CN113826007A - 使用湿-干生物分析技术通过剪切水平表面声波生物传感器检测心肌钙蛋白或生物标志物 - Google Patents

使用湿-干生物分析技术通过剪切水平表面声波生物传感器检测心肌钙蛋白或生物标志物 Download PDF

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Abstract

所示实施例包括一种操作SAW传感器以检测流体中的样品的方法，所述方法包括以下步骤：在手持便携式测定和传感器系统中提供具有功能化检测通道的SAW传感器；保持所述SAW传感器的功能化检测通道干燥，直到样品流体性地布置在所述检测通道中；将所述样品流体性地布置在所述功能化检测通道中；去除流体所述功能化检测通道以将所述样品浓缩在所述功能化检测通道中以增加特异性抗体‑抗原相互作用的可能性；洗涤所述功能化检测通道，使得基本上只有所述特异性抗原‑抗体相互作用保留在所述功能化检测通道中；再次从所述功能化检测通道中去除流体；并且在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度。

Description

使用湿-干生物分析技术通过剪切水平表面声波生物传感器 检测心肌钙蛋白或生物标志物
技术领域
本发明涉及使用表面声波(SAW)传感器对生物制剂、因子或标记的诊断微量分析的领域。特别地，本发明涉及用于使用剪切水平(SH)表面声波(SAW)生物传感器通过免疫化学反应来检测目标抗原与固定在压电基板(钽酸锂)上的特异性抗体的结合的装置和方法。
背景技术
已经开发了模型系统来检查三肽、心肌钙蛋白(肌钙蛋白I-T-C复合物)或肌钙蛋白亚单位I以及抗体之间的受体-配体相互作用以识别肌钙蛋白I亚单位上的表位。肌钙蛋白是一种位于骨骼肌和心肌纤维的细丝上的三肽复合物(亚基C、T和I)。肌钙蛋白C是钙结合成分，肌钙蛋白T是原肌球蛋白结合成分，且肌钙蛋白I是抑制成分。由于肌钙蛋白C的亚型在骨骼肌和心肌中是相同的，因此血液中的肌钙蛋白C浓度不是心肌损伤所特有的。肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的亚型不同于骨骼肌和心肌，因此对心脏组织坏死具有特异性。肌钙蛋白T主要以与心肌细胞的收缩元素结合的形式存在；然而，它也游离存在于细胞质中。肌钙蛋白T表现出最初的细胞质成分和随后的结合成分的双重释放。肌钙蛋白亚单位I具有单一的亚型，对心肌具有极高的特异性，并且尚未从骨骼肌中分离出来。
这种绝对特异性使其成为心肌损伤的理想标志物。它们在心肌损伤后6-8小时释放到循环中，在12-24小时达到峰值并保持高位7-10天(42)。cTn的唯一缺点是清除较晚，这排除了对复发性心肌梗塞的诊断。为了解决此问题，需要连续进行多次肌钙蛋白测量，以确定水平是上升、下降还是保持不变。
尽管如此，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T已成为全球公认的用于诊断急性心肌梗死(AMI)的标准生物标志物。免疫传感和二次扩增技术的最新技术进步已将检测限推至远低于1ng/mL，从而开发了高灵敏度心肌钙蛋白(hs-cTn)测定。虽然这些现在正在世界范围内实施，但此类测定在便携性方面受到限制，运行和维护成本高昂，并且需要经验丰富的技术培训才能使用。因此，仍然迫切需要一种简便的、方便的便携式hs-cTn测定和传感器系统。
发明内容
所示实施例包括一种操作SAW传感器以检测流体中的样品的方法，所述方法包括以下步骤：在手持便携式测定和传感器系统中提供具有功能化检测通道的SAW传感器；保持所述SAW传感器的功能化检测通道干燥，直到样品被流体性地布置在所述检测通道中；将所述样品流体性地布置在所述功能化检测通道中；去除流体所述功能化检测通道以将所述样品浓缩在所述功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的可能性；洗涤所述功能化检测通道，使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述功能化检测通道中；再次从所述功能化检测通道中去除流体；并且在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度。
所述方法包括：在稍后的时间采集第二样品；重复保持所述SAW传感器的所述功能化检测通道的步骤干燥，直到所述第二样品流体性地布置在所述检测通道中，将所述第二样品流体性地布置在所述功能化检测通道中，去除流体所述功能化检测通道以将所述第二样品浓缩在所述功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的可能性，洗涤所述功能化检测通道使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述功能化检测通道中，再次从所述功能化检测通道中去除流体；并且测量所述第二样品的浓度，同时所述功能化检测通道在第二次之后无流体以确定所述样品浓度是随时间增加还是减少。
