CN113769166B - 包含金属-多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨缺损修复技术领域，具体涉及包含金属‑多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途。本发明提供了金属‑多酚网络用于制备促进骨组织修复的药物组合物或组织工程材料的用途。本发明还提供了一种骨修复材料，包括基材，所述基材表面覆盖有上述金属‑多酚网络。该骨修复材料具有很好的亲水性、力学性能和生物相容性。且由于该骨修复材料能够有效降低氧化应激，具有骨诱导性和免疫调节功能，能够有效促进骨缺损的再生。因此，本发明在骨缺损的治疗和修复中具有很好的应用前景。

Description

包含金属-多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于骨缺损修复技术领域，具体涉及包含金属-多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途。
背景技术
各种原因所致的骨缺损仍然是临床诊疗工作中面临的重点与难点。现有研究主要集中在骨缺损本身，并针对此开发了多种移植策略以及组织工程骨材料。然而，骨延迟愈合甚至不愈合仍然发生在相当比例的患者中。事实上，骨膜在骨愈合中的作用，长期以来一直被忽视。在过去的十年里，越来越多的证据表明，骨膜是一种血管化的骨-软骨器官，在骨骼系统的发育、稳态、骨修复和重建中起着重要的作用。据报道，骨膜在自体移植物介导的修复早期对骨和软骨的形成有70％以上的贡献。因此，骨膜在治疗骨缺损方面具有巨大的潜力。
目前已有部分基于天然或高分子材料合成的人工骨膜用于临床及临床前研究，如聚己内酯、(纳米)羟基磷灰石、聚乙二醇、聚醚醚酮、聚乳酸、丝素蛋白、明胶、胶原和壳聚糖等。现有的人工骨膜主要针对软组织长入，作为支架辅助细胞迁移到缺陷区域，以促进骨再生，或者提供抗菌性能以及骨诱导信号。然而，在骨修复的过程中，氧化应激也会抑制干/祖细胞增殖及分化，造成细胞损伤凋亡及坏死，影响骨再生修复的质量。同时，氧化应激还可以诱导破骨细胞生成，导致破骨溶骨行为，进一步加剧骨再生修复的困境。而现有人工骨膜材料无法消除氧化应激对骨修复过程的不利影响，进而导致现有的人工骨膜在促进骨组织修复方面的性能受到了限制。
金属-多酚网络(Metal-phenolic networks,MPNs)是由天然多酚和金属离子通过配位驱动作用自组装形成的网络结构。目前金属-多酚网络在医药领域中主要用于载药，制成各种靶向制剂。例如：中国发明专利申请“CN202011371775.1一种用于肺部疾病治疗的药物制剂及其制备方法”提供了一种药物制剂，包括细胞、金属-多酚网络、包裹于细胞与金属-多酚网络间的药物。中国发明专利申请“CN202011337685.0一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备及其产品”提供了一种靶向纳米疫苗，其包括负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，介孔二氧化硅纳米颗粒的表面涂覆金属-多酚网络涂层。
目前，人们尚未发现金属-多酚网络对骨生长有何影响，也未见金属-多酚网络用于治疗或修复骨缺损方面的报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供金属-多酚网络的用途、骨修复材料、其制备方法及其用途。目的在于提供一种人工骨修复材料，能够消除骨修复过程中的氧化应激。
金属-多酚网络用于制备促进骨组织修复材料的用途，所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛、原花青素、单宁酸或表没食子儿茶素没食子酸酯中的至少一种；所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ、MgⅡ或CuⅡ中的至少一种。
优选的，所述材料的作用是在骨组织修复过程中消除氧化应激、抑制炎症、调控免疫微环境、促进成骨细胞再生及矿化。
优选的，所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；和/或，所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ；和/或，所述金属-多酚网络中金属离子与多酚的摩尔比为3:1～6:1；和/或，所述金属-多酚网络是通过将多酚溶液和金属离子溶液混合、反应、干燥得到。
本发明还提供一种骨修复材料，包括基材，所述基材表面覆盖有金属-多酚网络；所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛、原花青素、单宁酸或表没食子儿茶素没食子酸酯中的至少一种；所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ、MgⅡ或CuⅡ中的至少一种。
