CN113773831B - 一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针以及该荧光探针的制备方法。本发明还公开了上述荧光探针在检测Aβ蛋白和检测阿尔茨海默病(AD)上的应用。本发明中同二聚体结构的荧光探针与Aβ蛋白的结合能力得到显著提升，同时表现出优异的光学性能，其发射来到近红外区域，近红外荧光成像灵敏度高、分辨率高、可实时成像，它可以实现生物组织的深度穿透，避免生物组织的自荧光，而且具有很好的光稳定性；同时其并且其背景信号降低，信噪比增大，PH稳定性、抗干扰能力与脂水分配比也明显改善，因此本发明中的荧光探针显著提高了探针分子的各项性能指标，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种痴呆症，随着时间的推移病情会逐渐恶化。这种疾病不是正常衰老的一部分，很可能是由大脑各种神经元受损的过程引起的。许多临床症状与AD相关，包括认知能力下降、不可逆的记忆丧失、认知障碍、语言障碍等。死后AD脑的神经病理学观察主要发现老年斑的存在，老年斑主要包含β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集和高度磷酸化的Tau蛋白缠结。虽然关于AD的发病机制有许多理论和假设，但Aβ假说被认为是最重要和关键的，因为它引发了一系列对大脑神经元有害的病理事件，Aβ假说提出:AD的发生是由大脑中Aβ蛋白聚集物的积累和沉积导致的。并且Aβ蛋白的这种异常聚集是不可逆的，随着蛋白异常聚集的增多，阿尔兹海默相关症状也会逐步加深。目前为止，尚未开发出能彻底治愈阿尔兹海默症的药物，但如果我们能够提前对Aβ蛋白异常聚集进行精准的监测，我们就能够对阿尔兹海默症提前进行干涉，极大的减缓相关症状的发展。
于是近些年以Aβ蛋白为目标物的有机荧光探针分子被大量设计合成出来，但是这些化合物和Aβ蛋白结合能力是有限的。而结合能力、背景信号、与蛋白结合后的信噪比、光稳定性等对于探针分子的应用来说都是很重要的参数，尤其是结合能力。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的荧光探针在检测Aβ蛋白时，和A β蛋白结合能力有限的问题，提供一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针，可以有效提高荧光探针与Aβ蛋白的结合能力，同时降低其背景信号，提高光稳定性和与蛋白结合后的信噪比。本发明同时提供了上述荧光探针的制备方法和上述荧光探针在检测Aβ蛋白、阿尔茨海默病(AD)上的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种检测淀粉样蛋白
聚集体的荧光探针，其特征在于，荧光探针的结构式为：
本发明还提供上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、将4-甲基吡啶与1,2-二溴乙烷以摩尔比2.5:1的量混合，在100℃下搅拌4小时，得到白色固体；
S2、用乙醚洗涤步骤S1中获得的白色固体，得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷；
S3、将1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛溶解在正丁醇中，加入哌啶作为催化剂，120℃下回流6-8小时，冷却至室温后静置冷藏24h，析出黑色粉末状固体，抽滤，乙醚洗涤得到荧光探针。
优选地，所述步骤S3中，1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛之间的摩尔比为1:2～1:3。
优选地，所述步骤S3中，催化剂哌啶与对二甲氨基肉桂醛的摩尔比为1:1～ 1:2。
本发明提供上述荧光探针在检测Aβ蛋白中的应用。
本发明还提供上述荧光探针在检测阿尔茨海默病(AD)上的应用。
在分子水平上，Aβ蛋白的空间构型是错误折叠的交叉-β结构，形成疏水空腔，产生类似结合位点的有序排列(附图6)，在小配体识别中这个疏水空腔起关键作用。探针与Aβ原纤维相互作用时，在Val18和Phe20之间形成的疏水沟槽是主要位点，探针倾向于沿着原纤维轴进入沟槽，因此，理论上来说扁平和纤细的分子倾向于对Aβ蛋白表现出高亲和力。
针对Aβ蛋白的以上结构特点，本发明提出一种同二聚体策略来构建Aβ淀粉样蛋白聚集体的荧光探针，该荧光探针的具体合成路线如下：