所述样品包括心肌钙蛋白，并且还包括以下步骤：在无需经历技术培训即可操作的简易便携式测定和传感器系统中提供具有功能化检测通道的SAW传感器。
在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度的步骤包括在所述功能化检测通道浓度等于或低于10pg/mL是无流体时测量所述样品的浓度的步骤。
所述方法还包括用于同时或大约同时进行心肌梗塞的附加测试的步骤。
所述进行所述附加测试的步骤包括进行多种生物标志物的多重测量的步骤。
所述样品是心肌钙蛋白，并且还包括同时或大约同时进行用于心肌梗塞的附加测试的步骤。
所述进行所述附加测试的步骤包括进行心电图检查(EKG)的步骤。
所述进行多种生物标志物的所述多重测量的步骤包括进行用于等摩尔测试的肌钙蛋白C和I测量的步骤，或进行用于肌酸激酶(CK)和/或肌红蛋白(MB)的测试。以增加用于cTnI结果的置信度。
在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度的步骤包括在所述SAW传感器的多个功能化检测通道中同时测量所述样品中分析物的浓度，而所述功能化检测通道无流体。
在所述功能化检测通道无流体时在所述SAW传感器的多个功能化检测通道中同时测量所述样品中分析物的浓度的步骤包括在每个所述功能化检测通道均无流体时在所述SAW传感器的多个功能化检测通道中同时测量所述样品中分析物的浓度的步骤。
在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度的步骤包括在所述功能化检测通道分析物的校准动态范围在2pg/ml至24μg/ml无流体时测量所述样品的浓度。
在所述功能化检测通道分析物的校准动态范围在2pg/ml至24μg/ml无流体时测量所述样品的浓度的步骤包括在所述功能化检测通道肌钙蛋白I的校准动态范围在2pg/ml至24μg/ml无流体时测量所述样品的浓度。
在手持便携式测定和传感器系统中提供具有功能化检测通道的SAW传感器的步骤包括在利用旋转盘盒的传感器旋转盘系统中提供SAW传感器，其中，旋转产生的力从全血样品中分离红细胞、白细胞以及血小板，其中，所述旋转盘盒包括用于将纳米颗粒结合物引入到所述SAW传感器的感测区域、用于混合并用于洗涤所述样品，以及用于移动所述盒周围的所述样品，其中，所述SAW传感器集成到所述旋转盘盒中，从而无需将所述样品移动到另一个设备或腔室进行测量，从而减少了分析时间，使得在将所述全血样品放入所述系统后10分钟或更短的时间内即可完成样品的测定。
所述方法还包括以下步骤：大约同时采集多个样品；重复保持所述SAW传感器的所述功能化检测通道干燥，直到所述第二样品流体性地被布置在所述检测通道中，将所述第二样品流体性地布置在所述功能化检测通道中，去除流体所述功能化检测通道以将所述第二样品浓缩在所述功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的所述可能性，洗涤所述功能化检测通道使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述功能化检测通道中，再次从所述功能化检测通道中去除流体，直到足够质量的所述样品已经布置在所述功能化检测通道中以产生可靠的读数；并且然后在所述功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度。
所示实施例还可以表征为一种湿-干方法，所述方法包括以下步骤：通过SAW检测器的感测区布置预定有限体积的包括分析物的液体样品，感测区已经使用预定抗体功能化；通过SAW检测器的参考区布置预定有限体积的包括分析物的液体样品，参考区没有使用预定抗体功能化；保持所述液体样品与所述SAW检测器的所述感测区接触的时间段长于所述分析物从流体扩散到所述预定抗体并找到与所述抗体结合的正确方向所需的时间以便可能被固定在所述感测区；从所述感测区和所述参考区蒸发所述液体样品；并且从所述感测区和所述参考区产生表示蒸发后结合到所述感测区的分析物的数量的差分测量信号。
所述方法还包括以下步骤：重复通过SAW检测器的感测区布置预定有限体积的包括分析物的额外的液体样品，通过SAW检测器的参考区布置预定有限体积的包括分析物的所述额外的液体样品，保持所述额外的液体样品与所述SAW检测器的所述感测区接触的时间段长于所述分析物从液体扩散到所述预定抗体并找到与所述抗体结合的正确方向所需的时间以便可能被固定在所述感测区上，并且从所述感测区和所述参考区蒸发所述额外的液体样品，以增加所述分析物以正确方向与所述抗体配对的可能性，以致于在测量之前在所述感测区中进行特定捕获。
所述方法还包括在所述感测区上方布置垫片以限制性地限定所述感测区的与所述液体样品结合的部分的步骤。
所示实施例的精神和范围还包括用于进行上述方法的装置。
虽然为了语法流畅性和功能性解释已经或将要描述所述装置和方法，但应明确理解，除非根据35 USC 112明确规定，否则所述权利要求不应被解释为必须限于以任何方式通过“手段”或“步骤”的结构来限制，但在等同的司法学说下，将被赋予由所述权利要求提供的定义的全部含义和等同物，并且在所述权利要求是在35 USC 112下明确制定的将被赋予在35 USC 112下的完整的法定等同物。现在通过转向以下附图可以更好地形象化本公开，其中，相同的元件由相同的数字表示。