优选的，所述基材为如下材料中的至少一种制成的膜片：CaCO3、Fe3O4、SiO2、氧化石墨烯、聚苯乙烯、(纳米)羟基磷灰石、聚己内酯、聚乙二醇、聚醚醚酮、聚乳酸、丝素蛋白、明胶、胶原、壳聚糖、聚氨酯或纤维素。所述聚氨酯可以是分子量为80k～120K的聚氨酯；所述纤维素可以是分子量为60K～80K的纤维素。
优选的，所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；和/或，所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ；和/或，所述金属-多酚网络中金属离子与多酚的摩尔比为3:1～6:1；和/或，所述金属-多酚网络覆盖在所述基材表面形成的膜的厚度为200nm～800nm；和/或，所述基材的厚度为0.4-0.8mm。
本发明经过实验证明，采用金属-多酚网络修饰不同的基材，比如，采用原儿茶醛和Zn形成的金属-多酚网络修饰聚氨酯或者纤维素，均能够得到具有骨修复性能的复合材料，可促进成骨细胞再生、仿生矿化，能够促进骨缺损再生修复。因此，本发明前述骨修复材料可以用于人体任意场景的骨修复，比如，用于骨膜修复。
本发明还提供上述骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制成多酚与金属离子的混合溶液；
(2)将所述基材浸入步骤(1)得到的混合溶液反应，既得。
优选的，步骤(1)中，所述混合溶液的pH为8.5～9.8；和/或，步骤(2)中，所述反应的条件为室温反应24～48小时。
本发明还提供上述骨修复材料用于制备骨膜的用途。
本发明还提供一种骨膜，它是由上述骨修复材料制成，所述基材的形状为膜状、块状或颗粒状。
本发明中，所述“ZnⅡ”“MgⅡ”或“CuⅡ”分别是指二价的Zn、Mg或Cu离子。
本发明首次将金属-多酚网络应用于骨修复的药物或组织工程材料，并且提供了一种基于金属-多酚网络的仿生骨膜材料。
实验证明，本发明金属-多酚网络修饰不同基材后，在骨组织修复过程中能够消除氧化应激、抑制炎症、调控免疫微环境、促进成骨细胞再生、仿生矿化。因此，金属-多酚网络可极大促进骨缺损再生修复。需要特别说明的是，现有技术中已知ZnⅡ等金属离子具有促进骨缺损修复的作用，然而直接使用游离状态的金属离子对骨缺损修复的效果十分有限，而本发明的金属-多酚网络相比于游离状态的金属离子能够产生非常优良的骨缺损修复作用。
本发明骨修复材料具有良好的亲水性、力学性能和生物相容性，能够有效降低氧化应激，具有骨诱导性、炎症抑制作用和免疫抑制性，能够有效促进骨缺损的再生，在骨缺损的治疗和修复中具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实验例1中Control组、PCA组和PCA+ZnⅡ组的照片；
图2为实验例1中Control组、PCA组、PCA+ZnⅡ组、PCA+MgⅡ组和PCA+CuⅡ组的亲水性能测试结果；
图3为实验例1中Control组、PCA组、PCA+ZnⅡ组、PCA+MgⅡ组和PCA+CuⅡ组的扫描电镜及EELS测试结果；
图4为实验例1中Control组、PCA组、PCA+ZnⅡ组、PCA+MgⅡ组和PCA+CuⅡ组的XPS分析结果；
图5为实验例1中Control组、PCA组和PCA+ZnⅡ组的拉曼光谱测试结果；
图6为实验例1中Control组、PCA组和PCA+ZnⅡ组的力学性能测试结果；
图7为实验例2中的Alamar Blue实验结果；
图8为实验例2中的细胞活死染色结果；
图9为实验例2中大鼠术后1/2月血常规及血生化检测结果；
图10为实验例2中大鼠术后1月心、肝、脾、肺、肾及小肠等脏器组织结构的病理检测结果；
图11为实验例3中DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量的实验结果；
图12为实验例3中以聚氨酯为基材的各实验组的MDA水平、SOD水平及高浓度H2O2刺激下细胞LDH释放及细胞凋亡实验的结果；
图13为实验例3中以纤维素为基材的各实验组的SOD、ROS、MDA水平及高浓度H2O2刺激下LDH释放实验的结果；
图14为实验例3中以纤维素为基材的各实验组的细胞凋亡检测情况检测结果；
图15为实验例4中诱导分化后第1/3周行碱性磷酸酶染色及细胞内ALP活性测定，第2/3周行茜素红染色及定量分析的结果；
图16为实验例5中mcrio-CT扫描三维重建及骨密度和骨体积定量分析结果；
图17为实验例5中H&E染色结果；
图18为实验例5中ALP、OCN和BMP-2免疫组化结果；
图19为实验例5中炎症相关指标免疫组化结果。
具体实施方式
本发明的实施例和实验例中未具体说明来源的试剂和材料均为市售品。
实施例1人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为聚氨酯，金属-多酚网络由原儿茶醛与ZnⅡ构成。
