CN113755526A

CN113755526A - HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用

Info

Publication number: CN113755526A
Application number: CN202111158036.9A
Authority: CN
Inventors: 刘雅兰; 胡勤学
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2021-12-07

Abstract

本发明属于细胞工程领域，更具体涉及HSV‑2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用，申请人首次发现将HSV‑2的包膜糖蛋白gJ在哺乳动物细胞中表达能显著增加其他外源蛋白的表达水平，属于调控蛋白质表达的新基因。通过该发现，申请人构建了体外稳定表达HSV‑2包膜糖蛋白gJ的哺乳动物细胞系293‑J和CHO‑J，该细胞系可用于工程细胞生产蛋白或多肽类外源蛋白。通过外泌型抗体的表达效果和HIV‑1假病毒包装的病毒产量证实，稳定表达gJ的细胞系能提高蛋白或多肽类外源蛋白的产量。

Description

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用

技术领域

本发明属于细胞工程领域，更具体涉及HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用。

背景技术

哺乳动物细胞表达系统的蛋白质加工机制，包括糖基化等翻译后修饰，能够为外源蛋白提供最接近于天然状态的翻译后修饰，产生的外源蛋白质在空间结构和修饰上会更接近天然蛋白质，在生物活性方面优于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统所生产的蛋白。这一特性使得哺乳动物细胞表达系统在生物药(包括抗体类和融合蛋白或多肽类等)的研发和生产中具有广泛的应用。

然而，哺乳动物细胞表达系统的表达从整体水平上看仍偏低。对现有细胞株选择性地进行遗传改造是提高重组蛋白表达水平的重要手段之一(Su Xiao,Joseph Shiloach,MichaelJBetenbaugh.Engineering cells to improve protein expression.CurrentOpinion in Structural Biology.Volume 26,June 2014,Pages 32-38)Engineeringcells to improve protein expression。CHO(中国仓鼠卵巢细胞)是最常用来表达蛋白类药物(包括单抗等)的细胞株，目前市场上大多数批准的蛋白药是用CHO(中国仓鼠卵巢细胞)来表达的。293T细胞由293细胞(人肾上皮细胞系)衍生而来，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平，因此293T细胞是一个很常用的研究外源基因表达的细胞株，也广泛应用于病毒包装。

人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是生殖器疱疹的主要病原，是一种具有双层包膜结构的DNA病毒。在它的包膜上含有至少11种包膜糖蛋白，这些包膜糖蛋白很多都在病毒的吸附和侵入宿主细胞的过程中发挥作用。HSV-2的包膜糖蛋白gJ，是一个非必需蛋白，在我们的研究结果发表之前它的功能未知，而且到目前为止也仅有我们实验室对其功能进行了报道。我们首次发现gJ能促进HSV-2的细胞-细胞间扩散和合胞体形成，敲减或敲除gJ均会导致HSV-2病毒产量的下降，同时还发现gJ能促进JEV和HIV-1病毒蛋白的表达和增加病毒产量(Yalan Liu etal,HSV-2glycoprotein J promotes viral protein expression andvirusspread.Virology.2018Dec；525:83-95)。gJ在病毒复制过程中的作用提示它可能作为一个调控因子调节蛋白表达量和病毒产量，由此我们首次发明了其作为功能分子应用于工程细胞的改造并检验了获得的改造工程细胞在提高外源蛋白表达量中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供了HSV-2的包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的应用，所述的HSV-2的包膜糖蛋白gJ为SEQ ID NO.3所示。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

HSV-2的包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的应用，所述的HSV-2的包膜糖蛋白gJ基因为编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。

以上应用中，优选的，是将含有HSV-2的包膜糖蛋白gJ基因的慢病毒，转导至哺乳动物细胞中，获得稳定表达gJ蛋白的细胞系，然后利用该细胞系表达外源蛋白。

以上所述的应用中，优选的，所述的哺乳动物细胞为人肾上皮细胞系或CHO细胞系。

以上所述的应用中，优选的，稳定表达gJ蛋白的细胞系为保藏编号为CCTCC NO:C2021263的人肾上皮细胞293-J或保藏编号为CCTCC NO:C2021264的中国仓鼠卵巢细胞CHO-J。