附图说明
图1是钙饱和形式的人心肌钙蛋白复合物(52kDa核心)的图解带状表示。蓝色＝肌钙蛋白C；绿色＝肌钙蛋白I；品红色＝肌钙蛋白T。
图2是SAW相位偏移输出随时间变化的图，显示了SH-SAW检测器对甘油的浓度变化的灵敏度。
图3是说明SH-SAW传感器对溶液粘度变化的灵敏度的表格。
图4是由CTn引起的SAW相位偏移与浓度的函数关系的图，说明作为肌钙蛋白结合函数的SAW传感器的灵敏度。
图5是说明SH-SAW传感器对磷酸钠缓冲溶液中cTn浓度的灵敏度的表格。
图6是多通道SH-SAW传感器的照片，以隔离的方式显示了包含其的任何电路以及已移液到其中的样品。
图7是所示实施例的湿-干工艺的示意图。
图8是电流SAW传感器的示意图，该传感器由沉积在钽酸锂基板16上的二氧化硅的复合薄膜14组成，该基板16具有一对叉指电极(IDT)。
现在可以通过转向优选实施例的以下详细描述来更好地理解本公开及其各种实施例，这些优选实施例被呈现为权利要求中限定的实施例的所示示例。清楚地理解的是，由权利要求限定的实施例可以比下面描述的所示实施例更宽泛。
具体实施方式
心肌钙蛋白I(cTnI)测量已成为用于怀疑患有急性冠状动脉综合征(ACS)的患者的风险分层和结果评估的不可或缺的工具。心肌钙蛋白的带状图如图1所示。一种能够监测患者的血液中肌钙蛋白的高度便携传感器代表了向全球任何地方的任何患者提供床边测量的重大进步。
cTnI是疾病状态的指标，或者它甚至可以作为疾病发作的早期指标。由于循环cTnI复合物或亚单位I在人血液中的浓度自然低于10pg/ml，因此传感器平台需要能够检测低于10pg/mL的浓度。有几种常见的情况可以增加肌钙蛋白浓度而不会增加患者的急性心肌梗塞(AMI)的风险。因此，临床医生需要了解肌钙蛋白I浓度增加的可能存在的非心脏原因。为了尽量减少误诊或假阳性评估的可能性，肌钙蛋白评估通常与其他测定一起进行。例如，医生通常会要求进行包括心电图和用于cTnI的血液测试的处理，以协助鉴别诊断。据估计，所有循环cTnI的95％以上以cTnI-cTnC复合物的形式出现。因此，用于提高cTnI结果的置信度的一种潜在方法是提供多种生物标志物的多重测量；例如，包括用于等摩尔测试的肌钙蛋白C和I测量，或包括用于肌酸激酶(CK)和/或肌红蛋白(MB)的测试。
如图6所示，在单个SAW传感器10中具有多个检测通道12，剪切波表面声波(SH-SAW)传感器10非常适合于进行多重测定。用于测量多种生物标志物以进行正确诊断的需要当然不限于急性心肌梗塞(AMI)。事实上，包括多种形式的癌症、病毒感染和真菌病原体的几种疾病模型都需要对多种生物标志物进行测试以进行诊断和治疗。所有这些生化测定都可以通过在SH-SAW生物测定中进行的免疫测定来检测。
所述SAW传感器10由沉积在钽酸锂基板16上的二氧化硅的复合薄膜14组成，该基板具有一对叉指电极(IDT)18，如图8示意性地所示并且如美国专利8,709,791中所述，如同全文列出一样以引用方式并入本文。二氧化硅层14有两个目的：1)为生物功能化提供支架、捕获剂(通常是抗体或DNA探针)；以及2)用作波导20以将SH-SAW波限制到波导20和SAW传感器10的上表面上约一个波长的表层。因此，SAW传感器10仅探测固液界面而非本体溶液。自然地，假设表面处分析物的浓度代表本体溶液。为了检测肌钙蛋白，通过固定针对人心肌钙蛋白亚单位I上的结合表位的抗体功能化二氧化硅波导20的上表面。
在所述SAW传感器10两端的SiO2的顶层14之下是IDT18。在我们的设备中，IDT结构18被精确调谐以转换325或650MHz范围内的信号。IDT18被设计成激发基板16的钽酸锂(LiTaO3)晶体，并在此过程中产生压力波(声波)。在制造所述SH-SAW传感器10之前，将基板16的LiTaO3晶体切割成具有X轴传播形状的36°Y切割，以促进剪切波在晶体中的传播。所述SH-SAW传感器10中的剪切波的传播被描述为泄漏的表面声波传播，因为来自波的一些能量由于溶剂的粘性而损失。由于二氧化硅引导层，切割成具有X轴传播36°Y切割的LiTaO3晶体能够处理液体，但是，该系统在空气中最敏感，因为由于溶剂粘度或由于液体溶剂的质量负载，声波有较小的衰减。空气的粘度或质量负载非常小，因此，所述SH-SAW传感器10在空气中的灵敏度明显高于在液体环境中的灵敏度。
当一个IDT阵列18被适当频率的RF输入波形激励时，信号以SH-SAW波的形式通过LiTaO3基板16传输，并被另一端的IDT阵列18接收。该波的传播率和衰减率对两个IDT 18区域之间的材料特性高度敏感；这是波导20的感测区或延迟线。改变SH-SAW波传输的感测区20的变化包括粘弹性特性的改变，该改变包括由于抗原与抗体的结合、由于温度的升高或降低、以及由于固液界面处质量的增加或去除而使粘弹性层变硬。因此，与抗体-抗原复合物的结合和形成相关的表面质量的增加是SAW系统10感测的基础。下面进一步讨论了将SH-SAW波的改变转换为诊断测量的方法。
