CN113811540A - 环状化合物以及制备和使用方法 - Google Patents

环状化合物以及制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于直接对未保护的肽和其他化合物进行高效化学选择性肽环化和双环化的化合物和方法，以及通过所述方法所制备的化合物，其具有新的结构基序。快的反应速率和操作简易性使得该方法高效地合成环状结构，即环肽。环状化合物实现在化学生物学研究和药物发现中有用的各种功能性。

Description

环状化合物以及制备和使用方法
序列表的引用
依照37 C.F.R.§1.52(e)(5)特此将于2019年4月4日提交的序列表通过引用并入，所述序列表为于2019年3月29日创建的名为“UHK_00833_PCT_ST25.txt”且大小为12161字节的文本文件。
发明领域
本发明总体上涉及环状化合物以及制备和使用它们的方法，更具体地涉及环肽以及制备和使用它们的方法。
发明背景
肽环化赋予肽更刚性的构象(Morrison,Nature Reviews Drug discovery,17(8):531-533(2018)；Driggers等人,Nature Reviews Drug Discovery,7(7):608(2008)；Wang等人,Nature Chemical Biology,14(5):417(2018))以及对酶促蛋白水解的增强的稳定性(Tapeinou等人,Peptide Science,104(5):453-461(2015)；Kessler,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,21(7):512-523(1982))。已经从不同界的生物发现了许多环肽，其展现出多样的生物活性，包括抗肿瘤、抗微生物、以及抗炎活性(Wang等人,NatureChemical Biology,14(5):417(2018)；Kritzer,Nature Chemical Biology,6(8):566(2010)；Kohli,Nature,418(6898):658(2002))。以大结合表面结合时，环肽的刚性可以降低吉布斯(Gibbs)自由能的熵成本。因此，环肽被用于探测和干扰蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)(Rubin等人，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.,26(3):199-221(2016))，其在常规的基于小分子的药物发现中被认为是“无成药性”靶标。基于结构，环肽可以分为头对尾、头对侧链、侧链对尾和侧链对侧链环化。已经开发了各种方法和策略以构建环肽(White等人，Nature Chemistry,3(7):509(2011))。特别地，有效的化学选择性方法的进展使得能够对未保护的天然肽直接进行环化。例如，Pentlute和合作者使用钯介导的赖氨酸或半胱氨酸芳基化(Spokoyny等人,J.Am.Chem.Soc.,135(16):5946-9(2013)；Rojas等人,Chem.Sci.,8(6):4257-4263(2017)；Lee等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,56(12):3177-3181(2017)；Vinogradova等人，Nature,526(7575):687(2015)；Zhang等人，Nature Chemistry,8(2):120(2016))，以及Dawson和合作者使用二氯丙酮(Assem等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,54(30):8665-8668(2015))，Chou使用硫醇-烯反应(Wang等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,54(37):10931-10934(2015))，以及Greenbaum使用二溴-间-二甲苯(Jo等人，J.Am.Chem.Soc.,134(42):17704-17713(2012))以形成半胱氨酸-半胱氨酸二烷基化环化。在Dawson的实例中，环化提供了用于经由肟反应的进一步后期缀合(late-stageconjugation)的环外羰基官能团(Assem等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,54(30):8665-8668(2015))。
邻苯二甲醛(OPA)、硫醇部分(即，2-巯基乙醇)和胺的三组分偶联反应以形成发荧光的1-取代-硫代-2-取代-异吲哚，其在历史上已经被用于在肽埃德曼(Edman)降解过程和氨基酸的分析测定期间检测氨基基团。Roth在1971年首次报道了该反应及其用于氨基酸的荧光检测的用途(Roth,Anal.Chem.,43(7):880-882(1971))。Benson和合作者后来通过使用大量过量的2-巯基乙醇并添加苄泽(Brij)改善了反应重现性(Benson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72(2):619-22(1975))。在硼酸缓冲液(pH 9.7)中添加氨基酸之前，该三组分反应的既定方案需要预混合大量过量的巯基乙醇和OPA两者，以便获得干净且可重复的结果(Simons等人，Anal.Biochem.,82(1):250-4(1977))。对于解释该现象，该反应在机理上仍然不清楚。
仍然需要开发在药物发现和化学生物学研究中有用的功能性环状化合物。还需要一种用于制备环状化合物的快速、干净、简单并且实现多种功能性的有效方法。
因此，本发明的目的是提供功能性环状化合物。
本发明的另一目的是提供制备这样的化合物的方法。
本发明的另一目的是提供使用这样的化合物的方法。
本发明的又另一目的是提供用于合成这样的化合物的试剂盒。
贯穿本说明书的描述和权利要求书，词语“包括/包含(comprise)”和该词语的变体，诸如“包括/包含(comprising)”和“包括/包含(comprises)”，意指“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整体或步骤。
本说明书中已经包括的对文献、法案、材料、文章等的任何讨论不被认为是承认任何或所有这些事项由于其存在于本申请的每项权利要求的优先权日之前而形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识。
发明概述
公开了环状化合物以及制备和使用它们的方法。具体地，公开了具有式I的结构的环状化合物：
Figure BDA0003281449180000031
其中A′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
其中X′是–NR3、氧原子、或硫原子，其中R3是氢、取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中R1和R2独立地是不存在的、未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的杂烷基基团、或取代的杂烷基基团；
其中Q是关注的化合物；和
其中L′和M′独立地是不存在的或关注的化合物。
在一些形式中，X′是硫原子。在一些形式中，Q、L′、以及M′，如果存在，是相同类型的分子，诸如相同类型的低聚物。在一些形式中，Q可以是低聚物或合成材料。在一些形式中，Q可以是合成单体残基的低聚物。在一些形式中，L′和M′是一个或多个单体残基或合成材料。在一些形式中，L′和M′是一个或多个单体残基。在一些形式中，L′和M′是合成材料。
在一些形式中，单体残基可以各自独立地是氨基酸残基或核苷酸残基。在一些形式中，单体残基可以是氨基酸残基。在一些形式中，单体残基可以是核苷酸残基。在一些形式中，L′和M′可以各自独立地是一个或多个氨基酸残基。
在一些形式中，Q可以是肽或寡核苷酸。在一些形式中，Q可以是肽。在一些形式中，Q可以是线性肽、环肽、或分支肽。在一些形式中，Q可以是线性肽。在一些形式中，Q可以是环肽。在一些形式中，Q可以是分支肽。在一些形式中，Q可以是寡核苷酸。在一些形式中，Q可以是未保护的肽。在一些形式中，Q可以是寡核苷酸。
在一些形式中，A′是
Figure BDA0003281449180000041
其中J′是
Figure BDA0003281449180000042
其中D′包含化学探针和/或生物功能分子，其中R6-R12各自独立地是C、S、O、或N。在式VII″的一些形式中，R10或R12之一是S，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在一些形式中，D′进一步包含偶联至式VI的环和偶联至化学探针和/或生物功能分子的连接基。在一些形式中，D′是-R4-(CH2)n-Z，其中R4是：
氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式II的结构：
Figure BDA0003281449180000051
其中X′、R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中A″是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中Y′是氮原子。
在一些形式中，A″可以是未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是未取代的聚杂芳基基团或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是未取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是取代的聚杂芳基基团。
在一些形式中，A″是
Figure BDA0003281449180000061
其中J′是
Figure BDA0003281449180000062
其中D′包含化学探针和/或生物功能分子，其中R6-R12各自独立地是C、S、O、或N。在式VII″的一些形式中，R10或R12之一是S，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在一些形式中，D′进一步包含偶联至式VI的环和偶联至化学探针和/或生物功能分子的连接基。在一些形式中，D′是-R4-(CH2)n-Z，其中R4是：
氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式III的结构：
Figure BDA0003281449180000071
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中R4是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中R5是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的羰基基团、取代的羰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式III′或式III″的结构：
Figure BDA0003281449180000081
其中R1、R2、R4、R5、Q、L′、M′、n和Z是如以上所定义的。
在具体形式中，当R4是氢时，n可以是零，并且Z可以是不存在的。在一些形式中，R4可以是未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、或取代的杂烯基基团。在一些形式中，R4可以是取代的烯基基团或取代的杂烯基基团。在一些形式中，R4可以是取代的烯基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是取代的琥珀酰亚胺基基团。
在一些形式中，Z，如果存在，可以是发光探针或含有发光探针。在一些形式中，发光探针可以是有机染料、生物荧光团、或量子点。在一些形式中，发光探针可以是有机染料。在一些形式中，有机染料可以是荧光素、若丹明、或其衍生物。在一些形式中，发光探针可以是生物荧光团。在一些形式中，发光探针可以是量子点。在一些形式中，Z，如果存在，可以是比色探针或含有比色探针。在一些形式中，Z，如果存在，可以是生物功能分子或含有生物功能分子。在一些形式中，生物功能分子可以是聚糖、肽、寡核苷酸、蛋白质、或小分子药物。在一些形式中，功能分子可以是聚糖。在一些形式中，功能分子可以是肽。在一些形式中，功能分子可以是寡核苷酸。在一些形式中，功能分子可以是蛋白质。在一些形式中，功能分子可以是小分子药物。在一些形式中，Z可以含有两个或更多个生物功能分子。在一些形式中，Z，如果存在，可以含有发光探针和生物功能分子的组合。
在一些形式中，式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物是发荧光的。
在一些形式中，式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物可以通过进行式IV的化合物和式V的化合物之间的反应制备。
Figure BDA0003281449180000091
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中X″和Y″独立地是羧酸基团、羧酸酯基团，
任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，
任选地在羟基氧处含有一个取代基的羟基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者
任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中A″′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中G1′和G2′是反应性基团。
在一些形式中，X″和Y″可以各自独立地是任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团。
在一些形式中，X″和Y″可以各自独立地是胺基团或硫醇基团。在一些形式中，X″和Y″不相同并且可以各自独立地是氨基基团或硫醇基团。在一些形式中，X″是硫醇基团并且Y″是氨基基团。在一些形式中，X″是硫醇基团并且Y″是胺基团。
在一些形式中，A″′可以是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″′可以是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的聚芳基基团、或取代的聚芳基基团。在一些形式中，A″′可以是未取代的芳基基团或取代的芳基基团。
在一些形式中，G1′和G2′可以各自独立地是醛基团、氰酸酯基团、腈基团、异腈基团、硝基基团、亚硝基基团、亚硝基氧基团、酰基基团、羧酸基团、或羧酸酯基团。在一些形式中，G1′和G2′可以各自独立地是醛基团或酰基基团。在一些形式中，G1′和G2′相同并且可以是醛基团或酰基基团。在一些形式中，G1′和G2′相同并且可以是醛基团。
在一种具体形式中，式V的化合物是邻苯二甲醛(OPA)。在另一种具体形式中，式V的化合物是2,3-噻吩二甲醛(TDA)。
在一些形式中，式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物可以通过以下制备：(a)进行式IV的化合物与式V的化合物之间的反应以形成加合物，其中式IV和式V是如以上所定义的，以及(b)进行来自步骤(a)的加合物与反应物之间的反应以形成第二加合物。
在一些形式中，反应物可以是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是马来酰亚胺衍生物。在一些形式中，反应物可以是未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是衍生的炔基基团。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应可以各自独立地在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应可以在相同的缓冲溶液中进行。在一些形式中，缓冲溶液可以是乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TEAA缓冲液、或硼酸盐缓冲液。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约7的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在约6至约10、约6.5至约10、约6.8至约10、约7至约10、约7.4至约10、或约8至约10的pH下进行。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约7的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在约6至约10、约6.5至约10、约6.8至约10、约7至约10、约7.4至约10、或约8至约10的pH下进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应在不同于步骤(b)的反应的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应在与步骤(b)的反应相同的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应都在至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应都在至少约8、优选至少约8.5的pH下进行。
给定步骤的反应的进程或完成可以依据例如在给定的反应时间处、在给定的反应时间之后、截止给定的反应时间、和/或持续给定的反应时间(所有时间开始于反应开始时)所消耗的(多种)反应物或所产生的产物的量或百分比来提及。例如，在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以进行导致至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物已经反应的时间。在一些形式中，步骤(a)的反应可以进行导致至少80％的式IV的化合物已经反应的时间。在一些形式中，步骤(a)的反应可以进行导致至少80％的式V的化合物已经反应的时间。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的步骤(a)中所形成的加合物和/或反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的步骤(a)中所形成的加合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以不同于步骤(b)的反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以与步骤(b)的反应相同的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约80％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约90％的转化率。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。在一些形式中，步骤(b)的反应可以达到至少约80％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约90％的转化率。
在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率不同于由步骤(b)的反应所达到的转化率。在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率高于由步骤(b)的反应所达到的转化率。在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率低于由步骤(b)的反应所达到的转化率。
公开了用于合成所公开的化合物的试剂盒。该试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种所公开的式IV和式V的化合物，任选地包含一种或多种所公开的反应物、一种或多种缓冲液、使用说明，以及任选地包含一种或多种载体、和/或离子型或非离子型洗涤剂。
还公开了在药物发现和化学生物学研究中使用所公开的化合物的方法。
所公开的化合物、试剂盒、以及方法的另外的优点将在下面的描述中部分地阐述，并且将从描述中部分地理解，或者可以通过所公开的化合物、试剂盒、以及方法的实践来了解。所公开的化合物、试剂盒、以及方法的优点将凭借所附权利要求书中特别指出的要素和组合实现和获得。应当理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都仅是示例性的和说明性的，并且不是对所要求保护的本发明的限制。
附图简述
并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图展示了所公开的化合物、试剂盒、以及方法的若干实施方案，并且与描述一起用于解释所公开的化合物、试剂盒、以及方法的原理。
图1是示出Ac-KAAACH-CONH2(SEQ ID NO:16)(0.5mM)与OPA(1当量)在各种pH缓冲液中反应15分钟的条形图。
图2是示出使用模型肽Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2(SEQ ID NO:10)，OPA环化的DMAC修饰的肽和OPA环化的肽的稳定性结果的图。
图3A是示出荧光素修饰的肽cKC10′-F、cKC9′-F、以及cCK9′-F与Caco2细胞的结合能力的流式细胞术分析的图。图3B是示出若丹明修饰的环肽cKC10′-R、cKC9′-R、以及cCK9′-R与Cacos细胞结合的图。KC-10′：Ac-KTPSPFDSHC-CONH2(SEQ ID NO:25)，KC-9′：Ac-KSDSWHYWC-CONH2(SEQ ID NO:26)，CK-9′：Ac-CPIEDRPMK-CONH2(SEQ ID NO:27)，F：荧光素，R：若丹明，Neg：DMSO。*：P值<0.05，**：P值<0.01，***：P值<0.001。
图4A是示出荧光素修饰的肽cKC10′-F、cKC9′-F、以及cCK9′-F与HT116细胞的结合能力的流式细胞术分析的图。图4B是示出若丹明修饰的环肽cKC10′-R、cKC9′-R、以及cCK9′-R与HT116细胞结合的图。KC-10′：Ac-KTPSPFDSHC-CONH2(SEQ ID NO:25)，KC-9′：Ac-KSDSWHYWC-CONH2(SEQ ID NO:26)，CK-9′：Ac-CPIEDRPMK-CONH2(SEQ ID NO:27)，F：荧光素，R：若丹明，Neg：DMSO。*：P值<0.05，**：P值<0.01，***：P值<0.001。
图5A是示出荧光素修饰的肽cKC10′-F、cKC9′-F、以及cCK9′-F与A431细胞的结合能力的流式细胞术分析的图。图5B是示出若丹明修饰的环肽cKC10′-R、cKC9′-R、以及cCK9′-R与A431细胞结合的图。KC-10′：Ac-KTPSPFDSHC-CONH2(SEQ ID NO:25)，KC-9′：Ac-KSDSWHYWC-CONH2(SEQ ID NO:26)，CK-9′：Ac-CPIEDRPMK-CONH2(SEQ ID NO:27)，F：荧光素，R：若丹明，Neg：DMSO。*：P值<0.05，**：P值<0.01，***：P值<0.001。
图6A是示出荧光素修饰的肽(cKC10′-F、cKC9′-F、以及cCK9′-F)与不同细胞系(Caco2、HT116、以及A431)结合的条形图。图6B是示出若丹明修饰的肽(cKC10′-R、cKC9′-R、以及cCK9′-R)与不同细胞系(Caco2、HT116、以及A431)结合的条形图。
图7是OPA介导的一锅环化和生物缀合(bioconjugation)的示意图。
发明详述
所公开的化合物、试剂盒、以及方法可以通过参考以下具体实施方案和其中所包括的实施例的详细描述以及附图和它们先前和随后的描述更容易地理解。
本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或另外与上下文明显抵触。除非另有要求，否则本文所提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围造成限制。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实施是必要的。
所公开的化合物和试剂盒可以用于所公开的方法，可以与所公开的方法联合使用，可以用于形成所公开的方法，或者是所公开的方法的产品。应理解的是，当公开这些化合物和试剂盒的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些材料的每种不同的个体和集体组合的具体指称，但在本文中具体考虑和描述了每种。例如，如果公开和讨论了化合物并且讨论了可以对包括化合物的许多分子进行的许多修饰，除非明确相反地指示，否则具体考虑了化合物和可能的修饰的每种和所有组合与排列。
此外，如以上所考虑和公开的化合物、试剂盒、组分等中的每一种也可以具体地且独立地包括在这样的材料的任何组、子组、列表、集合等中，或者从这样的材料的任何组、子组、列表、集合等中排除。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的化合物、组合物、混合物、以及试剂盒的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的各种另外的步骤，应理解的是，这些另外的步骤中的每一个可以用所公开的方法的任何具体的实施方案或实施方案的组合进行，并且每种这样的组合被具体地考虑并且应被认为是公开的。
I.定义
单数形式“一(a/an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指出。例如，提及“一种化合物(a compound)”包括多种化合物，并且提及“该化合物(thecompound)”是指一种或多种化合物及其本领域技术人员已知的等同物。
术语“可以(can)”和“可以是(can be)”以及相关术语旨在表达所涉及的主题事项是任选的(即，该主题事项以一些形式存在并且不以其他形式存在)，而不是对该主题事项的能力或概率的提及，除非上下文另外明确指出。
术语“任选的”和“任选地”意指随后所描述的事件、情况、或材料可以发生或存在或者可以不发生或存在，并且该描述包括其中事件、情况、或材料发生或存在的实例以及其中其不发生或不存在的实例。