以上所述的应用中，优选的，所述的外源基因包括外泌型蛋白基因，胞内蛋白基因和或病毒基因。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

申请人首次发现将HSV-2的包膜糖蛋白gJ在哺乳动物细胞中表达能显著增加其他外源蛋白的表达水平，目前该基因调控蛋白质表达的功能仅由申请人发现并报道，属于调控蛋白质表达的新基因，而通过慢病毒转导而构建的稳定表达gJ的工程细胞是由申请人首次获得的产品，申请人已经使用该产品并证实稳定表达gJ的工程细胞能提高外泌型抗体的产量、外源胞内蛋白的表达量和HIV-1假病毒的病毒产量，该工程细胞将应用到蛋白、多肽、病毒等的大规模生产中，可以提高产量。

附图说明

图1稳转细胞系和原始细胞系中分泌型OPD抗体的相对表达水平。

图2稳转细胞系和原始细胞系中分泌型SFTSV纳米抗体的相对表达水平。

图3稳转细胞系和原始细胞系中胞内表达的HSV-2US1蛋白的相对表达水平。

图4利用稳转细胞系和原始细胞系包装出HIV-1病毒的产量比较示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

含有HSV-2Us5基因的细胞系的制备：

1)HSV-2Us5基因编码区的克隆：

以本实验室已经构建的表达载体pcDNA3.1(+)-gJ(该载体是将HSV-2包膜糖蛋白gJ的基因(GenBank:KU310668.1)序列插入到pcDNA3.1(+)的EcoRI和XbaI这两个酶切位点之间)为模板，PCR扩增包膜糖蛋白gJ的基因(US5)，正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATCGGTATGCC-3’，反向引物：5’-GCCGTTTAAACTCATGGGGCAAATTG-3’。最终获得包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(HSV-2US5序列)，该序列编码SEQ ID NO.3所示的蛋白(HSV-2包膜糖蛋白gJ序列)。

以上方案中，为了实现和载体的连接，在正向和反向引物的5’端分别加了BamH I酶切位点(5’-GGATCC-3’)和Pme I酶切位点(5’-GTTTAAAC-3’)和相应的保护碱基。

2)慢病毒载体的构建

将克隆得到的HSV-2US5基因片段的PCR产物和本实验室构建的慢病毒载体pLenti6.3-CMV-β7-IRES2-EGFP/V5-DEST(Chang Li etal,Binding of HIV-1virions toα4β7expre ssing cells and impact of antagonizingα4β7on HIV-1infection ofprimary CD4⁺T cells.VIROLOGICA SINICA 2014,29(6):381-392)均进行双酶切(BamHI和PmeI)，其反应体系如下：

37℃反应30分钟。

然后，双酶切质粒与PCR产物分别利用试剂盒按照说明书进行纯化回收，回收结果利用1％琼脂糖凝胶检测其浓度。

目标基因与表达质粒载体的连接与转化，具体步骤如下：

a.配置连接反应体系(10μl)

10×T4 DNA ligase Buffer 1μl

T4 DNA ligase 1μl

DNA片段(片段的摩尔数控制在载体的3-10倍)

ddH₂O至 10μl

b.25℃连接4h；

c.全量加入100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置25min；

d.42℃加热90s后，冰水浴放置3min；

e.加入890μl LB液体培养基，37℃，150rpm/min振荡培养60min；

f.在含有氨苄霉素(Amp，100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜；

g.挑取单菌落于划板的LB固体培养基(Amp，100mg/L)培养16小时左右，同时PCR菌落检测阳性克隆。

h.挑取菌落PCR阳性的克隆进行测序鉴定，使用的测序引物如下：

正向引物:5’-CGCGGATCCATGGATCGGTATGCC-3’

反向引物:5’-GCCGTTTAAACTCATGGGGCAAATTG-3’

I.测序结果如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，通过序列比对发现在US5的第258bp处有一个点突变(C变为T)，但是对应的氨基酸并未改变，不影响蛋白序列。将鉴定正确的pLenti6.3-J2-EGFP克隆保存质粒和菌种。

3)包装慢病毒

(1)利用质粒提取试剂盒(操作参照说明书进行)提取含HSV-2gJ基因序列的慢病毒表达载体(pLenti6.3-J2-EGFP)质粒和辅助质粒psPAX-2和pMD-2G。