诊断背景：
准确获得小分子和蛋白质生物标志物的浓度的能力是用于监测疾病进展及用于早期诊断的关键要求。然而，这很复杂因为循环血液中生物标志物的水平通常处于痕量水平。因此，生物标志物的检测通常需要浓缩步骤，或者所使用的传感器必须非常灵敏。进行生物标志物检测的传统方法包括进行免疫诊断生化测定。用于蛋白质抗原的免疫诊断测定有多种形式，并且可以使用几类感测方式进行。这些方式包括酶联免疫测定、荧光免疫测定、电泳免疫测定、电化学阻抗免疫测定和质谱免疫测定。这些系统中的每一个系统都有其自身的缺点。这些技术都具有需要标记的标志、处理时间长以及需要大而笨重的设备的缺点。因此，需要具有这些仪器的灵敏度的手持式护理点设备。在手持式生物传感器中使用蛋白质涂层芯片进行免疫测定具有彻底改变医学的巨大潜力。
在这些手持式护理点系统中，使用作为识别元件的表面结合抗体进行抗原检测。一种抗体，成功地与抗原配对，它会引起电传输信号的变化。因此，测定灵敏度取决于固定的抗原数量。在SH-SAW传感器10的情况下，抗原与表面结合的抗体的结合影响声波的传播。影响捕获效率的因素包括表面密度、表面上的抗体方向以及使用的溶剂。使用环氧基封端的三甲氧基硅烷接头进行抗体的共价连接。在理想情况下，我们希望以天然形式固定抗体。在这里，我们展示了一种用户友好且快速的SAW传感器10，用于监测人血液中的生物标志物。
SH-SAW波背景：
面波的现象在1877年由Lord Rayleigh最先描述。然而，基于SAW技术的化学传感器的第一份报告是出现在1979年8月的《分析化学》(Analytical Chemistry)一期中的蒸汽传感器。自从这份早期报告以来，SAW设备在用作气体传感器方面一直很有吸引力。然而，瑞利波(Rayleigh wave)的纵向和剪切垂直分量在液体中显着衰减，这限制了它们作为化学传感器的使用。为了克服此限制，拉夫波(Love wave)装置被开发并被优化。这类压电器件在基板上使用引导层来保护传感器免受恶劣液体环境的影响，充当声波波导以防止液体和声波之间的直接相互作用，并将表面波的能量限制在固液界面。所述SAW传感器10的波导20的表面上粒子的偏移衰减了由压电基板16的激励产生的表面声波的速度和幅度。SH-SAW设备使用引导层、声波波导20，以将表面声波限制在到SAW传感器10的表面的一个波长内的区域内。主要要求是波导具有比用于制造所述SAW传感器10的基板16低的波速。没有波导，裸SH-SAW设备10具有较低的灵敏度，因为声波深入基板16。在钽酸锂的情况下，对于具有X传播的36度Y形切口，SH波速度约为4077m/s。SH-SAW设备上使用的引导层是二氧化硅层14。
SH-SAW传感器10在工作频率下的性能可以通过在SAW芯片设计用于操作的中心频率周围的小范围或频率(±1MHz)上扫描来自动确定。这允许对激励频率进行微调，从而使SAW传感器10以可能的最高增益运行。尽管进行了这些努力，但由于多种因素(包括样品粘度或介质中存在的样品质量)的组合，总会损失一些能量。因此，最大化信噪比成为最小化插入损耗、最大化由于传感器表面上的质量负载而导致的特定信号、增加传感器表面上的粘度以及由于结合在表面上而增加刚度的努力。
使用移液管、注射器或注射泵经由样品腔室(未示出)或孔将样品引入读数器(未示出)。被测样品传统上被引入含有设定体积的缓冲溶液的液体样品中，以覆盖SAW传感器10的波导20的整个表面区域。如图6所示，这里我们提出了一种减少引入单个液滴的液体体积或一系列液滴的替代方法。或者，我们可以使用0.5-5μl之间的小体积。样品中的抗原可以与波导20的传感表面相互作用并达到动态平衡。样品中的液体完全蒸发。蒸发后，我们接着进行洗涤步骤，然后让样品再次干燥。然后通过从样品或检测通道12中减去从参考通道24测量的信号，将新终点与参考通道24的终点进行比较。样品通道12的终点与参考通道24的终点之间的差异是用于校准SAW传感器10的差分测量。我们建立了2皮克每毫升(2pg/ml)和24微克每毫升(24μg/ml)之间的动态范围。该范围跨越10pg/ml-100ng/ml的临床相关范围。这允许SH-SAW传感器10评估肌钙蛋白I的正常浓度、轻微升高的肌钙蛋白水平以及来自单一测量的高肌钙蛋白水平。一小时后进行的第二次测量确定该值是在前沿还是后沿，即具有递增或递减的斜率。
在第一实施例中，蒸发是自然蒸发过程，其发生在传感器10所处环境的温度、压力和湿度下。这种环境的湿度和其他参数可能因地点和时间而异。虽然通常加热传感器10使其干燥是不希望的，因为存在生物活性分子，加热可能不会使蛋白质、核酸或碳水化合物在100°F以下变性，但是，它可能会改变天然生物活性。在另一个实施例中，可以采用通过使干燥气流流过液滴或样品而进行的干燥来增加或减少分析时间。例如，使干燥氮气流过传感器10是一个实施例，因为氮气是一种相对惰性的气体，其不应改变任何生物活性。
在又一个实施例中，依次使用干燥，即干燥-再悬浮或添加更多液体-然后再次干燥。这有两个优点：增加分析物的总质量；并且它允许用于正确的抗体-抗原结合的多次尝试。除了(a)具有较短的扩散长度(由于小液滴或样品尺寸)，由于样品仅分布在感测区域上，因此蒸发和捕获的最大化导致样品的浓度。然而，连续添加的能力增加了捕获的几率且增加了总沉积样品质量。
