CN113769099A - 一种asb17在制备traf6相关炎症性疾病药物中的用途 - Google Patents

一种asb17在制备traf6相关炎症性疾病药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途，所述ASB17的Human ASB17Sequence.txt序列如SEQID NO：1所示，所述ASB17的Mouse ASB17Sequence.txt序列如SEQ ID NO：2所示；所述验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法包括：小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离；蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫荧光；蛋白质稳定性检测及泛素化实验。本发明通过研究推测，ASB17和TRAF6相互作用，能够抑制TRAF6K48泛素化和稳定TRAF6，促进TRAF6介导的炎症反应。

Description

一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途。
背景技术
目前，树突状细胞(DCs)是抵抗病原体必不可少的，但也可能有助于免疫病理。它们连接先天性和获得性免疫反应，对宿主防御入侵病原体发挥着必不可少的作用。I型常规DCs(cDC1s)和cDC2s分别以BATF3/IRF-8和IRF4依赖的方式从共同的DCs前体发育而来，而浆细胞样DCs(pDCs)可能来自共同的DCs和共同的淋巴祖细胞。树突状细胞对病原体的检测主要由模式识别受体 (PRRs)介导，PRRs对树突状细胞的激活和随后的免疫反应至关重要。PRRs 中有TLRs，由人类中的10个和小鼠中的12个成员组成。有趣的是，仅在小鼠中表达的TLR11和TLR12很少感受到病原体相关的分子模式分子(PAMP)。相反，TLR4在小鼠和人类的许多细胞类型中表达，包括cDC1s、cDC2s和pDCs，并在革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)参与后诱导NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)通路的激活。值得注意的是，LPS对TLR4的过度刺激可能导致严重的具有脓毒症状的免疫病理。
通过Toll样受体(TLRs)感应病原体时，DCs的激活主要由模式识别受体 /核因子-κB(NF-κB)信号介导，并取决于相应信号分子的适当泛素化。然而，参与其中的泛素化和去泛素化酶及其互相之间的关系还不完全清楚。TRAF6作为通过Toll样受体激活NF-κB转录活性过程中重要的调控蛋白，其自身多聚泛素化在这个过程中颇为重要。目前，若干研究表明，K48连接的TRAF6泛素化可以促进TRAF6的降解，进而有效地阻断了TLR依赖的炎症信号通路。尽管如此，在TLRs依赖性先天免疫反应中调节K48泛素化和TRAF6蛋白水平的分子机制仍不清楚。
ASB家族蛋白包含有锚定蛋白重复结构域(ANK)和一个C末端的细胞因子信号抑制子盒子结构域(SOCS)，因ANK结构域数量的不同，ASB蛋白家族由ASB1到ASB18，一共18个成员组成。ASB家族和其他四个蛋白家族共同组成SOCS box超家族。包含有SOCS box的分子一般有2个功能性的蛋白质与蛋白质相互作用结构域，即底物结合结构域和SOCS box结构域，这使得它们能够具备E3泛素连接酶的功能。虽然有报道称ASB蛋白参与受体信号调节，但对ASB家族的具体功能知之甚少。ASB2在造血分化过程中能够降解混合系白血病(MLL)蛋白，ASB2通过自身的ANK结构域与MLL相互作用，并泛素化和降解了MLL。Lumpkin等人首次解析了ASB9 E3泛素连接酶复合物的结构， ASB9招募CRL复合物，自己则识别并结合底物肌酸激酶B(CKB)。这也是 ASB家族的结构首次被解析，为后面其他ASB家族蛋白的研究提供了重要依据。最近ASB1被报道在炎症反应中具有新颖的功能，它能减少TAB2的K48泛素化，进而稳定其表达，而当ASB1在小鼠中被敲除时，在面对细菌或脂多糖诱导的炎症时，敲除小鼠的炎症反应会减弱。大多数的研究表明ASB蛋白在细胞内组装与Elongin B/C、Cullin5和Rbx2形成ECS E3泛素连接酶，靶向底物通过泛素蛋白酶体体系(UPS)降解。ASB17目前被研究的特别少，据报道它在小鼠和人的睾丸里特异性高表达，且表达具有时空特异性。关于ASB17的功能，基本没有研究。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：ASB17的调控方式，以及如何下调ASB17表达水平来抑制TRAF6介导的炎症反应仍未得到解决，同时关于ASB17的功能，基本没有研究。
解决以上问题及缺陷的难度为：第一个问题，ASB17的调控方式如何，本发明推测ASB17可能受宿主的细胞因子调控，但是需要进一步筛选和验证；第二个问题，如何下调ASB17表达水平来抑制TRAF6介导的炎症反应，这个确实是一个难点，最近出现的双链RNAi特异性靶向下调宿主蛋白的技术有较好的临床效果。
解决以上问题及缺陷的意义为：如果知道调控ASB17表达的细胞因子，那么这种细胞因子可以作为调控炎症反应的重要靶点；同时如果把双链RNAi技术特异性靶向ASB17，使其表达量下调，那么就解决了调控ASB17表达水平，对于ASB17能够成为药物靶标起着重要作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途。
本发明是这样实现的，一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途。
进一步，所述ASB17的Human ASB17 Sequence.txt序列如SEQ ID NO：1 所示，所述ASB17的Mouse ASB17 Sequence.txt序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，所述验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法包括以下步骤：
步骤一，小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离；
步骤二，蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫荧光；
步骤三，蛋白质稳定性检测及泛素化实验。
进一步，步骤一中，所述小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离，分离方法更为经济高效，包括：
(1)分离小鼠骨髓来源树突状细胞BMDCs
准备6到8周龄的野生小鼠和ASB17-/-小鼠，无菌条件下，取出所有股骨和胫骨，用70％酒精浸泡5min，PBS洗2次；用注射器(吸取PBS0冲洗骨髓至培养皿中，直至骨变白；悬液过滤(200目尼龙网)，离心，用RPMI 1640培养基(含20ng/ml GM-CSF)重悬，均匀铺至细胞培养皿中；第3天，向培养皿中加入10ml新鲜RPMI 1640培养基(含20ng/ml GM-CSF)；第6天和第8天，培养液离心后用完全培养液(含20ng/ml重组小鼠GM-CSF)重悬细胞沉淀，随后细胞悬液放回原细胞培养皿；第10天即得到BMDCs。
(2)分离小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDMs
准备6到8周龄的野生小鼠和ASB17-/-小鼠，无菌条件下，取出所有股骨和胫骨，用70％酒精浸泡(5min)，PBS洗2次；用注射器(吸取PBS)冲洗骨髓至培养皿中，直至骨变白；悬液过滤(200目尼龙网)，再离心，除去红细胞(红细胞裂解液)；向培养皿中加入RPMI 1640培养基(含10～20％L929细胞培养基)；第3天和第5天，换为新鲜的RPMI 1640培养基(含10～20％L929细胞培养基)，第6天得到BMDMs。
进一步，步骤二中，所述蛋白质免疫印迹，包括：
用裂解液处理细胞，并超声破碎后，再用Bradford法测定细胞蛋白的浓度；得到的细胞裂解液经过处理后，在8～12％的SDS-PAGE胶中跑胶2h，SDS-PAGE 胶上跑开的蛋白质经转膜设备，经2h转到NC膜上；将NC膜用5％的脱脂牛奶封闭，经过一抗4℃孵育过夜和二抗室温孵育1h，再由化学显色液显色，最后通过化学发光仪观察目的蛋白条带；其中，所述脱脂牛奶由PBST配制。
进一步，步骤二中，所述免疫共沉淀，包括：
(1)转染后36～48h，收取细胞样品，用预冷的PBS润洗细胞1～2次，再用胰酶消化；随后用含有血清的培养基终止胰酶消化，1.5ml EP管收集细胞，低速离心后去掉上清，再用预冷的PBS吹洗细胞2次，最后得到细胞沉淀；
(2)按照细胞量加入500～1000μl的RIPA裂解液以及蛋白酶抑制剂，在4℃冰箱中，旋转摇床上裂解细胞30min；裂解结束后，对剩余的细胞进行超声波破碎处理，随后4℃，转速12000rpm离心10min；
(3)离心后，将上清分为两部分，其中100μl加入到新的1.5ml EP管中，随后和25μl的5×SDS Loading Buffer混匀，100℃加热10min，快速离心后放于-20℃保存；剩余的上清900μl，将20μl用RIPA裂解液洗净后的Protein A/G珠子加入其中，并在4℃，旋转摇床上吸附2h；
(4)吸附结束后，1000g离心，用移液枪将上清转移到新的1.5ml EP管中。将1μg免疫沉淀抗体加入到溶液内，4℃旋转摇床过夜12～14h；
(5)第二天，将40μl用RIPA裂解液洗好的Protein A/G珠子加入溶液中， 4℃旋转摇床吸附2h；
(6)2h后，将所述EP管4℃，转速1000g离心1min，弃掉上清，再加入 1ml RIPA洗脱液，上下轻柔颠倒混匀后，4℃1000g离心1min，洗液枪小心吸走上清，重复洗脱6次；将60μl的2×SDS Loading Buffer加入到所述EP管中， 100℃加热10min，经短暂离心后，将蛋白免疫沉淀样品放于-20℃冰箱中；通过蛋白免疫印迹实验检测免疫沉淀和细胞裂解液中目标蛋白的表达情况。
进一步，步骤(2)中，所述RIPA裂解液的配方为0.05M Tris盐酸，0.001M 乙二胺四乙酸，0.15M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，pH值为7.4。
步骤(6)中，所述RIPA洗脱液的配方为0.05M Tris盐酸，0.001M乙二胺四乙酸，0.3M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，pH值为7.4。
进一步，步骤二中，所述免疫荧光，可操作性更强，要求更简便，包括：
转染结束后，弃掉confocal皿中的培养基，预冷的PBS润洗细胞2次；将甲醇和丙酮按照1:1比例的混合液提前4℃预冷，加入到confocal皿中，放到4℃， 20min固定和透化细胞；PBS润洗3次，每次5min，固定透化的细胞后，加入 3％的BSA，常温封闭1h；封闭结束后，用PBS润洗3次，每次5min，再将3％ BSA配制的荧光一抗加入到confocal皿中，4℃过夜孵育12～16h；一抗孵育结束后，PBS缓冲液润洗3次，每次10min，将10％BSA配制的荧光二抗加入到 confocal皿中，室温锡箔纸避光处理放置45min；二抗孵育结束，PBS润洗三次，每次10min，将细胞核染料DAPI加入到confocal皿中，避光处理，放置于37℃ 5min；用PBS缓冲液润洗细胞3次，每次10min，即可用激光共聚焦显微镜观察样品。
进一步，所述BSA由PBS配制，所述细胞核染料DAPI由甲醇配制。实验室常用试剂即可配置，无需购买特定试剂。
进一步，步骤三中，所述蛋白质稳定性检测及泛素化实验，包括：
(1)蛋白质稳定性检测
在HEK293T细胞中，转染相对应质粒，并在对应时间点加入放线菌酮CHX 收集待处理细胞，用预冷的PBS洗1～2次，吸干残留液体，加入100μl含有1％ SDS的细胞裂解液，吹打混匀，4℃放置20min后，4℃，12000rpm离心10min；取80μl管中上清液体，加入加入20μl 5×SDS Loading Buffer，沸水浴10min，样品保存在-20℃冰箱，第二天跑胶，转膜和显色；
(2)泛素化实验
细胞转染36～48h后，收集细胞至1.5ml EP管中，加入100μl含有1％SDS 的RIPA裂解液，用移液枪反复吹打后，100℃加热5min；将900μl的RIPA裂解液加入溶液中，得到0.1％浓度的SDS，随后冰上放置20min；将细胞进行超声破碎后，4℃，转速12000rpm离心10min，将上清收集到新的1.5ml EP管中。
将所述1.5ml EP管中的液体吸取100μl至新的1.5ml EP管中，加入25μl 5×SDSLoading Buffer并混匀，100℃加热10min，离心后-20℃保存；剩余的液体中加入20μl RIPA裂解液洗过的Protein A/G珠子，预吸附2h；随后4℃，1000g 离心，上清转移到新的1.5mlEP管中并加入对应的抗体进行IP；4℃，旋转摇床过夜；加入40μl洗过的Protein A/G珠子，继续吸附2h；吸附结束后，RIPA洗脱液洗脱上述的Protein A/G珠子；4℃，1000g转速进行，重复6次；最后一次，将上清尽量吸走后，加入60μl 2×SDS Loading Buffer并混合均匀，100℃加热 10min，短暂高速离心后，蛋白样品即制备完成。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途中，通过研究结果推测：ASB17和TRAF6相互作用，能够抑制TRAF6 K48泛素化和稳定TRAF6，从而促进TRAF6介导的炎症反应，从而正调控TRAF6相关炎症性疾病。
本发明提供的ASB17在治疗TRAF6相关炎症性疾病中的应用中，本发明研究工作发现：(1)ASB17可以和TRAF6相互；(2)在细胞水平发现ASB17能够抑制TRAF6泛素化和稳定TRAF6，同时促进TRAF6介导的炎症反应。在实验结果和国内外研究进展的基础上，探究树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用，这为宿主促进TRAF6介导炎症反应提供实验依据，为TRAF6在炎症免疫反应中的调控作用提供理论基础，以及为防治TRAF6相关疾病提供新的思路。
(1)本发明的研究意义：