如本文所使用的，术语“烷基”是指通过从任意碳原子去除氢原子而衍生自烷烃的一价基团。烷烃表示饱和烃，包括环状(单环的或多环的)的烷烃。烷基基团可以是直链或支链的。“环烷基基团”是指环状的烷基基团。优选的烷基基团具有1至30个碳原子，即C1-C30烷基。在一些形式中，C1-C30烷基可以是直链C1-C30烷基、支链C1-C30烷基、或者直链或支链C1-C30烷基。更优选的烷基基团具有1至20个碳原子，即C1-C20烷基。在一些形式中，C1-C20烷基可以是直链C1-C20烷基、支链C1-C20烷基、或者直链或支链C1-C20烷基。仍更优选的烷基基团具有1至10个碳原子，即C1-C20烷基。在一些形式中，C1-C10烷基可以是直链C1-C10烷基、支链C1-C10烷基、或者直链或支链C1-C10烷基。最优选的烷基基团具有1至6个碳原子，即C1-C6烷基。在一些形式中，C1-C6烷基可以是直链C1-C6烷基、支链C1-C6烷基、或者直链或支链C1-C6烷基。优选的C1-C6烷基基团具有1至4个碳，即C1-C4烷基。在一些形式中，C1-C4烷基可以是直链C1-C4烷基、支链C1-C4烷基、或者直链或支链C1-C4烷基。供选择地，任意C1-C30烷基、C1-C20烷基、C1-C10烷基、C1-C6烷基、和/或C1-C4烷基基团可以是环状的。如果烷基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果烷基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子，诸如O、N、或S替代的烷基基团。杂烷基基团可以是直链或支链的。“环杂烷基基团”是指环状的杂烷基基团。优选的杂烷基基团具有1至30个碳原子，即C1-C30杂烷基。在一些形式中，C1-C30杂烷基可以是直链C1-C30杂烷基、支链C1-C30杂烷基、或者直链或支链C1-C30杂烷基。更优选的杂烷基基团具有1至20个碳原子，即C1-C20杂烷基。在一些形式中，C1-C20杂烷基可以是直链C1-C20杂烷基、支链C1-C20杂烷基、或者直链或支链C1-C20杂烷基。仍更优选的杂烷基基团具有1至10个碳原子，即C1-C20杂烷基。在一些形式中，C1-C10杂烷基可以是直链C1-C10杂烷基、支链C1-C10杂烷基、或者直链或支链C1-C10杂烷基。最优选的杂烷基基团具有1至6个碳原子，即C1-C6杂烷基。在一些形式中，C1-C6杂烷基可以是直链C1-C6杂烷基、支链C1-C6杂烷基、或者直链或支链C1-C6杂烷基。优选的C1-C6杂烷基基团具有1至4个碳，即C1-C4杂烷基。在一些形式中，C1-C4杂烷基可以是直链C1-C4杂烷基、支链C1-C4杂烷基、或者直链或支链C1-C4杂烷基。如果杂烷基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果杂烷基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“烯基”是指通过从任意碳原子去除氢原子而衍生自烯烃的一价基团。烯烃是含有至少一个碳碳双键的不饱和烃。烯基基团可以是直链、支链、或环状的。优选的烯基基团具有2至30个碳原子，即C2-C30烯基。在一些形式中，C2-C30烯基可以是直链C2-C30烯基、支链C2-C30烯基、环状C2-C30烯基、直链或支链C2-C30烯基、直链或环状C2-C30烯基、支链或环状C2-C30烯基、或者直链、支链或环状C2-C30烯基。更优选的烯基基团具有2至20个碳原子，即C2-C20烯基。在一些形式中，C2-C20烯基可以是直链C2-C20烯基、支链C2-C20烯基、环状C2-C20烯基、直链或支链C2-C20烯基、支链或环状C2-C20烯基、或者直链、支链或环状C2-C20烯基。仍更优选的烯基基团具有2至10个碳原子，即C2-C10烯基。在一些形式中，C2-C10烯基可以是直链C2-C10烯基、支链C2-C10烯基、环状C2-C10烯基、直链或支链C2-C10烯基、支链或环状C2-C10烯基、或者直链、支链或环状C2-C20烯基。最优选的烯基基团具有2至6个碳原子，即C2-C6烯基。在一些形式中，C2-C6烯基可以是直链C2-C6烯基、支链C2-C6烯基、环状C2-C6烯基、直链或支链C2-C6烯基、支链或环状C2-C6烯基、或者直链、支链或环状C2-C6烯基。优选的C2-C6烯基基团具有2至4个碳，即C2-C4烯基。在一些形式中，C2-C4烯基可以是直链C2-C4烯基、支链C2-C4烯基、环状C2-C4烯基、直链或支链C2-C4烯基、支链或环状C2-C4烯基、或者直链、支链或环状C2-C4烯基。如果烯基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果烯基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“杂烯基”是指其中一个或多个双键连接的碳原子被杂原子替代的烯基基团。杂烯基基团可以是直链、支链、或环状的。优选的杂烯基基团具有2至30个碳原子，即C2-C30杂烯基。在一些形式中，C2-C30杂烯基可以是直链C2-C30杂烯基、支链C2-C30杂烯基、环状C2-C30杂烯基、直链或支链C2-C30杂烯基、直链或环状C2-C30杂烯基、支链或环状C2-C30杂烯基、或者直链、支链或环状C2-C30杂烯基。更优选的杂烯基基团具有2至20个碳原子，即C2-C20杂烯基。在一些形式中，C2-C20杂烯基可以是直链C2-C20杂烯基、支链C2-C20杂烯基、环状C2-C20杂烯基、直链或支链C2-C20杂烯基、支链或环状C2-C20杂烯基、或者直链、支链或环状C2-C20杂烯基。仍更优选的杂烯基基团具有2至10个碳原子，即C2-C10杂烯基。在一些形式中，C2-C10杂烯基可以是直链C2-C10杂烯基、支链C2-C10杂烯基、环状C2-C10杂烯基、直链或支链C2-C10杂烯基、支链或环状C2-C10杂烯基、或者直链、支链或环状C2-C20杂烯基。最优选的杂烯基基团具有2至6个碳原子，即C2-C6杂烯基。在一些形式中，C2-C6杂烯基可以是直链C2-C6杂烯基、支链C2-C6杂烯基、环状C2-C6杂烯基、直链或支链C2-C6杂烯基、支链或环状C2-C6杂烯基、或者直链、支链或环状C2-C6杂烯基。优选的C2-C6杂烯基基团具有2至4个碳，即C2-C4杂烯基。在一些形式中，C2-C4杂烯基可以是直链C2-C4杂烯基、支链C2-C4杂烯基、环状C2-C4杂烯基、直链或支链C2-C4杂烯基、支链或环状C2-C4杂烯基、或者直链、支链或环状C2-C4杂烯基。如果杂烯基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果杂烯基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“炔基”是指通过从任意碳原子去除氢原子而衍生自炔烃的一价基团。炔烃是含有至少一个碳碳三键的不饱和烃。炔基基团可以是直链、支链、或环状的。优选的炔基基团具有2至30个碳原子，即C2-C30炔基。在一些形式中，C2-C30炔基可以是直链C2-C30炔基、支链C2-C30炔基、环状C2-C30炔基、直链或支链C2-C30炔基、直链或环状C2-C30炔基、支链或环状C2-C30炔基、或者直链、支链或环状C2-C30炔基。更优选的炔基基团具有2至20个碳原子，即C2-C20炔基。在一些形式中，C2-C20炔基可以是直链C2-C20炔基、支链C2-C20炔基、环状C2-C20炔基、直链或支链C2-C20炔基、支链或环状C2-C20炔基、或者直链、支链或环状C2-C20炔基。仍更优选的炔基基团具有2至10个碳原子，即C2-C10炔基。在一些形式中，C2-C10炔基可以是直链C2-C10炔基、支链C2-C10炔基、环状C2-C10炔基、直链或支链C2-C10炔基、支链或环状C2-C10炔基、或者直链、支链或环状C2-C20炔基。最优选的炔基基团具有2至6个碳原子，即C2-C6炔基。在一些形式中，C2-C6炔基可以是直链C2-C6炔基、支链C2-C6炔基、环状C2-C6炔基、直链或支链C2-C6炔基、支链或环状C2-C6炔基、或者直链、支链或环状C2-C6炔基。优选的C2-C6炔基基团具有2至4个碳，即C2-C4炔基。在一些形式中，C2-C4炔基可以是直链C2-C4炔基、支链C2-C4炔基、环状C2-C4炔基、直链或支链C2-C4炔基、支链或环状C2-C4炔基、或者直链、支链或环状C2-C4炔基。如果炔基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果炔基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“杂炔基”是指其中一个或多个三键连接的碳原子被杂原子替代的炔基基团。杂炔基基团可以是直链、支链、或环状的。优选的杂炔基基团具有2至30个碳原子，即C2-C30杂炔基。在一些形式中，C2-C30杂炔基可以是直链C2-C30杂炔基、支链C2-C30杂炔基、环状C2-C30杂炔基、直链或支链C2-C30杂炔基、直链或环状C2-C30杂炔基、支链或环状C2-C30杂炔基、或者直链、支链或环状C2-C30杂炔基。更优选的杂炔基基团具有2至20个碳原子，即C2-C20杂炔基。在一些形式中，C2-C20杂炔基可以是直链C2-C20杂炔基、支链C2-C20杂炔基、环状C2-C20杂炔基、直链或支链C2-C20杂炔基、支链或环状C2-C20杂炔基、或者直链、支链或环状C2-C20杂炔基。仍更优选的杂炔基基团具有2至10个碳原子，即C2-C10杂炔基。在一些形式中，C2-C10杂炔基可以是直链C2-C10杂炔基、支链C2-C10杂炔基、环状C2-C10杂炔基、直链或支链C2-C10杂炔基、支链或环状C2-C10杂炔基、或者直链、支链或环状C2-C20杂炔基。最优选的杂炔基基团具有2至6个碳原子，即C2-C6杂炔基。在一些形式中，C2-C6杂炔基可以是直链C2-C6杂炔基、支链C2-C6杂炔基、环状C2-C6杂炔基、直链或支链C2-C6杂炔基、支链或环状C2-C6杂炔基、或者直链、支链或环状C2-C6杂炔基。优选的C2-C6杂炔基基团具有2至4个碳，即C2-C4杂炔基。在一些形式中，C2-C4杂炔基可以是直链C2-C4杂炔基、支链C2-C4杂炔基、环状C2-C4杂炔基、直链或支链C2-C4杂炔基、支链或环状C2-C4杂炔基、或者直链、支链或环状C2-C4杂炔基。如果杂炔基是支链的，应理解的是，存在至少四个碳。如果杂炔基是环状的，应理解的是，存在至少三个碳。
如本文所使用的，术语“芳基”是指通过从环原子去除氢原子而衍生自芳烃的一价基团。芳烃是单环和多环芳族烃。在多环芳基基团中，环可以以侧链方式连接在一起或者可以被稠合。优选的芳基基团具有6至50个碳原子，即C6-C50芳基。在一些形式中，C6-C50芳基可以是支链C6-C50芳基、单环C6-C50芳基、多环C6-C50芳基、支链多环C6-C50芳基、稠合多环C6-C50芳基、或支链稠合多环C6-C50芳基。更优选的芳基基团具有6至30个碳原子，即C6-C30芳基。在一些形式中，C6-C30芳基可以是支链C6-C30芳基、单环C6-C30芳基、多环C6-C30芳基、支链多环C6-C30芳基、稠合多环C6-C30芳基、或支链稠合多环C6-C30芳基。甚至更优选的芳基基团具有6至20个碳原子，即C6-C20芳基。在一些形式中，C6-C20芳基可以是支链C6-C20芳基、单环C6-C20芳基、多环C6-C20芳基、支链多环C6-C20芳基、稠合多环C6-C20芳基、或支链稠合多环C6-C20芳基。最优选的芳基基团具有6至12个碳原子，即C6-C12芳基。在一些形式中，C6-C12芳基可以是支链C6-C12芳基、单环C6-C12芳基、多环C6-C12芳基、支链多环C6-C12芳基、稠合多环C6-C12芳基、或支链稠合多环C6-C12芳基。优选的C6-C12芳基基团具有6至11个碳原子，即C6-C11芳基。在一些形式中，C6-C11芳基可以是支链C6-C11芳基、单环C6-C11芳基、多环C6-C11芳基、支链多环C6-C11芳基、稠合多环C6-C11芳基、或支链稠合多环C6-C11芳基。更优选的C6-C12芳基基团具有6至9个碳原子，即C6-C9芳基。在一些形式中，C6-C9芳基可以是支链C6-C9芳基、单环C6-C9芳基、多环C6-C9芳基、支链多环C6-C9芳基、稠合多环C6-C9芳基、或支链稠合多环C6-C9芳基。最优选的C6-C12芳基基团具有6个碳原子，即C6芳基。在一些形式中，C6芳基可以是支链C6芳基或单环C6芳基。
如本文所使用的，术语“杂芳基”是指通过从环原子去除氢原子而衍生自杂芳烃的一价基团。杂芳烃是通过由三价或二价杂原子分别替代一个或多个次甲基(–C＝)和/或亚乙烯基(–CH＝CH–)基团而衍生自芳烃的杂环化合物，其以这种方式以维持芳族体系的连续π-电子体系特性和对应于休克尔(Hückel)规则(4n+2)的许多面外π-电子。在多环杂芳基基团中，环可以以侧链方式连接在一起或者可以被稠合。优选的杂芳基基团具有3至50个碳原子，即C3-C50杂芳基。在一些形式中，C3-C50杂芳基可以是支链C3-C50杂芳基、单环C3-C50杂芳基、多环C3-C50杂芳基、支链多环C3-C50杂芳基、稠合多环C3-C50杂芳基、或支链稠合多环C3-C50杂芳基。更优选的杂芳基基团具有6至30个碳原子，即C6-C30杂芳基。在一些形式中，C6-C30杂芳基可以是支链C6-C30杂芳基、单环C6-C30杂芳基、多环C6-C30杂芳基、支链多环C6-C30杂芳基、稠合多环C6-C30杂芳基、或支链稠合多环C6-C30杂芳基。甚至更优选的杂芳基基团具有6至20个碳原子，即C6-C20杂芳基。在一些形式中，C6-C20杂芳基可以是支链C6-C20杂芳基、单环C6-C20杂芳基、多环C6-C20杂芳基、支链多环C6-C20杂芳基、稠合多环C6-C20杂芳基、或支链稠合多环C6-C20杂芳基。最优选的杂芳基基团具有6至12个碳原子，即C6-C12杂芳基。在一些形式中，C6-C12杂芳基可以是支链C6-C12杂芳基、单环C6-C12杂芳基、多环C6-C12杂芳基、支链多环C6-C12杂芳基、稠合多环C6-C12杂芳基、或支链稠合多环C6-C12杂芳基。优选的C6-C12杂芳基基团具有6至11个碳原子，即C6-C11杂芳基。在一些形式中，C6-C11杂芳基可以是支链C6-C11杂芳基、单环C6-C11杂芳基、多环C6-C11杂芳基、支链多环C6-C11杂芳基、稠合多环C6-C11杂芳基、或支链稠合多环C6-C11杂芳基。更优选的C6-C12杂芳基基团具有6至9个碳原子，即C6-C9杂芳基。在一些形式中，C6-C9杂芳基可以是支链C6-C9杂芳基、单环C6-C9杂芳基、多环C6-C9杂芳基、支链多环C6-C9杂芳基、稠合多环C6-C9杂芳基、或支链稠合多环C6-C9杂芳基。最优选的C6-C12杂芳基基团具有6个碳原子，即C6杂芳基。在一些形式中，C6杂芳基可以是支链C6杂芳基、单环C6杂芳基、多环C6杂芳基、支链多环C6杂芳基、稠合多环C6杂芳基、或支链稠合多环C6杂芳基。
如本文所使用的，术语“异羟肟酸”是指-C(＝O)NH-OH，其中氢原子可以被取代基取代。
如本文所使用的，术语“低聚物”是指具有小或中等数目的单体残基的子单元(例如，单体、结构单元(building block))的多聚体。低聚物的值得注意的实例是肽、寡核苷酸、以及合成单体的低聚物。多聚体是两个或更多个单体残基的任意链。低聚物是具有2至100个单体残基的任意多聚体。通常，低聚物可以具有2至100个单体残基、优选5至50个单体残基、最优选5至20个单体残基。聚合物是具有20个或更多个单体残基的任意多聚体。通常，聚合物可以具有50个或更多个单体残基、75个或更多个单体残基、或者100个或更多个单体残基。因此，术语多聚体、低聚物、以及聚合物重叠，但是低聚物和聚合物具有不同长度的结构域。
如本文所使用的，术语“单体”是指是或者可以是多聚体、低聚物、聚合物等的结构单元的单元。例如，氨基酸是肽和蛋白质的标准结构单元(即单体)。核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的标准结构单元(即单体)。合成单体子单元(例如，乙二醇子单元、丙烯酰胺子单元、乙烯基子单元等)是合成低聚物和聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯基等)的结构单元。
如本文所使用的，术语“残基”是指保留或存在于其中存在单体残基的多聚体、低聚物、或聚合物中的单体子单元的部分。
如本文所使用的，术语“合成材料”是指非低聚物、非聚合物组分。
如本文所使用的，术语“小分子药物”是指可以调节生物学过程的、分子量等于或小于900道尔顿的有机化合物。
如本文所使用的，术语“取代的”意指化学基团或部分含有替代化学基团或部分中的氢原子的一个或多个取代基。取代基包括但不限于：
卤素原子、烷基基团、环烷基基团、杂烷基基团、环杂烷基基团、烯基基团、杂烯基基团、炔基基团、杂炔基基团、芳基基团、杂芳基基团、聚芳基基团、聚杂芳基基团、-OH、-SH、-NH2、-N3、-OCN、-NCO、-ONO2、-CN、-NC、-ONO、-CONH2、-NO、-NO2、-ONH2、-SCN、-SNCS、-CF3、-CH2CF3、-CH2Cl、-CHCl2、-CH2NH2、-NHCOH、-CHO、-COCl、-COF、-COBr、-COOH、-SO3H、-CH2SO2CH3、-PO3H2、-OPO3H2、-P(＝O)(ORT1′)(ORT2′)、-OP(＝O)(ORT1′)(ORT2′)、-BRT1′(ORT2′)、-B(ORT1′)(ORT2′)、或-G′RT1′，其中-T′是-O-、-S-、-NRT2′-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRT2′-、-OC(＝O)-、-NRT2′C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)NRT2′-、-NRT2′C(＝O)O-、-NRT2′C(＝O)NRT3′-、-C(＝S)-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)S-、-C(＝NRT2′)-、-C(＝NRT2′)O-、-C(＝NRT2′)NRT3′-、-OC(＝NRT2′)-、-NRT2′C(＝NRT3′)-、-NRT2′SO2-、-C(＝NRT2′)NRT3′-、-OC(＝NRT2′)-、-NRT2′C(＝NRT3′)-、-NRT2′SO2-、-NRT2′SO2NRT3′-、-NRT2′C(＝S)-、-SC(＝S)NRT2′-、-NRT2′C(＝S)S-、-NRT2′C(＝S)NRT3′-、-SC(＝NRT2′)-、-C(＝S)NRT2′-、-OC(＝S)NRT2′-、-NRT2′C(＝S)O-、-SC(＝O)NRT2′-、-NRT2′C(＝O)S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-SC(＝O)S-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、-OC(＝S)O-、-SO2NRT2′-、-BRT2′-、或–PRT2′-；其中RT1′、RT2′、以及RT3′每次出现时独立地是氢原子、卤素原子、烷基基团、杂烷基基团、烯基基团、杂烯基基团、炔基基团、杂炔基基团、芳基基团、或杂芳基基团。
在一些情况下，“取代的”还指碳链(例如，烷基、烯基、炔基、以及芳基基团)中的一个或多个碳原子被杂原子，诸如但不限于氮、氧、以及硫一次或多次取代。
应理解的是，“取代(substitution)”或“取代的(substituted)”包括隐含的条件，即这样的取代符合经取代的原子和取代基的允许的化合价，并且取代产生稳定的化合物，即不自发地经历诸如通过重排、环化、消除等的转化的化合物。
如本文所使用的，术语“衍生物”是指由母体化合物通过(多种)化学反应所形成的化合物。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短核酸(即，DNA和RNA)分子。它们含有少于100个核苷酸。优选地，它们含有少于50个核苷酸。更优选地，它们含有25个或更少的核苷酸。最优选地，它们含有13-25个核苷酸。
如本文所使用的，术语“发光(Luminescence)”是指不是由热产生的，而是由物质发射光。它可以由化学反应、电能、亚原子运动或对晶体的应力所引起，这都最终由自发发射引起。它可以指化学发光，即作为化学反应的结果的光的发射。它还可以指光致发光，即作为光子吸收的结果的光的发射。光致发光可以包括荧光和磷光。
如本文所使用的，术语“载体(carrier)”或“多种载体(carriers)”是指存在于制剂中的除一种或多种活性成分之外的所有组分。它们可以包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、以及助流剂。
如本文所使用的，术语“转化率”是指产物的量与反应物的量的比率。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其他实施方案中，值可以在以大约+/-5％的范围高于或低于所述值的值的范围内；在其他实施方案中，值可以在以大约+/-2％的范围高于或低于所述值的值的范围内；在其他实施方案中，值可以在以大约+/-1％的范围高于或低于所述值的值的范围内。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不暗示进一步的限制。
本申请中所公开的任何类型的数字范围单独地公开了这样的范围可以合理地涵盖的每个可能的数字，以及其中所涵盖的任何子范围和子范围的组合。
II.化合物
本文公开了环状化合物。特别地，所公开的化合物具有式I的结构或其盐。
Figure BDA0003281449180000231
其中A′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
其中X′是–NR3、氧原子、或硫原子，其中R3是氢、取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中R1和R2独立地是不存在的、未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的杂烷基基团、或取代的杂烷基基团；
其中Q是关注的化合物；和
其中L′和M′独立地是不存在的或关注的化合物。
在一些形式中，X′是硫原子。在一些形式中，Q、L′、以及M′，如果存在，是相同类型的分子(即彼此相同类型的分子)，诸如相同类型的低聚物。在一些形式中，Q可以是低聚物或合成材料。在一些形式中，Q可以是合成单体残基的低聚物。在一些形式中，L′和M′是一个或多个单体残基或合成材料。在一些形式中，L′和M′是一个或多个单体残基。在一些形式中，L′和M′是合成材料。
在一些形式中，单体残基可以各自独立地是氨基酸残基或核苷酸残基。在一些形式中，单体残基可以是氨基酸残基。在一些形式中，单体残基可以是核苷酸残基。在一些形式中，L′和M′可以各自独立地是一个或多个氨基酸残基。
在一些形式中，Q可以是肽或寡核苷酸。在一些形式中，Q可以是肽。在一些形式中，Q可以是线性肽、环肽、或分支肽。在一些形式中，Q可以是线性肽。在一些形式中，Q可以是环肽。在一些形式中，Q可以是分支肽。在一些形式中，Q可以是寡核苷酸。在一些形式中，Q可以是未保护的肽。在一些形式中，Q可以是保护的肽。在一些形式中，Q可以是多糖。在一些形式中，Q可以是单糖。
在一些形式中，A′是
Figure BDA0003281449180000251
其中J′是
Figure BDA0003281449180000252
其中D′包含化学探针和/或生物功能分子，其中R6-R12各自独立地是C、S、O、或N。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的每一个是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的每一个是C。
在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个独立地是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个独立地是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个独立地是S、O、或N。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是S。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是O。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是N。
在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是S、O、或N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个独立地是S、O、或N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个独立地是S、O、或N。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是S并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是S并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是S。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是O并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是O并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是O。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是N。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是S、O、或N，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是S，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是O，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是N，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。
在一些形式中，D′进一步包含偶联至式VI的环和偶联至化学探针和/或生物功能分子的连接基。在一些形式中，D′是-R4-(CH2)n-Z，其中R4是：
氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式II的结构：
Figure BDA0003281449180000271
其中X′、R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中A″是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中Y′是氮原子。
在一些形式中，A″可以是未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是未取代的聚杂芳基基团或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是未取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A″可以是取代的聚杂芳基基团。
在一些形式中，A″是
Figure BDA0003281449180000272
其中J′是
Figure BDA0003281449180000273
其中D′包含化学探针和/或生物功能分子，其中R6-R12各自独立地是C、S、O、或N。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的每一个是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的每一个是C。