在所示实施例的范围和精神内，可以在传感器10中提供三维感测表面积以增加总感测表面积。表面积的增加将增加传感器10上的总体抗原捕获。
在一个实施例中，提供了湿度传感器(未示出)，使得测量过程仅在预定湿度水平(例如20％相对湿度)时开始或进行。在使用绝对干燥的气体干燥后，在密闭腔室中达到湿度。感测和参考通道经历相同的环境条件。然而，参考通道不具有特异性结合抗原的能力。只有非特异性结合。可以监测感测区的干燥度或编程为每次都相同。SH-SAW传感器10本身给出被测膜何时足够干燥的指示。当达到所需的干燥度时，来自传感器10的信号会发生巨大的跳跃。在液体没有被去除到临界或期望水平的过程中，传感器10的灵敏度没有显着偏移。当被测膜干燥时，这种偏移总是在过程结束时发生。
手持设备(未显示)是完全集成式系统，它采集全血并将血液加工成血浆和固体以促进测量。在2019年2月25日提交的美国申请16/285,092中完整地描述了手持设备及其操作方法，该申请通过引用整体并入本文。新鲜血液样品的血液加工和净化在盘状盒(未显示)中进行，该盒以每分钟2000转(RPM)的速度旋转，以将红细胞、白细胞以及血小板与血液的液体成分分离。盒设计成在盒中有腔室(未显示)，允许将纳米颗粒结合物引入SH-SAW传感器的感测区域，混合并洗涤测定。除了解决将血液分离成其成分的问题，盘还解决了在盒周围移动液体的问题。SH-SAW传感器10集成到旋转盘中，无需将液体样品移动到另一个设备或另一个腔室。这导致分析时间减少。这允许所公开的系统在患者就诊后不到30分钟内或在接收全血样品后10分钟内给出患者的样品的结果。SH-SAW分析系数的结果显示小于10％的变化。ANOVA方差分析揭示了，从浓度范围跨越六个数量级的样品中收集的数据，揭示每个SH-SAW结果落在95％置信限度内，平均值来自另一个群体的几率小于5％，样品浓度在2.4ng/ml-24μg/ml之间。低于2.4ng/ml的数据点需要依次添加样品以增加质量以获得信号。这些值也是一致且不同种类的，因为知道每个组的平均值是不同种类的，值低于另一个统计群体的值的几率小于5％。
SH-SAW生化测定
开发此SH-SAW生物传感器平台的目标是能够检测生化相互作用，特别是在感兴趣的蛋白质生物标志物上的表位和那个抗原的针对这些特定表位的抗体之间的生化相互作用。通常，通过将大约50μL样品溶液添加到在SAW传感器10上已有一些缓冲溶液的孔中来进行。这导致样品稀释了大约三分之二。这种稀释对于粘性样品或具有复杂基质的样品是有益的。然而，由于样品处理中的挑战和降低检测限的努力，样品的稀释会适得其反。
为了解决此问题，我们开发了一种替代方法来使用湿-干法进行SH-SAW测量，其中，传感器保持干燥直到将样品添加到波导20的感测表面。该技术有效地消除了初始稀释并且允许样品在液体蒸发时在波导20的感测表面上变得高度集中。与之前的“湿-湿”方法相比，进行湿-干法有几个明显的优点：1)消除了由于检测通道12上方的液柱引起的声波的衰减；2)将测量减少到纯质量测量，这允许简单的洗涤步骤，以确保仅探测我们感兴趣的特定抗原-抗体相互作用；3)蒸发过程作为一种浓缩机制，增加了特异性抗体-抗原配对的可能性。综合起来，这些优势将显着提高信噪比。
在湿-干法中，少量液体样品，通常为50μl，被移取或连续的液体流流过波导20的单个延迟线。如果液体保持与波导20的感测区接触的时段长于分子从溶液扩散到抗体并找到用于结合的正确方向所需的时间，然后抗体很可能被固定在检测通道12上。在SH-SAW传感器10的一次迭代中，垫片(未示出)被放置在波导20的延迟线上以限制性地引导样品结合的区域。液体样品蒸发是时间、湿度以及溶液中分析物的分子的浓度的函数。如果蒸发率高，则正确抗体-抗原相互作用的可能性会显着增加。多次施用含有抗原的样品会增加抗原与抗体以正确方向配对的可能性，从而导致特异性捕获。剩余的通道用作为参考通道24。通过比较从样品通道12蒸发后的终点并减去参考通道24中样品的信号来计算被测信号。参考通道24中的样品含有不含所有抗原的缓冲溶液。样品将具有未知浓度的cTnI。湿-干测量与不同类型的质量增强剂(包括金纳米粒子(AuNP)和磁性纳米粒子(MNP))兼容。
在生化测定中，SH-SAW传感器10被浸没，并且通过吸附或选择性结合本体溶液中的物质而形成的生物层的质量与剪切水平表面声波(SH-SAW)传感器10表面上的声波传播相互作用。由声波相对于未受干扰波的延迟引起的相位偏移给出了相位偏移。消除由液体介质柱引起的相位偏移和信号衰减会显着增加粘弹性耦合对相速度的影响。可以使用由固体弹性基板(LiTaO3)16、粘弹性中间层14(二氧化硅)以及粘弹性顶层26(生物层)组成的三层系统开发生物传感器表面的简单模型。在固体基板16中，SH-SAW波的偏移场由横波方程(以下方程1)给出。
方程1。横波方程
Figure BDA0003283913460000111
其中，v0为在基板(LiTaO3)中的声速，μ0为基板弹性剪切模量，并且ρi为基板16的质量密度。
每个波长的传播损耗由以下方程2给出。
方程2。每个波长的传播损耗