树突状细胞(DCs)是免疫系统的关键前哨细胞和抗原呈递细胞(APC)。它们连接先天性和适应性免疫反应，在宿主抵御包括病毒、细菌和寄生虫在内的入侵病原体方面发挥着不可或缺的作用。通过Toll样受体(TLRs)感应病原体时，DCs的激活主要由模式识别受体/核因子-κB(NF-κB)信号介导，并取决于相应信号分子的适当泛素化。然而，参与其中的泛素化和去泛素化酶及其互相之间的关系还不完全清楚。TRAF6作为通过Toll样受体激活NF-κB转录活性过程中重要的调控蛋白，其自身多聚泛素化在这个过程中颇为重要。目前，若干研究表明，K48连接的TRAF6泛素化可以促进TRAF6的降解，进而有效地阻断了TLR依赖的炎症信号通路。尽管如此，在TLRs依赖性先天免疫反应中调节K48泛素化和TRAF6蛋白水平的分子机制仍不清楚。如何调控TRAF6相关的炎症性疾病成为全世界科研人员关注的科学问题，本发明揭示树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用，为宿主促进TRAF6介导炎症反应提供实验依据，为丰富TRAF6介导炎症反应的调控机理提供理论基础，以及为防治TRAF6相关疾病提供新的思路。
(2)本发明的研究目标明确
本发明的研究目标非常明确，紧紧围绕ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用展开两个方面的研究。
本发明的创新之处在于：
(1)宿主蛋白ASB17促进TRAF6介导炎症反应的新机制
本发明是宿主蛋白促进TRAF6介导炎症反应的分子机制研究，利用免疫共沉淀实验发现ASB17能够与TRAF6相互作用。在细胞水平上，阐明在树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制。这为揭示宿主蛋白促进 TRAF6介导的炎症反应提供新机制。
(2)本发明提出了新功能。目前，ASB17的功能知之甚少，本发明提出 ASB17能够在树突状细胞促进TRAF6介导炎症反应的功能。
(3)本发明提供调控炎症新蛋白。本发明阐明ASB17促进TRAF6介导炎症反应的机制，为TRAF6介导的炎症反应通路和相关疾病提供调控新蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的ASB17在BMDCs中促进LPS介导NF-κB激活示意图。
图1(A)是本发明实施例提供的从野生型小鼠中分离BMDMs和BMDCs，用 Q-PCR方法分析ASB17在BMDMs和BMDCs中mRNA的表达情况的示意图。
图1(B)是本发明实施例提供的从野生型小鼠中分离BMDCs，在不同时间点 (0h、2h、4h、8h和12h)用LPS刺激，通过Q-PCR分析BMDCs中ASB17 mRNA的表达情况的示意图。
图1(C)是本发明实施例提供的通过引物(WT-F/WT-R和Mut-F/WT-R)鉴定小鼠(ASB17+/+、ASB17+/-和ASB17-/-)的基因型的示意图。
图1(D)是本发明实施例提供的从ASB17+/+和ASB17-/-小鼠中分离BMDCs，用Q-PCR分析ASB17在BMDCs中mRNA的表达情况的示意图。
图1(E-F)是本发明实施例提供的分离ASB17+/+和ASB17-/-小鼠BMDCs，用 LPS刺激BMDCs 0h和2h，Q-PCR法检测BMDCs中CCL2和IL-6的mRNA 表达的示意图。
图1(G)是本发明实施例提供的从ASB17+/+和ASB17-/-小鼠中分离BMDCs，用LPS刺激不同时间(0min、15min、30min、60min和120min)，Western blotting 检测BMDCs中p65和磷酸化p65的蛋白水平；(H-I)从ASB17+/+和ASB17-/-小鼠分离BMDCs，通过感染重组慢病毒，ASB17在ASB17-/-BMDCs中过表达；用LPS刺激所有细胞2h，Q-PCR法检测BMDCs中CCL2和IL-6的mRNA表达的示意图。
图1(H-I)是本发明实施例提供的从ASB17+/+和ASB17-/-小鼠分离BMDCs，通过感染重组慢病毒，ASB17在ASB17-/-BMDCs中过表达；用LPS刺激所有细胞2h，Q-PCR法检测BMDCs中CCL2和IL-6的mRNA表达的示意图。
图1(J)是本发明实施例提供的从ASB17+/+和ASB17-/-小鼠中分离BMDCs，通过感染重组慢病毒，ASB17在ASB17-/-BMDCs中过表达；用LPS在2个时间点刺激细胞(0min和120min)，Western blotting检测BMDCs中磷酸化p65蛋白水平的示意图。
图2是本发明实施例提供的ASB17在THP1中促进LPS介导NF-κB激活示意图。
图2(A)是本发明实施例提供的从稳定表达Flag-ASB17的THP-1细胞及其对照细胞中分离总RNA，用Q-PCR法测定这些细胞中ASB17 mRNA水平的示意图。
图2(B-C)是本发明实施例提供的在不同时间点(0h、1h、2h和4h)用LPS 刺激稳定表达Flag-ASB17的THP-1细胞及对照组细胞，用Q-PCR法测定IL-6 和CCL2 mRNA水平的示意图。
图2(D)是本发明实施例提供的在不同时间点(0min、15min、30min、60min 和120min)用LPS刺激稳定表达Flag-ASB17的THP-1及对照组细胞，Western blotting法测定细胞中IKKα、磷酸化IKKα、p65和磷酸化p65蛋白水平的示意图。
图3是本发明实施例提供的ASB17能够和TRAF6相互作用示意图。
图3(A)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验验证ASB17分别与IRF7，STING，TBK1，IRF3，IκBα，IKKe，RIP1，TRAF6， p50和p65的相互作用的示意图。
图3(B)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验验证 ASB17分别与TRAF2，TRAF3，TRAF5和TRAF6的相互作用的示意图。
图3(C-E)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验验证ASB17分别与TRAF6的相互作用的示意图。
图3(F-G)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫荧光实验和生物分子荧光互补(BiFC)验证ASB17和TRAF6之间的相互作用的示意图。
图4是本发明实施例提供的ASB17抑制TRAF6多聚泛素化并稳定TRAF6 蛋白示意图。
图4(A)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中验证不同浓度梯度 ASB17能够稳定TRAF6蛋白的示意图。
图4(B)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过放线菌酮追踪分析验证ASB17能够稳定TRAF6蛋白的示意图。
图4(C)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中，通过泛素化实验确定ASB17抑制TRAF6泛素化的示意图。
图4(D)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中，通过泛素化实验验证不同浓度梯度ASB17能够抑制TRAF6泛素化的示意图。
图4(E)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中,通过泛素化实验确定 ASB17抑制TRAF6泛素化类型(K48O和K63O)的示意图。
图4(F)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中，通过泛素化实验验证不同浓度梯度的ASB17能够抑制TRAF6 K48泛素化的示意图。
图4(G)是本发明实施例提供的在THP-1细胞中，通过Western blotting实验在加刺激物LPS(1μg/ml，6h)验证ASB17能够稳定TRAF6蛋白的示意图。
