CN113842501A - 内植入物表面改性材料及其制备方法和应用 - Google Patents

内植入物表面改性材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新材料技术领域，尤其涉及内植入物表面改性材料及其制备方法和应用。内植入物表面改性材料的制备方法，包括下述步骤合成QCS‑GO：由QCS和GO偶联制备；合成QCS‑GO‑PDA：合成QCS‑GO所得产物悬浮液离心，收集上清液，加入多巴胺、EDC和NHS，调ph＝4‑5，透析，加入多巴胺，pH调成8‑9，透析，冷冻干燥，得到QCS‑GO‑PDA。表面改性材料，包含有前述的内植入物表面改性材料。表面改性材料在制备内植入物中的应用。本发明的涂层材料具有多功能特性，对于创伤引起的感染性骨缺损等具有很好的治疗效果，同时具有抗菌成骨和细胞粘附作用。

Description

内植入物表面改性材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及新材料技术领域，尤其涉及内植入物表面改性材料及其制备方法和应用。
背景技术
成功的骨科种植体植入后应避免并发症的发生。Goodman(GoodmanSB，Biomaterials2013,34(13):3174-3183)提出骨科生物涂层植入物在涂料方向未来重点提高骨整合，减少慢性炎症反应。
总之，对骨科内植入表面功能化改性不仅要抑制植入物周围炎症反应，还需提高植入物骨整合能力，骨修复植入材料的体外实验大多局限于促进成骨性能研究，但机体对假体的反应是非常复杂的，有些修饰的骨科假体体外实验促进成骨效果较好，但体内骨整合实验却不太理想，主要原因在于体外很难模拟一个体内环境。机体对内植物的炎症反应被认为影响假体体内性能的重要因素，基于此生物材料的设计应该避免宿主的炎症免疫反应。宿主对内植物的炎症反应能够很大程度上影响内植物在体内的性能尤其是骨整合，也即是骨髓间充质干细胞成骨分化。
骨科内植入物的表面涂层材料是常用的生物材料，但是目前的涂层材料功能比较单一，对于创伤引起的感染性骨缺损等缺乏很好的治疗效果，同时具有抗菌成骨、成血管、细胞粘附以及抗氧化作用的涂层还比较少。
发明内容
针对上述问题，本发明提供内植入物表面改性材料及其制备方法和应用，主要为了解决现有技术涂层功能单一、对于引起感染性骨缺损治疗效果不佳、不具有抗菌成骨和细胞粘附作用的改性材料。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
内植入物表面改性材料制备方法，包括下述步骤
合成QCS-GO：由QCS和GO偶联制备；
合成QCS-GO-PDA：
合成QCS-GO所得产物悬浮液离心，收集上清液，加入多巴胺、EDC和NHS，调至酸性，
透析，
加入多巴胺，至碱性，透析，冷冻干燥，得到QCS-GO-PDA。
一些方式中，合成季铵化壳聚糖步骤包括：
壳聚糖和甘油基三甲基氯化铵形成混合溶液，
回流搅拌，
所述产物在蒸馏水中用透析膜透析，对透析后的产物冷冻干燥得季铵化壳聚糖。
一些方式中，合成季铵化壳聚糖中：回流搅拌温度为80-85℃；使用1.4×103Da的透析膜透析。
一些方式中，合成QCS-GO步骤包括：
用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂，由QCS和GO偶联制备；
GO和QCS配比为1：5。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，加入多巴胺、EDC和NHS，调ph＝4-5，在保护气体中反应。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，保护气体为氮气。
一些方式中，在合成QCS-GO-PDA中，
多巴胺与氧化石墨烯等质量或者相对于氧化石墨烯过量，
EDC与DA的摩尔比为1:5，NHS与EDC的摩尔比是1：1.2。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，
加入多巴胺，pH调成8-9，优选8.5；
透析使用1.4×103Da的透析膜透析；
冷冻干燥前，透析至无色。
表面改性材料，包含有前述的内植入物表面改性材料；优选的，所述内植入物表面改性材料附着到PLA/HA支架表面。
骨科内植入物，包括PLA/HA支架，所述PLA/HA支架表面附着有前述的内植入物表面改性材料。