本发明制备的荧光探针为同二聚体结构，用烷基链将两个相同的分子结构“连”起来，4-甲基吡啶与二溴乙烷发生取代反应得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷，中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷在催化剂哌啶作用下，拔去两端甲基的一个“H”,成为碳负离子，具有亲核性，从而可以进攻肉桂醛中的羰基碳，最终生成目标化合物，成为同二聚体结构，这样延长了荧光探针的分子构型，并使之具有两个探测位点。本发明中的同二聚体结构的荧光探针表现出优异的光学性能，其发射来到近红外区域，近红外荧光成像灵敏度高、分辨率高、可实时成像，它可以实现生物组织的深度穿透，避免生物组织的自荧光，而且具有很好的光稳定性；同时其与Aβ蛋白的结合能力得到显著提升，并且其背景信号降低，信噪比增大，PH稳定性、抗干扰能力与脂水分配比也明显改善。相比之下，商用探针ThT(硫磺素-T),只有一个结合位点，并且分子呈刚性，形态短小，基于探针与Aβ蛋白结合的机理，本发明中的探针分子从结构上就比ThT分子具有显著优势。
综上所述，本发明中的荧光探针显著提高了探针分子的各项性能指标，尤其是提高了其光学性质和与Aβ蛋白的结合能力，具有广泛的应用前景。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明中的同二聚体结构的荧光探针显著提高了其与Aβ蛋白的结合能力和光学性质；同时降低其背景信号，信噪比增大；并且改善了探针分子的PH 稳定性、抗干扰能力与脂水分配比，有效提高了探针分子的综合性能指标。
二)本发明中的荧光探针对Aβ蛋白具有很高的亲和力，能有效检测Aβ蛋白聚集物。
三)本发明中的荧光探针可以用于阿尔茨海默病(AD)的检测。
附图说明
图1为荧光探针性能测试试验中的结合常数数据图；
图2为荧光探针性能测试试验中的紫外吸收图谱；
图3为荧光探针性能测试试验中的荧光图谱；
图4为荧光探针性能测试试验中的背景信号图；
图5为荧光探针性能测试试验中的信噪比图；
图6为分子水平上Aβ蛋白的空间构型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
将4-甲基吡啶与1,2-二溴乙烷以摩尔比2.5:1的量混合，在100℃下搅拌四小时，得到白色固体，乙醚洗涤，得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷。将 1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛以摩尔比1：2的量溶解在正丁醇中，加入与对二甲氨基肉桂醛等摩尔量的哌啶作为催化剂，120℃下回流7小时，冷却至室温后静置于冰箱中24h,析出黑色粉末状固体，抽滤，乙醚洗涤后得到荧光探针。
实施例2
将4-甲基吡啶与1,2-二溴乙烷以摩尔比2.5:1的量混合，在100℃下搅拌四小时，得到白色固体，乙醚洗涤，得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷。将 1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛以摩尔比1：2.5的量溶解在正丁醇中，加入哌啶作为催化剂，哌啶与对二甲氨基肉桂醛的摩尔比为1:2，于120℃下回流8小时，冷却至室温后静置于冰箱中24h,析出黑色粉末状固体，抽滤，乙醚洗涤后得到荧光探针。
实施例3
将4-甲基吡啶与1,2-二溴乙烷以摩尔比2.5:1的量混合，在100℃下搅拌四小时，得到白色固体，乙醚洗涤，得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷。将 1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛以摩尔比1：3的量溶解在正丁醇中，加入哌啶作为催化剂，哌啶与对二甲氨基肉桂醛的摩尔比为1:1.5，于120℃下回流6小时，冷却至室温后静置于冰箱中24h,析出黑色粉末状固体，抽滤，乙醚洗涤后得到荧光探针。
荧光探针性能测试试验
试验对象：包括试验组和对照组，对照组为目前市面已有的以Aβ蛋白为目标物的商用探针ThT；试验组为由实施例1制备的荧光探针，命名为E2。
试验方法：依次测试试验组和对照组的结合常数、光学性质、背景信号和信噪比指标，具体如下：
1.结合常数
