可用市场上现有的全自动核酸提取工作站完成，本实施例未使用全自动核酸提取工作站，为手动完成。
16、对于同一患者或同一批检测，使用同一质量的RNA(总RNA)进行逆转录(模板量可以为100ng～1000ng，本实施例具体为500ng)。
17、向逆转录试剂混合物(10μL/管)中加入待检测RNA，并加入RNAse-free水补足至20微升。补充RNAse-free水的体积(μL)＝10-RNA质量(ng)/RNA浓度(ng/μL)。
18、在PCR仪器中进行逆转录反应，反应条件依次如下：
25℃，10分钟；
42℃，30分钟；
85℃，5分钟；
结束。
19、Q-PCR反应(实时荧光定量PCR)
配制如下反应体系：1μL上述逆转录反应液、0.5μL引物混合物、0.5μL ROX混合物、8μL Q-PCR反应混合物。每个反应设置3个重复。
反应条件依次如下：
(A)95℃，3分钟；
(B)95℃，5秒；
(C)60℃，30秒；步骤B、C重复40次；
(D)72℃，30秒(信号收集)；
(E)72℃，5分钟；
(F)熔解曲线(Melting curve)生成反应。
反应结束后，进入后续计算步骤。
20、计算
按如下公式进行计算：RQ＝2-ΔΔCt。
RQ：相对表达量。
ΔCt：肿瘤样本(HCC)靶基因PCR循环数与内参PCR循环数差值。
ΔΔCt＝[肿瘤样本(HCC)靶基因PCR循环数-内参PCR循环数]-[对照样本(Nor)靶基因PCR循环数-内参PCR循环数]。
21、复发风险值：
Risk＝RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)×2。
22、判定方法
如果Risk＞100，则为六因子高表达，表明预后可能不乐观，需要积极复查、密切关注肿瘤状况。如果Risk≤100，则为六因子低表达。
23、引物序列如表1所示。
表1
Figure BDA0003270635550000091
Figure BDA0003270635550000101
Gapdh为内参基因。
图1为预测因子在原位肿瘤中的表达水平图。纵坐标为Log2(TPM+1)，TPM:transcriptsper million reads。可见，每一种因子在肿瘤组织样本(Tumor)、癌旁组织样本(Normal)样本中的表达水平均具有显著差异。
图2为预测因子在正常肝组织(Liver，为TCGA数据库中的数据)、癌旁组织(Adjacent normal)、肝细胞癌(HCC)中基因表达的降维分析图。可见，我们选择的预测因子在肝细胞癌中的表达与正常肝组织、癌旁组织中的表达具有显著差异。
图3为预测因子与患者的生存曲线分析图(自测序的样本为42例，来自TCGA数据库的样本为364例)，图中，靠近横坐标的实线(即位于下方位的实线)为6因子高表达组的5年总体性生存率曲线，远离横坐标的实线(即位于上方位的实线)为6因子低表达组的5年总体性生存率曲线。可见，本实施例所选择的6种预测因子的高表达组患者五年总体性生存率显著低于6种预测因子低表达组的患者，表明待测样本中6种预测因子的相对表达量越高，复发的风险越高，从而证明这6种预测因子可以有效预测患者的预后。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市龙华区中心医院
<120> 生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途
<130> 21I32337
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaggaggttg ttttagctct gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcaaagcgt tccgaaaatc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaggtactg tcaaagctgc t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcaaggacg ctaataatgg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcgctctcc tgctaacagt c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcgtactgg atgggtgaac t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctttgaaat tgttgttcgc ca 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cctgggttca ttagctgggt a 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
accttccgca gtgctccta 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccagccaag aaacggtcc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctttgggctg ctcgctatga 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcatgttgat ttaacaagct gct 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，其特征在于，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包含如下基因中的全部：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包含待测样本中所述基因的表达水平；
和/或，所述生物标志物包含待测样本中所述基因相对于参考基因的表达水平；
和/或，所述参考基因包含在细胞中组成型、稳定表达的基因；
和/或，所述参考基因包含内参基因；
和/或，所述内参基因包含Gapdh基因、Actin基因、Tubulin基因中的至少一种；
和/或，所述生物标志物用于评估癌症复发的风险；
和/或，所述复发包括用药后复发、术后复发中的至少一种；
和/或，所述癌症包括肝癌；
和/或，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌；
和/或，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，根据待测样本中所述基因的相对表达量，计算风险值，根据所述风险值，评估受试者复发的风险。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，根据所述风险值与阈值的大小关系，评估受试者复发的风险；
和/或，如果风险值＞阈值，则预测为高风险，如果风险值≤阈值，则预测为低风险；
和/或，所述阈值为100；
和/或，所述风险值＝[RQ(Anxa1)×RQ(Anxa4)×RQ(CD90)×RQ(Gpc3)×RQ(Ccnd2)×RQ(Afp)]×α，α为非零常数，RQ表示靶基因相对于参考基因的相对表达量；
和/或，RQ＝2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(待测样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)-(对照样本中靶基因PCR循环数-参考基因PCR循环数)；
和/或，所述PCR循环数是通过实时荧光定量PCR检测得到；
和/或，所述参考基因包含内参基因；
和/或，α为2；
和/或，所述待测样本包括肿瘤组织样本；
和/或，所述对照样本包括正常组织样本；
和/或，所述正常组织样本包括癌旁组织样本。
6.生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，其特征在于，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp。
7.一种计算癌症风险值的方法，其特征在于，包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。
8.一种用于预测癌症风险的装置，其特征在于，包括：
表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
9.一种装置，其特征在于，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：Anxa1、Anxa4、CD90、Gpc3、Ccnd2、Afp；
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
10.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如权利要求7所述方法或权利要求9中所述预测方法。
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