Figure BDA0003283913460000112
其中，ILiq为流动池充满液体时的设备插入损耗，IAir为流动池为空时的设备插入损耗。这两项的相减并不能解释固液界面处的菲涅耳反射。
实验性地，观察到设备传播损耗随着粘度和密度的平方根的乘积而增加。
因此，每波长的传播损耗可表示为以下方程3：
方程3。每个波长的传播损耗
Figure BDA0003283913460000113
长波长SH-SAW的相速度偏移可由以下方程4给出：
方程4。相速度偏移
Figure BDA0003283913460000114
其中，
Figure BDA0003283913460000115
是使用网络分析仪测量的相位偏移，
Figure BDA0003283913460000116
是输入和输出叉指换能器(IDT)18之间的未扰动相位。
对于粘性液体负载下的SH-SAW传感器10，发现相对相速度偏移与液体粘度的平方根成正比，并由方程6给出：
方程5。相速度偏移
Figure BDA0003283913460000117
如果我们做一个
Figure BDA0003283913460000118
与
Figure BDA0003283913460000119
相反的图，得到与理论模型一致的线性关系。图中的线性回归线与原点有轻微的负补偿。从原点产生的额外相对速度偏移是由于液体负载引起的。去除液体可消除这些影响，从而产生正补偿。
与湿-湿技术相比，湿-干技术显示出更高的质量感测灵敏度。这可能是因为在相同的加工条件下，湿-干技术导致夹带的粘性液体更稀薄。由于波导20的延迟线上方的流体柱将接近最大衰减深度，因此这导致传播声波的较少扰动，即低得多的插入损耗。
SAW芯片
使用剥离光刻-平版印刷方法在LiTaO3基板16上制造如上所述的多通道SH-SAW传感器10。制造工艺包括以下方式使用LiTaO3基板16：1)沉积一系列金属以形成合金，即以沉积
Figure BDA0003283913460000122
钛，再沉积
Figure BDA0003283913460000124
铝，再沉积
Figure BDA0003283913460000127
硅腈，再沉积0.75μm二氧化硅的顺序；2)器件的顶部先镀
Figure BDA0003283913460000125
钛，再镀
Figure BDA0003283913460000126
铝；3)布置最后一层是
Figure BDA0003283913460000123
的二氧化硅。在光刻方法完成之后，SAW传感器10的部分处理的芯片涂覆有粘合层。粘合层是一层环氧基封端的三乙氧基硅烷。环氧基封端的三乙氧基硅烷可与多个官能团反应。环氧基团与来自多肽和各种蛋白质的游离胺基团具有高度反应性，并通过开环过程进行反应。SAW传感器10的芯片然后被清洁并被储存在没有水分的惰性气氛中。当SAW传感器10的芯片准备好使用时，它们用诸如IgG和ScFv之类的靶向分子共价装饰。使用称为Stabil Coat免疫测定稳定剂(SurModics ofEden Prairie,Minnesota)的蛋白质稳定淬灭游离环氧基团。SH-SAW传感器10的功能化芯片在使用前被存储在专用腔室中。可以使用电子表格或数据分析工具Matlab进一步离线处理来自阅读器的数据。
数据分析
使用定制设计的图形用户界面(GUI)进行数据分析，该界面在Agilent Vee Pro环境中被设计用于数据收集。数据处理由MatLab/SimuLink程序执行，该程序确定相位延迟、衰减并将数据归一化为已知参考。计算机中用于确定样品中相位变化和构象变化的方程为：
方程1。
Figure BDA0003283913460000121
其中，ACR是平均校准曲线响应，且SCR是特定的校准曲线响应，并且其中，下标R表示参考数据点，且下标S表示样品数据点。方程2给出了_。
方程2。
Figure BDA0003283913460000131
初步数据
甘油校准
二元甘油-水溶液在甘油浓度低于50％时表现得与牛顿流体基本相同。水和甘油-水混合物之间的主要区别在于粘度的大小。因此，我们可以探测改变溶液粘度对由设备测量的传播声波的相位偏移的影响。
使用甘油在去离子水中的二元溶液(范围从0.002％甘油到20％甘油)对湿-干法进行校准。假设传感器的温度近似于所有测量的样品。然而，用于所有实验的温度都被记录下来，因此相位偏移可以针对声波传播的温度的影响进行归一化。图3中的表1和图2的图总结了甘油-水研究的结果。
在不脱离实施例的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以做出许多改变和修改。因此，必须理解的是，所示实施例仅出于示例的目的而被阐述，并且不应被视为限制由以下实施例及其各种实施例限定的实施例。
因此，必须理解的是，所示实施例仅为示例的目的而被阐述，不应将其视为限制以下权利要求所定义的实施例。例如，尽管权利要求的要素在以下特定组合中被阐述，但必须明确理解的是，实施例包括更少、更多或不同要素的其他组合，即使在最初未在此类组合中声明，这些要素在上文中也已被公开。将两个元素组合在所要求的组合中的教导进一步被理解为也允许所要求的组合，其中两个元素未彼此组合，但可单独使用或组合在其他组合中。在实施例的范围内，明确考虑切除实施例的任何公开元素。