在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个独立地是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个独立地是S、O、或N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个独立地是S、O、或N。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是S并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是S。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是O并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是O。在式VII′的一些形式中，R6-R9之一是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的两个是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的三个是N并且R6-R9中的其他的是C。在式VII′的一些形式中，R6-R9中的四个是N。
在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是S、O、或N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个独立地是S、O、或N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个独立地是S、O、或N。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是S并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是S并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是S。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是O并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是O并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是O。在式VII″的一些形式中，R10-R12之一是N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的两个是N并且R10-R12中的其他的是C。在式VII″的一些形式中，R10-R12中的三个是N。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是S、O、或N，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是S，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是O，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。在式VII″的一些形式中，R10或R12中的一个是N，R10或R12中的另一个是C，并且R11是C。
在一些形式中，D′进一步包含偶联至式VI的环和偶联至化学探针和/或生物功能分子的连接基。在一些形式中，D′是-R4-(CH2)n-Z，其中R4是：
氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式III的结构：
Figure BDA0003281449180000291
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中R4是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中R5是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的羰基基团、取代的羰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
其中n是零或正整数；和
其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
在一些形式中，化合物可以具有式III′或式III″的结构：
Figure BDA0003281449180000311
其中R1、R2、R4、R5、Q、L′、M′、n和Z是如以上所定义的。
在具体形式中，当R4是氢时，n可以是零，并且Z可以是不存在的。在一些形式中，R4可以是未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、或取代的杂烯基基团。在一些形式中，R4可以是取代的烯基基团或取代的杂烯基基团。在一些形式中，R4可以是取代的烯基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是未取代的琥珀酰亚胺基基团。在一些形式中，R4可以是取代的琥珀酰亚胺基基团。
在一些形式中，Z，如果存在，可以是发光探针或含有发光探针。在一些形式中，发光探针可以是有机染料、生物荧光团、或量子点。在一些形式中，发光探针可以是有机染料。在一些形式中，有机染料可以是荧光素、若丹明、或其衍生物。在一些形式中，发光探针可以是生物荧光团。在一些形式中，发光探针可以是量子点。示例性发光探针包括但不限于荧光素、若丹明、试卤灵、Tokyo Green、香豆素、萤光素、及其衍生物。
在一些形式中，Z，如果存在，可以是比色探针或含有比色探针。示例性比色探针包括对硝基苯酚、对硫硝基苯甲酸、及其衍生物。在一些形式中，Z，如果存在，可以是生物功能分子或含有生物功能分子。在一些形式中，生物功能分子可以是聚糖、肽、寡核苷酸、蛋白质、或小分子药物。在一些形式中，功能分子可以是聚糖。在一些形式中，功能分子可以是肽。在一些形式中，功能分子可以是蛋白质。在一些形式中，功能分子可以是小分子药物。在一些形式中，Z可以含有两个或更多个生物功能分子。在一些形式中，Z，如果存在，可以含有发光探针和生物功能分子的组合。
在一些形式中，式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物是发荧光的。
独立地，在所公开的化合物的一些形式中，每个R1、R2、R3、R4、以及R5可以独立地是氢或者取代或未取代的C1-C30烷基、直链C1-C30烷基、支链C1-C30烷基、C1-C20烷基、直链C1-C20烷基、支链C1-C20烷基、C1-C10烷基、直链C1-C10烷基、支链C1-C10烷基、C1-C6烷基、直链C1-C6烷基、支链C1-C6烷基、C1-C4烷基、直链C1-C4烷基、支链C1-C4烷基、C1-C30杂烷基、直链C1-C30杂烷基、支链C1-C30杂烷基、C1-C20杂烷基、直链C1-C20杂烷基、支链C1-C20杂烷基、C1-C10杂烷基、直链C1-C10杂烷基、支链C1-C10杂烷基、C1-C6杂烷基、直链C1-C6杂烷基、支链C1-C6杂烷基、C1-C4杂烷基、直链C1-C4杂烷基、支链C1-C4杂烷基、C2-C30烯基、直链C2-C30烯基、支链C2-C30烯基、环状C2-C30烯基、C2-C20烯基、直链C2-C20烯基、支链C2-C20烯基、环状C2-C20烯基、C2-C10烯基、直链C2-C10烯基、支链C2-C10烯基、环状C2-C10烯基、C2-C6烯基、直链C2-C6烯基、支链C2-C6烯基、环状C2-C6烯基、C2-C4烯基、直链C2-C4烯基、支链C2-C4烯基、环状C2-C4烯基、C2-C30杂烯基、直链C2-C30杂烯基、支链C2-C30杂烯基、环状C2-C30杂烯基、C2-C20杂烯基、直链C2-C20杂烯基、支链C2-C20杂烯基、环状C2-C20杂烯基、C2-C10杂烯基、直链C2-C10杂烯基、支链C2-C10杂烯基、环状C2-C10杂烯基、C2-C6杂烯基、直链C2-C6杂烯基、支链C2-C6杂烯基、环状C2-C6杂烯基、C2-C4杂烯基、直链C2-C4杂烯基、支链C2-C4杂烯基、环状C2-C4杂烯基、C2-C30炔基、直链C2-C30炔基、支链C2-C30炔基、环状C2-C30炔基、C2-C20炔基、直链C2-C20炔基、支链C2-C20炔基、环状C2-C20炔基、C2-C10炔基、直链C2-C10炔基、支链C2-C10炔基、环状C2-C10炔基、C2-C6炔基、直链C2-C6炔基、支链C2-C6炔基、环状C2-C6炔基、C2-C4炔基、直链C2-C4炔基、支链C2-C4炔基、环状C2-C4炔基、C2-C30杂炔基、直链C2-C30杂炔基、支链C2-C30杂炔基、环状C2-C30杂炔基、C2-C20杂炔基、直链C2-C20杂炔基、支链C2-C20杂炔基、环状C2-C20杂炔基、C2-C10杂炔基、直链C2-C10杂炔基、支链C2-C10杂炔基、环状C2-C10杂炔基、C2-C6杂炔基、直链C2-C6杂炔基、支链C2-C6杂炔基、环状C2-C6杂炔基、C2-C4杂炔基、直链C2-C4杂炔基、支链C2-C4杂炔基、环状C2-C4杂炔基、C6-C50芳基、支链C6-C50芳基、单环C6-C50芳基、多环C6-C50芳基、支链多环C6-C50芳基、稠合多环C6-C50芳基、支链稠合多环C6-C50芳基、C6-C30芳基、支链C6-C30芳基、单环C6-C30芳基、多环C6-C30芳基、支链多环C6-C30芳基、稠合多环C6-C30芳基、支链稠合多环C6-C30芳基、C6-C20芳基、支链C6-C20芳基、单环C6-C20芳基、多环C6-C20芳基、支链多环C6-C20芳基、稠合多环C6-C20芳基、或支链稠合多环C6-C20芳基、C6-C12芳基、支链C6-C12芳基、单环C6-C12芳基、多环C6-C12芳基、支链多环C6-C12芳基、稠合多环C6-C12芳基、支链稠合多环C6-C12芳基、C6-C11芳基、支链C6-C11芳基、单环C6-C11芳基、多环C6-C11芳基、支链多环C6-C11芳基、稠合多环C6-C11芳基、支链稠合多环C6-C11芳基、C6-C9芳基、支链C6-C9芳基、单环C6-C9芳基、多环C6-C9芳基、支链多环C6-C9芳基、稠合多环C6-C9芳基、支链稠合多环C6-C9芳基、C6芳基、支链C6芳基、单环C6芳基、C6-C50杂芳基、支链C6-C50杂芳基、单环C6-C50杂芳基、多环C6-C50杂芳基、支链多环C6-C50杂芳基、稠合多环C6-C50杂芳基、支链稠合多环C6-C50杂芳基、C6-C30杂芳基、支链C6-C30杂芳基、单环C6-C30杂芳基、多环C6-C30杂芳基、支链多环C6-C30杂芳基、稠合多环C6-C30杂芳基、支链稠合多环C6-C30杂芳基、C6-C20杂芳基、支链C6-C20杂芳基、单环C6-C20杂芳基、多环C6-C20杂芳基、支链多环C6-C20杂芳基、稠合多环C6-C20杂芳基、或支链稠合多环C6-C20杂芳基、C6-C12杂芳基、支链C6-C12杂芳基、单环C6-C12杂芳基、多环C6-C12杂芳基、支链多环C6-C12杂芳基、稠合多环C6-C12杂芳基、支链稠合多环C6-C12杂芳基、C6-C11杂芳基、支链C6-C11杂芳基、单环C6-C11杂芳基、多环C6-C11杂芳基、支链多环C6-C11杂芳基、稠合多环C6-C11杂芳基、支链稠合多环C6-C11杂芳基、C6-C9杂芳基、支链C6-C9杂芳基、单环C6-C9杂芳基、多环C6-C9杂芳基、支链多环C6-C9杂芳基、稠合多环C6-C9杂芳基、支链稠合多环C6-C9杂芳基、C6杂芳基、支链C6杂芳基、或单环C6杂芳基。
具有式I、式II、式III、式III′或式III″的结构的示例性化合物包括化合物1a-1j、7a-7c、9a-9n、cKC10′-F、cKC10′-R、cKC9′-F、cKC9′-R、cCK9′-F、cCK9′-R、20a-20e、23a-23r、以及23a′-23r′，其结构示如下所示。
Figure BDA0003281449180000331
Figure BDA0003281449180000341
Figure BDA0003281449180000351
Figure BDA0003281449180000361
Figure BDA0003281449180000371
Figure BDA0003281449180000381
Figure BDA0003281449180000391
Figure BDA0003281449180000401
Figure BDA0003281449180000411
Figure BDA0003281449180000421
Figure BDA0003281449180000431
Figure BDA0003281449180000441
Figure BDA0003281449180000451
Figure BDA0003281449180000461
Figure BDA0003281449180000471
Figure BDA0003281449180000481
Figure BDA0003281449180000491
Figure BDA0003281449180000501
在一些形式中，式I、II、III、III′和III″的盐可以通过用适量的碱处理化合物的游离酸形式制备。示例性碱是氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化亚铁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铝、氢氧化铁、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。
1.氨基酸、肽、以及蛋白质
所公开的化合物中可以包括肽和多肽，诸如氨基酸的或包含氨基酸的多聚体、低聚物、以及聚合物。例如，Q、L′、M′、及其组合可以是肽和多肽、包含肽和多肽、或包括肽和多肽。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指包含氨基酸残基的聚合物的氨基酸序列。术语“肽”是指包含氨基酸残基的低聚物的氨基酸序列。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物和低聚物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物，及其异构体。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、及其异构体。术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即结合至氢、羧基基团、氨基基团、以及R基团的碳的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。本文中氨基酸可以通过它们通常已知的三字母符号或者通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母符号指称。
如本文所使用的术语“人工氨基酸”是指在其侧链功能性方面不同于二十种天然存在的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)的氨基酸。非天然氨基酸可以是二十种天然氨基酸之一的近似类似物，或者它可以引入全新的功能性和化学性质，只要非天然氨基酸的疏水性等于或大于天然氨基酸的疏水性。非天然氨基酸可以替代蛋白质中的已有氨基酸(取代)，或者可以是对野生型序列的添加(插入)。非天然氨基酸的掺入可以通过包括固相肽合成或天然化学连接的已知化学方法、或者通过生物学方法实现。在某些实施方案中，人工氨基酸包括4-氟-L-苯丙氨酸(F-Phe)和1-甲基-L-色氨酸(Me-Trp)。
2.核酸
所公开的化合物中可以包括核酸，诸如核苷酸的或包含核苷酸的多聚体、低聚物、以及聚合物。例如，Q、L′、M′、及其组合可以是核酸、包含核酸、或包括核酸。
核酸是核苷酸的多聚体、低聚物、以及聚合物。术语“多核苷酸(polynucleotide)”是指包含核苷酸残基的聚合物的核苷酸序列。术语“核苷酸低聚物(nucleotideoligomer)”是指包含核苷酸残基的低聚物的核苷酸序列。该术语还适用于其中一个或多个核苷酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的核苷酸聚合物和低聚物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所使用的，术语“核苷酸”是指含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通过它们的磷酸部分和糖部分连接在一起，创建核苷间连接。标准核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)、以及胸腺嘧啶-1-基(T)。标准核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。标准核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性实例将是3′-AMP(3′-腺苷一磷酸)或5′-GMP(5′-鸟苷一磷酸)。存在本领域中可获得的和本文可获得的许多种类的这些类型的分子。
如本文所使用的，术语“核苷酸类似物”是指含有对碱基、糖、或磷酸部分的一些类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域中众所周知的，并且将包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸部分的修饰。存在本领域中可获得的和本文可获得的许多种类的这些类型的分子。
如本文所使用的，术语“核苷酸替代物”是指具有与核苷酸类似的功能性质但其不含有磷酸部分的核苷酸分子。示例性核苷酸替代物是肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是将以沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogsteen方式识别核酸，但其通过除磷酸部分之外的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物当与合适的靶核酸相互作用时能够符合双螺旋型结构。
除非上下文另外指示，否则本文提及“核苷酸”是指任何形式的核苷酸(标准核苷酸、核苷酸类似物、以及核苷酸替代物)。
在一些形式中，核酸可以包含核糖核苷酸和非核糖核苷酸。在一些这种形式中，核酸可以包含一种或多种核糖核苷酸和一种或多种脱氧核糖核苷酸。在一些形式中，核酸可以包含一种或多种非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物，诸如具有硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯(boranophosphate)键的核苷酸，在核糖环的2′与4′碳之间包含亚甲基桥的锁定核酸(LNA)核苷酸，肽核酸(PNA)，桥接核酸(BNA)或吗啉代。修饰核苷酸的其他实例包括2′-O-甲基类似物、2′-脱氧类似物、2-硫代尿苷类似物、N6-甲基腺苷类似物、或2′-氟代类似物。修饰核苷酸的进一步的实例包括在2'位置连接化学部分，包括但不限于肽、肽核酸(PNA)、吗啉代、聚乙二醇(PEG)、三甘醇、或四甘醇(TEG)。修饰碱基的进一步的实例包括但不限于2-氨基嘌呤、5-溴-尿苷、假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、5-甲氧基尿苷(5moU)、肌苷、7-甲基鸟苷。核酸化学修饰的实例包括但不限于在一个或多个末端核苷酸处掺入2’-O-甲基(M)、2’-O-甲基-3’-硫代磷酸(MS)、硫代磷酸(PS)、S-约束乙基(cEt)、2’-O-甲基-3’-硫代PACE(MSP)、或2’-O-甲基-3’-膦酰基乙酸酯(MP)。
修饰核苷酸(诸如非天然存在的核苷酸)的实例包括但不限于二氨基嘌呤、S2T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸5(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2,6-二氨基嘌呤。也可以在碱基部分(例如，在一个或多个一般可用于与互补核苷酸形成氢键的原子处和/或在一个或多个一般不能与互补核苷酸形成氢键的原子处)、糖部分或磷酸骨架处修饰核酸分子。核酸分子还可以含有胺-修饰基团，诸如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以实现胺反应性部分，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的共价连接。
锁定核酸(LNA)是构象锁定的核苷酸类似物的家族，其向DNA和RNA寡核苷酸提供非常高的亲和力和非常高的核酸酶抗性(Wahlestedt C等人，Proc.Natl Acad.Sci.美国,975633-5638(2000)；Braasch,DA等人，Chem.Biol.81-7(2001)；Kurreck J等人，NucleicAcids Res.301911–1918(2002))。
肽核酸(PNA)是其中天然核酸的磷酸糖骨架已经被通常由N-(2-氨基-乙基)-甘氨酸单元所形成的合成肽骨架替代，产生非手性且不带电荷的模拟物(Nielsen PE等人，Science 254,1497-1500(1991))的核酸类似物。它是化学上稳定的并且耐水解(酶)裂解。
在一些形式中，核酸可以包含吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸一般由两个以上的含有嘌呤或嘧啶碱基配对部分的吗啉代单体组成，所述嘌呤或嘧啶碱基配对部分通过碱基特异性氢键有效地结合至多核苷酸中的碱基，该多核苷酸通过1至3个原子长的含磷键连接在一起，将一个单体的吗啉代氮连接至相邻单体的5′环外碳。嘌呤或嘧啶碱基配对部分一般是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。第5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063、以及5,506,337号美国专利中详细描述了吗啉代低聚物的合成、结构、以及结合特性。
III.制备化合物的方法
公开了制备所公开的环状化合物的方法。在一些形式中，制备式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物的方法可以包括：
(a)进行式IV的化合物与式V的化合物之间的反应。
Figure BDA0003281449180000541
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如以上所定义的；
其中X″和Y″独立地是羧酸基团、羧酸酯基团，
任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，
任选地在羟基氧处含有一个取代基的羟基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者
任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中A′″是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中G1′和G2′是反应性基团。
在一些形式中，X″和Y″可以各自独立地是任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团。
在一些形式中，X″和Y″可以各自独立地是胺基团或硫醇基团。在一些形式中，X″和Y″不相同并且可以各自独立地是氨基基团或硫醇基团。在一些形式中，X″是硫醇基团并且Y″是氨基基团。在一些形式中，X″是硫醇基团并且Y″是胺基团。
在一些形式中，A′″可以是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。在一些形式中，A′″可以是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的聚芳基基团、或取代的聚芳基基团。在一些形式中，A″′可以是未取代的芳基基团或取代的芳基基团。
在一些形式中，G1′和G2′可以各自独立地是醛基团、氰酸酯基团、腈基团、异腈基团、硝基基团、亚硝基基团、亚硝基氧基团、酰基基团、羧酸基团、或羧酸酯基团。在一些形式中，G1′和G2′可以各自独立地是醛基团或酰基基团。在一些形式中，G1′和G2′相同并且可以是醛基团或酰基基团。在一些形式中，G1′和G2′相同并且可以是醛基团。
在一种具体形式中，式V的化合物是邻苯二甲醛(OPA)。在另一种具体形式中，式V的化合物是2,3-噻吩二甲醛(TDA)。
在一些形式中，式I、式II、式III、式III′和式III″的化合物可以通过以下制备：
(a)进行式IV的化合物与式V的化合物之间的反应以形成加合物，其中式IV和式V是如以上所定义的；和
(b)进行来自步骤(a)的加合物与反应物之间的反应以形成第二加合物。
在一些形式中，反应物可以是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是马来酰亚胺衍生物。在一些形式中，反应物可以是未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。在一些形式中，反应物可以是衍生的炔基基团。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应可以各自独立地在缓冲溶液中进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应可以在相同的缓冲溶液中进行。在一些形式中，缓冲溶液可以是乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TEAA缓冲液、或硼酸盐缓冲液。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约7的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以在约6至约10、约6.5至约10、约6.8至约10、约7至约10、约7.4至约10、或约8至约10的pH下进行。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约7的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在至少约7.4的pH下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在约6至约10、约6.5至约10、约6.8至约10、约7至约10、约7.4至约10、或约8至约10的pH下进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应在不同于步骤(b)的反应的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)的反应在与步骤(b)的反应相同的pH下进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应都在至少约7.4的pH下进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以在室温下进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以在室温下进行。在一些形式中，步骤(a)和步骤(b)的反应都可以在室温下进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式IV的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式IV的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中80％的式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中80％的步骤(a)中所形成的加合物和/或反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中80％的步骤(a)中所形成的加合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中80％的反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式IV的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以其中至少80％的式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的步骤(a)中所形成的加合物和/或反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的步骤(a)中所形成的加合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。在一些形式中，步骤(b)的反应可以以其中至少80％的反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以以不同于步骤(b)的反应的速率进行。在一些形式中，步骤(a)的反应可以以与步骤(b)的反应相同的速率进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约80％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约90％的转化率。