图4(H)是本发明实施例提供的在THP-1细胞中，通过泛素化实验验证 ASB17抑制TRAF6泛素化的示意图。
图4(I)是本发明实施例提供的在BMDCs中，通过Western blotting实验在加刺激物LPS(1μg/ml，6h)验证ASB17能够稳定TRAF6蛋白的示意图。
图4(I)是本发明实施例提供的在BMDCs中，通过泛素化实验验证ASB17 抑制TRAF6泛素化的示意图。
图5本发明实施例提供的ASB17 aa177-250片段是与TRAF6的锌指结构域相互作用和抑制TRAF6的多泛素化所必需示意图。
图5(A)是本发明实施例提供的TRAF6及其截短突变体(TRAF6 FL、 TRAF6Δ1、TRAF6Δ2和TRAF6Δ3)的示意图。
图5(B)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验验证 ASB17分别与TRAF6其截短突变体的相互作用的示意图。
图5(C)是本发明实施例提供的ASB17及其截短突变体(ASB17 FL、ASB17 Δ1、ASB17Δ2、ASB17Δ3和ASB17Δ4)的示意图。
图5(D)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀实验验证TRAF6分别与ASB17其截短突变体相互作用的示意图。
图5(E)是本发明实施例提供的在HEK293T细胞中，通过泛素化实验验证 ASB17或ASB17截短突变体抑制TRAF6泛素化的示意图。
图6是本发明实施例提供的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物步骤图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图6所示，本发明实施例提供的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法包括以下步骤：
S101，小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离；
S102，蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫荧光；
S103，蛋白质稳定性检测及泛素化实验。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1、本发明分析工作：
(1)ASB17可以和TRAF6相互；
(2)在细胞水平发现ASB17能够抑制TRAF6泛素化和稳定TRAF6，同时促进TRAF6介导的炎症反应。在实验结果和国内外研究进展的基础上，探究树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用，这为宿主促进TRAF6介导炎症反应提供实验依据，为TRAF6在炎症反应中的调控作用提供理论基础，以及为防治TRAF6相关疾病提供新的思路。
(1)本发明的意义：
树突状细胞(DCs)是免疫系统的关键前哨细胞和抗原呈递细胞(APC)。它们连接先天性和适应性免疫反应，在宿主抵御包括病毒、细菌和寄生虫在内的入侵病原体方面发挥着不可或缺的作用。通过Toll样受体(TLRs)感应病原体时，DCs的激活主要由模式识别受体/核因子-κB(NF-κB)信号介导，并取决于相应信号分子的适当泛素化。然而，参与其中的泛素化和去泛素化酶及其互相之间的关系还不完全清楚。TRAF6作为通过Toll样受体激活NF-κB转录活性过程中重要的调控蛋白，其自身多聚泛素化在这个过程中颇为重要。目前，若干研究表明，K48连接的TRAF6泛素化可以促进TRAF6的降解，进而有效地阻断了TLR依赖的炎症信号通路。尽管如此，在TLRs依赖性先天免疫反应中调节K48泛素化和TRAF6蛋白水平的分子机制仍不清楚。如何调控TRAF6相关的炎症性疾病成为科研人员致力于解决的科研问题，本发明揭示树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用，为宿主促进TRAF6介导炎症反应提供实验依据，为丰富TRAF6介导炎症反应的调控机理提供理论基础，以及为防治TRAF6相关疾病提供新的思路。
(2)本发明的目标
本发明的研究目标非常明确，紧紧围绕ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制和作用展开两个方面的研究。
本发明的创新之处在于：提出了ASB17促进TRAF6介导炎症反应的新机制；
本发明是宿主蛋白促进TRAF6介导炎症反应的分子机制研究，利用免疫共沉淀实验发现ASB17能够与TRAF6相互作用。在细胞水平上，阐明在树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制。这为揭示宿主蛋白促进 TRAF6介导的炎症反应提供新机制。
还提供调控炎症新蛋白。
本发明阐明ASB17促进TRAF6介导炎症反应的机制，为TRAF6及相关疾病提供抗炎新蛋白。
2、内容
2.1在树突状细胞中ASB17促进TRAF6介导炎症反应的影响
通过分离小鼠原代细胞(BMDCs)，通过细胞刺激实验发现树突状细胞中 ASB17能够促进TRAF6介导的炎症反应。
2.2明确ASB17促进TRAF6介导炎症反应的具体机制
(1)ASB17和TRAF6相互作用，并能够稳定TRAF6
通过免疫共沉淀和免疫荧光，确定ASB17和TRAF6相互作用；通过放线菌酮追踪分析，确定ASB17能够稳定TRAF6蛋白。
(2)ASB17促进TRAF6介导炎症反应是通过稳定TRAF6蛋白
慢病毒过表达mASB17，通过慢病毒感染BMDCs和免疫印迹实验，确定 ASB17通过稳定TRAF6蛋白促进TRAF6介导炎症反应。
3、实验方法
(1)提取细胞及组织RNA和实时荧光定量PCR
1)本发明的样本分为细胞和小鼠的组织，在处理细胞样品时，若是贴壁细胞，可以直接加1ml的Trizol裂解液到细胞培养皿中，用移液枪反复吹打，使细胞充分理解。若是悬浮细胞，则先低速离心收集细胞，弃掉上清后加入1ml Trizol，充分裂解细胞；处理小鼠组织样品时，先将小鼠新鲜的组织剪碎，然后取适当大小的各类组织到无RNA酶的EP管中，再加入1ml的Trizol裂解液，用组织研磨器充分破碎组织细胞。
2)上述样品在Trizol裂解液中充分裂解，随后常温放置5min，使裂解液分离蛋白质核酸复合物。
3)将200μl氯仿加入到2的EP管中，注意一定要盖好管盖，充分震荡混匀，随后放置于常温2min。
4)上述样品在4℃，最高转速离心10min，离心结束后本发明会发现EP管中的样品至下而上分为三层：红色透明层，白色沉淀层和无色透明层，RNA在上层无色透明层内。小心地将上层无色透明液体转移到新的无RNA酶的EP管中。
5)将与上述无色透明液体等体积的70％乙醇(DEPC水配制)加入到4的 EP管中，上下颠倒混匀。
6)将试剂盒中的吸附柱装入收集管内，将5中的溶液加到吸附柱内，每次最多700μl，若一次没有加完，应该加完为止。随后收集管常温，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体。
7)700μl漂洗液1加到吸附柱中，常温转速12000rpm离心30s，收集管中液体被弃掉。
8)将500μl漂洗液2(已加入无水乙醇)加到吸附柱内，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，随后重复上述操作一次。
