CN113789328A - lncRNA及其在免疫调控及免疫相关疾病诊治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及lncRNA及其在免疫调控及免疫相关疾病诊治中的应用。具体而言，本发明涉及lncRNA AK131315或其表达产物或其促进剂在制备促进对象免疫应答的产品中的应用，其抑制剂在制备抑制对象免疫应答的产品中的应用，以及相应的产品。还提供了lncRNA AK131315或其表达产物在药物筛选和/或治疗方案选择中的应用。本发明的AK131315可有效用于临床病毒感染性疾病和自身免疫性疾病治疗方案的选择和临床预后评估，以及用于个性化治疗和靶向治疗，具有较好的临床应用前景。

Description

lncRNA及其在免疫调控及免疫相关疾病诊治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及一种新型长链非编码RNA(Long NonCoding RNA，lncRNA)——AK131315，其具体序列和相关产品，及其在免疫调控及免疫相关疾病诊治(例如促进抗病毒天然免疫应答和调控自身免疫性疾病)中的用途和应用方法。

背景技术

天然免疫应答，尤其是I型干扰素(Interferon，IFN)免疫应答，在病毒感染性疾病以及自身免疫性疾病和癌症中均扮演不可或缺的角色。尤其是在病毒感染中，I型IFN作为广谱的抗病毒因子，是抗病毒免疫应答的第一道防线。由此，I型IFN的调控机制具有重要的研究价值和科学意义。

干扰素调节因子3(Interferon Regulating Factor 3，IRF3)组成性表达于大多数细胞类型，保证了不同细胞类型被病毒入侵后，可及时启动I型IFN应激表达，保护宿主抵抗病原体感染[1]。

据研究报道，在TANK结合激酶-1(TANK-binding kinase-1，TBK1)活化IRF3的过程中，MAVS、STING和TRIF等接头蛋白发挥了重要的脚手架作用，直接结合IRF3蛋白，与同样结合于接头蛋白的TBK1接近，为IRF3的激活提供结构基础[2-3]；IRF3形成二聚体后在CREB结合蛋白(CREB Binding Protein，GREBBP)辅助下转运至细胞核内启动I型干扰素基因转录[4]。

IRF3作为天然免疫应答中关键的转录因子，如果发生异常失活或活化，将导致严重的免疫系统紊乱，引起慢性病毒感染、自身免疫性疾病、淋巴系统疾病等等[5-10]。因此，转录因子IRF3的调控机制具有极高的临床研究价值，其调控物可能具有极高的临床应用价值。

长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是长度大于200bp的非编码RNA。哺乳动物基因组可转录多种lncRNA。因此类RNA具有非常重要的调控功能，且几乎参与到了各种生物学过程和通路，与各种疾病的发生发展紧密关联，从而成为过去几年和将来的研究热点和重点。

对于人类基因组来说，产生的lncRNA数量比编码RNA的数量要多得多。目前除了少数lncRNA的功能比较明确外，大部分lncRNA的功能都还未知。虽然已报道某些lncRNA在某些过程和疾病中起到重要作用，但关于lncRNA与免疫系统之间的研究尚不深入。

综上，尽管已经报道了许多IRF3相互作用蛋白，但是IRF3的抑制性蛋白和RNA结合仍亟需探究。寻找到结合IRF3并调控I型干扰素表达的lncRNA对于临床治疗病毒感染性疾病和自身免疫性疾病具有一定的应用价值。

发明内容

本发明正是提供了一种新型lncRNA——AK131315在免疫调节和临床免疫相关疾病诊治中的应用。

在本发明中涉及新型lncRNA AK131315及其表达产物或前体，所述AK131315可包括如下序列：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。

在本发明的一些方面中，提供了lnc RNA AK131315或其表达产物、或其促进剂在制备促进对象免疫应答的产品中的应用。

在一些实施方式中，所述产品提高I型干扰素(例如IFN-α与IFN-β)水平或活性，和/或活化I型干扰素信号传递途径中的信号传导或效应基因或蛋白(例如MAVS、STING、TBK、IKK)的水平或活性。