(2)转染前20h将HEK293T细胞铺于六孔板中，1.2×10⁶细胞/孔。

(3)取8μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

(4)将慢病毒质粒(pLenti6.3-J2-EGFP)与辅助质粒(psPAX-2+pMD-2G)以适当比例(9:8:1)(六孔板每孔总质粒量为4ug)混合，并用250μl OPTI-MEM稀释。

(5)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

(6)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。由于gJ与GFP荧光蛋白构成双顺反子，可以通过荧光蛋白来监测gJ表达。

(7)收集培养上清，0.45μM滤器过滤后，添加1/10体积的FBS，分装置于-80℃保存。

4)慢病毒滴度测定

1)转染前～20h将CHO细胞铺24孔板中。

2)测定当天，将慢病毒10倍倍比稀释，取0.5mL每孔加入培养板，放入培养箱中继续培养48h。

3)荧光显微镜下计数表达荧光蛋白的细胞数，计算出每mL病毒液中所含的感染性病毒数(MOI/mL)。

5)慢病毒转导细胞并筛选稳定表达细胞系

(1)转导前24h，将HEK293T细胞铺于24孔板，以转导时细胞覆盖培养孔表面约30％为宜；

(2)按每个细胞30MOI加入步骤3)中包装好的慢病毒，添加8μg/mL polybrene；

(3)感染4～8h，换成新鲜完全培养基，放入培养箱继续培养；

(4)感染后24～48h，添加10μg/mL灭稻瘟菌素S(Blasticidin S；Sigma)；

(5)每隔1～2天，换成新鲜的添加有10μg/mL灭稻瘟菌素S的完全培养基以去除死细胞；

(6)待单层细胞长满后传代，继续用含灭稻瘟菌素S的完全培养基进行培养筛选

(7)约2周后，收集存活细胞，用流式对GFP⁺细胞进行分选纯化；

(8)继续筛选数代，直至获得稳定携带有pLenti6.3-J2-EGFP慢病毒表达载体的细胞系，命名为293-J。

(9)我们筛选出了多株稳定表达gJ的293-J(包括293-J1，293-J2，293-J3)，取gJ表达效果最好的一株293-J3于2021年9月16日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为：CCTCC NO:C2021263，分类命名：人肾上皮细胞293-J，地址，中国武汉武汉大学。

按照上述方法，本发明同时获得了多株稳定表达gJ的CHO-J细胞系。取gJ表达效果最好的一株于2021年9月16日送到中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为：CCTCCNO:C2021264，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-J，地址，中国武汉武汉大学。

实施例2：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高分泌型OPD抗体在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将实施例1制备的293-J1，293-J2，293-J3和HEK293T(对照)分别细胞铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达分泌型OPD抗体的质粒pcDNA3.4-OPD(该载体是将OPD抗体基因序列：SEQID NO.4所示核苷酸序列)插入到pcDNA3.4-TOPO的XbaI和AgeI两个酶切位点之间)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。

6)收集培养上清，0.45μM滤器过滤，收集的细胞用细胞裂解液裂解。

7)WB检测上清中的抗体和细胞裂解液中的内参actin，抗体和内参蛋白的显色条带如图1所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。

获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)分泌OPD抗体的量分别是原始细胞株293T的3.4、10.4和12.6倍，其中gJ表达量最高的293-J细胞系(CCTCC NO:C2021263)，分泌的OPD抗体的量最高。

9)用protein A的纯化柱纯化，最终每个样品浓缩成0.5ml。

10)CBA试剂盒测定获得的分泌型抗体的蛋白浓度。

WB结果和CBA测定出的蛋白浓度结果显示实施例1获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)分泌的OPD抗体的量均高于原始细胞株293T，其中gJ表达量最高的293-J3，分泌的OPD抗体的量最高。

CHO-J细胞系的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系分泌的OPD抗体的量，均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，分泌的OPD抗体的量最高。

实施例3：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高分泌型SFTSV纳米抗体在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将293-J1、293-J3和HEK293T细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达分泌型SFTSV纳米抗体的质粒SNB02(Xinlin Wu etal,A single-domainantibod y inhibits SFTSV and mitigates virus-induced pathogenesis in vivo.JCIInsight.2020Jul 9；5(13):e136855.)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