本说明书中用于描述各种实施例的词语不仅应被理解为它们通常定义的含义，而且还应通过特殊定义在本说明书中包括超出通用定义的范围的结构、材料或行为意义。因此，如果元素在本说明书的上下文中可以被理解为包括多于一个含义，那么它在权利要求中的使用必须被理解为对说明书和该词语本身支持的所有可能的含义是通用的。
因此，在本说明书中，所附权利要求的词语或元素的定义不仅包括字面上阐述的元素的组合，还包括用于进行基本相同的功能的所有等效结构、材料或行为。以基本相同的方式获得基本相同的结果。因此，在这个意义上，预期可以对以下权利要求中的任何一个元素进行两个或更多个元素的等效替换，或者可以用单个元素替换权利要求中的两个或更多个元素。尽管上述元件可被描述为在某些组合中起作用，甚至最初被要求如此，但应明确理解的是，在某些情况下，可从组合中切除来自所要求的组合的一个或更多个元素，并且所要求的组合可被指向子组合或子组合的变体。
如本领域普通技术人员看来，现在已知的或以后设计的对所要求保护的主题的非实质性变化被明确地预期为等同于在权利要求的范围内。因此，本领域普通技术人员现在或以后已知的明显替换被定义为在所定义元素的范围内。
因此，权利要求应被理解为包括上面具体说明和描述的内容、概念上等同的内容、可以明显替换的内容以及基本上结合实施例的基本思想的内容。

Claims (20)

1.一种操作SAW传感器以检测流体中的样品的方法，包括：
在手持便携式测定和传感器系统中提供具有至少一个功能化检测通道的SAW传感器；
保持所述SAW传感器的所述至少一个功能化检测通道干燥，直到所述样品流体性地被布置在所述至少一个检测通道中；
将所述样品流体性地布置在所述至少一个功能化检测通道中；
从所述至少一个功能化检测通道中去除流体以将所述样品浓缩在所述至少一个功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的可能性；
洗涤所述至少一个功能化检测通道，使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述至少一个功能化检测通道中；
再次从所述至少一个功能化检测通道中去除流体；并且
在所述至少一个功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在稍后的时间采集第二样品；
重复保持所述SAW传感器的所述至少一个功能化检测通道干燥，直到所述第二样品流体性地被布置在所述至少一个检测通道中，将所述第二样品流体性地布置在所述至少一个功能化检测通道中，从所述至少一个功能化检测通道中去除流体以将所述第二样品浓缩在所述至少一个功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的可能性，洗涤所述至少一个功能化检测通道使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述至少一个功能化检测通道中，再次从所述至少一个功能化检测通道中去除流体；并且
测量所述第二样品的浓度，同时所述至少一个功能化检测通道在第二稍后的时间无流体以确定所述样品浓度是随时间增加还是减少。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是心肌钙蛋白，并且还包括在无需经历技术培训即可操作的简易便携式测定和传感器系统中提供具有至少一个功能化检测通道的SAW传感器。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样品是心肌钙蛋白，并且还包括在无需经历技术培训即可操作的简易便携式测定和传感器系统中提供具有至少一个功能化检测通道的SAW传感器。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述至少一个功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度包括在所述至少一个功能化检测通道浓度水平等于或低于10pg/mL下无流体时测量所述样品的浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括同时或大约同时进行用于心肌梗塞的附加测试。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，进行所述附加测试包括进行多种生物标志物的多重测量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是心肌钙蛋白，并且还包括同时或大约同时进行用于心肌梗塞的附加测试。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，进行所述附加测试包括进行心电图检查(EKG)。