在一些实施方式中，所述产品用于治疗感染性疾病和/或其症状，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、犬、猪、马、牛或羊。

在本发明的一些方面中，提供了针对lnc RNA AK131315或其表达产物的抑制剂在制备抑制对象免疫应答的产品中的应用。

在一些实施方式中，抑制剂包括针对AK131315或其表达产物的抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂。

在一些实施方式中，所述产品用于治疗免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状，例如自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病，例如选自下组的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病。

在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、犬、猪、马、牛或羊。

在本发明的一些方面中，提供了一种药物组合物，其包含：

(A)lnc RNA AK131315或其表达产物或其促进剂；或者lnc RNA AK131315或其表达产物的抑制剂；

(B)药学上可接受的载剂。

在一些实施方式中，所述产品包含lnc RNA AK131315或其表达产物或其促进剂。所述产品用于治疗感染性疾病和/或其症状，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

在一些实施方式中，所述产品包含lnc RNA AK131315或其表达产物的抑制剂。所述产品用于治疗免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状，例如自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病，例如选自下组的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病。

在本发明的一些方面中，提供了检测样品中lnc RNA AK131315或其表达产物的水平的物质在制备用于药物筛选和/或治疗方案选择的产品(例如检测试剂盒)中的应用。

在一些实施方式中，所述药物和/或治疗方案针对感染性疾病和/或其症状，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

在一些实施方式中，所述药物和/或治疗方案针对免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状，例如自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病，例如选自下组的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病。

在本发明的一些方面中，提供了一种试剂盒，其包含：

(A')检测获自对象的样品中lnc RNA AK131315或其表达产物水平的物质；例如针对所述序列的特异性引物、抗体；和/或

(B')用于检测的器材、设备，例如选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

在一些实施方式中，试剂盒用于通过包括但不限于下组的方法检测lncRNA或其前体：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法、RNA免疫共沉淀、原位杂交法。

在一些实施方式中，检测试剂盒检测结果显示对象样品中AK131315水平高于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于活化或增强状态；反之，对象样品中AK131315水平低于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于抑制或减弱状态。在一些实施方式中，所述对照选自：健康对象(例如健康群体的平均水平)、对象本身的正常组织(例如病灶旁正常组织)、对象先前测定的水平(例如未治疗前、治疗先前阶段时)。

在一些实施方式中，检测试剂盒用于评估检测对象对治疗的应答。例如，对于罹患自身免疫性疾病的对象，若AK131315水平在治疗后低于治疗前，则表明该治疗对该对象有效。对于感染性疾病对象，若AK131315水平在治疗后高于治疗前，则表明该治疗对该对象有效。

在一些实施方式中，检测试剂盒用于诊断对象是否患有与免疫系统异常相关的疾病，例如若对象的AK131315水平显著高于对照，则表明该对象可能罹患免疫过激相关的疾病，例如自身免疫性疾病、过敏、排斥。若对象的AK131315水平显著低于对照，则表明该对象可能罹患免疫功能不足相关的疾病，例如感染性疾病等。

本发明中还提供了一种疾病诊断、药物评估和/或治疗方案选择的方法，所述方法包括：

(a)检测对象中lncRNA AK131315的水平；

(b)将其与对照进行比较，若对象样品中AK131315水平高于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于活化或增强状态；反之，对象样品中AK131315水平低于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于抑制或减弱状态；

(c)基于(b)中结果，对疾病进行诊断，和/或根据所需的治疗目的，对药物进行评估和/或对治疗方案进行选择。

在本发明的一些实施方式中，还提供了相应的疾病治疗方法，所述方法包括给予有需要的对象本发明的lnc RNA AK131315或其表达产物或其促进剂或者lnc RNAAK131315或其表达产物的抑制剂、或者本发明的药物组合物。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：病毒感染对长链非编码RNA AK131315的表达诱导：