聚氨酯：分子量80K～120K，PDI≤5，合成方法如下：0.02mol聚己内酯(2000g/mol)、0.03mol 4,4'-亚甲基双(苯基异氰酸酯)及20ppm二月桂酸二丁基锡混合，85℃搅拌2小时，得到端异氰酸酯预聚物。缓慢加入0.01mol乙二胺充分扩链后二乙胺终止反映。溶液在大量水中沉淀，80℃干燥24小时得干燥聚合物，将得到的聚合物静电纺丝制成基材膜片。
仿生骨膜的制备方法具体如下：
1g原儿茶醛(PCA)溶于50ml去离子水中，逐滴加入氨水将pH调整至9.8。将氯化锌(ZnCl2)按与PCA摩尔比6:1加入溶液体系中，采用超声分散法充分混匀。将基材(聚氨酯/纤维素膜片)浸入上述溶液体系中，室温下反应48小时。反应结束后，去离子水充分洗涤，烘干得PCA+ZnⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+ZnⅡ组)。
实施例2人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为纤维素膜片，金属-多酚网络由原儿茶醛与ZnⅡ构成。
制备方法与实施例1相同，区别在于将基材替换为纤维素膜片。
纤维素分子量60K～80K,PDA≤3，纤维素膜片制备方法如下：
首先将30g漂白滤纸放入3000ml蒸馏水中，搅拌12h，直到完全分散在水中。然后，分别加入0.468g四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)(0.1mmol/g纤维素)和3.086g溴化钠(1.0mmol/g纤维素)。当TEMPO和溴化钠完全溶解时，加入193.6g,11wt.％的次氯酸钠(10mmol/g纤维素)溶液。在室温下，用10.1M盐酸连续搅拌，将系统的pH调整至10-10.5。在反应过程中，pH会逐渐下降。为保持pH为10，需加入0.5M氢氧化钠溶液，用pH计监测。当系统的pH不发生变化时，反应终止。快速氧化的纤维素被洗涤成中性。然后将获得的纤维素浆稀释至0.5wt.％，使用超声细胞干扰器(JY99-IIDN，科学生物技术有限公司，中国宁波)在900W下超声处理2小时。最后，用10000rpm离心30min去除未分散的杂质，得到完全分散在水中的CNF。随后采用抽滤，真空干燥等工艺制成纤维素膜。
本实施例得到PCA+ZnⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+ZnⅡ组)。
实施例3人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为聚氨酯膜片，金属-多酚网络由原儿茶醛与MgⅡ构成。
制备方法与实施例1相同，区别在于将氯化锌替换为氯化镁。得到PCA+MgⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+MgⅡ组)。
实施例4人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为纤维素膜片，金属-多酚网络由原儿茶醛与MgⅡ构成。
制备方法与实施例2相同，区别在于将氯化锌替换为氯化镁。得到PCA+MgⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+MgⅡ组)。
实施例5人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为聚氨酯膜片，金属-多酚网络由原儿茶醛与CuⅡ构成。
制备方法与实施例1相同，区别在于将氯化锌替换为氯化镁。得到PCA+CuⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+CuⅡ组)。
实施例6人工仿生骨膜
本实施例提供一种仿生骨膜，包括基材，基材表面覆盖有金属-多酚网络。其中基材为纤维素膜片，金属-多酚网络由原儿茶醛与CuⅡ构成。
制备方法与实施例2相同，区别在于将氯化锌替换为氯化镁。得到PCA+CuⅡMPN表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA+CuⅡ组)。
对比例1基材
纯基材聚氨酯膜片，采用与实施例1相同的方法制备，以下实验例中样品对应实验组记为Control组。
对比例2基材
纯基材纤维素膜片，采用与实施例2相同的方法制备，以下实验例中样品对应实验组记为Control组。
对比例3PCA表面修饰的基材
PCA表面修饰的基材，按照如下方法制备：
1g PCA溶于50ml去离子水中，逐滴加入氨水将pH调整至9.8。将基材(实施例1中制备的聚氨酯膜片)浸入上述溶液体系中，室温下反应48小时。反应结束后，去离子水充分洗涤，烘干得PCA表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA组)。
对比例4PCA表面修饰的基材
PCA表面修饰的基材，按照如下方法制备：