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，进行所述附加测试包括进行多个生物标志物的多重测量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，进行所述多个生物标志物的多重测量包括进行用于等摩尔测试的肌钙蛋白C和肌钙蛋白I测量，或进行用于肌酸激酶(CK)和/或肌红蛋白(MB)的测试以增加测试对于cTnI结果的置信度。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述至少一个功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度包括在所述至少一个功能化检测通道无流体时同时测量所述SAW传感器的多个功能化检测通道中的所述样品中的分析物的浓度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，在所述至少一个功能化检测通道物流体时在所述SAW传感器的多个功能化检测通道中同时测量所述样品中分析物的浓度包括：在每个所述功能化检测通道无流体时同时测量所述SAW传感器的多个功能化检测通道中的所述样品中的所述分析物的浓度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述至少一个功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度包括在所述至少一个功能化检测通道在分析物的校准动态范围为2pg/ml至24μg/ml的情况下无流体时测量所述样品的浓度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，在所述至少一个功能化检测通道在分析物的校准动态范围为2pg/ml至24μg/ml的情况下无流体时测量所述样品的浓度包括在所述至少一个功能化检测通道在肌钙蛋白I的校准动态范围为2pg/ml至24μg/ml的情况下无流体时测量所述样品的浓度。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，在手持便携式测定和传感器系统中提供具有至少一个功能化检测通道的SAW传感器，包括在利用旋转盘盒的传感器旋转盘系统中提供SAW传感器，其中，旋转产生的力将红细胞、白细胞和血小板从全血样品中分离，其中，所述旋转盘盒包括用于将纳米颗粒结合物引入所述SAW传感器的感测区、用于混合及用于洗涤所述样品，并且用于使所述样品围绕所述盒移动的腔室，其中，所述SAW传感器被集成到所述旋转盘盒中，从而无需将所述样品移动到另一个设备或腔室进行测量，从而减少了分析时间，使得在将所述全血样品放入所述系统后10分钟或更短的时间内即可完成所述样品的测定。
17.根据权利要求1所述的方法，还包括：
大约同时采集多个样品；
重复保持所述SAW传感器的所述至少一个功能化检测通道干燥，直到所述第二样品被流体性地布置在所述至少一个检测通道中，将所述第二样品流体性地布置在所述至少一个功能化检测通道中，从所述至少一个功能化检测通道中去除流体以将所述第二样品浓缩在所述至少一个功能化检测通道中以增加特异性抗体-抗原相互作用的可能性，洗涤所述至少一个功能化检测通道使得基本上只有所述特异性抗原-抗体相互作用保留在所述至少一个功能化检测通道中，再次从所述至少一个功能化检测通道中去除流体，直到足够质量的所述样品已经被布置在所述至少一个功能化检测通道中以产生可靠的读数；并且
然后在所述至少一个功能化检测通道无流体时测量所述样品的浓度。
18.一种湿-干方法，包括：
通过SAW检测器的感测区布置预定有限体积的包括分析物的液体样品，该感测区已经使用预定抗体进行了功能化；
通过SAW检测器的参考区布置预定有限体积的包括分析物的液体样品，该参考区没有使用预定抗体进行功能化；
保持所述液体样品与所述SAW检测器的所述感测区接触的时间长于所述分析物从液体扩散到所述预定抗体并找到与所述抗体结合的正确取向所需的时间以便可能被固定在所述感测区上；
从所述感测区和所述参考区蒸发所述液体样品；并且
从所述感测区和所述参考区产生差分测量信号，所述差分测量信号表示蒸发后结合到所述感测区的分析物的量。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括重复通过SAW检测器的感测区布置预定有限体积的包括分析物的额外的液体样品，通过SAW检测器的参考区布置预定有限体积的包括分析物的所述额外的液体样品，保持所述额外的液体样品与所述SAW检测器的所述感测区接触的时间长于所述分析物从液体扩散到所述预定抗体并找到与所述抗体结合的正确取向所需的时间以便可能被固定在所述感测区上，并且从所述感测区和所述参考区蒸发所述额外的液体样品，以增加所述分析物以所述正确取向与所述抗体配对的可能性，以致于在测量之前在所述感测区中进行特定捕获。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括在所述感测区上方布置垫片以限制性地限定所述感测区的与所述液体样品结合的部分。
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