实时荧光定量PCR检测人肺癌细胞系A549被水泡性口炎病毒VSV感染后的AK131315的表达水平，以证实AK131315可经病毒感染诱导表达。

结果显示为平均值±标准差(n＝3)，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图2：AK131315与IRF3蛋白的结合：

RNA免疫共沉淀检测IRF3蛋白结合的AK131315水平，证明IRF3蛋白与AK131315相结合。

结果显示为平均值±标准差(n＝3)，*表示p<0.05。

图3：抑制AK131315表达对病毒感染后I型IFN表达和病毒复制的影响：

实时荧光定量PCR检测人肺癌细胞系A549在经小RNA干扰AK131315表达后，VSV病毒诱导的I型干扰素表达降低及病毒复制增加。

图中每组3个并列的柱形分别表示：对照干扰RNA(左)、干扰RNA-1(中)和干扰RNA-2(右)。图中“感染对照”指未经感染的细胞。

结果显示为平均值±标准差(n＝3)，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图4：健康人、自身免疫性疾病患者治疗前后的AK131315水平比较：

实时荧光定量PCR分别检测健康者、系统性红斑狼疮患者、有效治疗后患者的外周血AK131315表达水平，证明AK131315表达与I型干扰素表达正相关。

结果显示为平均值±标准差(n＝3)，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

具体实施方式

本发明涉及一种新型长链非编码RNA(lncRNA)促进抗病毒天然免疫和调控自身免疫性疾病的功能和用途，属于生物医学材料技术领域。具体涉及lncRNA——AK131315(GenBank:AK131315.1)在促进巨噬细胞抵抗病毒感染和调控自身免疫性疾病进展的用途和应用方法。本发明的AK131315在病毒感染后经I型干扰素诱导表达，实验证明AK131315显著促进了IRF3介导的I型干扰素表达和宿主抵抗病毒感染的能力，且与系统性红斑狼疮的I型干扰素分泌正相关。本发明的AK131315可有效用于临床病毒感染性疾病和自身免疫性疾病治疗方案的选择和临床预后评估，以及用于个性化治疗和靶向治疗，具有较好的临床应用前景。

具体而言，本发明人经甲醛交联免疫沉淀技术富集IRF3结合的RNA组分，RNA测序得到与IRF3相互作用众多潜在的lncRNA，并利用紫外交联免疫沉淀技术验证从中筛选出了与IRF3亲和力最强的lncRNA—AK131315(GenBank:AK131315.1)。我们实验证明AK131315为病毒诱导表达的lncRNA，且调控IRF3介导I型干扰素分泌，协助宿主细胞清除病毒感染。我们还探究了AK131315表达量与系统性红斑狼疮疾病活动度的相关性，实验证明，系统性红斑狼疮患者的AK131315表达水平显著高于健康者，而经过有效治疗的系统性红斑狼疮患者AK131315表达水下发生下调，即说明AK131315参与调控了系统性红斑狼疮的疾病发展。

本发明提供了长链非编码RNA AK131315有效促进病毒感染性疾病及自身免疫性疾病的天然免疫应答的新用途。AK131315表达量的检测可应用于天然免疫相关疾病的检测，对疾病的预后诊断等提供有效信息，以及对疾病的临床治疗策略等给出参考信息。针对AK131315表达量的调控，包括过表达和沉默表达等生物医学措施，可应用于天然免疫相关疾病的临床治疗，实现对天然免疫应答的调控，进而实现疾病治疗的目的。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本文中的数值范围包括其端点以及该数值范围内的各具体数值点和子范围。例如，1～3包括端点1和3、其中的具体整数数值点2和非整数数值点(例如但不限于：1.2、1.5、1.8、2.1、2.3、2.4、2.8等，以及其子范围(例如但不限于：1～2、2～3、1～1.2、1.5～1.8等)。

lncRNA及其杂交和同源序列

如本文所用，术语“本发明的lncRNA”或“lncRNA AK131315”或“AK131315”可互换使用，均是指与IRF3具有高亲和力的lncRNA分子。根据本申请中的内容，其在免疫调控中起到重要作用，可用于有效调控病毒感染性疾病及自身免疫性疾病的天然免疫应答。