9)漂洗液洗完后，常温下，最大转速离心2min后，将吸附柱插入新的无RNA酶EP管中，常温静置数分钟，使得吸附柱上的乙醇彻底挥发。
10)乙醇彻底挥发后，将30～50μl DEPC水加入到吸附柱中，静置1min后，常温最大转速离心1min，RNA溶于管底的水中，测量RNA浓度并记录。
11)按逆转录体系，一次加入约1μg RNA，4μl逆转录酶混合物5×HiScript II qRTSuperMix，DEPC水补齐至20μl。混匀后离心，放入PCR仪内，设定程序：50℃15min，85℃15s。得到样本的cDNA。
12)按照Q-PCR体系，本发明配好预混液，Q-PCR板子每个孔中包含有1μl cDNA，正向反向引物各1μl，10μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix和8μl ddH2O。要确保每个样品都有三个平行对照孔，离心后上机检测。
(2)细胞的培养和转染
本发明中使用了较多常见的细胞系。Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)培养基(其中包含10％胎牛血清FBS，100μg/ml链霉素和100U/ml 氨苄青霉素)被用于培养HEK293T细胞和Hela细胞。HupG2细胞、Huh7细胞、U251细胞、A549细胞、原代BMDMs、原代BMDCs和RD细胞被培养于添加有10％胎牛血清FBS，1％双抗(100μg/ml链霉素和100U/ml氨苄青霉素)的 DMEM培养基中。Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％双抗)被用于培养THP-1细胞。GC-1、GC-2、TM3和TM4 细胞在添加有10％FBS，100u/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的DMEM/F12 (GIBCO)培养基中培养。
细胞转染
本发明中在HECK293T细胞和Hela细胞中进行了大量的细胞转染实验。它们的转染过程大致一样，步骤如下：
1)确定好细胞生长的速度，在前一晚将所需要的细胞铺到对应的培养皿(24 孔板、12孔板、6孔板，600mm皿和10cm皿)中。
2)做实验前要确保细胞的密度在60％～80％范围内。
3)在超净工作台中进行操作，将事先准备好的质粒和转染试剂分别与等量的OPTI-MEM混匀，加入OPTI-MEM的量为转染的培养皿中培养基体积的二十分之一。其中根据转染试剂的不同，加入质粒与转染试剂的量也有所不同。一般用Lipo 2000进行转染时,1μg质粒需要加入2μl的Lipo 2000。若是用PEI 进行转染，1μg质粒需要加入3μl的PEI。
4)将质粒混合液和转染试剂混合液混匀，若转染试剂是Lipo 2000，常温静置5min即可；若用PEI转染，常温静置时间则需要20min。
5)用移液枪均匀的把步骤4中的混合物加入到细胞培养皿中，可以适当晃动培养皿使其更均匀。
6)大约6h后，给细胞换上新鲜的培养基，接着在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。需要注意的是HECK293T细胞可以在转染前换液，但由于Lipo 2000 对Hela细胞毒性较大，一定要在转染4～6h后换上新鲜的培养基。
(3)小鼠原代细胞分离
分离小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)
1)准备野生小鼠和ASB17敲除小鼠(6～8周龄)，无菌条件下取出所有股骨和胫骨，在70％酒精的中浸泡5min，PBS洗2次。
2)用注射器(吸取PBS)冲洗骨髓至培养皿中，至骨变白；悬液过滤(200 目尼龙网)，再离心，用RPMI 1640培养基(含20ng/ml GM-CSF)重悬，铺匀至100mm细胞培养皿。
3)第3天时，向培养皿中再加入10ml RPMI 1640培养基(含20ng/ml GM-CSF)；第6天和第8天，收集培养液，离心后用完全培养液(含20ng/ml GM-CSF)重悬细胞沉淀，再将细胞悬液放回原细胞培养皿；第10天得到 BMDCs。
分离小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)
1)准备野生小鼠和ASB17敲除小鼠(6～8周龄)，无菌条件下，取出所有股骨和胫骨。
2)用70％酒精浸泡5min，PBS润洗2次。
3)用注射器(吸取PBS)冲洗骨髓至培养皿中，直至骨变白；悬液过滤(200 目尼龙网)，离心，用红细胞裂解液除去红细胞。
4)向培养皿中加入RPMI 1640培养基(含10～20％L929细胞培养基)。
5)第3天和第5天用RPMI 1640培养基(含10～20％L929细胞培养基) 进行换液，第6天即为BMDMs。
(4)蛋白质免疫印迹
1)细胞样品的制备：倒掉培养皿中的培养基后，先用2ml预冷的PBS润洗细胞2～3次；加入少量胰酶消化细胞(最好在37℃)，再加入1ml含有血清的培养基终止胰酶消化，重悬细胞；预冷的PBS吹打重悬细胞，常温低速离心后，吸走PBS，加入300μl细胞裂解液(含蛋白酶抑制)；细胞悬液经由超声波细胞破碎仪超声处理，由浑浊变澄清；4℃离心机离心样品10min后，将上清转移到新的1.5ml EP管中，加入80μl 5×SDS Loading Buffer，混匀后100℃加热10min，蛋白样品制备完成。
2)免疫印迹：凝胶电泳跑胶和转膜完成后，取出NC膜，用含有5％脱脂牛奶的PBST(PBS+吐温)缓冲液封闭45min；PBST洗三次(每次5min)；加一抗(PBST缓冲液稀释)，4℃孵育过夜；回收一抗，PBST洗3次(每次5min)；加入二抗(用含有2％脱脂牛奶的PBST配制)，室温孵育45min；PBST洗3 次，每次10min；显色和曝光。
(5)免疫共沉淀
1)转染后36到48h，收取细胞样品，先用预冷的PBS润洗细胞1～2次，再用胰酶消化，随后用含有血清的培养基终止胰酶消化，1.5ml EP管收集细胞，低速离心后去掉上清，再用预冷的PBS吹洗细胞2次，最后得到细胞沉淀。
2)按照细胞量加入500至1000μl的RIPA裂解液(配方为0.05M Tris盐酸， 0.001M乙二胺四乙酸，0.15M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，pH值为7.4)以及蛋白酶抑制剂，在4℃冰箱中，旋转摇床上裂解细胞30min。
3)裂解结束后，对剩余的细胞进行超声波破碎处理，随后4℃，转速12000rpm 离心10min。
4)离心后，将上清分为两部分，其中100μl加入到新的1.5ml EP管中，随后和25μl的5×SDS Loading Buffer混匀，100℃加热10min，快速离心后放于-20℃保存。剩余的上清约900μl，将约20μl用RIPA裂解液洗净后的Protein A/G珠子加入其中，并在4℃，旋转摇床上吸附2h。
5)吸附结束后，1000g离心，用移液枪将上清转移到新的1.5ml EP管中。
6)将1μg免疫沉淀抗体加入到5的溶液内，4℃旋转摇床过夜(12～14h)。
7)第二天，将约40μl用RIPA裂解液洗好的Protein A/G珠子加入到6的溶液中，4℃旋转摇床吸附2h。
8)2h后，上述EP管4℃，转速1000g离心1min，弃掉上清，再加入1ml RIPA 洗脱液(配方为0.05M Tris盐酸，0.001M乙二胺四乙酸，0.3M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，其pH值为7.4)，上下轻柔颠倒混匀后，4℃1000g离心1min，洗液枪小心吸走上清，重复洗脱6次。