结合常数是衡量一个探针分子好坏的最重要标准，本发明分别测试了对照组和试验组分别与Oligomer(Aβ蛋白寡聚体)和Fibrils(原纤维)的结合常数。
Aβ蛋白寡聚体和原纤维(与探针结合后最终浓度为4μM)与不同浓度梯度的对照组和试验组在PBS(pH＝7.4)溶液中孵育20min，测其荧光强度，按照已报道的方法计算Kd(结合常数)，算法公式为：Y＝Bmax.X/(Kd+X)，其中X是探针浓度，Y为荧光强度，Bmax是探针与Aβ寡聚体或原纤维结合后观察到的最大荧光增强。Kd结合曲线由GraphPad Prism 8通过非线性单位点拟合得到。
2.光学性质
分别检测对照组和试验组紫外吸收和荧光图谱。
3.背景信号
配制等摩尔浓度的ThT与E2分子的PBS缓冲溶液，ThT分子在437nm激发下，E2在460nm激发下测得两分子的荧光强度。
4.信噪比
首先进行蛋白培养，分别培养Oligomer(Aβ蛋白寡聚体)和Fibrils(原纤维)两种蛋白。
Oligomer(Aβ蛋白寡聚体)：每管蛋白加入434μL pH＝7.4的PBS缓冲液和11μL的DMSO助溶，最终浓度为50μM，涡旋1分钟，13000r条件下离心 20min,取上清液，25℃下水浴加热24h，即得Oligomer。
Fibrils(原纤维):每管蛋白加入434μL pH＝7.4的PBS缓冲液和11μL 的DMSO助溶，最终浓度为50μM，涡旋1分钟，13000r条件下离心20min,取上清液，37℃下水浴加热7天，即得Fibrils。
对照组和试验组保持一致摩尔浓度，加入等体积的上述培养的Oligomer和Fibrils。检测对照组和试验组与蛋白结合后的荧光增强倍数(与不加蛋白对比)。
试验结果：结合常数数据见附图1；紫外吸收图谱见附图2；荧光图谱见附图3；背景信号见附图4；信噪比见附图5。
以上试验数据显示，与对照组相比，如附图1所示，试验组可以显著降低结合常数。对于荧光探针的结合常数Kd来说，其值越小，代表荧光探针的结合能力越强。由附图1的数据可以看出，对于Oligomer来说，E2的Kd值为0.04495，远小于ThT的Kd值(0.5562)；对于Fibrils(原纤维)来说，E2的Kd值为0.1080，也远小于ThT的0.7309。因此，不管是Oligomer或是Fibrils，E2分子的结合能力都要远大于商用探针ThT，从探针应用角度来说，无疑是一种巨大的优势。
如附图2、图3、图4和图5所示，与对照组相比，试验组能明显改善光学性质，其发射来到近红外区域，同时具有更低的背景信号，明显提升信噪比。另外，本试验还单独检测了试验组的脂水分配系数log P为1.02。
综上所述，本发明的荧光探针可以有效提高其与Aβ蛋白的结合能力，提高对Aβ蛋白聚集体检测的灵敏度；明显改善其光学性质，发射来到近红外区域，近红外荧光成像灵敏度高、分辨率高、可实时成像，它可以实现生物组织的深度穿透，避免生物组织的自荧光；同时其背景信号降低，信噪比增大，从整体上提升了探针分子的性能。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针，其特征在于，荧光探针的结构式为：
2.一种检测淀粉样蛋白聚集体的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将4-甲基吡啶与1,2-二溴乙烷以摩尔比2.5:1的量混合，在100℃下搅拌4小时，得到白色固体；
S2、用乙醚洗涤步骤S1中获得的白色固体，得到中间体1，2-二-4-甲基吡啶乙烷；
S3、将1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛溶解在正丁醇中，加入哌啶作为催化剂，120℃下回流6-8小时，冷却至室温后静置冷藏24h，析出黑色粉末状固体，抽滤，乙醚洗涤得到荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，1，2-二-4-甲基吡啶乙烷与对二甲氨基肉桂醛之间的摩尔比为1:2～1:3。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，催化剂哌啶与对二甲氨基肉桂醛的摩尔比为1:1～1:2。
5.权利要求1所述的荧光探针在检测Aβ蛋白中的应用。
6.权利要求1所述的荧光探针在制备用于检测阿尔茨海默病的试剂或试剂盒中的应用。
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