本发明的lncRNA分子可为：

(a)哺乳动物基因组中特异性表达基因序列如SEQ ID NO:1(GenBank:AK131315.1)所示的特定长链非编码RNA分子的基因；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有80％以上序列同一性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的lncRNA全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的lncRNA AK131315优选获自人，获自其它动物的与人lncRNAAK131315高度同源(如具有70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它lncRNA也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

lncRNA的促进剂和抑制剂

本发明中还涉及lncRNA AK131315的“促进剂”。术语“促进剂”是指可提高AK131315的水平或活性的物质。可用于本发明中的促进剂包括但不限于：AK131315表达载体、外源性AK131315、AK131315的脂质体包裹RNA等等。

本发明的AK131315或其促进剂可产生促进免疫反应的效果，提高I型IFN水平，从而可进一步用于治疗可通过提高免疫反应治疗的疾病或症状，尤其是可通过提高I型干扰素水平治疗的疾病或症状。

在一些实施方式中，本发明的AK131315或其促进剂可用于治疗感染性疾病。感染性疾病包括但不限于：细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，特别是病毒感染相关疾病和征状，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

本发明中还涉及lncRNA AK131315的“抑制剂”。术语“抑制剂”是指可降低lncRNAAK131315的水平或活性的物质。可用于本发明中的抑制剂包括但不限于，针对lncRNAAK131315的：抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂等。

本发明的AK131315抑制剂可产生免疫抑制作用，降低I型干扰素水平，从而可进一步用于预防或治疗免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状。在一些实施方式中，AK131315抑制剂可用于自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病等的预防和/或治疗。在一些实施方式中，自身免疫性疾病包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病等。

可采用本领域中已知的方法和平台获得本申请的促进剂和抑制剂，并对其效果进行检验。

药物或药物组合物及其治疗应用

本发明还提供了一种药物或药物组合物，其中含有有效量的本发明的AK131315或其促进剂或抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“本发明的活性物质”可互换使用，是指AK131315、其促进剂或抑制剂。

在一些实施方式中，药物或药物组合物包含AK131315或其促进剂，其可用于产生促进免疫反应的效果，提高I型IFN水平，从而可进一步用于治疗可通过提高免疫反应治疗的疾病或症状，尤其是可通过提高I型干扰素水平治疗的疾病或症状。例如，该药物、药物组合物或试剂盒可用于治疗感染性疾病。感染性疾病包括但不限于：细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，特别是病毒感染相关疾病和征状，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

本发明的AK131315抑制剂可产生免疫抑制作用，降低I型干扰素水平，从而可进一步用于预防或治疗免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状。在一些实施方式中，AK131315抑制剂可用于自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病等的预防和/或治疗。在一些实施方式中，自身免疫性疾病包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病等。

如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的组合物中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中活性物质的含量为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。

应理解，所用活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸DNA/RNA注射法；(2)将AK131315相关cDNA、mRNA与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cDNA、mRNA和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cDNA、mRNA和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cDNA、mRNA和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cDNA、mRNA和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将RNA、cDNA、mRNA等导入靶细胞。

在一些实施方式中，本发明中还提供了抗感染性疾病的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗有效量的AK131315或其促进剂。

在一些实施方式中，本发明中还提供了治疗免疫过激引起的疾病和/或症状的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗有效量的AK131315抑制剂。免疫过激引起的疾病和/或症状包括但不限于：自身免疫性疾病、移植物抗宿主、过敏、炎症因子风暴等。