9)最后一次离心时，要用大枪头套10μl的小枪头，尽量将上清吸走。
10)将60μl的2×SDS Loading Buffer加入到上面的EP管中，随后100℃加热10min，经短暂离心后，将蛋白免疫沉淀样品放于-20℃冰箱中。
11)最后通过蛋白免疫印迹实验检测免疫沉淀和细胞裂解液中目标蛋白的表达情况。
(6)免疫荧光
通过在HECK293T细胞中单独转染或共转质粒来观察目标蛋白在细胞内的分布情况以及它们是否有共定位现象存在。转染结束后，弃掉confocal皿中的培养基，预冷的PBS润洗细胞2次。将甲醇和丙酮1:1比例的混合液提前4℃预冷，加入到confocal皿中，随后放到4℃，20min来固定和透化细胞。PBS润洗 (3次，每次5min)固定透化的细胞后，加入3％的BSA(PBS配制)，常温封闭1h。封闭结束后，用PBS润洗(3次，每次5min)，再将3％BSA配制的荧光一抗加入到confocal皿中，4℃过夜孵育(12～16h)。一抗孵育结束后，PBS 缓冲液润洗(3次，每次10min)，将10％BSA配制的荧光二抗加入到confocal 皿中，室温锡箔纸避光处理放置45min。二抗孵育结束，PBS润洗三次，每次 10min，将细胞核染料DAPI(甲醇配制)加入到confocal皿中，避光处理，放置于37℃5min。最后用PBS缓冲液润洗细胞3次(每次10min)，就可以用激光共聚焦显微镜观察样品了。
(7)泛素化实验
1)细胞转染36到48h后，收取细胞样品，具体可以参考免疫沉淀收取细胞时的操作。
2)收集细胞至1.5ml EP管中，加入100μl RIPA裂解液(含有1％SDS)，用移液枪反复吹打，随后100℃加热5min。
3)将900μl的RIPA裂解液加入到2的溶液中，此时本发明得到的是0.1％浓度SDS，随后冰上放置20min。
4)上述细胞进行超声破碎，随后4℃，转速12000rpm离心10min，将上清收集到新的1.5ml EP管中。
5)将上述1.5ml EP管中的液体吸取100μl至新的1.5ml EP管中，加入25μl 5×SDSLoading Buffer并混匀，100℃加热10min，离心后-20℃保存。
6)剩余的液体中加入20μl RIPA裂解液洗过的Protein A/G珠子，预吸附 2h。
7)将上述EP管4℃，1000g离心，上清转移到新的1.5ml EP管中并加入对应的抗体进行IP。4℃，旋转摇床过夜。
8)加入40μl洗过的Protein A/G珠子，继续吸附2h。
9)吸附结束后，RIPA洗脱液洗脱上述的Protein A/G珠子。4℃，1000g转速进行，重复6次。
10)最后一次，将上清尽量吸走，随后加入60μl 2×SDS Loading Buffer并混合均匀，100℃加热10min，短暂高速离心后，蛋白样品即制备完成。
4、实验结果与讨论
转录因子核因子-κ增强子结合蛋白(nuclear factor kappa enhancer bindingprotein，NF-κB)控制了包括炎症和先天免疫在内的诸多生理活动。而Toll样受体在受到脂多糖(LPS)等刺激后，激活细胞内一系列酶促反应，进而激发NF- κB的转录活性，可见Toll样受体对于NF-κB激活的重要性。而TRAF6作为通过Toll样受体激活NF-κB转录活性过程中重要的调控蛋白，其自身多聚泛素化在这个过程中颇为重要。目前，若干研究表明，K48连接的TRAF6泛素可以促进TRAF6的降解，进而有效地阻断了TLR依赖的炎症信号通路。尽管如此，在TLR依赖性先天免疫反应中调节K48泛素化和TRAF6蛋白水平的分子机制仍不清楚。锚蛋白重复序列和含有SOCS盒的蛋白17(Ankyrin repeat和SOCS box containing protein17，ASB17)是ASB家族中的一个成员。ASB17目前的功能还不是很清楚，基本没有文献报道，只知道它能够在小鼠的睾丸器官中大量表达。本发明发现了ASB17缺陷能够抑制LPS诱导的NF-κB转录激活活性，而过表达ASB17则会促进这一过程。同时，本发明证实了ASB17与TRAF6能够相互作用，并且ASB17能够抑制TRAF6的多聚泛素化和稳定TRAF6的蛋白水平。判断它可能是宿主体内一个重要的炎症通路调控蛋白，对于保护宿主自身炎症反应的过度激活起着重要。因此本发明深入探讨了ASB17在调控TRAF6 介导炎症反应中的功能。
4.1ASB17在BMDCs中促进LPS介导NF-κB激活
之前的研究检测显示ASB17主要在睾丸中表达。然而，在骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和树突状细胞(BMDCs)中可检测到该基因的表达(见图1A)。尤其是，其在BMDCs中的表达水平可由LPS诱导，LPS是一种来自革兰氏阴性细菌的重要热原(见图1B)。提示ASB17可能参与了感染性炎症的病理过程。为了研究ASB17在树突状细胞中的作用，本发明用从公司购买的ASB17+/-小鼠产生ASB17-/-小鼠，并分离其BMDCs(见图1C，D)。本发明发现ASB17敲除显著减弱了LPS诱导的促炎细胞因子CCL2和IL-6在BMDCs中的表达(见图 1E，F)。当TLR4被LPS激活时，NF-κB信号通路在促炎细胞因子的产生中起着关键作用。通过检测该途径，本发明发现当LPS刺激BMDCs时，ASB17缺失明显降低了NF-κB组分p65的磷酸化(见图1G)，表明NF-κB激活受到抑制。此外，当ASB17在ASB17-/-BMDCs中过表达时，本发明检测了促炎细胞因子的诱导和NF-κB p65的磷酸化，以验证其特异性。ASB17-/-BMDCs中ASB17 的过表达恢复了LPS诱导的CCL2和IL-6表达以及NF-κB p65的激活(见图1H， I，J)。本发明的结果表明ASB17对LPS介导的NF-κB激活非常重要。
4.2ASB17在THP1中促进LPS介导NF-κB激活
为了进一步研究ASB17在NF-κB信号传导中的作用，本发明构建了稳定表达ASB17蛋白的THP-1细胞(见图2A)。无论是否有LPS刺激，ASB17的过表达显著促进IL-6和CCL2的表达(见图2B，C)。与敲除实验一致，ASB17 的过量表达明显促进了NF-κB的激活(见图2D)。总之，ASB17可以促进LPS 介导的NF-κB激活。
4.3ASB17能够和TRAF6相互作用
为了研究ASB17是如何调控NF-κB信号通路的，本发明通过免疫沉淀筛选了参与或与该通路相关的关键分子，包括IRF7、STING、TBK1、IRF3、IκBα、IKKε、RIP1、TRAF6、P50和P65，以确定哪些分子可能与ASB17相互作用。在这些分子中，本发明发现只有TRAF6与ASB17相互作用(见图3A)。为了确保TRAF6与ASB17相互作用的特异性，本发明还构建了TRAF家族相关基因TRAF2、TRAF3和TRAF5来进行免疫沉淀。结果表明，ASB17可以专门沉淀TRAF6(见图3B)。进一步的共免疫沉淀(Co-IP)和相互共免疫沉淀分析证实了ASB17和TRAF6的相互作用(见图3C、D、E)。共聚焦显微镜显示 ASB17与TRAF6在细胞中共定位(见图3F)。本发明还使用双分子荧光互补 (BiFC)分析系统来检测这种蛋白质-蛋白质相互作用。本发明构建了 VN-173-TRAF6和VC-155-ASB17质粒并将其转染到细胞中。对照组未观察到荧光，但在VN-173-TRAF6和VC-155-ASB17均转染的实验组中观察到明显的荧光。结果表明ASB17可以与TRAF6相互作用(见图3F)。总的来说，这些结果表明ASB17与TRAF6存在生理上的联系。鉴于TRAF6在NF-κB信号转导中起着关键作用，本发明认为ASB17通过与TRAF6的相互作用调节NF-κB信号通路。