7)WB检测上清中的抗体和细胞裂解液中的内参actin，抗体和内参蛋白的显色条带如图2所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。实施例1获得的稳定表达gJ的细胞系(293-J1和293-J3)分泌的SFTSV纳米抗体的量均高于原始细胞株293T，293-J1分泌SFTSV纳米抗体的量是原始细胞株293T的1.8倍，而293-J3分泌SFTSV纳米抗体的量是原始细胞株293T的3.5倍，其中gJ表达量最高的293-J3，分泌的SFTSV纳米抗体的量最高。

CHO-J细胞系表达SFTSV纳米抗体的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系中SFTSV纳米抗体的表达均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，分泌的SFTSV纳米抗体的量最高。

实施例4：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高胞内表达的外源蛋白(HSV-2的极早期蛋白US1)在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将293-J3和HEK293T细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达HSV-2极早期蛋白US1的质粒US1-Flag(Mudan Zhang etal,HSV-2Immediate-Early Protein US1 Inhibits IFN-βProduction by SuppressingAssociation of IRF-3with IFN-βPromoter.J Immunol.2015Apr 1；194(7):3102-15.)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

6)收集细胞并用细胞裂解液裂解。

7)WB检测细胞裂解液中的US1-flag和内参actin，US1-flag和内参蛋白的显色条带如图3所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。实施例1获得的稳定表达gJ的细胞系(293-J3)表达US1-flag的量是原始细胞株293T的6.4倍。

CHO-J细胞系表达US1-flag的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系中US1-flag的表达均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，表达的US1-flag的量最高。

实施例5：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高HIV-1病毒产量中的应用：

1)转染前20h将293-J1，293-J2，293-J3和HEK293T(分别对应图4中的293T-1，293T-2，293T-3)细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取8μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达HIV-1包膜蛋白Env的质粒(pcDNA3.1-Env，QH 0648#1，Qin-xue Huetal，Identification of ENV Determinants in V3 that Influence the MolecularAnatomy of CCR5Utilization.J.Mol.Biol.(2000)302,359±375)和不含包膜蛋白的框架质粒(pNL4-3.Luc.R^-E^-，Connor,R.I.etal.Vpr is required for

cient replicationof human

ciency virus type-1in mononuclear phagocytes.Virology,1995,206,935-944)(2:3质量比，共5ug)稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养72h。

6)收集培养上清，0.45μM滤器过滤。

7)将p24ELISA试剂盒中的96孔板取出，按试剂盒说明书步骤操作。

8)OD₄₅₀读板，以OD₆₅₀做参比。

9)绘制标准曲线，计算样品中p24浓度，比较不同细胞株包装生产病毒的能力差异。

如图4所示，实施例1获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)包装出的HIV-1病毒量均高于原始细胞株293T。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatcggt atgccgttcg gacctggggg attgtgggaa tcctcgggtg tgctgctgtt 60

ggggccgcac ccaccggccc cgcgtccgat acaacaaacg cgaccgcacg cctccccacg 120

caccccccac tcatccgttc cgggggcttt gccgtccccc tcatcgtggg ggggctgtgt 180

ctcatgattc tggggatggc gtgtctactc gaggtcctgc gtcgcctggg tcgcgagttg 240

gcgaggtgct gcccccacgc gggccaattt gccccatga 279

<210> 2

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttatcgataa gcttgggagt tccgcgttac 60

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 120

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 180

ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 240

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 300

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 360

gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 420

aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 480

tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 540

ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 600

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg actctagagg atccatggat cggtatgccg 660

ttcggacctg ggggattgtg ggaatcctcg ggtgtgctgc tgttggggcc gcacccaccg 720

gccccgcgtc cgatacaaca aacgcgaccg cacgcctccc cacgcacccc ccactcatcc 780

gttccggggg ctttgccgtc cccctcatcg tgggggggct gtgtctcatg attctgggga 840

tggcgtgtct actcgaggtc ctgcgtcgcc tgggtcgcga gttggcgagg tgctgccccc 900

atgcgggcca atttgcccca tgagtttaaa cttatctcga ggctcctctc cctccccccc 960

ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 1020

attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1080

cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1140

tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1200

cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1260

tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1320

tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 1380

gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tacacatgct ttacatgtgt 1440

ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1500

aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 1560

gg 1562

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Arg Tyr Ala Val Arg Thr Trp Gly Ile Val Gly Ile Leu Gly