1g PCA溶于50ml去离子水中，逐滴加入氨水将pH调整至9.8。将基材(实施例1中制备的纤维素膜片)浸入上述溶液体系中，室温下反应48小时。反应结束后，去离子水充分洗涤，烘干得PCA表面修饰材料(以下实验例中样品对应实验组记为PCA组)。
为了进一步说明本发明的技术方案，下面通过实验例对本发明的有益效果作进一步说明。
实验例1材料表征
本实验例对实施例和对比例制备的材料进行表征。
1、实验方法
材料亲水性采用水滴接触角实验进行评价，8μL去离子水滴于材料表面，Data-Physics OCA25用于测量接触角大小。扫描电镜用于评价各组材料表面形貌，同时电子能量损失谱图(EELS)、能量色散x射线元素谱图(EDX)及X射线光电子能谱(XPS)用于各组材料表面元素组成、含量及价态进行分析。单轴拉伸实验用于对各组材料力学性能进行表征。以上实验均测量4个样本用于统计学分析。
2、实验结果
图1为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的照片，从图中可以看到，Control组的纯基材呈白；PCA表面修饰后，材料呈深棕色；PCA+ZnⅡMPN表面修饰后，材料颜色进一步加深呈黑色。
图2为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)、PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)、PCA+MgⅡ组(实施例3的样品)和PCA+CuⅡ组(实施例5的样品)的亲水性能测试，Control组材料表面疏水，水滴接触角达112°，PCA表面修饰后，接触角降至48°。而在MPN表面修饰后，PCA+ZnⅡ组，PCA+MgⅡ组，PCA+CuⅡ组接触角分别为18°，2℃及21°。这表明PCA表面修饰能够提高基材的亲水性，且MPN表面修饰后能够进一步提高基材的亲水性，这为材料良好的生物相容性提供了亲水性能的基础。
图3为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)、PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)、PCA+MgⅡ组(实施例3的样品)和PCA+CuⅡ组(实施例5的样品)的扫描电镜及EELS测试结果。扫描电镜结果提示，PCA及MPN修饰后，材料表面未发现明显的聚集，微孔结构均得到保留。EELS测试结果表明各种金属离子在材料表面分布均匀。这表明MPN能够均匀地修饰在基材上。
EDX元素光谱分析结果如下表所示：
Wt％ Control PCA PCA+Zn<sup>Ⅱ</sup> PCA+Mg<sup>Ⅱ</sup>
C 71.4 71 61.2 59.2
O 28.6 29 28 27.8
Zn - - 1.3 -
Mg - - - 1.2
对修饰后材料进行清洗后进行EELS测试和EDX元素光谱分析均表明金属元素能够稳定地存在于材料表面。这说明，本发明的MPN表面修饰方法具有良好的金属离子装载性能及稳定性。
图4为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)、PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)、PCA+MgⅡ组(实施例3的样品)和PCA+CuⅡ组(实施例5的样品)的XPS分析结果，PCA+ZnⅡ组、PCA+MgⅡ组和PCA+CuⅡ组的XPS谱线中明显有Zn、Mg或Cu特征性谱峰形成，表明MPN表面修饰方法具有良好的金属离子装载性能及稳定性。
图5为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的拉曼光谱表征结果，从图中可以看到PCA+ZnⅡ组于499-667cm-1处出现新的拉曼峰，该拉曼峰归属于ZnⅡ与PCA邻苯二酚形成的配位键。而1200–1500cm-1处的峰值对应于PCA的邻苯二酚结构。由此可以证明，按照本发明的方法，确实成功在基材表面制备了MPN网络。
图6为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)的力学性能的分析结果，应力-应变曲线提示表面修饰后的力学性能基本相似。PCA和PCA+ZnⅡ组的弹性模量分别由Control组的(38.9±7.8)MPa降至(20.5±5.1)MPa和(22.8±2.5)MPa。Control组、PCA组及PCA+ZnⅡ组的拉伸强度分别为(32.7±1.0)、(38.3±6.6)和(38.2±4.7)MPa，断裂伸长率分别为(73.5±7.1)％、(122.1±12.4)％和(121.2±9.3)％。以上结果表明，PCA和PCA+ZnⅡMPN表面修饰可适度提高复合材料的强度。
综上，本实验例证明了实施例1-3成功在基材表面修饰了MPN网络，且修饰MPN网络后，基材的亲水性和力学性能得到了提高。
实验例2生物相容性评价
1、实验方法
1)体外实验