4.4ASB17抑制TRAF6多聚泛素化并稳定TRAF6蛋白
为了探讨ASB17如何影响TRAF6的功能，本发明研究了TRAF6蛋白水平。 HEK293T定量转染TRAF6、EGFP(设为对照)和不同剂量的ASB17，Western blotting分析显示ASB17能够增加TRAF6蛋白水平，但不影响EGFP的表达(见图4A)。为了研究TRAF6蛋白的稳定性，本发明用阻止细胞蛋白质合成的放线菌酮(CHX)进行了蛋白质衰变试验。结果表明ASB17的过表达显著降低了 TRAF6蛋白的降解率，表明ASB17稳定了TRAF6蛋白(见图4B)。
然后，本发明检查了TRAF6的多聚泛素化是否受ASB17的调控。在 HEK293T细胞中，ASB17可显著抑制TRAF6的多聚泛素化(见图4C)。此外， ASB17以ASB17剂量依赖性方式抑制TRAF6的多聚泛素化(见图4D)。据报道，许多E3泛素连接酶以TRAF6连接的泛素链(K48连接或K63连接)为靶点。本发明构建了泛素突变载体K48O和K63O(除了分别位于48和63位的赖氨酸残基外，所有赖氨酸残基都变成精氨酸残基)。泛素检测显示ASB17可抑制TRAF6的K48和K63连接的多聚泛素化(见图4E)。为了进一步确保ASB17 抑制TRAF6 K48连接的多聚泛素化，本发明发现了ASB17能够以剂量依赖性的方式抑制TRAF6 K48连接的多聚泛素化(见图4F)。此外，ASB17的过表达也提高了THP-1中的内源性TRAF6蛋白水平(见图4G)。ASB17的过表达显著抑制LPS诱导的THP-1中TRAF6多聚泛素化和K48连接的多聚泛素化(见图4H)。与此一致，ASB17敲除降低了BMDCs中内源性TRAF6蛋白水平，并增加了TRAF6多聚泛素化(见图4I，J)。总之，ASB17可以抑制TRAF6的多聚泛素化，表明ASB17保护TRAF6不被降解以促进NF-κB激活。
4.5ASB17 aa177-250片段是与TRAF6的锌指结构域相互作用和抑制 TRAF6的多泛素化所必需
TRAF6包含RF域、ZnF域和TRAF-C域(见图5A)。Co-IP分析表明ASB17 可以与TRAF6的ZnF结构域相互作用(见图5B)。据报道，ASB17主要包含 ANK-box结构域和SOCS-box结构域(见图5C)。Co-IP分析表明，ANK-box 结构域和SOCS-box结构域之间ASB17的aa177-250片段是与TRAF6相互作用所必需的(见图5D)。为了进一步研究ASB17相互作用对TRAF6多聚泛素化的影响，本发明进行了ASB17截短的泛素检测试验。结果表明，aa177-250片段的缺失使ASB17丧失了对TRAF6多聚泛素化抑制的活性。这些数据表明ASB17 通过其aa177-250片段与TRAF6相互作用，并抑制TRAF6的多聚泛素化。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 佛山病原微生物研究院
<120> 一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtaaat ctactaaatt atgtggtaag acttcttgtc caagaagcaa tatattctgc 60
aatctccttg acaaaattgt taaaagaccc tccctacagt ttttgggtca gtggggatat 120
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<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaataact cttctaaatt atgccggaag acgtcttttc caagaagcaa tatattctgt 60
aaccttgttg acaagatagt taagcggccc tctctgcagt ttctgggcca atggggatac 120
cactgctatg aacccaggat ttacagaacc ctggcaaaaa tcctgaggta tgttgacttg 180
gacggctttg acatactcct cacggactat attgcttttg tggaaaagtc aggacaccgt 240
tttgaactca actttaacct tgagtttact gaaatatgcg tgaataccat tctgtactgg 300
gttttcgcca ggaaaggtaa tcctgacttc gtggaactgc ttctcaagaa gacgaaggac 360
tatgtccaag acagaagctg cagcctggcg ctgatatgga gaaccttcac acctgtgtac 420
tgccccagcc ccctgagtgg catcacacct ctactctacg tggctcagac aagacagtca 480
aatatcttaa aaattctcct gcagtatgga atcctagaaa gagaaaaaaa ccctatcaac 540
attgttctga caatactact ttacccttcg agagtgagaa taatggttga ccacgagttg 600
attgacattc aagaagatgc caagacatgt ttaatgctat gttccagagt gctttctacg 660
atctcagtca gggagataga gacacagctg agcttaggac gacgcccaat tattcaaaat 720
tggttggact acatcccgcc aacaagatac aaggatccat gtgaactcgt ccacctttgc 780
agaataacca tcaggaccca actgctggcc aacaatatgc tcccaaatgg aatattttcc 840
cttctaattc ctactcgttt acaaaacttc ctgaatttag aaagctag 888

Claims (10)

1.一种ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途。
2.如权利要求1所述的ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途，其特征在于，所述ASB17的Human ASB17 Sequence.txt序列如SEQ ID NO：1所示，所述ASB17的MouseASB17 Sequence.txt序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种应用如权利要求1～2任意一项所述的ASB17在制备TRAF6相关炎症性疾病药物中的用途的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，所述验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法包括以下步骤：
步骤一，小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离；
步骤二，蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫荧光；
步骤三，蛋白质稳定性检测及泛素化实验。