检测试剂盒及检测应用

本发明中还提供了一种用于检测对象免疫系统活化水平、与之相关疾病、和/或治疗效果的检测试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括检测获自对象的样品中AK131315水平的物质，例如针对AK131315的试剂(包括但不限于特异性引物、抗体等)和/或用于检测的器材、设备等，例如选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

在一些实施方式中，试剂盒用于通过包括但不限于下组的方法检测lncRNA或其前体：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法、RNA免疫共沉淀、原位杂交法。

在本发明的一些实施方式中，检测试剂盒检测结果显示对象样品中AK131315水平高于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于活化或增强状态；反之，对象样品中AK131315水平低于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于抑制或减弱状态。在一些实施方式中，所述对照选自：健康对象(例如健康群体的平均水平)、对象本身的正常组织(例如病灶旁正常组织)、对象先前测定的水平(例如未治疗前、治疗先前阶段时)。

在一些实施方式中，检测试剂盒用于评估检测对象对治疗的应答。例如，对于罹患自身免疫性疾病的对象，若AK131315水平在治疗后低于治疗前，则表明该治疗对该对象有效。对于感染性疾病对象，若AK131315水平在治疗后高于治疗前，则表明该治疗对该对象有效。

本发明中还提供了一种药物评估和/或治疗方案选择的方法，所述方法包括：

(a)检测对象中lncRNA AK131315的水平；

(b)将其与对照进行比较，若对象样品中AK131315水平高于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于活化或增强状态；反之，对象样品中AK131315水平低于对照水平，则表明该对象的免疫系统相对于对照处于抑制或减弱状态；

(c)基于(b)中结果，并根据所需的治疗目的，对药物进行评估和/或对治疗方案进行选择。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：lncRNA基因的qRT-PCR检测

人肺癌细胞系A549(购自ATCC，目录号CRM-CCL-185)经胰酶消化，计数，制成6×10⁵个/ml细胞悬液，铺24孔培养板，每孔加500μl悬液(培养基为RPMI-1640)。细胞培养过夜后加VSV病毒刺激(感染复数＝1)，分别刺激0小时、12小时、24小时，每孔加1ml Trizol试剂裂解细胞，并按照Trizol试剂操作步骤进行RNA提取。

提取细胞总RNA后，取1μg RNA经高效反转录试剂盒进行反转录，反转录体系如下：

反转录程序为：37℃15min，95℃5min，4℃+∞。

以反转录产物为模板，采用如下引物进行实时荧光定量PCR：

SEQ ID NO.	名称	序列
			2	AK131315正向引物	5'-CCTTTTATCGCCAGCAGTGT-3'
3	AK131315反向引物	5'-ACCTTTGGGCCTCAACTCAC-3'
			4	Isg15正向引物	5'-CGCAGATCACCCAGAAGATCG-3'
5	Isg15反向引物	5'-TTCGTCGCATTTGTCCACCA-3'

其中，Isg15(干扰素刺激基因15)编码的蛋白质是泛素样蛋白，其为抗病毒天然免疫通路中的重要调节因子，病毒感染和干扰素刺激均可强烈诱导ISG15的表达。因此，本实验中采用Isg15作为阳性对照。

按照Takara公司TB Green荧光定量试剂盒(RR820)配置qPCR体系，经定量ABI公司Q6 PCR仪进行定量PCR扩增。体系如下：

qPCR扩增程序如下：

实验结果如图1所示。结果显示病毒感染后，AK131315表达量显著提高，12h时其水平提高近50倍，24h时更达180倍左右，该提高水平明显高于阳性对照Isg15基因的感染后表达增加倍数(与各自0小时比较)。