各实验组材料裁至适当大小，粘附于不同规格细胞培养板板底。紫外灭菌后，培养基浸泡过夜用于后续实验。
细胞在各组材料上存活情况采用细胞活死染色评价：尿源性干细胞(Urine-derived stem cells,USCs)按10,000cells/well密度接种于48孔板中，于接种后第1/3天进行检测。细胞增殖情况采用Alamar Blue实验进行评价，细胞按3,000cells/well密度接种于96孔板中，于接种后第1/4/7天加入Alamar Blue工作液孵育，记录各组荧光强度(激发波长550nm，发射波长590nm)。细胞形态采用细胞骨架染色进行评价，细胞按10,000cells/well密度接种于48孔板中，与接种后第1/3天进行检测。同时测量细胞伸展面积，进一步评价不同表面修饰对细胞粘附情况的影响。
2)体内安全性评价：
动物造模：六周龄雄性Sprague-dawley(SD)大鼠用于材料体内功能验证。采用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。充分剃须消毒后，在手术区域中部作纵向切口，仔细分离软组织，暴露颅骨。制造两个对称的直径为5mm的缺损。用各组材料覆盖缺陷区域，另设Blank组仅钻孔造模，不覆盖任何材料。逐层封闭软组织。术后每天注射青霉素1次，连续3天。
将各组材料覆盖SD大鼠颅骨缺损表面。于术后第1/3月行血常规及血生化检测。并在术后第1月取材，对SD大鼠重要脏器行病理检查。
2、实验结果
Control组(对比例1的样品)PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)、PCA+MgⅡ组(实施例3的样品)和PCA+CuⅡ组(实施例5的样品)的Alamar Blue实验结果如图7左图所示，结果表明，细胞在各组材料上表现出相似地增殖趋势，MPN表面修饰未影响细胞增值趋势。如图7右所示，细胞活死染色表明USCs在Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)材料表面存活状态良好，未见明显死细胞。同时，三组细胞增殖趋势相似。
Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)的细胞骨架染色结果如图8所示，细胞PCA组和PCA+ZnⅡ组材料表面粘附状况优于Control组，细胞伸展面积显著提高。
Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的体内生物性相容性评价结果如图9、图10所示，大鼠术后1/2月，血常规及血生化(红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血尿素氮、白蛋白、血肌酐)各组见未见明显差异。术后1月，大鼠心、肝、脾、肺、肾及小肠等重要脏器组织结构未见异常。以上结果提示MPN表面修饰后的材料具有良好生物相容性。
本实验例结果表明，本发明提供的仿生骨膜材料的生物相容性良好。
实验例3抗氧化应激能力评价
1、实验方法
各实验组材料裁至适当大小，粘附于不同规格细胞培养板板底。紫外灭菌后，培养基浸泡过夜用于后续实验。
其中，培养基组成如下：50％v/v K-SFM+33.75％v/v DMEM-HG+11.25％v/v Ham’sF12+5％v/v FBS，并补充5ng/ml表皮生长因子+50ng/ml牛垂体提取物+0.4μg/ml氢化可的松+5μg/ml转铁蛋白+5ng/ml胰岛素+0.18mmol/L腺嘌呤+2nmol/L 3,3,5-Triiodo-L-thyromine+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素。
USCs按10,000cells/well密度接种于48孔板中，100μM过氧化氢(H2O2)刺激24小时候，DCFH-DA探针用于检测细胞内活性氧簇(Reactive oxide species,ROS)水平。此外，USCs按100,000cells/well密度接种于6孔板中，100uM H2O2刺激后检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)及脂质氧化终产物戊二醛(Malondialdehyde,MDA)水平，评价细胞氧化应激状态。
同时评价各组材料在高浓度H2O2刺激下对细胞的保护作用。细胞按10,000cells/well密度接种于96孔板中，500-1000μM H2O2(对于聚氨酯作为基材的实验组采用500μMH2O2；对于纤维素作为基材的实验组采用1000μM H2O2)刺激24小时后，检测培养上清中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性以反映细胞损伤情况。相似地，细胞按200,000cells/well密度接种于96孔板中，500μM H2O2刺激24小时后，进行流式细胞检测，对刺激后细胞凋亡及坏死情况进行评价。
2、实验结果