4.如权利要求3所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤一中，所述小鼠原代细胞BMDCs和BMDMs分离，包括：
(1)分离小鼠骨髓来源树突状细胞BMDCs
准备6到8周龄的野生小鼠和ASB17-/-小鼠，无菌条件下，取出所有股骨和胫骨，在70％酒精的中浸泡5min，PBS洗2次；用注射器吸取PBS冲洗骨髓至培养皿中，至骨完全变为白色；细胞悬液过滤，离心，RPMI 1640培养基(包含20ng/ml GM-CSF)重悬，100mm细胞培养皿中培养；第3天，向培养皿中再加入10ml RPMI 1640培养基；第6天和第8天，培养液离心后用完全培养液重悬细胞沉淀，随后铺至原细胞皿；第10天得到BMDCs；
(2)分离小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDMs
准备6到8周龄的野生小鼠和ASB17-/-小鼠，无菌条件下，取出所有股骨和胫骨并在70％酒精的中浸泡5min，PBS洗2次；用注射器反复冲洗出骨髓至培养皿中，至骨变白；悬液过滤，再离心，用红细胞裂解液除去红细胞；向培养皿中加入RPMI 1640培养基；第3天和第5天换为新鲜RPMI 1640培养基，第6天即为BMDMs。
5.如权利要求3所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤二中，所述蛋白质免疫印迹，包括：
用裂解液处理细胞，并超声破碎后，再用Bradford法测定细胞蛋白的浓度；得到的细胞裂解液经过处理后，在8～12％的SDS-PAGE胶中跑胶2h，SDS-PAGE胶上跑开的蛋白质经转膜设备，经2h转到NC膜上；将NC膜用5％的脱脂牛奶封闭，经过一抗4℃孵育过夜和二抗室温孵育1h，再由化学显色液显色，最后通过化学发光仪观察目的蛋白条带；其中，所述脱脂牛奶由PBST配制。
6.如权利要求3所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤二中，所述免疫共沉淀，包括：
(1)转染后36～48h，收取细胞样品，用预冷的PBS润洗细胞1～2次，再用胰酶消化；随后用含有血清的培养基终止胰酶消化，1.5ml EP管收集细胞，低速离心后去掉上清，再用预冷的PBS吹洗细胞2次，最后得到细胞沉淀；
(2)按照细胞量加入500～1000μl的RIPA裂解液以及蛋白酶抑制剂，在4℃冰箱中，旋转摇床上裂解细胞30min；裂解结束后，对剩余的细胞进行超声波破碎处理，随后4℃，转速12000rpm离心10min；
(3)离心后，将上清分为两部分，其中100μl加入到新的1.5ml EP管中，随后和25μl的5×SDS Loading Buffer混匀，100℃加热10min，快速离心后放于-20℃保存；剩余的上清900μl，将20μl用RIPA裂解液洗净后的Protein A/G珠子加入其中，并在4℃，旋转摇床上吸附2h；
(4)吸附结束后，1000g离心，用移液枪将上清转移到新的1.5ml EP管中；将1μg免疫沉淀抗体加入到溶液内，4℃旋转摇床过夜12～14h；
(5)第二天，将40μl用RIPA裂解液洗好的Protein A/G珠子加入溶液中，4℃旋转摇床吸附2h；
(6)2h后，将所述EP管4℃，转速1000g离心1min，弃掉上清，再加入1ml RIPA洗脱液，上下轻柔颠倒混匀后，4℃1000g离心1min，洗液枪小心吸走上清，重复洗脱6次；将60μl的2×SDS Loading Buffer加入到所述EP管中，100℃加热10min，经短暂离心后，将蛋白免疫沉淀样品放于-20℃冰箱中；通过蛋白免疫印迹实验检测免疫沉淀和细胞裂解液中目标蛋白的表达情况。
7.如权利要求6所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RIPA裂解液的配方为0.05M Tris盐酸，0.001M乙二胺四乙酸，0.15M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，pH值为7.4；
步骤(6)中，所述RIPA洗脱液的配方为0.05M Tris盐酸，0.001M乙二胺四乙酸，0.3M氯化钠，1％NP-40，5％甘油，pH值为7.4。
8.如权利要求3所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤二中，所述免疫荧光，包括：
转染结束后，弃掉confocal皿中的培养基，预冷的PBS润洗细胞2次；将甲醇和丙酮按照1:1比例的混合液提前4℃预冷，加入到confocal皿中，放到4℃，20min固定和透化细胞；PBS润洗3次，每次5min，固定透化的细胞后，加入3％的BSA，常温封闭1h；封闭结束后，用PBS润洗3次，每次5min，再将3％BSA配制的荧光一抗加入到confocal皿中，4℃过夜孵育12～16h；一抗孵育结束后，PBS缓冲液润洗3次，每次10min，将10％BSA配制的荧光二抗加入到confocal皿中，室温锡箔纸避光处理放置45min；二抗孵育结束，PBS润洗三次，每次10min，将细胞核染料DAPI加入到confocal皿中，避光处理，放置于37℃5min；用PBS缓冲液润洗细胞3次，每次10min，用激光共聚焦显微镜分析样品。
9.如权利要求8所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，所述BSA由PBS配制，所述细胞核染料DAPI由甲醇配制。
10.如权利要求3所述的验证ASB17制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的方法，其特征在于，步骤三中，所述蛋白质稳定性检测及泛素化实验，包括：
(1)蛋白质稳定性检测
在HEK293T细胞中，转染相对应质粒，并在对应时间点加入放线菌酮CHX收集待处理细胞，用预冷的PBS洗1～2次，吸干残留液体，加入100μl含有1％SDS的细胞裂解液，吹打混匀，4℃放置20min后，4℃，12000rpm离心10min；取80μl管中上清液体，加入加入20μl 5×SDSLoading Buffer，沸水浴10min，样品保存在-20℃冰箱，第二天跑胶，转膜和显色；
(2)泛素化实验
细胞转染36～48h后，收集细胞至1.5ml EP管中，加入100μl含有1％SDS的RIPA裂解液，用移液枪反复吹打后，100℃加热5min；将900μl的RIPA裂解液加入溶液中，得到0.1％浓度的SDS，随后冰上放置20min；将细胞进行超声破碎后，4℃，转速12000rpm离心10min，将上清收集到新的1.5ml EP管中；
将所述1.5ml EP管中的液体吸取100μl至新的1.5ml EP管中，加入25μl 5×SDSLoading Buffer并混匀，100℃加热10min，离心后-20℃保存；剩余的液体中加入20μl RIPA裂解液洗过的Protein A/G珠子，预吸附2h；随后4℃，1000g离心，上清转移到新的1.5ml EP管中并加入对应的抗体进行IP；4℃，旋转摇床过夜；加入40μl洗过的Protein A/G珠子，继续吸附2h；吸附结束后，RIPA洗脱液洗脱上述的Protein A/G珠子；4℃，1000g转速进行，重复6次；最后一次，将上清尽量吸走后，加入60μl 2×SDS Loading Buffer并混合均匀，100℃加热10min，短暂高速离心后，蛋白样品即制备完成。
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