在一些形式中，步骤(b)的反应可以达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。在一些形式中，步骤(b)的反应可以达到至少约80％的转化率。在一些形式中，步骤(a)的反应可以达到至少约90％的转化率。
在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率不同于由步骤(b)的反应所达到的转化率。在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率高于由步骤(b)的反应所达到的转化率。在一些形式中，由步骤(a)的反应所达到的转化率低于由步骤(b)的反应所达到的转化率。
在一些形式中，纯化步骤可以任选地在步骤(a)的反应和/或步骤(b)的反应之后进行。在一些形式中，纯化步骤可以任选地在步骤(a)的反应之后进行。在一些形式中，纯化步骤可以任选地在步骤(b)的反应之后进行。
在一些形式中，步骤(a)的反应可以是OPA-环化反应。该方法实现快速且干净的转化、操作简易性、温和的反应条件、以及各种后修饰以实现各种功能性。在一些形式中，步骤(a)的反应可以是OPA-环化反应以形成环肽。在一些形式中，环肽可以是侧链对尾环肽或侧链对侧链环肽。在一些形式中，反应在未保护的肽与OPA之间进行。在一些形式中，未保护的肽可以含有至少一个赖氨酸和至少一个半胱氨酸。在一些形式中，赖氨酸、半胱氨酸、以及OPA反应以形成环肽。在一些形式中，赖氨酸和半胱氨酸可以具有1：1mol/mol的比率。形成环肽的示例性OPA-环化反应如以下所示：
Figure BDA0003281449180000591
在一些形式中，步骤(a)的反应可以是TDA-环化反应。该方法实现快速且干净的转化、操作简单、温和的反应条件、以及各种后修饰以实现各种功能性。在一些形式中，步骤(a)的反应可以是TDA-环化反应以形成环肽。在一些形式中，环肽可以是侧链对侧链环肽。在一些形式中，反应在未保护的肽与TDA之间进行。在一些形式中，未保护的肽可以含有至少一个赖氨酸和至少一个半胱氨酸。在一些形式中，赖氨酸、半胱氨酸、以及TDA反应以形成环肽。在一些形式中，赖氨酸和半胱氨酸可以具有1：1mol/mol的比率。形成环肽的示例性TDA-环化反应如以下所示：
Figure BDA0003281449180000592
在一些形式中，步骤(a)的反应可以是OPA-环化反应以形成双环肽。在一些形式中，反应可以在环肽与OPA之间进行。在一些形式中，环肽可以含有至少一个赖氨酸和至少一个半胱氨酸。在一些形式中，OPA-环化可以是赖氨酸、半胱氨酸、以及OPA之间的侧链对尾反应或侧链对侧链反应。在一些形式中，赖氨酸和半胱氨酸可以具有1：1mol/mol的比率。在一些形式中，NCL反应可以在OPA-环化之前进行以提供环肽。形成双环肽的示例性OPA-环化反应如以下所示：
Figure BDA0003281449180000601
在一些形式中，后修饰(步骤(b))可以在OPA-环化反应之后进行以进一步修饰环肽和/或双环肽。在一些形式中，步骤(a)的反应中所形成的加合物可以用反应物进一步修饰以增加环肽和/或双环肽的稳定性、引入功能性、或两者的组合。
在一些形式中，后修饰(步骤(b))可以在TDA-环化反应之后进行以进一步修饰环肽和/或双环肽。在一些形式中，步骤(a)的反应中所形成的加合物可以用反应物进一步修饰以增加环肽和/或双环肽的稳定性、引入功能性、或两者的组合。
在一些形式中，可以将步骤(a)中的邻苯二甲醛(OPA)和/或2,3-噻吩二甲醛(TDA)和步骤(b)中的反应物依次添加至含有肽或环肽和溶剂的反应混合物中。在一些形式中，可以将步骤(a)中的OPA和/或2,3-噻吩二甲醛(TDA)和步骤(b)中的反应物同时添加至含有肽或环肽和溶剂的反应混合物中。在一些形式中，溶剂可以是缓冲液、有机溶剂、或两者的混合物。在一些形式中，溶剂可以是缓冲液。在一些形式中，溶剂可以是有机溶剂。在一些形式中，溶剂可以是缓冲液和有机溶剂的混合物。在一些形式中，有机溶剂可以是二甲亚砜、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、乙胺、或二甲基甲酰胺。在一些形式中，有机溶剂可以是二甲亚砜。
在一些形式中，反应物可以是乙炔二羧酸二甲酯(DMAC)、N-马来酰亚胺、或马来酰亚胺衍生物。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有化学探针或生物功能分子。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有荧光团、肽、寡核苷酸、或聚糖。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有荧光团。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有肽。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有寡核苷酸。在一些形式中，马来酰亚胺衍生物可以含有聚糖。
示例性DMAC介导的OPA-环化反应的后修饰如以下所示：
Figure BDA0003281449180000611
示例性荧光团-马来酰亚胺介导的OPA-环化的后修饰如以下所示：
Figure BDA0003281449180000612
示例性生物功能分子-马来酰亚胺介导的OPA-环化的后修饰如以下所示：
Figure BDA0003281449180000621
合成式I、式II、式III、式III′和式III″的具体化合物，即用于制备1a-1j、7a-7c、9a-9n、cKC10′-F、cKC10′-R、cKC9′-F、cKC9′-R、cCK9′-F、cCK9′-R、20a-20e、23a-23r、以及23a′-23r′的示例性方法描述于所公开的实施例中。
IV.试剂盒
可以将以上所描述的化合物与其他组分以任何合适的组合包装在一起，作为用于实施、或帮助实施所公开的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的组分被设计并适配用于在所公开的方法中一起使用，则是有用的。
一方面，公开了用于进行合成环状化合物的反应的试剂盒。该试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种所公开的式IV和式V的化合物，任选地包含一种或多种所公开的反应物、一种或多种缓冲液、以及一种或多种其他组分，诸如化合物、溶剂、反应物、以及载体、使用说明和任选地包含离子型或非离子型洗涤剂。其他组分不干扰所公开的式IV和式V的化合物在用于合成环状化合物的反应中的有效性。
试剂盒还可以含有离子型或非离子型洗涤剂。试剂盒还可以包括使用说明。
V.使用化合物的方法
所公开的环状化合物的各种形式之一是产生用于药物发现的环状化合物库，即构建DNA编码的环肽库和噬菌体展示环肽库的方法。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用于化学生物学研究，即细胞成像。环状化合物可以用于体外和体内化学生物学研究。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用作用于组织染色与成像和/或细胞染色与成像的体外探针。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用作用于成像的体内探针。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用作药物。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用于药物递送、优选靶向药物递送。在一些形式中，所公开的环状化合物可以用于开发抗菌环肽的高通量药物筛选。
所公开的化合物和方法可以通过以下编号的段落进一步理解。
1.一种具有式I的结构的化合物：
Figure BDA0003281449180000631
(a)其中A′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
(b)其中X′是–NR3、氧原子、或硫原子，其中R3是氢、取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
(c)其中R1和R2独立地是不存在的、未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的杂烷基基团、或取代的杂烷基基团；
(d)其中Q是低聚物或合成材料；和
(e)其中L′和M′独立地是不存在的、一个或多个单体残基或者合成材料。
2.段落1所述的化合物，其中所述单体残基独立地是氨基酸残基或核苷酸残基。
3.段落1或2所述的化合物，其中Q是肽或寡核苷酸。
4.段落1-3中任一项所述的化合物，其具有式II的结构：
Figure BDA0003281449180000641
(a)其中X′、R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础段落中所定义的；
(b)其中A″是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
(c)其中Y′是氮原子。
5.段落4中任一项所述的化合物，其中A″是未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。
6.段落1-5中任一项所述的化合物，其中X′是硫原子。
7.段落1-6中任一项所述的化合物，其中Q是肽。
8.段落7所述的化合物，其中所述肽是线性肽、环肽、或分支肽。
9.段落1-8中任一项所述的化合物，其中Q是未保护的肽。
10.段落1-9中任一项所述的化合物，其中L′和M′独立地是一个或多个氨基酸残基。
11.段落1-6中任一项所述的化合物，其中Q是合成单体残基的低聚物。
12.段落1-11中任一项所述的化合物，其中所述化合物是发荧光的。
13.段落1-12中任一项所述的化合物，其具有式III的结构：
Figure BDA0003281449180000651
(a)其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础段落中所定义的；
(b)其中R4是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
(c)其中R5是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的羰基基团、取代的羰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
(d)其中n是零或正整数；和
(e)其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
14.段落1-13中任一项所述的化合物，其具有式III′或式III″的结构
Figure BDA0003281449180000661
其中R1、R2、R4、R5、Q、L′、M′、n和Z是如以上所定义的。
15.段落13或段落14所述的化合物，其中当R4是氢时，n是零，并且Z是不存在的。
16.段落13或段落14所述的化合物，其中R4是未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、或取代的杂烯基基团。
17.段落13或段落14所述的化合物，其中R4是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。
18.段落13-17中任一项所述的化合物，其中Z包含发光探针。
19.段落18所述的化合物，其中所述发光探针是有机染料、生物荧光团、或量子点。
20.段落19所述的化合物，其中所述发光探针是选自荧光素、若丹明、及其衍生物的有机染料。
21.段落13-20中任一项所述的化合物，其中Z包含比色探针。
22.段落13-21中任一项所述的化合物，其中Z包含选自聚糖、肽、寡核苷酸、蛋白质、以及小分子药物的生物功能分子。
23.一种制备段落1-22中任一项所述的化合物的方法，其包括：
(a)进行式IV的化合物与式V的化合物之间的反应以形成加合物，
Figure BDA0003281449180000671
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础段中所定义的；
其中X″和Y″独立地是羧酸基团、羧酸酯基团，
任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，
任选地在羟基氧处含有一个取代基的羟基基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者
任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中A″′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中G1′和G2′独立地是醛基团、氰酸酯基团、腈基团、异腈基团、硝基基团、亚硝基基团、亚硝基氧基团、酰基基团、羧酸基团、或羧酸酯基团。
24.段落23所述的方法，其进一步包括：
(b)进行来自步骤(a)的加合物与反应物之间的反应以形成第二加合物，其中所述反应物是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。
25.段落23或24所述的方法，其中式V的化合物是邻苯二甲醛(OPA)。
26.段落23或24所述的方法，其中式V的化合物是2,3-噻吩二甲醛(TDA)。
27.段落23-26中任一项所述的方法，其中X″是硫醇基团并且Y″是氨基基团。
28.段落23-27中任一项所述的方法，其中所述反应在缓冲溶液中进行。
29.段落28所述的方法，其中所述缓冲溶液选自乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TEAA缓冲液、以及硼酸盐缓冲液。
30.段落23-29中任一项所述的方法，其中所述反应在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。
31.段落23-30中任一项所述的方法，其中所述反应在至少约8、优选至少约8.5的pH下进行。
32.段落23-31中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的反应以其中至少80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。
33.段落23-32中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的反应以其中80％的式IV的化合物和/或式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
34.段落23-33中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的反应以其中80％的步骤(a)中所形成的加合物和/或反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
35.段落23-34中任一项所述的方法，其中步骤(a)的反应达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。
36.段落23-35中任一项所述的方法，其中步骤(b)的反应达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。
将通过参考以下非限制性实施例进一步理解本发明。
实施例
以下实施例证明了直接对未保护的肽的高效化学选择性肽环化和双环化，其产生新的结构基序。快的反应速率和操作简易性使得该方法高效地合成环状结构，环肽。
碱环化反应产生可以用于进一步反应的环化结构。碱环化和进一步的反应两者都可以是一锅反应，包括两个反应的顺序组合。反应操作简单、高效(两个步骤<30分钟)，并且在生理条件下进行。尤其值得注意的是，待环化的肽不需要具有任何保护基团，并且反应是高度化学选择性的。
总的来说，OPA/TDA环化方法在化学生物学研究和药物发现两者中都可以用于各种功能环/双环肽、肽缀合物和分支肽的合成。OPA/TDA肽环化的操作简易性和高效率还将为构建DNA编码的环肽库提供新的工具。
实施例1.OPA-环化提供了环化肽的简单方式。
材料和方法
肽合成
所有商品化的材料(Sigma-Aldrich、Acros Organics、J&K Scientific和GLBiochem)不经进一步纯化即使用。所有溶剂均为试剂级或HPLC级(RCI或DUKSAN)。用氢化钙(CaH2)蒸馏干燥的二氯甲烷(CH2Cl2)。在硅胶60F254预涂覆的玻璃板上进行分析型TLC。在硅胶(230-400目，Merck)上进行正相柱色谱法。在Bruker Avance DRX 400FT-NMR光谱仪(1H NMR为400MHz，13C NMR为100MHz)或者Bruker Avance DRX 500FT-NMR光谱仪(1H NMR为500MHz，13C NMR为126MHz)上记录1H和13C NMR光谱。HPLC和MALDI TOF MS方法在以下相应文字中具体描述。
所有商品化的材料(Aldrich、CSBio、Chem-Impex和GL Biochem)不经进一步纯化即使用。所有溶剂均为试剂级或HPLC级(RCI或DUKSAN)。以下Fmoc氨基酸购自GL Biochem和Chemimpex并用于固相合成：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-D-Thr(tBu)-OH。所有分离涉及0.1％的在乙腈中的TFA(体积/体积)和0.1％的在水中的TFA(体积/体积)的流动相。用配备有光二极管阵列检测器(Waters 2996)的Waters HPLC系统进行HPLC分离，使用Vydac 218TP C18柱(5μm，
Figure BDA0003281449180000701
4.6×250mm)以0.6mL/min的流速用于分析型HPLC和XBrigdge Prep C18 10μm OBD柱(10μm，
Figure BDA0003281449180000702
30×250mm)以15mL/min的流速用于制备型HPLC。用Water 3100质谱仪进行质谱分析。
RP-LCMS检测
对于OPA-肽缀合物的所有RP-LCMS和RP-UPLC检测，所有分离涉及0.1％的在乙腈中的TFA(体积/体积)和0.1％的在水中的TFA(体积/体积)的流动相。用配备有光二极管阵列检测器(Waters 2996)的Waters HPLC系统，使用Vydac 218TP C18柱(5μm，
Figure BDA0003281449180000703
4.6×250mm)以0.6mL/min的流速进行RP-LCMS分析。Waters UPLC H级系统配备有ACQUITYUPLC光二极管阵列检测器和Waters SQ检测器2质谱仪，使用ACQUITY BEH C18柱(1.7μm，
Figure BDA0003281449180000704
2.1×50mm)，流速为0.4mL/min。
固相肽合成和天然化学连接
在标准Fmoc方案下，在rink酰胺树脂(GL Biochem)上手动进行合成。使用20/80(体积/体积)的哌啶/DMF的混合物进行Fmoc保护基团的去除，15～20min。使用Fmoc-氨基酸(4.0当量)、HATU(4.0当量)和DIPEA(8.0当量)在DMF中在室温下进行偶联1小时。对于N-末端乙酰化的肽，无水CH2Cl2：吡啶：乙酸酐(2：1：1，体积：体积：体积)与树脂在室温下1小时。合成完成后，使用9.5：0.25：0.25的TFA：TIPS：水(体积：体积：体积)以进行完全脱保护。然后将肽在冷乙醚中沉淀并通过制备型RP-HPLC纯化。
肼2-氯三苯甲基氯树脂的制备
将2-氯三苯甲基氯树脂(500mg，负载＝0.5mmol/g)置于底部具有聚乙烯过滤器的10mL聚丙烯注射器中。将树脂在无水DCM中预溶胀20min。然后通过DCM(3×6mL)和DMF(3×6mL)洗涤树脂。将NH2NH2·H2O/DMF溶液(1/15，体积/体积，6mL)添加到树脂中并将混合物摇动1小时。然后通过DCM(3×6mL)和DMF(3×6mL)洗涤树脂。添加另一份NH2NH2·H2O/DMF溶液(1/15，体积/体积，6mL)并将混合物摇动30min。然后由DCM(3×8mL)和DMF(3×6mL)再次洗涤树脂。将剩余的2-氯三苯甲基氯树脂通过甲醇/DMF溶液(1/15，体积/体积，6mL)淬灭20min。然后将树脂由DMF(3×8mL)洗涤并准备用于Fmoc-固相肽合成(Zheng等人，Natureprotocols.,8(12):2483(2013))。
采用模型肽的OPA-环化
将模型肽(含有赖氨酸和半胱氨酸，1当量)溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)(pH＝7.4)，终浓度为0.5mM。将邻苯二甲醛(1.2当量)添加至溶液并将反应在室温下搅拌约10～15min。通过LC-MS监测转化率。
结果
OPA引导的化学选择性环化的方案：
Figure BDA0003281449180000711
OPA可以与游离胺基团在水性缓冲液中快速反应以形成苯并吡咯酮(Zhang等人，Org.Lett.,14(19):5146-5149(2012)；Tung等人，Org.Lett.,18(11):2600-2603(2016))。发现胺与OPA形成苯并吡咯酮的双组分反应与胺、OPA、以及硫醇形成异吲哚的三种化合物反应竞争。出于该原因，使用大量过量的硫醇基团是有用的。
模型肽(Ac-KAAAAAACF-CONH2；SEQ ID NO:7)携带半胱氨酸残基和赖氨酸。在将OPA添加至在水性PBS缓冲液(pH 7.4)中的肽后，出人意料地，反应呈现为非常平稳且快速的以形成异吲哚环肽，在10分钟内完全转化并且无任何痕量的双组分反应产物(参考苯并吡咯酮)或其他副产物，这通过粗反应混合物的LCMS分析判断(参见上述化合物1a-1j)。OPA以化学计量的量使用。该反应是简单且稳健的(robust)硫醇-胺环化，其是高效且化学选择性的。在环化之后获得了预期的固有荧光。
在PBS缓冲液中，使不同长度且具有在N-末端或Lys侧链与Cys残基之间的4至7个残基的间隔氨基酸的十种模型肽与OPA反应，以提供不同环的环肽，通过粗反应混合物的LCMS分析判断具有93->98％的转化率(参见上述化合物1a-1j和表1)。存在于未保护的肽中的各种侧链功能性不干扰反应。因此，该化学选择性OPA-环化提供了环化未保护的天然肽的简单方式。应当指出的是，该反应不能区分侧链氨基基团和N-末端胺，因此能够产生侧链对尾和侧链对侧链环肽。当肽序列中存在多个赖氨酸残基时，需要使用正交的胺保护基团。
表1.采用不同的肽序列的OPA-引导的环化。
Figure BDA0003281449180000721
实施例2.缓冲液条件影响OPA-环化。
材料和方法
将模型肽Ac-KAAACH-CONH2(SEQ ID NO:16)(0.5mM，1当量)溶解于各种缓冲水溶液中，终浓度为0.5mM。将在DMSO中的OPA(1当量)添加至反应中并在室温下搅拌15min。15min之后，将反应由10μL的一水合肼淬灭。然后将反应混合物由ACN/H2O(含有0.1％TFA)稀释并通过RP-UPLC监测转化率，并且基于LC-MS光谱计算转化率。
结果
进一步的条件筛选显示具有pH 7.4或更高的缓冲液产生非常干净的反应，而具有pH 7或更低的缓冲液产生一些少量的未鉴定的副产物，并且pH 3根本不好(参见图1)。
实施例3.OPA与分子内硫醇-胺的反应提供了有效的肽环化。
材料和方法
将模型肽Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2(SEQ ID NO:10)(1当量)和Ac-AFAQK-CONH2(SEQ ID NO:11)(1当量)溶解于PBS缓冲液，终浓度为0.02mM。将在DMSO中的OPA(1当量)添加至混合物中并在室温下搅拌30min。30min之后，通过RP-UPLC直接监测反应溶液，并基于LC-MS光谱计算转化率。
结果
进行竞争实验以探索反应途径。将仅具有赖氨酸的肽(Ac-AFAQK-CONH2)(SEQ IDNO:11)和具有赖氨酸和半胱氨酸两者的肽(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID No:10)以1：1的比率混合，并在PBS缓冲液中以0.02mM的浓度与OPA(1.0当量)反应。由LCMS分析观察到双组分反应产物(6％)和三组分反应产物(94％)两者(参见表2)。该结果显示，在亚胺形成之后，分子内硫醇对亚胺的进攻比羟基亚胺形成快15倍，提供三组分反应产物作为主要产物。也有可能的是，硫醇首先与OPA反应以形成硫代半缩醛，随后与分子内胺反应。在任何情况下，OPA与分子内硫醇-胺的反应提供了非常有效的肽环化。
表2.竞争反应的转化率
Figure BDA0003281449180000741
[a]基于LCMS曲线计算转化率百分比。
实施例4.NCL-和OPA-环化以超过90％转化率提供双环产物。
材料和方法
经由NCL和OPA环化形成双环肽的方案：
Figure BDA0003281449180000742
双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)
经由NCL和OPA环化形成双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(7a)(SEQ ID NO:12)的方案：
Figure BDA0003281449180000751
肽合成
通过通用SPPS方法在肼2-氯三苯甲基氯树脂上合成肽NH2-CSSLDEPGRGGFSSESKV-CONHNH2(SEQ ID NO:34)。制备型HPLC纯化(10％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈白色粉末的NH2-CSSLDEPGRGGFSSESKV-CONHNH2(SEQID NO:34)。