表面改性材料在制备内植入物中的应用；优选的，其应用方式为作为内植入物的表面改性材料，其使用浓度为50μg/ml。
本发明的有益效果是：
具有抗菌，成骨及促进细胞粘附的作用，可以有效固定在内植入物表面，进行功能化改性，防止感染，促进感染性骨折和骨缺损的愈合。涂层材料具有多功能，对于创伤引起的感染性骨缺损等具有很好的治疗效果，同时具有抗菌成骨和细胞粘度作用。
附图说明
图1为针对不同比例GO、QCS合成的QCS-GO-PDA效果研究；
图2为针对不同比例GO、QCS合成的QCS-GO-PDA进行效果研究；
图3为针对不同比例GO、QCS合成的QCS-GO-PDA进行细胞增殖效果研究；
图4为针对QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA与MC3T3-E1进行成骨诱导效果研究；
图5为针对QCS-GO-PDA使用后铺展及粘附性效果研究；
图6为QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA不同组氧化刺激后RAW264.7巨噬细胞内的ROS水平(对照组Control无H2O2刺激)；
图7为金黄色葡萄球菌在未经处理的对照组以及QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA以50μg/mL的浓度下作用2h后的生物电镜(BIOSEM)微观图像；
图8为QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA以50μg/mL的浓度与RAW264.7巨噬细胞共培养3天后的CD206、F4/80的免疫荧光染色；
图9为50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA处理的血管内皮细胞在6h、12h、24h、48h的划痕迁移分析；
图10为A.50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA与MC3T3-E1细胞共培养3天后的细胞骨架染色及12h后的血管内皮细胞的Transwell迁移实验；B.血管内皮细胞与50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA在4h和7h的血管形成情况；
图11为Mic-CT扫描分析术后4周、8周不同处理组的大鼠颅骨临界骨缺损模型的愈合情况；
图12为QCS-GO-PDA诱导骨再生修改效果研究；
图13为QCS-GO-PDA的延申材料QCS-GO-PDA@PLA/HA成骨效果研究。
具体实施方式
本部分第一方面介绍内植入物表面改性材料制备方法：
内植入物表面改性材料制备方法，包括下述步骤
合成QCS-GO：由QCS和GO偶联制备；
合成QCS-GO-PDA：
合成QCS-GO所得产物悬浮液离心，收集上清液，加入多巴胺、EDC和NHS，调ph＝4-5，
透析，
加入多巴胺，pH调成8-9，优选8.5，透析，冷冻干燥，得到QCS-GO-PDA。
一些方式中，合成季铵化壳聚糖步骤包括：
壳聚糖和甘油基三甲基氯化铵形成混合溶液，
回流搅拌，
所述产物在蒸馏水中用透析膜透析，对透析后的产物冷冻干燥得季铵化壳聚糖。
一些方式中，合成季铵化壳聚糖中：回流搅拌温度为80-85℃；使用1.4×103Da的透析膜透析。
一些方式中，合成QCS-GO步骤包括：
用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂，由QCS和GO偶联制备；
GO和QCS配比为1：5。其他相近配比也应当等同在本发明范围内。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，加入多巴胺、EDC和NHS，调ph＝4-5，在保护气体中反应。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，保护气体为氮气。
一些方式中，在合成QCS-GO-PDA中，
多巴胺与氧化石墨烯等质量或者相对于氧化石墨烯过量，
EDC与DA的摩尔比为1:5，NHS与EDC的摩尔比是1：1.2。其他相近配比也应当等同在本发明范围内。
一些方式中，合成QCS-GO-PDA时，
加入多巴胺，pH调成8.5；
透析使用1.4×103Da的透析膜透析；
冷冻干燥前，透析至无色。
本部分第二方面介绍表面改性材料：