1 5 10 15

Cys Ala Ala Val Gly Ala Ala Pro Thr Gly Pro Ala Ser Asp Thr Thr

20 25 30

Asn Ala Thr Ala Arg Leu Pro Thr His Pro Pro Leu Ile Arg Ser Gly

35 40 45

Gly Phe Ala Val Pro Leu Ile Val Gly Gly Leu Cys Leu Met Ile Leu

50 55 60

Gly Met Ala Cys Leu Leu Glu Val Leu Arg Arg Leu Gly Arg Glu Leu

65 70 75 80

Ala Arg Cys Cys Pro His Ala Gly Gln Phe Ala Pro

85 90

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacgcca tgctgcgcgg actgtgctgc gtgctgctac tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcc aggagatcca cgcccgattc aggagaggag ccagaggagg atccgagatc 120

gtgctgaccc agtcccccgc tacactgtcc ctgtcccctg gagagagggc caccctgtcc 180

tgcagggcta gccagagcgt gtcctcctac ctggcctggt atcagcagaa gcccggccaa 240

gctcccaggc tgctgatcta cgacgcctcc aacagggcca caggcatccc tgccaggttc 300

tccggttctg gttctggcac cgacttcacc ctgaccatct cctccctgga gcccgaggac 360

ttcgccgtgt actactgcca gcagtcctcc aactggccca ggaccttcgg ccagggcacc 420

aaggtggaga tcaagagggg cggcggcggc tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 480

tcccaggtgc agctggtgga gtccggagga ggcgtggtgc aacctggcag gtccctgagg 540

ctggactgca aggcctccgg catcaccttc tccaacagcg gcatgcactg ggtgaggcag 600

gctcctggaa agggcctgga gtgggtggcc gtgatctggt acgacggctc caagaggtac 660

tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc atctccaggg acaactccaa gaacaccctg 720

ttcctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg cgccaccaac 780

gacgactact ggggacaggg caccctggtg accgtgtcct ccgcttccac caaggagagc 840

aagtatggac caccttgccc accatgtcct gcaccagagt ttctgggcgg cccatccgtg 900

ttcctgtttc ctccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc agaggtgaca 960

tgcgtggtgg tggacgtgtc tcaggaggat cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggat 1020

ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag ccaagggagg agcagtttaa ttccacctac 1080

cgcgtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1140

tgcaaggtga gcaataaggg cctgcccagc tccatcgaga agaccatctc caaggcaaag 1200

ggacagccca gggagcctca ggtgtacaca ctgcccccta gccaggagga gatgaccaag 1260

aaccaggtgt ccctgacatg tctggtgaag ggcttctatc cctccgacat cgccgtggag 1320

tgggagtcta atggccagcc tgagaacaat tacaagacca caccacccgt gctggactcc 1380

gatggctctt tctttctgta tagccggctg accgtggata agtccagatg gcaggagggc 1440

aacgtgtttt cttgcagcgt gatgcacgaa gcactgcaca atcactacac tcagaagtcc 1500

ctgtccctgt ccctgggcaa atga 1524

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tggatcggta tgcc 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccgtttaaa ctcatggggc aaattg 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca tggatcggta tgcc 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccgtttaaa ctcatggggc aaattg 26

Claims

1.HSV-2的包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的应用，所述的HSV-2的包膜糖蛋白gJ为SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其应用过程是将含有HSV-2的包膜糖蛋白gJ基因的慢病毒，转导至哺乳动物细胞中，获得稳定表达gJ蛋白的细胞系，然后利用该细胞系表达外源蛋白。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的哺乳动物细胞为人肾上皮细胞系或CHO细胞系。

4.根据权利要求2所述的应用，所述的稳定表达gJ蛋白的细胞系为保藏编号为CCTCCNO:C2021263的人肾上皮细胞293-J或保藏编号为CCTCC NO:C2021264的中国仓鼠卵巢细胞CHO-J。

5.根据权利要求1所述的应用，所述的外源基因包括外泌型蛋白基因，胞内蛋白基因和/或病毒基因。