NCL缓冲液制备(pH＝3和pH＝7)
将NCL缓冲液(pH＝3.0)：Na2HPO4(284mg，2.0mmol)和Gn·HCl(5.7g，60.0mmol)溶解于10mL蒸馏水中。在超声溶解所有固体之后，将混合物的pH用1M HCl溶液和1M NaOH溶液小心地调节至3.0(通过使用pH计)。将NCL缓冲液(pH＝7.0)：Na2HPO4(284mg，2.0mmol)和Gn·HCl(5.7g，60.0mmol)溶解于10mL蒸馏水中。在超声溶解所有的固体之后，将混合物的pH用1M HCl溶液和1M NaOH溶液小心地调节至7.0(通过pH计)。所有缓冲溶液在使用之前现制备。
NCL-环化
将肽NH2-CSSLDEPGRGGFSSESKV-CONHNH2(SEQ ID NO:34)(5.18mg，2.79μmol)完全溶解于pH＝3.0的NCL缓冲液(含有6.0mol/L Gn·HCl和0.2mol/L NaH2PO4，20mL)中，然后将反应混合物冷却至-15℃。然后缓慢地将0.2M NaNO2溶液(70μL)添加至反应混合物中。在-15℃下搅拌反应15min之后，将0.2M MPAA溶液(在NCL缓冲液中，pH＝7，0.7mL)添加至反应混合物中。将连接混合物的pH值用1.0M NaOH溶液小心地调节至6.8至7.0，使反应物升温并在室温下搅拌5h至7h。反应完成之后，添加20.0当量的在pH＝7.0磷酸盐缓冲液中的TCEP·HCl(0.1M)以还原反应。然后通过UPLC监测反应。在HPLC纯化之前，反应混合物将通过ACN/H2O稀释。制备型HPLC纯化(15％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，随后在真空下浓缩并冻干，提供呈白色粉末的环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)(3.5mg，1.9μmol，68.8％)。
来自粗NCL环状反应混合物环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的NCL环化反应(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C75H118N22O29S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1823.95，[M+2H]2+m/z＝912.97，实测值913.19(粗产物)。
来自纯化之后的环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯NCL环化产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速)。C75H118N22O29S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1823.95，[M+2H]2+m/z＝912.97，实测值913.11(纯化之后的产物)。
OPA-环化
然后环肽环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)(0.5mg，1当量)接着经历如以上所描述的OPA-环化条件，通过LC-MS获得期望的双环肽。
在15min处的来自OPA-环化反应产物双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化反应在生理条件下干净地进行以提供双环产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C83H120N22O29S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1923.05，[M+2H]2+m/z＝961.53，实测值961.87。
双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)
经由NCL和OPA环化形成双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(7b)(SEQ ID NO:13)的方案：
Figure BDA0003281449180000771
肽合成
通过通用SPPS方法在肼2-氯三苯甲基氯树脂上合成肽NH2-CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ-CONHNH2(SEQ ID NO:35)。制备型HPLC纯化(10％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈白色粉末的NH2-CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ-CONHNH2(SEQ ID NO:35)。
NCL-环化
将肽NH2-CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ-CONHNH2(SEQ ID NO:35)(9.3mg，3.99μmol)完全溶解于pH＝3.0的NCL缓冲液(含有6.0mol/L Gn·HCl和0.2mol/L NaH2PO4，20mL)中，然后将反应混合物冷却至-15℃。然后缓慢地将0.2M NaNO2溶液(70μL)添加至反应混合物中。在-15℃下搅拌反应15min之后，将0.2M MPAA溶液(在NCL缓冲液中，pH＝7，0.7mL)添加至反应混合物中。将连接混合物的pH值用1.0M NaOH溶液小心地调节至6.8至7.0，使反应物升温并在室温下搅拌5h至7h。反应完成之后，添加20.0当量的在pH＝7.0磷酸盐缓冲液中的TCEP·HCl(0.1M)以还原反应。然后通过UPLC监测反应。在HPLC纯化之前，反应混合物将通过ACN/H2O稀释。制备型HPLC纯化(15％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，随后在真空下浓缩并冻干，提供呈白色粉末的环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)(6.6mg，2.87μmol，71.7％)。
来自粗NCL环状反应混合物环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的NCL环化反应(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C97H147N29O34S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2296.47，[M+2H]2+m/z＝1148.23，[M+3H]3+m/z＝766.49，实测值766.48，1148.80(粗产物)。
来自纯化之后的环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯NCL环化产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速)。C97H147N29O34S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2296.47，[M+2H]2+m/z＝1148.23，[M+3H]3+m/z＝766.49，实测值766.48，1148.97(纯化之后的产物)。
OPA-环化
然后环肽环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)(0.65mg，1当量)接着经历如以上所描述的OPA-环化条件，通过LC-MS获得期望的双环肽。
在15min处的来自OPA-环化反应产物双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化反应在生理条件下干净地进行以提供双环产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C105H149N29O34S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2394.57，[M+2H]2+m/z＝1197.28，[M+3H]3+m/z＝798.19，实测值798.99，1197.56。
双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)
经由NCL和OPA环化形成双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(7c)(SEQ ID NO:14)的方案：
Figure BDA0003281449180000791
肽合成
通过通用SPPS方法在肼2-氯三苯甲基氯树脂上合成肽NH2-CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONHNH2(SEQ ID NO:36)。制备型HPLC纯化(10％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈白色粉末的NH2-CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONHNH2(SEQ ID NO:36)。
NCL-环化
将肽NH2-CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONHNH2(SEQ ID NO:36)(16.4mg，7.44μmol)完全溶解于pH＝3.0的NCL缓冲液(含有6.0mol/L Gn·HCl和0.2mol/L NaH2PO4，20mL)中，然后将反应混合物冷却至-15℃。然后缓慢地将0.2M NaNO2溶液(80μL)添加至反应混合物中。在-15℃下搅拌反应15min之后，将0.2M MPAA溶液(在NCL缓冲液中，pH＝7，0.8mL)添加至反应混合物中。将连接混合物的pH值用1.0M NaOH溶液小心地调节至6.8至7.0，使反应物升温并在室温下搅拌6h。反应完成之后，添加20.0当量的在pH＝7.0磷酸盐缓冲液中的TCEP·HCl(0.1M)以还原反应。然后通过UPLC监测反应。在HPLC纯化之前，反应混合物将通过ACN/H2O稀释。制备型HPLC纯化(20％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，随后在真空下浓缩并冻干，提供呈白色粉末的环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)(4.9mg，2.27μmol，31％)。
来自粗NCL环状反应混合物环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的NCL环化反应(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C90H140N26O32S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2163.8，[M+2H]2+m/z＝1082.9，[M+3H]3+m/z＝721.5，实测值1082.0，721.96(粗产物)。
来自纯化之后的环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯NCL环化产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速)。C90H140N26O32S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2163.8，[M+2H]2+m/z＝1082.9，[M+3H]3+m/z＝721.5，实测值1081.92，721.96(纯化之后的产物)。
OPA-环化
然后环肽环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)(2mg，1当量)接着经历如通用方法中所描述的OPA-环化条件，通过LC-MS获得期望的双环肽。
在15min处的来自OPA-环化反应产物双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化反应在生理条件下干净地进行以提供双环产物(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C98H142N26O32S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2261.48，[M+2H]2+m/z＝1131.74，实测值1131.27。
结果
证明了经由天然化学连接(NCL)随后是OPA-环化的肽双环化策略(图6A-6C)。通过Fmoc-固相肽合成(Fmoc-SPPS)容易地制备具有N-末端半胱氨酸的三种肽酰肼。由肽酰肼得到的肽硫酯经由分子内天然化学连接(NCL)平稳地环化。随后，通过LCMS分析，OPA-环化干净地产生双环产物，转化率>90％(参见表3)。
表3.采用不同肽序列的双环化
Figure BDA0003281449180000811
实施例5.OPA-环化用作用于进一步衍生化的有用处理：采用乙炔二羧酸二甲酯(DMAC)的后修饰。
材料和方法
DMAC介导的OPA-环化的后修饰的方案：
Figure BDA0003281449180000821
在所有OPA-环化和随后的DMAC后修饰实验中，在15mL Eppendorf管中，将模型肽或蛋白质(1当量)溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，终浓度为0.5mM～1mM。将在DMSO中的邻苯二甲醛(OPA)(1.3当量)添加至反应混合物中，然后在室温下搅拌10min～15min并通过分析型RP-UPLC监测。将在DMSO中的乙炔二羧酸二甲酯(DMAC，1.1当量)添加至反应混合物中，然后在室温下搅拌2min～5min并通过分析型RP-UPLC监测，直至反应完成。两步反应可以在20min内完成。将反应通过H2O/ACN稀释，并且然后通过制备型HPLC纯化，在真空下浓缩并冻干以提供期望的产物。
环-(Ac-KAAAACH-CONH2)-DMAC(9a)(SEQ ID NO:15)
步骤1：将Ac-KAAAACH-CONH2(SEQ ID NO:15)(3.8mg，5.3μmol，1.0当量)溶解于10mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，终浓度为0.53mM。将在25μL DMSO中的邻苯二甲醛(OPA)(0.923mg，6.8mmol，1.3当量)添加至反应混合物中，然后在室温下搅拌15min并通过分析型RP-UPLC监测。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C37H51N11O8S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝810.94，[M+2H]2+m/z＝405.47，实测值810.61，405.95。
步骤2：在第一步骤OPA-环化反应完成之后，将在20μL DMSO中的乙炔二羧酸二甲酯(0.82mg，5.8mmol，1.1当量)添加至相同的反应混合物中，然后在室温下搅拌5min，并通过RP-UPLC监测反应直至反应完成。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(10％—45％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)纯化，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-KAAAACH-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:15)(1.7mg，34％收率)。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行(梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速)。C43H57N11O12S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝952.05，[M+2H]2+m/z＝476.02，实测值952.57，476.90。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽c环-(Ac-KAAAACH-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:15)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速)。C43H57N11O12S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝952.05，[M+2H]2+m/z＝476.02，实测值952.73，476.02。
环-(Ac-KAAACH-CONH2)-DMAC(9b)(SEQ ID NO:16)
使Ac-KAAACH-CONH2(SEQ ID NO:16)(4mg，6.25mmol)经受如以上所描述的OPA-环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-KAAACH-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:16)(2.6mg，47.27％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C34H46N10O7S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝738.87，[M+2H]2+m/z＝369.40，实测值739.64，370.43。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H52N10O11S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝880.98，[M+2H]2+m/z＝440.49，实测值881.61，441.55。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-KAAACH-CONH2)-DMA(SEQ ID NO:16)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C40H52N10O11S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝880.98，[M+2H]2+m/z＝440.49，实测值881.61，441.56。
环-(Ac-KAAAAACH-CONH2)-DMAC(9c)(SEQ ID NO:17)
使Ac-KAAAAACH-CONH2(SEQ ID NO:17)(6mg，7.67μmol)经受如以上所描述的OPA-环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-KAAAAACH-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:17)(4.0mg，52.2％的收率)。
在10min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：10％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H56N12O9S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝881.02，[M+2H]2+m/z＝440.51，实测值881.71，441.42。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：10％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C46H62N12O13S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1023.13，[M+2H]2+m/z＝511.56，实测值1023.50，512.54。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-KAAAAACH-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:17)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后DMAC后修饰的产物。梯度：5％-95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C46H62N12O13S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1023.13，[M+2H]2+m/z＝511.56，实测值1023.67，512.58。
双环-(Dap-Ala-Hyp-Cys-(D)thr-Ala-Glu)-DMAC(9d)(SEQ ID NO:18)
线性鬼笔环肽类似物通过按照通用的Fmoc-固相肽合成方法合成。合成完成之后，通过5mL的DCM/AcOH/TFE(体积/体积/体积＝8：1：1)的混合物处理树脂2小时以得到呈白色粉末的保护的粗线性鬼笔环肽类似物。
然后将粗肽(9.6mg，6.09μmol)再溶解于900mL的无水DCM中。在冰浴下将HOAT(4.9mg，0.036mmol)、OxymaPure(5.19mg，0.0365mmol)和DIEA(12.7μL)在15mL无水DCM中的混合物经10min滴加至反应混合物中。然后逐渐添加HATU(28.1mg，0.074mmol)，将反应搅拌并使其升温至室温。反应搅拌过夜之后，在真空下去除DCM。将10mL TFA/苯酚/H2O(体积/体积/体积＝95：2.5：2.5)的混合物经2h添加至残余物中。然后通过冷凝空气流去除TFA溶液，并将残留的肽通过冷Et2O(35mL×3)洗涤。制备型HPLC纯化(5％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈白色粉末的鬼笔环肽类似物(2.5mg)。
使鬼笔环肽类似物(4.5mg，6.67μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(15％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的双环-(Dap-A-Hyp-C-t-A-E)-DMAC(SEQ ID NO:18)(3.9mg，4.26μmol，65％)。
在10min处的来自步骤1OPA-环化的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C34H44N8O11S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝772.83，实测值773.53。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％-95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝914.94，实测值915.57。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽双环-(Dap-A-Hyp-C-t-A-E)-DMAC(SEQ ID NO:18)的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝914.94，实测值915.65。
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)-DMAC(9e)(SEQ ID NO:10)
使Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2(SEQ ID NO:10)(6mg，3.23μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(10％—65％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:10)(2.2mg，35％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1950.26，[M+2H]2+m/z＝975.13，[M+3H]3+m/z＝651.00，实测值976.18，651.43。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2092.37，[M+2H]2+m/z＝1047.18，[M+3H]3+m/z＝698.45，实测值1047.38，698.41。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)-DMAC(SEQ IDNO:10)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2092.37，[M+2H]2+m/z＝1047.18，[M+3H]3+m/z＝698.45，实测值1047.29，698.33。
环-(Ac-CDWLPK-CONH2)-DMAC(9f)(SEQ ID NO:19)
使Ac-CDWLPK-CONH2(SEQ ID NO:19)(5.6mg，6.9μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—70％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-CDWLPK-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:19)(2.3mg，2.22μmol，31.9％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C40H50N8O15S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝900.06，实测值900.76。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C51H63N9O13S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1042.17，[M+2H]2+m/z＝522.08，[M+3H]3+m/z＝698.45，实测值1042.64，522.19。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-CDWLPK-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:19)的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C51H63N9O13S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1042.17，[M+2H]2+m/z＝522.08，[M+3H]3+m/z＝698.45，实测值1042.72，521.98。