表面改性材料，包含有前述的内植入物表面改性材料；优选的，所述内植入物表面改性材料附着到PLA/HA支架表面。附着于PLA/HA方式可采用现有的方法，能够实现相关目的即可。
骨科内植入物，包括PLA/HA支架，所述PLA/HA支架表面附着有前述的内植入物表面改性材料。
本部分第三方面介绍表面改性材料在制备内植入物中的应用：
表面改性材料在制备内植入物中的应用；优选的，其应用方式为作为内植入物的表面改性材料，涂布于骨科内植物的表面，其使用浓度为50μg/ml。
本部分第四方面结合一些具体的实例进行说明：
实验例1
首合成QCS，8g的壳聚糖和14.4g的GTMAC分别加到120mL蒸馏水中，然后将混合物转移到三颈烧瓶并在80℃的条件回流搅拌36h，反应后的产物在蒸馏水中用截留分子量为1.4×103Da的透析膜透析72h，最后对透析后的产物冷冻干燥即可得到季铵化壳聚糖(QCS)。然后，QCS-GO用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为偶联试剂，由QCS和GO之间的偶联反应制备。反应结束后，悬浮液离心(10000rpm/min,15min)，收集上清液，然后加入多巴胺，再加入EDC和NHS，调ph＝4-5，在氮气下反应3小时，多巴胺和氧化石墨烯等质量，或者略大于GO的质量，EDC与DA的摩尔比为1:5，NHS与EDC的摩尔比是1：1.2，用14kDa的透析袋透析3天，加入多巴胺，pH调成8.5，反应20分钟后14kDa透析到无色，冷冻干燥，得到QCS-GO-PDA。
图1中为合成所得QCS-GO-PDA的性能参数：
QCS-GO-PDA的透射电镜(TEM)；
QCS-GO-PDA及其不同组分的傅里叶红外光谱分析(FTIR)；
QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA合成后的场发射扫描(FE-SEM)及能谱图。
实验例2
针对不同比例GO、QCS合成的QCS-GO-PDA进行效果研究。其结果如如图2所示：
(A)不同比例(1:1、1:3、1:5、1:10)的GO、QCS合成的QCS-GO-PDA在浓度(25/50/75/100μg/ml)时的细胞存活率；
(B)不同比例(1:1、1:3、1:5、1:10)的GO、QCS合成的QCS-GO-PDA对金葡菌、表葡菌和大肠杆菌的杀菌率(6h)；
(C)选取同时兼具最高细胞存活率与杀菌率的QCS-GO-PDA(1:5)及QCS-GO(1:5)、QCS进行后续实验，以50μg/ml的浓度与MC3T3-E1细胞分别共培养后1天，3天和5天时的活死染色(50μg/ml的细胞存活率最高)；
(D)吸光度定量分析1,3,5天的细胞增殖。
实验例3
针对不同比例GO、QCS合成的QCS-GO-PDA进行细胞增殖效果研究。如图3中：
QCS-GO-PDA(1:5)、QCS-GO(1:5)、QCS以50μg/ml的浓度与MC3T3-E1细胞分别共培养后1天后EdU染色观察MC3T3-E1细胞的增殖。
实验例4
针对QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA与MC3T3-E1进行成骨诱导效果研究。如图4中：
(A,B)QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA与MC3T3-E1成骨诱导7天后的碱性磷酸酶染色(ALP)及定量分析；
(C,D)QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA与MC3T3-E1成骨诱导14天后的茜素红染色(ALP)及定量分析。
实验例5
针对QCS-GO-PDA使用后铺展及粘附性效果研究。
如图5中：多功能纳米粒子QCS-GO-PDA涂覆到3D打印PLA/HA支架后MC3T3-E1细胞的铺展及粘附性良好。
实验例6
为QCS、QCS-GO、QCS-GO-PDA不同组氧化刺激后RAW264.7巨噬细胞内的ROS水平(对照组Control无H2O2刺激)，结果参见图6；
实验例7
为金黄色葡萄球菌在未经处理的对照组以及QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA以50μg/mL的浓度下作用2h后的生物电镜(BIOSEM)微观图像，结果参见图7；
实验例8
为QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA以50μg/mL的浓度与RAW264.7巨噬细胞共培养3天后的CD206、F4/80的免疫荧光染色，结果参见图8；