以上结果表明：病毒感染可以诱导AK131315高表达，预示了AK131315在病毒感染哺乳动物细胞时可发挥调控作用。

实施例2：RNA免疫共沉淀检测IRF3与AK131315结合

取VSV感染12小时的A549细胞，3×10⁶个细胞加1×CLB(#9803，CST)(含蛋白酶抑制剂1:200)250μl裂解细胞。在所得细胞裂解液中，加抗IRF3抗体(购自Proteintech公司，目录号11312-1-AP)2μl，4℃摇4h，Protein A+G珠子(sc2003,Santa cruz)，4℃摇1h。然后，用NTEN300(含蛋白酶抑制剂1:200，RRI 1:100)洗两次，NTEN600(含蛋白酶抑制剂1:200)洗一次，1/5珠子弃洗液，加1×蛋白上样缓冲液，100℃煮5min，后续进行Western blot；4/5珠子弃洗液，加1ml Trizol反复吹吸，后续提取RNA。实时荧光定量PCR检测基因表达，定量引物同实施例1。

实验结果如图2所示，其中Actb和U2为阴性对照，“IRF3组/对照组”中对照组为IgG对照抗体。RNA免疫共沉淀(RIP)检测的结果显示在病毒感染后的A549细胞中，AK131315被显著富集。该结果表明，在病毒感染后，AK131315能够与IRF3蛋白高效结合。

实施例3：AK131315的抗病毒功能检测

取未感染的A549细胞铺板，每孔3×10⁶个细胞，融合度30-50％。利用INTERFERin转染试剂，按照操作说明分别用小干扰RNA和对照干扰RNA对A549细胞进行转染(转染浓度为20nM)：

干扰RNA-1：GCU CAC AUC UGU UGA UUA ATT(SEQ ID NO:6)；

干扰RNA-2：CCA GCU AAC UAC UUG UAA UTT(SEQ ID NO:7)；

对照干扰RNA：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT(SEQ ID NO:8)。

8小时后更换新鲜培养基，24小时后，加VSV病毒(感染复数＝1)感染12小时，然后实时荧光定量PCR检测基因表达。AK131315与Isg15定量引物同实施例1，Ifnb1和VSV引物如下所示：

实验结果如图3所示，其中每组3个并列的柱形分别表示：对照干扰RNA(左)、干扰RNA-1(中)和干扰RNA-2(右)，“感染对照”指未经感染的细胞。结果显示：A549细胞经siRNA沉默AK131315基因的表达并被病毒刺激后，Ifnb1(I型干扰素)以及下游ISG基因的表达量极显著降低，而病毒RNA水平显著或极显著提高。

上述结果表明：抑制AK131315表达可降低I型干扰素抗病毒应答，导致病毒复制增加，即说明AK131315表达可促进I型干扰素介导的抗病毒应答。由此，该lncRNA或其促进剂可用于有效抗病毒。

实施例4：人外周血检测AK131315与系统性红斑狼疮(SLE)疾病进展相关性

临床上分别收集了健康志愿者9例、SLE患者9例、经过有效常规临床治疗的SLE患者5例的血液样品(获自北京协和医院)，经Ficoll密度梯度离心，获得人外周血单核细胞。利用TRIzol试剂提取外周血单核细胞总RNA，同实施例1，实时荧光定量检测基因表达，定量引物同实施例1和实施例3。

实验结果如图4所示。结果显示：SLE患者血样中AK131315的表达显著高于健康志愿者血样，而经过有效治疗的SLE患者中AK131315表达水平下降至与健康志愿者无明显差异。相应地，SLE患者血样中I型干扰素表达水平极显著高于健康志愿者血样，而经过有效治疗的SLE患者中其表达水平下降至与健康志愿者无明显差异。

以上结果表明AK131315参与调控了SLE的疾病发展，研究AK131315在SLE中的调控功能及机制具有重要的临床意义，可用于SLE的有效治疗和诊断。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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附表.序列表中序列的对应关系