环-(Ac-ACFALPKG-CONH2)-DMAC(9g)(SEQ ID NO:20)
使Ac-ACFALPKG-CONH2(SEQ ID NO:20)(5.7mg，7.1μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—55％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-ACFALPKG-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:20)(3.7mg，3.41μmol，48％的收率)。
在10min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C47H64N10O9S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝945.15，[M+2H]2+m/z＝473.07，实测值945.70，473.64。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C53H70N10O13S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1087.26，[M+2H]2+m/z＝543.63，实测值1087.84，544.58。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-ACFALPKG-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:20)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物(参见图G)。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C53H70N10O13S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1087.26，[M+2H]2+m/z＝543.63，实测值1087.74，544.58。
环-(Ac-KGEAFQC-CONH2)-DMAC(9h)(SEQ ID NO:21)
使Ac-KGEAFQC-CONH2(SEQ ID NO:21)(5.6mg，6.8μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(10％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-KGEAFQC-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:21)(2.6mg，2.45μmol，36.6％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C43H56N10O11S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝921.04，[M+2H]2+m/z＝461.52，实测值921.84，461.80。
在4min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C49H62N10O15S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1063.15，[M+2H]2+m/z＝532.57，实测值1063.88，532.68。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-KGEAFQC-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:21)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C49H62N10O15S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1063.15，[M+2H]2+m/z＝532.57，实测值1063.80，532.56。
环-(Ac-GAQCAFLK-CONH2)-DMAC(9i)(SEQ ID NO:22)
使Ac-GAQCAFLK-CONH2(SEQ ID NO:22)(6.0mg，6.7μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-GAQCAFLK-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:22)(2.8mg，2.5μmol，38％的收率)。
在10min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C47H65N11O10S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝976.16，实测值976.86。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C53H71N11O14S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1118.27，[M+2H]2+m/z＝560.13，实测值1118.74，560.11。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-GAQCAFLK-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:22)的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C53H71N11O14S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1118.27，[M+2H]2+m/z＝560.13，实测值1118.66，560.08。
环-(Ac-AKVTMTCSAS-CONH2)-DMAC(9j)(SEQ ID NO:23)
使Ac-AKVTMTCSAS-CONH2(SEQ ID NO:23)(4.15mg，4.0μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(20％—45％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-AKVTMTCSAS-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:23)(1.6mg，1.25μmol，32％的收率)。
在20min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C49H76N12O15S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1137.33，[M+2H]2+m/z＝569.66，实测值976.86，569.47。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C55H82N12O19S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1279.44，[M+2H]2+m/z＝640.72，实测值1279.68，640.67。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-AKVTMTCSAS-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:23)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C55H82N12O19S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1279.44，[M+2H]2+m/z＝640.72，实测值1279.52，640.50。
环-(Ac-NYRWRCKN-CONH2)-DMAC(9k)(SEQ ID NO:24)
使Ac-AKVTMTCSAS-CONH2(SEQ ID NO:24)(4.45mg，3.8μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—50％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的环-(Ac-NYRWRCKN-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:24)(1.7mg，1.2μmol，32％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C59H79N19O12S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1278.46，[M+2H]2+m/z＝640.23，实测值640.17。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C65H85N19O16S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1420.57，[M+2H]2+m/z＝711.28，实测值711.53。
来自纯化之后的DMAC修饰的环肽环-(Ac-NYRWRCKN-CONH2)-DMAC(SEQ ID NO:24)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C65H85N19O16S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1420.57，[M+2H]2+m/z＝711.28，实测值711.20。
双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)-DMAC(9l)(SEQ ID NO:12)
使环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)(SEQ ID NO:12)(1.5mg)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(10％—55％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)-DMAC(SEQ ID NO:12)(0.7mg，43％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C83H120N22O29S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1923.05，[M+2H]2+m/z＝961.53，实测值961.87。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C89H126N22O33S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2065.16，[M+2H]2+m/z＝1032.58，实测值1032.90。
来自纯化之后的DMAC修饰的双环肽双环-(CSSLDEPGRGGFSSESKV)-DMAC(SEQ IDNO:12)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C89H126N22O33S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2065.16，[M+2H]2+m/z＝1032.58，实测值1033.15。
双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)-DMAC(9m)(SEQ ID NO:13)
使环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)(SEQ ID NO:13)(2.6mg，1.132μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(5％—65％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)-DMAC(SEQ ID NO:13)(1.9mg，0.66μmol，65％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C105H149N29O34S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2394.57，[M+2H]2+m/z＝1197.28，[M+3H]3+m/z＝798.19，实测值798.99，1197.56。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C111H155N29O38S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2536.69，[M+2H]2+m/z＝1268.35，[M+3H]3+m/z＝846.00，实测值1268.85，846.06。
来自纯化之后的DMAC修饰的双环肽双环-(CSQGTFTSDYSKYLDSRRAQ)-DMAC(SEQ IDNO:13)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C111H155N29O38S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2536.69，[M+2H]2+m/z＝1268.35，[M+3H]3+m/z＝846.00，实测值1268.42，846.48。
双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)-DMAC(9n)(SEQ ID NO:14)
使环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)(SEQ ID NO:14)(6.4mg，2.91μmol)经受如以上所描述的环化(步骤1)和后修饰(步骤2)条件，并通过UPLC监测直至反应完成。制备型HPLC纯化(10％—55％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)-DMAC(SEQ ID NO:14)(4.9mg，2.03μmol，69％的收率)。
在15min处的来自步骤1OPA-环化反应的LC-MS分析的UV迹线示出了干净的OPA-环化反应产物，没有任何起始材料剩余。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C98H142N26O32S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2261.48，[M+2H]2+m/z＝1130.74，实测值1131.27。
在5min处的来自步骤2DMAC后修饰反应的LC-MS分析的UV迹线示出了OPA-环化和随后的DMAC后修饰以一锅方式干净地进行。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C104H148N26O36S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2402.59，[M+2H]2+m/z＝1202.79，实测值1202.22。
来自纯化之后的DMAC修饰的双环肽双环-(CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV)-DMAC(SEQ IDNO:14)的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的一锅OPA-环化和随后的DMAC后修饰的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C104H148N26O36S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2402.59，[M+2H]2+m/z＝1202.79，实测值1202.14。
结果
OPA-环化之后的异吲哚部分用作用于进一步衍生化的有用处理。所获得的环肽与乙炔二羧酸二甲酯(DMAC)非常迅速地反应，在数分钟内完成。通过DMAC的修饰，OPA-环化引导的后修饰是用于构建功能性肽结构的模块组装方法。通过将OPA和DMAC依次添加至反应混合物中，OPA-环化和后修饰可以以一锅法进行。发现所得产物是加成产物(参见以上所描述的化合物9a-9n)(Simons等人，The Journal of Organic Chemistry,46:(23):4739-4744(1981)；White等人，Advances in Heterocyclic Chemistry,Elsevier:Vol.10,pp113-147(1969)；Simons等人，Journal of the American Chemical Society,98(22):7098-7099(1976)；Kreher等人，Tetrahedron Letters,14(22):1911-1914(1973))。该后环化修饰可以进一步使环肽的结构复杂性多样化(参见表4)。
表4.采用不同肽序列的DMAC介导的OPA-环化的后修饰的结果。
Figure BDA0003281449180000931
Figure BDA0003281449180000941
[a]基于LCMS曲线计算转化率百分比。
实施例6.OPA-环化-DMAC产物显示增强的稳定性。
材料和方法
使模型肽α1(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID NO:10)经受OPA环化反应。通过RP-HPLC纯化OPA-环化肽。使模型肽α1(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID NO:10)经受OPA-环化和通过DMAC的一锅法后修饰。通过RP-HPLC纯化期望的DMAC-修饰的环肽。分别将两种肽溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，终浓度为0.5mM，并且然后将两个容器置于室温。基于LC-MS光谱通过峰面积计算稳定性(*：P值<0.05，**：P值<0.01，***：P值<0.001)。
结果
与易于随时间氧化的异吲哚相比，OPA-环化-DMAC产物的所得部分显示出大大增强的稳定性(参见图2)(White等人，Advances in Heterocyclic Chemistry,Eds.Katritzky and Boulton,Academic Press:Vol.10,第113-147页(1969)；Bonnett等人，Journal of the Chemical Society,Chemical Communications,7:393-395(1972)；Simons等人，Anal.Biochem.,90(2):705-25(1978))。
实施例7.OPA-环化用作用于进一步衍生化的有用处理：采用各种马来酰亚胺类似物的后修饰。
材料和方法
荧光团-马来酰亚胺与OPA引导的环化相结合的方案：
Figure BDA0003281449180000951
荧光素-马来酰亚胺类似物的合成
化合物2-(2-氨基乙基)环戊-4-烯-1,3-二酮盐酸盐(12a)按照文献方案制备(Richter等人，Chemistry-A European Journal,18(52):16708-16715(2012))。
Figure BDA0003281449180000952
荧光素-马来酰亚胺(12b)
向5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(20mg，0.042mmol)在DMSO/ACN(1mL/5mL)的溶液中添加DIPEA(7.9μL，0.045mmol)、2-(2-氨基乙基)环戊-4-烯-1,3-二酮盐酸盐(7.4mg，0.042mmol)，并将反应在室温下搅拌2h。通过RP-LCMS监测反应，并由H2O/ACN(0.1％TFA)稀释用于RP-HPLC纯化。制备型HPLC纯化(5％—70％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈黄色粉末的荧光素-马来酰亚胺(12b)(15.2mg，71.5％的收率)。
来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了主峰是所期望的荧光素-马来酰亚胺。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过8min，以0.4mL/min的流速。C27H18N2O6的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝499.44，实测值499.29。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出收集了纯的荧光素-马来酰亚胺(12b)。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C27H18N2O6的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝499.44，实测值499.46。
Figure BDA0003281449180000961
若丹明-马来酰亚胺(12c)
向5(6)-羧基四甲基若丹明(36mg，0.083mmol)在无水DMF/DCM(2mL/2mL)的溶液中添加HATU(64.7mg，0.083mmol)、DIPEA(79μL，0.22mmol)、2-(2-氨基乙基)环戊-4-烯-1,3-二酮盐酸盐(10mg，0.056mmol)，并将反应在室温下搅拌2h。通过RP-LCMS监测反应。制备型HPLC纯化(10％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过45min)，然后在真空下浓缩并冻干成呈红色粉末的若丹明-马来酰亚胺(12c)(20.5mg，66.3％的收率)。
来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出，由于5(6)-羧基四甲基若丹明的两种异构体，两个主峰是所期望的产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过8min，以0.4mL/min的流速。C31H28N4O6的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝553.58，实测值553.47。两个产物峰是由于5(6)-羧基四甲基若丹明的两种异构体。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出收集了纯的若丹明-马来酰亚胺(12c)。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C31H28N4O6的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝553.58，实测值553.47。两个产物峰是由于5(6)-羧基四甲基若丹明中的两种异构体。
Figure BDA0003281449180000971
OPA-环化和随后的采用荧光团-马来酰亚胺探针的后修饰
将目标肽(1当量)溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)，终浓度为0.5mM。缓慢添加在DMSO中的OPA(邻苯二甲醛)(1.2当量)并将混合物在室温下搅拌10～15min。环化完成之后，将在DMSO中的荧光团-马来酰亚胺探针(1.5当量～2当量)添加至反应混合物。5～15min之后通过LCMS监测反应。反应完成之后进行制备型RP-HPLC纯化。
环-(Ac-KTPSPFDSHC-CONH2)-荧光素(cKC10′-F)(SEQ ID NO:25)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅OPA-环化和随后的荧光素后修饰完全转化。梯度：10％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C85H94N16O24S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1756.8，[M+2H]2+m/z＝878.4，[M+3H]3+m/z＝586.6，实测值586.32，878.65。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的期望的荧光素修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C85H94N16O24S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1756.8，[M+2H]2+m/z＝878.4，[M+3H]3+m/z＝586.6，实测值586.49，878.16。
环-(Ac-KSDSWHYWC-CONH2)-荧光素(cKC9′-F)(SEQ ID NO:26)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了一锅OPA-环化和随后荧光素后修饰完全转化。梯度：10％—85％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C93H93N17O23S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1849.9，[M+2H]2+m/z＝925.45，[M+3H]3+m/z＝617.3，实测值617.48，925.55，1850.49。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线和相应的MS示出了纯的期望的荧光素修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C93H93N17O23S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1849.9，[M+2H]2+m/z＝925.45，[M+3H]3+m/z＝617.3，实测值617.48，925.56，1850.56。