图11为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)、PCA+MgⅡ组(实施例3的样品)和PCA+CuⅡ组(实施例5的样品)的DCFH-DA探针检测ROS实验结果，图12为Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)的MDA水平、SOD水平及高浓度H2O2刺激下LDH活性及细胞凋亡的实验结果。图13为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的MDA水平及高浓度H2O2刺激下LDH活性的实验结果。图14为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的细胞凋亡结果。
DCFH-DA探针表明，PCA及MPN表面修饰能有效降低H2O2刺激后细胞内ROS水平。进一步实验表明，PCA及PCA+ZnⅡ组SOD水平显著高于Control组，MDA水平则显著下降。同时，高浓度刺激下，PCA及PCA+ZnⅡ组可显著降低细胞损伤。此外，PCA+ZnⅡ组的MDA水平下降程度以及PCA+ZnⅡ组对细胞损伤的降低程度显著优于PCA组。这表明，本发明采用MPN对聚氨酯或纤维素进行表面修饰后得到的仿生骨膜材料，其对ROS对细胞的损伤有很好的保护作用，且其保护效果优于单纯将多酚化合物修饰在基材表面的情形。
实验例4骨诱导能力评价
1、实验方法
采用如下培养基培养得到牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)：α-MEM+10％v/v FBS+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素。将PDLSCs接种于各组材料表面，当细胞融合率达到70～80％后开始成骨诱导。成骨诱导培养基为：α-MEM+10％v/vFBS+50μg/ml抗坏血酸钠+100nmol/L地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素。于诱导分化后第1/3周行碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatasestaining,ALP staining)及细胞内ALP活性测定，于第2/3周行茜素红染色(Alizarin Rstaining,ARS staining)及定量分析。
2、实验结果
Control组(对比例1的样品)、PCA组(对比例3的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例1的样品)的结果如图15所示，第1/3周ALP染色及细胞内ALP活性测定结果(图15上)表明，PCA+ZnⅡ组能有效促进细胞ALP表达。相似地，第2/3周ARS染色及定量分析结果(图15下)表明，PCA+ZnⅡ组能促进钙盐沉积。以上结果表明，本发明采用MPN对聚氨酯进行表面修饰后得到的仿生骨膜材料，其能够有效促进细胞成骨分化及钙盐沉积。
实验例5体内功能验证
1、实验方法
六周龄雄性Sprague-dawley(SD)大鼠用于材料体内功能验证。采用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。充分剃须消毒后，在手术区域中部作纵向切口，仔细分离软组织，暴露颅骨。制造两个对称的直径为5mm的缺损。用各组材料覆盖缺陷区域，另设Blank组仅钻孔造模，不覆盖任何材料。逐层封闭软组织。术后每天注射青霉素1次，连续3天。
手术后1月取材，mcrio-CT扫描后行三维重建及骨密度和骨体积定量分析。固定脱钙后石蜡包埋，3μm切片。进行常规Hematoxylin&Eosin(H&E)染色，Masson染色，成骨相关指标[ALP,骨钙素(Osteocalcin,OCN)，骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)]及炎症相关指标[(肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素-6(Interleukin,IL-6)，巨噬细胞甘露糖受体蛋白(Macrophage mannose receptor,MMR,also known as CD206)]免疫组化染色。
2、实验结果
图16为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的mcrio-CT扫描三维重建及骨密度和骨体积定量分析结果。手术4周后，micro-CT三维重建见Blank组与Control组缺损均未见明显骨再生，PCA组缺损修复程度优于以上两组，PCA+ZnⅡ组修复效果最佳。骨密度及骨体积分析呈现相同趋势。