SEQ ID NO.	序列名称
		1	AK131315序列
2	AK131315正向引物
		3	AK131315反向引物
4	Isg15正向引物
		5	Isg15反向引物
6	干扰RNA-1
		7	干扰RNA-2
8	干扰对照RNA
		9	Ifnb1正向引物
10	Ifnb1反向引物
		11	VSV正向引物
12	VSV反向引物

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> lncRNA及其在免疫调控及免疫相关疾病诊治中的应用

<130> 216293 1CNCN

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2807

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

actggacatc tgcagagagg acaagaaatg gggcacccac acaatcaaaa ccccagggga 60

aaaggcttga aggttcagcc aaaaatccag cccctctcaa aggacaaaga tcaaccttcc 120

agaacaatta gcaaacactt ctcagagtcc tccatgctgt gcagatggta agcatctctg 180

ggagtctcgc cagcactgtg agtaaggcag cctttttacc catttcacag aaggagaaac 240

taaggcttag taaggtcaag taactaattc tgcctcccac acttcactcc ctagagtttt 300

atgtgtgcat ctgttaaagt tctcctttta tcgccagcag tgtttatgta taattaaaat 360

agctcacatc tgttgattaa cagtcacatt acaacctgca ttaactcttc cacttaatgc 420

ctgttaaagg attagcaaac cattttacag atgaggaagg cagggcacag agaattaatg 480

tccacaccat gcttatcagt gagtggagca gggattcaaa cctagacctt ctgggtctag 540

agccctcctc agccatcacc tctcattctc cattagagtt ggttatcatg tgagttgagg 600

cccaaaggtt aatggaagtt attattcttc ttcaccacca attgaacttt ttatctttac 660

ctactgtcct ctccatcctt ttaatgcttt gtaccctaaa atccgcttag atattaactt 720

tgccagttct ttctttttgg ttacatgtgc caggtatact ttgtcaaact tttaattttg 780

ggtgttttgc tttgtttttt gttggtgaga caagatctca ctctgtcgcc caggctggag 840

tgcagtggtg caatctgggc tcactgcaac ccccgcctcc tgggcataag caatcttcct 900

gccttggcct cccaagtagc tgagaccaca ggcatgagcc accacaccca gctaactact 960

tgtaattttt ttgatagaga caggtcttgc catgtcactc agactgatct caaaactcct 1020

gggctcaggc gacccaccca ccttggcctc ccaaagtgct gggattatag gtgtgagcca 1080

ctgcacctga cccaatttgt aattttgaac ctcttcttac tatcctgttt cagttttttt 1140

tttttgtaaa caactatagc tggattttgt tttctaaccc agtctaaagc agtctcagat 1200

tttgttagaa caactgaagg atctgacatt tgtatgtcac tttattctat gtgaatggtt 1260

tattttaccc ctttttccat agttttgatg gtttgggcaa attactattt attctctttc 1320

taattgtcaa tctatcatta cagcaaatgg ttgcttcctg atcattatat agaaacaggg 1380

taagcacctg cctcccgcta ggactctctc tgcttccttc cgccctaccc accccagtaa 1440

gagctaccca agaaggctcc tatccctgcc accttccact gatattttcc tataaactgt 1500

gagactcaac taacaaggat tccctctcct tccaacttgg ggtccctatt ctgatcaact 1560

gccatttcat tagggccttt cttgatgatt tccttcatac gtaacacaag cgggaatatc 1620

ctctgaattt cgcttgctcg tctgcaaaat atatttctta gtctggtcag ggaatggtat 1680

taatgctctg gtgaggcttc ctgggcccag gccagccaga gtcctccggt tttcagtgct 1740

gcaaatgagg aatctgctgc caatgtgttt cttttcttcc tcctttgtca attatctatt 1800

tattctgctg ggaagcctct ttgattttat ctgtagcttt caagaatgtc accaggagat 1860

gccaagggtg tatctttttc ttcaatgtaa ccctgcctgg aactctaaca accttttcaa 1920

tgtgcaaact catgcccttt tctgatcagg gaaaatttct actattattt attgatcata 1980

tttgccatgt ccagacctgc ttcctcttct ccttccacag cccctaacat tcacaggtag 2040

atgaaaagac atccaccaaa cctatatttt ctttcgtgac ttccacctgt gtttctggtt 2100

ttctgggagg cctttgtttc ccagaaacag gaaaaccatc ctcttttcca cttgatgttt 2160

tgaattttct aaatttgaaa atcctagttc tagaacctgt tttcttgggc agtatctgga 2220

tttccctggg tttttgaaac ctaacacttg tccagtatgt gccgcttggc tttccttttc 2280