环-(Ac-CPIEDRPMK-CONH2)-荧光素(cCK9′-F)(SEQ ID NO:27)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅OPA-环化和随后的荧光素后修饰完全转化。梯度：20％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C82H100N16O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1726.9，[M+2H]2+m/z＝863.95，[M+3H]3+m/z＝576.3，实测值576.50，863.75，1726.71。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的期望的荧光素修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C82H100N16O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1726.9，[M+2H]2+m/z＝863.95，[M+3H]3+m/z＝576.3，实测值576.32，864.18，1727.55。
环-(Ac-KTPSPFDSHC-CONH2)-若丹明(cKC10′-R)(SEQ ID NO:25)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅OPA-环化和随后的若丹明后修饰完全转化。梯度：15％—70％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C89H104N18O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1809.97，[M+2H]2+m/z＝905.98，[M+3H]3+m/z＝604.32，实测值604.60，906.33。两个产物峰是由于5(6)-羧基四甲基若丹明中的两种异构体。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的期望的若丹明修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C89H104N18O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1809.97，[M+2H]2+m/z＝905.98，[M+3H]3+m/z＝604.32，实测值604.52，906.08。
环-(Ac-KSDSWHYWC-CONH2)-若丹明(cKC9′-R)(SEQ ID NO:26)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅OPA-环化和随后的若丹明后修饰完全转化。梯度：15％—45％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C89H104N18O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1809.97，[M+2H]2+m/z＝952.03，[M+3H]3+m/z＝635.02，实测值635.59，952.22。两个产物峰是由于5(6)-羧基四甲基若丹明中的两种异构体。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的期望的若丹明修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C89H104N18O22S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1809.97，[M+2H]2+m/z＝952.03，[M+3H]3+m/z＝635.02，实测值635.25，952.55。
环-(Ac-CPIEDRPMK-CONH2)-若丹明(cCK9′-R)(SEQ ID NO:27)
来自一锅反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅OPA-环化和随后的若丹明后修饰完全转化。梯度：10％—60％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C86H110N18O20S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1781.05，[M+2H]2+m/z＝891.02，[M+3H]3+m/z＝594.35，实测值594.27，891.09。两个产物峰是由于5(6)-羧基四甲基若丹明中的两种异构体。
来自纯化产物的LC-MS分析的UV迹线示出了纯的期望的若丹明修饰的OPA-环化产物。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过5min，以0.4mL/min的流速。C86H110N18O20S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1781.05，[M+2H]2+m/z＝8 91.02，[M+3H]3+m/z＝594.35，实测值594.19，891.01。
细胞系
Caco2细胞系由Jiang Xia教授(CUHK)提供。A431和HT116细胞系来自Chiming Che教授(HKU)。在补充有10％FBS的DMEM中培养Caco2、A431细胞。在补充有10％FBS的RPMI1640培养基中培养HT116细胞。所有细胞在37℃下在补充5％CO2的潮湿温育箱中培养。细胞培养基和FBS购自Gibco。Hoechst 33342和DiI购自Beyotime Biotechnology。流式细胞管购自BD pharmacology。
荧光共聚焦成像分析
将Caco2细胞在35mm玻璃底平皿中培养过夜，至60％的融合度(confluence)。向平皿中添加具有10％FBS的1mL新鲜的DMEM。在37℃下，将1μL在DMSO中的10mM环肽(Ac-CPIEDRPMK-CONH2)-荧光素(cCK9′-F)(SEQ ID NO:27)添加至培养基中2小时。两小时的孵育之后，弃去上清液，并用PBS洗涤细胞三次。用PBS补充细胞。在室温下，将Hoechst 33342(终浓度：2.5μg/mL)和DiI(终浓度：5μM)添加至PBS中持续10min。弃去上清液。用PBS洗涤细胞三次，并补充3％聚醛用于成像。所有图像均在×63油镜(Leica)下经由LeicaApplication Suit X进行捕获和处理。
流式细胞术分析
将Caco2、HT116、A431细胞在10cm平皿中培养，至80％-90％的融合度，消化，用PBS洗涤三次，并用PBS再悬浮。在37℃下，将所有细胞系与10μM荧光素缀合的环肽(cCK9′-F、cKC9′-F、cKC10′-F)和若丹明缀合的肽(cCK9′-R、cKC9′-R、cKC10′-R)分别孵育2小时。两小时的孵育之后，将所有样品用PBS洗涤三次并再悬浮于1％的在PBS中的聚醛中。通过FACSAria(Becton Dickinson，圣何塞市，加利福尼亚州)分析所有样品。使用Flowjo 7.6分析所有FACS数据。每个样品重复三次。通过Graphpad Prism 6分析静态数据(平均荧光强度)。(*：P值<0.05，**：P值<0.01，***：P值<0.001。)
结果
由OPA环化所获得的环肽可以与N-马来酰亚胺(NMM)非常迅速地反应，在数分钟内完成。通过N-马来酰亚胺的修饰，OPA-环化引导的后修饰可以是用于构建功能性肽结构的模块组装方法。
合成了两个N-马来酰亚胺缀合的荧光团(荧光素和若丹明)模块，其可以容易地与OPA-引导的环肽缀合。先前报道环肽CK-9环(CPIEDRPMC)(SEQ ID NO:37)特异性靶向分化不良的结肠癌细胞(Kelly等人，Neoplasia,5(5):437-444(2003))。为了应用OPA环化，首先合成了CK-9衍生肽CK-9′(CPIEDRPMK；SEQ ID NO:27)，KC-9′(KSDSWHYWC；SEQ ID NO:26)和KC-10′(KTPSPFDSHC；SEQ ID NO:25)作为类似物合成(Li等人，Journal of ControlledRelease,148(3):292-302(2010)；Qin等人，J Biochem,142(1):79-85(2007))。OPA-介导的环化和随后的一锅法N-马来酰亚胺缀合平稳地提供了cCK-9′-荧光团缀合物和其他荧光团缀合物类似物。
接着，采用荧光共聚焦成像以证明荧光团缀合的环肽cCK-9′的特异性。具有荧光素缀合的环肽cCK-9′的Caco2细胞的成像与细胞膜染料(DiI)很好的重叠。流式细胞术也用于测试荧光团缀合的环肽的靶向特异性(参见表5和图3-6)。与HT116和A431细胞相比，荧光素和若丹明缀合的环肽两者示出了与Caco2细胞的特异性结合，这与先前的报道一致(Kelly等人，Neoplasia,5(5):437-444(2003)；Li等人，Journal of Controlled Release,148(3):292-302(2010)；Qin等人，J.Biochem.,142(1):79-85(2007))。这些研究证明OPA-介导的环化可以有效地模拟二硫环键，维持细胞靶向能力。
总之，来自OPA-介导的环化的环肽可以进一步用官能团如荧光团修饰。通过容易地改变官能化基团和识别基团，可以通过这种稳健的OPA环化引导的后修饰合成各种功能性环肽生物分子。
表5.肽序列和合成收率
Figure BDA0003281449180001011
[a]基于LCMS曲线计算转化率百分比
[b]–F：荧光素
[c]–R：若丹明
实施例8.OPA环化引导的后修饰在约30分钟内以一锅法产生各种有用的生物缀合物而无需纯化。
OPA-介导的一锅环化和生物缀合反应的方案：
Figure BDA0003281449180001021
材料和方法
未保护的肽的OPA环化
将未保护的肽(P′)(具有赖氨酸和半胱氨酸，1当量)溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，终浓度为0.2～0.5mM。缓慢添加在DMSO中的OPA(邻苯二甲醛)(1.05当量)并将混合物在室温下搅拌10～15min。
具有各种功能分子的衍生的N-马来酰亚胺(B″)
将功能分子(B′)(肽/DNA/碳水化合物，具有游离胺，1当量)溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，终浓度为0.2～0.5mM。将OPA-马来酰亚胺类似物、N-(3,4-二甲酰基苯乙基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(18a)(1.01当量)溶解在DMSO中，并直接添加至反应混合物中。将反应在室温下搅拌10～15min。
N-(3,4-二甲酰基苯乙基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(18a)的合成
18a的合成方案：
Figure BDA0003281449180001031
Figure BDA0003281449180001041
4-(2-叠氮乙基)苯酚(19e)的合成
在室温下向搅拌的酪胺(1.5g，10.9mmol)和碳酸氢钠在无水甲醇(30mL)中的溶液中，将咪唑-1-磺酰叠氮硫酸氢盐(8.48g，31.9mmol)添加至混合物中，随后添加CuSO4.5H2O(7.4mg，0.03mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC板监测反应并完全转化，将混合物浓缩，用水(50mL)稀释，用1N HCl溶液酸化并用乙酸乙酯萃取两次。将经合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并蒸发。将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(乙酸乙酯，0.1％乙酸)以得到呈黄色油的化合物19e(1.39g，78.3％)(Goddard-Borger等人，Organic letters.,9(19):3797-3800(2007)；Battersby等人，Journal of the ChemicalSociety,Perkin Transactions.,1:31-42(1980)；Yang等人，Journal of the AmericanChemical Society.,132(11):3640-3641(2010))。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),5.65(s,1H),3.47(t,J＝7.2Hz,2H),2.84(t,J＝7.2Hz,2H)ppm。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ＝154.11,130.12,129.89,129.84,115.48,115.45,52.57,34.32。
5-(2-叠氮乙基)-2-羟基苯甲醛(19d)的合成
向搅拌的化合物19e(1.39g，8.5mmol)、无水二氯化镁(1.2g，12.6mmol)和Et3N(5.45mL，39.2mmol)在无水CH3CN(70mL)中的溶液中，添加多聚甲醛(1.73g，57.6mmol)。将反应混合物在回流下加热3h并冷却至室温。然后通过1N HCl溶液酸化，并用乙酸乙酯(200mL)萃取两次。将经合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯，2：1体积/体积)以得到呈无色油的化合物19d(1.29g，79.0％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝10.92(s,1H),9.87(d,J＝0.6Hz,1H),7.56–7.32(m,2H),6.95(d,J＝8.3Hz,1H),3.51(t,J＝7.0Hz,2H),2.86(t,J＝7.0Hz,2H)ppm。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ＝196.36,160.38,137.43,133.45,129.50,120.41,117.87,52.21,34.08。
4-(2-叠氮乙基)苯二甲醛(19c)的合成
向搅拌的化合物19d(1.29g，6.74mmol)在乙醇(90mL)中的溶液中，缓慢添加在乙醇(30mL)中的甲酰肼(809mg，13.4mmol)。将反应混合物回流2h。将反应通过TLC板监测并且完全转化，将反应混合物在冰浴中冷却并且将沉淀物过滤并用己烷和冰冷乙醇洗涤。将残留物在真空下干燥过夜。向搅拌的残留物在无水THF(120mL)中的溶液中，添加乙酸铅(IV)(6g，13.5mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌2.5h。通过TLC板监测反应并完全转化，混合物通过硅藻土过滤，并将滤液在真空下浓缩以得到粗醛。将粗品溶解在乙酸乙酯(500mL)中并用盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯，3：1体积/体积)以得到呈黄色固体的化合物19c(505mg，42.1％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝10.52(s,1H),10.43(s,1H),7.90(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝1.8Hz,1H),7.62(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),3.59(t,J＝6.8Hz,2H),3.00(t,J＝6.9Hz,2H)ppm。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ＝192.11,191.85,144.88,136.45,134.81,133.99,131.78,130.92,51.36,35.01。
2,2'-(4-(2-叠氮乙基)-1,2-亚苯基)双(1,3-二氧戊环)(19b)的合成
向搅拌的化合物19c(2.56g，12.61mmol)在无水甲苯(60mL)中的溶液中，添加对甲苯磺酸(76mg，0.441mmol)和乙二醇(7mL，125.1mmol)。将混合物在迪安-斯塔克(dean-stark)装置中回流10h。将混合物冷却至室温之后，将反应通过Et3N(0.5mL，3.58mmol)淬灭。然后将混合物在真空下蒸发，并将残留物溶解在乙酸乙酯中。将有机层用饱和NaHCO3(水溶液)和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并蒸发。将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯，3：1体积/体积)以得到呈淡黄色油的化合物19b(2.77g，75.68％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.58(d,J＝7.9Hz,1H),7.49(d,J＝1.9Hz,1H),7.23(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.22(s,2H),6.19(s,2H),4.24–4.04(m,4H),4.08–3.96(m,4H),3.48(t,J＝7.4Hz,2H),2.89(t,J＝7.4Hz,2H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝138.85,136.21,134.59,129.27,126.42,126.27,126.24,100.53,100.46,65.19,65.17,52.07,34.99。
2-(3,4-二(1,3-二氧戊环-2-基)苯基)乙烷-1-胺(18b)的合成
向在25mL圆底烧瓶中搅拌的化合物19b(1.25g，4.25mmol)的溶液中，添加钯/碳(10％w/w，200mg)和乙酸乙酯(8mL)。将混合物在1.1个大气压H2气氛下搅拌直至氢化完成，然后通过硅藻土过滤以去除催化剂。在真空下浓缩溶剂，并获得呈淡黄色油的产物18b(1.007g，89.411％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝7.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.47(d,J＝1.9Hz,1H),7.22(dd,J＝7.9,1.9Hz,1H),6.18(d,J＝2.1Hz,2H),4.18–4.08(m,4H),4.07–3.98(m,4H),2.95(t,J＝6.9Hz,2H),2.77(t,J＝6.9Hz,2H)ppm。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ＝140.66,135.98,134.02,129.49,126.41,126.34,100.67,100.65,65.26,65.24,43.19,39.55。
反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸(18c)的合成
通过按照文献(Pieczykol等人，WO2014141094A1)合成反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸。
N-(3,4-二(1,3-二氧戊环-2-基)苯乙基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(18d)的合成
向搅拌的化合物18c(250mg，1.05mmol)在无水DMF(15mL)中的溶液中，添加1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)(400mg，1.05mmol)、DIPEA(0.44mL，2.1mmol)、化合物18b(420mg，1.58mmol)并将反应在室温下搅拌过夜。通过TLC板监测反应并完全转化，通过真空去除溶剂。将残留物溶解于乙酸乙酯，然后通过0.5N HCl溶液和盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发。将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯，1：3体积/体积)以得到呈白色固体的化合物18d(450mg，88.1％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝7.65(d,J＝10Hz,1H),7.49(d,J＝10Hz,1H),7.37(s,1H),7.13-7.12(m,1H),6.63(s,2H),6.08(s,2H),4.08-4.06(m,4H),3.99-3.97(m,4H),3.375(d,J＝5Hz,2H),3.27(d,J＝5Hz,2H),2.87(s,1H),1.88(m,1H),1.75(d,J＝10Hz,2H),1.64(d,J＝10Hz,2H),1.36-1.31(m,2H),1.19(m,2H),0.88(d,J＝15Hz,2H)ppm。13CNMR(126MHz,CDCl3)δ＝176.14,176.06,170.98,140.04,135.77,133.83,133.46,130.20,129.43,126.39,100.47,100.29,65.13,65.10,49.25,49.08,48.90,44.47,43.45,39.99,38.35,36.16,35.07,29.60,28.50,27.24ppm。
N-(3,4-二甲酰基苯乙基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(18a)的合成
在0℃下，向化合物18d(450mg，0.92mmol)在DCM(2mL)中的溶液中，缓慢添加TFA(8mL)。将反应在室温下搅拌3h。然后将混合物在真空下蒸发，并将残留物通过在硅胶上进行的快速柱层析纯化(DCM/乙酸乙酯，1：3体积/体积)以得到呈白色固体的化合物18a(312mg，84.7％)。
1H NMR(500MHz,CD3CN)δ＝10.43(s,1H),10.39(s,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.77(d,J＝1.6Hz,1H),7.64(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),6.74(s,2H),3.51–3.34(m,2H),2.89(t,J＝6.9Hz,2H),1.95(td,J＝5.2,2.7Hz,2H),1.64(td,J＝14.1,3.2Hz,4H),1.26–1.19(m,2H),0.94–0.84(m,2H)。13C NMR(126MHz,CD3CN)δ＝193.41,193.02,176.78,171.66,146.51,136.42,134.58,134.25,134.02,130.93,44.42,43.19,39.26,36.20,34.83,29.32,28.45。
一锅法OPA环化和随后的与各种生物分子的生物缀合
在室温下，将由未保护的肽(P′)的OPA环化所获得的(双)环肽(P″)和具有各种功能分子(B′)的衍生的N-马来酰亚胺(B″)以相同的比率(P″：B″＝1：1mol/mol)直接混合在一起，持续5～15min。通过LC-MS监测生物缀合反应。反应之后，将混合物直接通过H2O/ACN(含有0.1％TFA)稀释并通过LC-MS监测。
环-(Ac-KAAAAACH-CONH2)+(Ac-AFAQK-CONH2)(SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:11)
环-(Ac-KAAAAACH-CONH2)(SEQ ID NO:15)和(Ac-AFAQK-CONH2；SEQ ID NO:11)之间的生物缀合反应提供了化合物20a。来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅法OPA-环化和随后的生物缀合反应得到缀合产物的干净的主峰。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C90H122N22O20S的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝1865.16，[M+2H]2+m/z＝933.08，[M+3H]3+m/z＝622.33，实测值622.47，932.58。
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)+(Ac-AFAQK-CONH2)(SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11)
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID NO:10)和(Ac-AFAQK-CONH2；SEQ IDNO:11)之间的生物缀合反应提供了化合物20b。来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅法OPA-环化和随后的生物缀合反应得到缀合产物的干净的主峰。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C136H198N34O35S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2934.4，[M+2H]2+m/z＝1467.7，[M+3H]3+m/z＝978.8，实测值978.72，1467.30。
双环-(Ac-CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2)+(Ac-AFAQK-CONH2)(SEQ ID NO:14，SEQID NO:11)
双环-(Ac-CNSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2)(SEQ ID NO:14)和(Ac-AFAQK-CONH2；SEQ ID NO:11)之间的生物缀合反应提供了化合物20c。来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅法OPA-环化和随后的生物缀合反应得到缀合产物的干净的主峰。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C148H208N36O43S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝3242.46，[M+2H]2+m/z＝1621.23，[M+3H]3+m/z＝1081.48，实测值1082.43，1622.57。
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)+(D-(+)-葡萄糖胺)(SEQ ID NO:10)
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID NO:10)和(D-(+)-葡萄糖胺)之间的生物缀合反应提供了化合物20d。来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅法OPA-环化和随后的生物缀合反应得到缀合产物的干净的主峰。梯度：5％—95％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。C114H167N27O33S2的ESI-MS计算值[M+H]+m/z＝2508.86，[M+2H]2+m/z＝1254.43，[M+3H]3+m/z＝837.62，实测值837.09，1255.39。
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)+(5′-NH2-C6-ATCGATCGATCG-3′)(SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:28)