实验例9
为50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA处理的血管内皮细胞在6h、12h、24h、48h的划痕迁移分析，结果参见图9；
实验例10
为A.50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA与MC3T3-E1细胞共培养3天后的细胞骨架染色及12h后的血管内皮细胞的Transwell迁移实验；B.血管内皮细胞与50μg/mL浓度的QCS，QCS-GO，QCS-GO-PDA在4h和7h的血管形成情况，结果参见图10；
实验例11
为Mic-CT扫描分析术后4周、8周不同处理组的大鼠颅骨临界骨缺损模型的愈合情况；图中白色箭头所示部位为蓝色，结果参见图11。
实验例12
QCS-GO-PDA诱导骨再生修改效果研究。
如图12中：SD大鼠颅骨临界骨缺损模型证明QCS-GO-PDA结合3D打印PLA/HA支架(QCS-GO-PDA@PLA/HA)后诱导骨再生修复。
实验例13
QCS-GO-PDA的延伸材料QCS-GO-PDA@PLA/HA成骨效果研究。
如图13中：SD大鼠颅骨临界骨缺损模型不同处理组4周、8周后的OCN染色证明包含多功能纳米QCS-GO-PDA的QCS-GO-PDA@PLA/HA成骨效果更好。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (10)

1.内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，包括下述步骤
合成QCS-GO：由QCS和GO偶联制备；
合成QCS-GO-PDA：
合成QCS-GO所得产物悬浮液离心，收集上清液，加入多巴胺、EDC和NHS，调至酸性，
透析，
加入多巴胺，调至碱性，透析，冷冻干燥，得到QCS-GO-PDA。
2.根据权利要求1所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，合成季铵化壳聚糖步骤包括：
壳聚糖和甘油基三甲基氯化铵形成混合溶液，
回流搅拌，
所述产物在蒸馏水中用透析膜透析，对透析后的产物冷冻干燥得季铵化壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，合成季铵化壳聚糖中：回流搅拌温度为80-85℃；使用1.4×103Da的透析膜透析。
4.根据权利要求1所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，合成QCS-GO步骤包括：
用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂，由QCS和GO偶联制备；
GO和QCS配比为1：5。
5.根据权利要求1所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，
合成QCS-GO-PDA时，加入多巴胺、EDC和NHS，调ph＝4-5，在保护气体中反应。
6.根据权利要求5所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，合成QCS-GO-PDA时，保护气体为氮气。
7.根据权利要求1所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，在合成QCS-GO-PDA中，
多巴胺与氧化石墨烯等质量或者相对于氧化石墨烯过量，
EDC与DA的摩尔比为1:5，NHS与EDC的摩尔比是1：1.2。
8.根据权利要求1所述的内植入物表面改性材料制备方法，其特征在于，合成QCS-GO-PDA时，
加入多巴胺，pH调成8-9，优选8.5；
透析使用1.4×103Da的透析膜透析；
冷冻干燥前，透析至无色。
9.表面改性材料，其特征在于，包含有权利要求1-8任一所述的内植入物表面改性材料。
10.权利要求9所述的表面改性材料在制备内植入物中的应用；优选的，其应用方式为作为内植入物的表面改性材料，其使用浓度为50μg/ml。
骨科内植入物，其特征在于，包括PLA/HA支架，所述PLA/HA支架表面附着有权利要求1-9中任一所述的内植入物表面改性材料。
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