cctccagctg ggggtccctc aaggctactc catgtcccca gcagccaggt ccagctgtgg 2340

ggtccccttc cagtgggtgc acggttatgc ctctggcccc tgacctgccc tggggcagca 2400

atagctttca gcaacctctg ggacagaggg caagggaaga atagagcaga aagactctaa 2460

ccccatctaa gcccactcag gactccaagg acaggaatcg attcacactt tctcttctga 2520

cttgtttttg tagagataag gttttgtcac gttgcccagg ctgggtcttg aactcccaga 2580

ctcaagtgat cctccagcct tggcctccca aagtgctagg attacaggtg tgagccactg 2640

cacccagcca ggtgcctttg taagagacct tagccccctt gcctcttctg ccatgtgagg 2700

acacagggaa tcagaaagtg ggtcccttac cagacacaaa atctgctggc accttgatct 2760

tggactttgt ctccagaatt gtgagaataa atttctgttt ataagcc 2807

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttttatcg ccagcagtgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acctttgggc ctcaactcac 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcagatcac ccagaagatc g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcgtcgcat ttgtccacca 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcucacaucu guugauuaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccagcuaacu acuuguaaut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcttggattc ctacaaagaa gca 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atagatggtc aatgcggcgt c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acggcgtact tccagatgg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcggttcaa gatccaggt 19

Claims (10)

1.具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物、或其促进剂在制备促进对象免疫应答的产品中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品提高I型干扰素(例如IFN-α与IFN-β)水平或活性，和/或活化I型干扰素信号传递途径中的信号传导或效应基因或蛋白(例如MAVS、STING、TBK、IKK)的水平或活性。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品用于治疗感染性疾病和/或其症状，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，以及感染导致的慢性炎症性疾病。

4.针对具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物的抑制剂在制备抑制对象免疫应答的产品中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。

5.如权利要求4所述的应用，其中，所述抑制剂包括抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂。

6.如权利要求4所述的应用，其中，所述产品用于治疗免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状，例如自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病，例如选自下组的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病。

7.如权利要求1或4所述的应用，其中，所述对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、犬、猪、马、牛或羊。

8.一种药物组合物，其包含：

(A)具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物或其促进剂；或者，具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物的抑制剂：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；以及

(B)药学上可接受的载剂。

9.检测样品中具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物的水平的物质在制备用于疾病诊断、药物筛选和/或治疗方案选择的产品(例如检测试剂盒)中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；

例如，所述诊断、药物和/或治疗方案针对感染性疾病和/或其症状，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、化学毒素引起的感染、物理因素引起的感染及其引起的各种症状和并发症，以及感染导致的慢性炎症性疾病；或者

又例如，所述诊断、药物和/或治疗方案针对免疫过激或I型干扰素过高相关的疾病和/或其征状，例如自身免疫性疾病、抑制物排斥、过敏性疾病，例如选自下组的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、炎性肠病。

10.一种试剂盒，其包含：

(A')检测获自对象的样品中具有选自下组序列的长链非编码RNA或其表达产物水平的物质：

(a)SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；例如针对所述序列的特异性引物、抗体；和/或

(B')用于检测的器材、设备，例如选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

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