环-(Ac-ENPECILDKHVQRVM-CONH2)(SEQ ID NO:10)和(5′-NH2-C6-ATCGATCGATCG-3′；SEQ ID NO:28)之间的生物缀合反应提供了化合物20e。来自反应的LC-MS分析的UV迹线示出了一锅法OPA-环化和随后的生物缀合反应得到缀合产物的干净的主峰。梯度：0％—35％ACN/H2O，含有0.1％TFA，经过10min，以0.4mL/min的流速。反应的MALDI-TOF谱图示出了缀合产物的干净的质量结果。
结果
N-马来酰亚胺用各种功能分子衍生化，所述功能分子包括聚糖、肽、以及胺修饰的DNA，其可以随后被引至环肽上，提供有用的生物缀合物(参见图7、以上所描述的化合物20a-20e和表6)。为此，设计了N-马来酰亚胺-OPA双功能连接基，通过如先前所开发的苯并吡咯酮化学，其可以容易地与存在于功能分子B′(例如，聚糖、肽或DNA)上的胺基团反应以提供缀合物B″。随后使所得的缀合物B″与OPA环肽P″以一锅方式反应以产生各种环肽-肽、环肽-聚糖和环肽-DNA杂合化合物。所有测试的实施例可以在约30分钟内以一锅方式干净地完成而没有任何纯化步骤(参见以上所描述的化合物20a-20e和表6)。
表6.OPA-介导的一锅环化和生物缀合的实施例。
Figure BDA0003281449180001091
[a]反应浓度是0.5mM。
[b]反应浓度是0.2mM。
[c]P″:B″＝1:1mol/mol。
实施例9.TDA-环化提供了简单且具有化学选择性的环化肽的方式。
材料和方法
化学选择性TDA-环化反应的方案：
Figure BDA0003281449180001101
固相肽合成
在标准Fmoc-SPPS方案下，在rink酰胺树脂(GL Biochem)上手动进行合成。使用20/80(体积/体积)的哌啶/DMF的混合物进行Fmoc保护基团的去除，15～20min。使用Fmoc-氨基酸(4.0当量)、HATU(4.0当量)和DIPEA(8.0当量)在DMF中在室温下偶联1小时。对于N-末端乙酰化肽，无水CH2Cl2：吡啶：乙酸酐(2：1：1，体积：体积：体积)与树脂在室温下1小时。合成完成后，使用9.5：0.25：0.25的TFA：TIPS：水(体积：体积：体积)以进行完全脱保护。然后将肽在冷乙醚中沉淀并通过制备型RP-HPLC纯化。
采用模型肽的TDA-环化
将模型肽(含有赖氨酸和半胱氨酸，1当量)溶解于硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)，终浓度为0.5mM。将在DMSO中的2,3-噻吩二甲醛(1.1～1.4当量)添加至溶液并将反应在室温下搅拌约2～2.5h。通过LC-MS监测转化率。
结果
在硼酸盐缓冲液中(pH＝8.5)使不同长度且具有在Lys侧链与Cys残基之间的2至7个残基的间隔氨基酸的十八种模型肽与TDA反应，以提供不同环的环肽(或双环肽)，通过粗反应混合物的LC-MS分析判断的转化率为88->98％(参见以上所描述的化合物23a-23r和23a′-23r′和表7)。存在于未保护的肽中的各种侧链功能性不干扰反应。因此，该化学选择性OPA-环化提供了环化未保护的天然肽的简单方式。应当指出的是，该反应可以区分侧链氨基基团和N-末端胺，因此仅Lys侧链可以产生侧链对侧链环肽族(clan)。N-末端在相同条件下在TDA-环化方式中具有极低的反应性。
表7.采用不同的肽序列的TDA-引导的环化。
Figure BDA0003281449180001111
Figure BDA0003281449180001121
[a]基于LCMS曲线计算转化率百分比。
实施例已经证明，直接使用未保护的肽作为起始材料，OPA-和TDA-胺-硫醇三组分反应可以有效地用于合成新的环肽基序。在温和条件下，OPA环化和TDA环化已经被证明高的化学选择性。此外，通过整合NCL和OPA-或TDA-介导的化学选择性肽环化，容易地制备了双环肽。来自OPA和/或TDA环化的环肽产物可以进一步用DMAC或N-马来酰亚胺衍生物修饰，用于构建新的结构并掺入功能部分。在这点上，N-马来酰亚胺-OPA和N-马来酰亚胺-TDA双官能连接基提供了将含胺生物分子分别缀合至由OPA和TDA环化所获得的环肽的简单方式。总的来说，OPA环化和TDA环化方法都可以用于在化学生物学研究和药物发现两者中的各种功能性环/双环肽、肽缀合物和分支肽的合成。OPA肽环化和TDA肽环化的操作简易性和高效率还为构建DNA编码的环肽库提供了新的工具。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文所引用的出版物和它们所引用的材料通过引用特别并入。
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由下面的权利要求涵盖。
序列表
<110> 香港大学（The University of Hong Kong）
李学臣
张越
<120> 环状化合物以及制备和使用方法
<130> FIC21210061P
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(5)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 3
Ala Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 4
Xaa Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 5
Xaa Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 6
Xaa Ala Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化苯基丙氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 7
Xaa Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 8
Xaa His His Ala Leu Thr His Ala Xaa
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 9
Xaa Ala His Asn Leu Thr His Ala Xaa
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化谷氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 10
Xaa Asn Pro Glu Cys Ile Leu Asp Lys His Val Gln Arg Val Met
1 5 10 15
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(5)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化丙氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 11
Xaa Phe Ala Gln Xaa
1 5
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> 合成肽
<400> 12
Cys Ser Ser Leu Asp Glu Pro Gly Arg Gly Gly Phe Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Val
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> 合成肽
<400> 13
Cys Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln
20
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> 合成肽
<400> 14
Cys Asn Ser Thr Lys Asn Leu Thr Phe Ala Met Arg Ser Ser Gly Asp
1 5 10 15
Tyr Gly Glu Val
20
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化组氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 15
Xaa Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化组氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 16
Xaa Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化组氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 17
Xaa Ala Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 赖氨酸的ε-羧基衍生物
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> 4Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 18
Xaa Ala Xaa Cys Thr Ala Glu
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 19
Xaa Asp Trp Leu Pro Xaa
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化丙氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化甘氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 20
Xaa Cys Phe Ala Leu Pro Lys Xaa
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化半胱氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 21
Xaa Gly Glu Ala Phe Gln Xaa
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化甘氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 22
Xaa Ala Gln Cys Ala Phe Leu Xaa
1 5
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化丙氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化丝氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 23
Xaa Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Xaa
1 5 10
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化天冬酰胺
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化天冬酰胺
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 24
Xaa Tyr Arg Trp Arg Cys Lys Xaa
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化半胱氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 25
Xaa Thr Pro Ser Pro Phe Asp Ser His Xaa
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化半胱氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 26
Xaa Ser Asp Ser Trp His Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化赖氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 27
Xaa Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Xaa
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'氨基C6连接基NH2-C6
<400> 28
atcgatcgat cg 12
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化赖氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化组氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 29
Xaa Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Xaa
1 5
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化谷氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化甲硫氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 30
Xaa Asn Cys Pro Glu Ile Leu Asp Lys His Val Gln Arg Val Xaa
1 5 10 15
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 赖氨酸的ε-羧基衍生物
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> 4Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 31
Xaa Glu Ala Thr Cys Xaa
1 5
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化甲硫氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 32
Xaa Glu Asn Pro Glu Ile Leu Asp His Val Lys Gln Arg Val Xaa
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化半胱氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化甲硫氨酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 33
Xaa Glu Asn Pro Glu Ile Leu Asp Lys His Val Gln Arg Val Xaa
1 5 10 15
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (18)..(18)
<223> 缬氨酸酰肼
<220>
<221> UNSURE
<222> (18)..(18)
<223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (18)..(18)
<223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 34
Cys Ser Ser Leu Asp Glu Pro Gly Arg Gly Gly Phe Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Xaa
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (20)..(20)
<223> 谷氨酰胺酰肼
<220>
<221> UNSURE
<222> (20)..(20)
<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (20)..(20)
<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 35
Cys Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Xaa
20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (20)..(20)
<223> 缬氨酸酰肼
<220>
<221> UNSURE
<222> (20)..(20)
<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (20)..(20)
<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 36
Cys Asn Ser Thr Lys Asn Leu Thr Phe Ala Met Arg Ser Ser Gly Asp
1 5 10 15
Tyr Gly Glu Xaa
20
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 合成肽
<400> 37
Cys Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Cys
1 5

Claims (36)

1.一种具有式I的结构的化合物：
Figure FDA0003281449170000011
(a)其中A′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
(b)其中X′是–NR3、氧原子、或硫原子，其中R3是氢、取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
(c)其中R1和R2独立地是不存在的、未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的杂烷基基团、或取代的杂烷基基团；
(d)其中Q是低聚物或合成材料；和
(e)其中L′和M′独立地是不存在的、一个或多个单体残基或者合成材料。
2.权利要求1所述的化合物，其中，所述单体残基独立地是氨基酸残基或核苷酸残基。
3.权利要求1或2所述的化合物，其中，Q是肽或寡核苷酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的化合物，其具有式II的结构：
Figure FDA0003281449170000021
(a)其中X′、R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础权利要求中所定义的；
(b)其中A″是未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；
(c)其中Y′是氮原子。
5.权利要求4所述的化合物，其中，A″是未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团。
6.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中，X′是硫原子。
7.权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中，Q是肽。
8.权利要求7所述的化合物，其中，所述肽是线性肽、环肽、或分支肽。
9.权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中，Q是未保护的肽。
10.权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中，L′和M′独立地是一个或多个氨基酸残基。
11.权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中，Q是合成单体残基的低聚物。
12.权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中，所述化合物是发荧光的。
13.权利要求1-12中任一项所述的化合物，其具有式III的结构：
Figure FDA0003281449170000031
(a)其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础权利要求中所定义的；
(b)其中R4是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
(c)其中R5是氢、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、未取代的琥珀酰亚胺基基团、取代的琥珀酰亚胺基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的羰基基团、取代的羰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酰基基团，
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的酯基团，或者
任选地含有取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团的异羟肟酸基团；
(d)其中n是零或正整数；和
(e)其中Z是任选的并且包含化学探针和/或生物功能分子。
14.权利要求1-13中任一项所述的化合物，其具有式III′或式III″的结构
Figure FDA0003281449170000041
其中R1、R2、R4、R5、Q、L′、M′、n和Z是如以上所定义的。
15.权利要求13或权利要求14所述的化合物，其中，当R4是氢时，n是零，并且Z是不存在的。
16.权利要求13或权利要求14所述的化合物，其中，R4是未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、或取代的杂烯基基团。
17.权利要求13或权利要求14所述的化合物，其中，R4是未取代的琥珀酰亚胺基基团或取代的琥珀酰亚胺基基团。
18.权利要求13-17中任一项所述的化合物，其中，Z包含发光探针。
19.权利要求18所述的化合物，其中，所述发光探针是有机染料、生物荧光团、或量子点。
20.权利要求19所述的化合物，其中，所述发光探针是选自荧光素、若丹明、及其衍生物的有机染料。
21.权利要求13-20中任一项所述的化合物，其中，Z包含比色探针。
22.权利要求13-21中任一项所述的化合物，其中，Z包含选自聚糖、肽、寡核苷酸、蛋白质、以及小分子药物的生物功能分子。
23.一种制备权利要求1-22中任一项所述的化合物的方法，其包括：
(a)进行式IV的化合物与式V的化合物之间的反应以形成加合物，
Figure FDA0003281449170000051
其中R1、R2、Q、L′、以及M′是如在(多个)基础权利要求中所定义的；
其中X″和Y″独立地是羧酸基团、羧酸酯基团，
任选地在氨基氮处含有一个取代基的氨基基团，其中所述取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，
任选地在羟基氧处含有一个取代基的羟基基团，其中所述取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团，或者
任选地在硫醇硫处含有一个取代基的硫醇基团，其中所述取代基是取代的烷基基团、取代的环烷基基团、取代的杂烷基基团、取代的烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的芳基基团、或取代的杂芳基基团；
其中A″′是未取代的烷基基团、取代的烷基基团、未取代的环烷基基团、取代的环烷基基团、未取代的杂烷基基团、取代的杂烷基基团、未取代的环杂烷基基团、取代的环杂烷基基团、未取代的烯基基团、取代的烯基基团、未取代的杂烯基基团、取代的杂烯基基团、取代的炔基基团、取代的杂炔基基团、未取代的芳基基团、取代的芳基基团、未取代的杂芳基基团、取代的杂芳基基团、未取代的聚芳基基团、取代的聚芳基基团、未取代的聚杂芳基基团、或取代的聚杂芳基基团；和
其中G1′和G2′独立地是醛基团、氰酸酯基团、腈基团、异腈基团、硝基基团、亚硝基基团、亚硝基氧基团、酰基基团、羧酸基团、或羧酸酯基团。
24.权利要求23所述的方法，进一步包括：
(b)进行来自步骤(a)的所述加合物与反应物之间的反应以形成第二加合物，其中所述反应物是未取代的马来酰亚胺、取代的马来酰亚胺、未取代的炔基基团、取代的炔基基团、或其衍生物。
25.权利要求23或24所述的方法，其中，所述式V的化合物是邻苯二甲醛(OPA)。
26.权利要求23或24所述的方法，其中，所述式V的化合物是2,3-噻吩二甲醛(TDA)。
27.权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，X″是硫醇基团并且Y″是氨基基团。
28.权利要求23-27中任一项所述的方法，其中，所述反应在缓冲溶液中进行。
29.权利要求28所述的方法，其中，所述缓冲溶液选自乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TEAA缓冲液、以及硼酸盐缓冲液。
30.权利要求23-29中任一项所述的方法，其中，所述反应在至少约6、优选至少约7、更优选至少约7.4的pH下进行。
31.权利要求23-30中任一项所述的方法，其中，所述反应在至少约8、优选至少约8.5的pH下进行。
32.权利要求23-31中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述反应以其中至少80％的所述式IV的化合物和/或所述式V的化合物在约2.5小时时、优选在约2小时时、更优选在约1.5小时时已经反应的速率进行。
33.权利要求23-32中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述反应以其中80％的所述式IV的化合物和/或所述式V的化合物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
34.权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的所述反应以其中80％的步骤(a)中所形成的所述加合物和/或所述反应物在约30分钟时、优选在约20分钟时、更优选在约10分钟时已经反应的速率进行。
35.权利要求23-34中任一项所述的方法，其中，步骤(a)的所述反应达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。
36.权利要求23-35中任一项所述的方法，其中，步骤(b)的所述反应达到至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的转化率。
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