图17为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的H&E染色结果，结果表明PCA及PCA+ZnⅡ组中有大量新生骨形成，并在新生骨边缘可见立方型成骨细胞，提示具有成骨活性的功能层形成。此外，PCA+ZnⅡ组的成骨效果优于PCA组，与体外研究相一致。相比之下，Blank和Control组中，缺损区域由大量软组织填充，阻碍骨缺损修复进程。Masson色染色中，PCA+ZnⅡ组呈现出最丰富的红蓝过渡区域及红染区域，提示该组显著的矿化过程和骨组织重建，PCA组次之。Blank及Control组缺陷区域内满是蓝染的疏松结缔组织，没有明显的新生骨形成。
图18为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的ALP、OCN和BMP-2免疫组化结果，结果表明，PCA+ZnⅡ组成骨相关蛋白表达水平最高，尤其是在包绕新生骨周围的成骨细胞中，同时骨陷窝内未完全成熟的骨细胞亦染色阳性。PCA组表达水平次之。而Blank和Control组OCN、ALP和BMP-2的表达水平最低。
图19为Control组(对比例2的样品)、PCA组(对比例4的样品)和PCA+ZnⅡ组(实施例2的样品)的炎症相关指标免疫组化结果，结果表明，Blank和Control组的骨组织外的基质中，TNF-α和IL-6高表达，而在PCA组和PCA+ZnⅡ组表达量显著降低。CD206表达阳性的M2型巨噬细胞的标志，呈现出相反的趋势，在PCA和PCA+ZnⅡ组中表达明显上调。
以上结果表明，在体内实验中，采用MPN对纤维素进行表面修饰后得到的仿生骨膜材料具有优异的骨诱导性、炎症抑制作用和免疫抑制性，能够有效促进骨缺损的再生。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明将金属-多酚网络应用于骨修复领域，用于制备骨修复材料，得到了一种基于金属-多酚网络的仿生骨膜材料。该仿生骨膜材料具有很好的亲水性、力学性能和生物相容性。且由于该仿生骨膜材料能够有效降低氧化应激，具有骨诱导性、炎症抑制作用和免疫抑制性，能够有效促进骨缺损的再生。此外，实验例中针对聚氨酯和纤维素两种不同的基材进行了测试，发现本发明的金属-多酚网络修饰于不同的基材，均能够得到具有骨修复性能的复合材料。因此，本发明在骨缺损的治疗和修复中具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.金属-多酚网络用于制备促进骨组织修复材料的用途，其特征在于：所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ、MgⅡ或CuⅡ中的至少一种；
所述金属-多酚网络中金属离子与多酚的摩尔比为3:1～6:1。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述材料是消除氧化应激、抑制炎症、调控免疫微环境、促进成骨细胞再生和/或促进矿化的材料。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；和/或，所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ；和/或，所述金属-多酚网络是通过将多酚溶液和金属离子溶液混合、反应、干燥得到。
4.一种骨修复材料，其特征在于：包括基材，所述基材表面覆盖有金属-多酚网络；所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ、MgⅡ或CuⅡ中的至少一种；
所述金属-多酚网络中金属离子与多酚的摩尔比为3:1～6:1。
5.按照权利要求4所述的骨修复材料，其特征在于：所述基材为如下材料中的至少一种制成的膜片：CaCO3、Fe3O4、SiO2、氧化石墨烯、羟基磷灰石、聚苯乙烯、聚己内酯、聚乙二醇、聚醚醚酮、聚乳酸、丝素蛋白、明胶、胶原、壳聚糖、聚氨酯或纤维素。
6.按照权利要求4所述的骨修复材料，其特征在于：所述金属-多酚网络中的多酚选自原儿茶醛；和/或，所述金属-多酚网络中的金属离子选自ZnⅡ；和/或，所述金属-多酚网络覆盖在所述基材表面形成的膜的厚度为200nm～800nm；和/或，所述基材的厚度为0.4-0.8mm。
7.如权利要求4-6任一项所述的骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制成多酚与金属离子的混合溶液；
(2)将所述基材浸入步骤(1)得到的混合溶液反应，即 得。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述混合溶液的pH为8.5～9.8；和/或，步骤(2)中，所述反应的条件为室温反应24～48小时。
9.如权利要求4-6任一项所述的骨修复材料用于制备骨膜的用途。
10.一种骨膜，其特征在于：它是由权利要求4-6任一项所述的骨修复材料制成，所述基材的形状为膜状、块状或颗粒状。
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