CN113748776A - 一种快速抑制梨种子nac转录因子表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，包括以下步骤：（1）选种：选取饱满、无病虫害的梨种子；（2）把种子与直径2 cm以下的碎玻璃渣混合放入封口容器中，50r/min轻微震荡30 min；（3）种子在波长为254nm紫外光下照射3 h；（4）种子处理：将种子放入容器中，加入适量清水，并使种子在水中处于持续翻滚状态，水温4℃处理1 d，水温10℃处理1 d，之后保持水温15℃，共5‑15 d；使种子处于持续翻滚状态的方法采用流水冲浸法和浸泡通气法任一种；本方法能够快速抑制梨种子NAC转录因子表达解决了现有的打破梨种子休眠耗时较长的问题，促进播种后实生苗的根系发育，提高幼苗质量。
Description
技术领域
本发明涉及梨栽培领域，具体涉及一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法。
背景技术
梨是蔷薇科梨属植物，叶片多呈卵形，大小因品种不同而各异。花为白色，或略带黄色、粉红色，有五瓣。果实形状有圆形的，也有基部较细尾部较粗的，即俗称的“梨形”；不同品种的果皮颜色大相径庭，有黄色、绿色、黄中带绿、绿中带黄、黄褐色、绿褐色、红褐色、褐色，个别品种亦有紫红色；野生梨的果径较小，在1到4厘米之间，而人工培植的品种果径可达8厘米，长度可达18厘米。
科研与生产中，梨杂交育种需要利用种子进行繁殖选育，梨的砧木一般也采用实生播种进行育苗。有效打破种子休眠、促进种子萌发是这些工作的一项必要前置措施。梨种子休眠的原因主要包括：(1)由于种子过厚、坚硬，阻碍了种子对空气和水分吸收，而抑制发芽，处于休眠状态。对于这类种子采用各种方法去掉种皮，可以打破休眠，促进萌发；(2)种子自身产生某些有毒物质，抑制种子萌发，农业生产上常利用适当浓度的赤霉素等处理，可促进发芽；(3)种子自身基因调控，可通过不同激素处理或RNAi的方法，调控相关基因表达，解除种子休眠。
梨NAC转录因子家族基因是调控种子休眠的关键基因，通过调控NAC65、NAC138基因的表达，可调节梨种子解除休眠。
目前，还没有能够短短几天内即可解除梨种子休眠的适用于大规模生产的方法。采用传统沙藏层积的方法来打破梨种子休眠耗时较长，一般需30-60天；采取化学药剂处理的种子，也得经过一段时间的沙藏层积才能使种子萌发；采用剥除种皮等措施处理种子，操作复杂，严重影响工作效率。现有方法无法高效快速抑制梨种子NAC转录因子表达，不能实现在短时间内打破梨种子休眠、促进种子萌发。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，解决了现有的打破梨种子休眠耗时较长的问题，可促进种播后实生苗的根系发育，提高幼苗质量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其技术要点是，包括以下步骤：
(1)选种：选取饱满、无病虫害的梨种子；
(2)把种子与直径2cm以下的碎玻璃渣等体积混合放入封口容器中，固定于摇床上，50r/min轻微震荡30min；
(3)种子在波长为254nm紫外光下照射3h；
(4)种子处理
将种子放入容器中，加入适量清水，并使种子在水中处于持续翻滚状态，水温4℃处理1d，水温10℃处理1d，之后保持水温15℃，共处理5-15d；
进一步的，使种子处于持续翻滚状态的方法采用流水冲浸法和浸泡通气法任一种；
所述流水冲浸法为：对种子进行流水冲浸，水流速度为1.5-1.8m/s，冲浸过程中种子始终能够浸泡在水中、并处于持续翻滚的状态。
所述浸泡通气法为：对浸泡的种子清水中进行持续通气，通气量为5-15L/min，水中种子保持翻滚的状态。
进一步的，所述流水冲浸的具体方法为：将种子置于三角瓶中，将三角瓶瓶口用两层纱布封口，所述三角瓶上方设有水管，所述水管出水口紧贴三角瓶瓶口纱布外侧，所述水管出水口小于三角瓶瓶口。
进一步的，所述浸泡通气法为：将种子置于三角瓶中，加入大于种子体积20倍的清水，使用加气泵连接通气管，通气管另一端插入浸泡种子的清水中，3天换一次清水，直至种子发芽，所述通气管口直径小于三角瓶瓶口。
进一步的，所述快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法用于快速解除梨种子休眠。
进一步的，所述快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法用于促进播种后实生苗的根系发育，播种方法为：流水冲浸或浸泡通气的种子萌芽后，胚根长约0.5cm时，将种子播种到含水量60％-70％的基质(草炭土与蛭石的体积比为3：1)中，表面覆盖1cm厚的基质，直至幼苗长成。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过流水冲浸或浸泡通气处理种子，快速抑制梨种子NAC转录因子(基因NAC65、NAC138)的表达。种子可在处理开始后5-7天内即可出现萌发的种子，所有萌发的种子中有90％以上可在开始处理后15天内萌发，NAC转录因子(基因NAC65、NAC138)的表达量比处理前均降低90％以上。
(2)采用本发明处理的种子萌发后幼苗根系生长较快，根系长度和粗度分别比常规沙藏层积处理的种子萌发后30天幼苗的根系长度增长1-2cm，增粗0.1-0.3mm。
(3)本发明所述方法简单、经济、不受季节、气候、自然灾害等因素的影响，利用这种技术可快速强烈抑制梨种子NAC转录因子(基因NAC65、NAC138)基因的表达，极大缩短打破梨种子休眠所需时间，提高幼苗质量，既可适时为设施内提前育苗提供已解除休眠的的种子，又可随时为以梨幼苗为材料的科研试验提供试材，对提升梨砧木培育和杂交育种效率具有重要意义。
附图说明
图1为所述流水冲浸法原理图；
图2为所述浸泡通气法原理图。
具体实施方式
实施例1一种快速抑制梨种子NAC65、NAC138基因表达的方法包括以下步骤：
(1)选种：选取饱满、无病虫害的梨种子；
(2)把种子与直径2cm以下的碎玻璃渣等体积混合放入封口容器中，固定于摇床上，50r/min轻微震荡30分钟；
(3)种子在254nm波长的紫外光下照射3小时；
(4)流水冲浸
将种子进行流水冲浸，水流速度为1.5-1.8m/s，水温4℃冲浸1天，水温10℃冲浸1天，之后保持水温15℃的条件冲浸，冲浸过程中种子始终能够浸泡在水中并处于翻滚的状态，直至种子发芽。
具体方法可以为：把种子装于100ml三角瓶中，三角瓶用两层纱布封口，纱布主要性能指标符合YY0331-2006标准规定；利用支架将三角瓶固定在水管出水口处，水管出水口紧贴三角瓶瓶口，所述水管出水口小于三角瓶瓶口；打开水管，水流速度为1.5-1.8m/s，以能保持种子在水中浸泡并一直受到水流冲击，流水进入三角瓶内再从瓶口溢出(见图1)；水温4℃冲浸1天，水温10℃冲浸1天，之后保持水温15℃的条件冲浸；冲浸种子溢出的水回收于集水槽中，用于后期幼苗的灌溉用水。
实施例2一种快速抑制梨种子NAC65、NAC138基因表达的优化方法包括以下步骤：
(1)选种：选取饱满、无病虫害的梨种子；
(2)把种子与直径2cm以下的碎玻璃渣等体积混合放入封口容器中，固定于摇床上，50r/min轻微震荡30min；
(3)种子在254nm波长的紫外光下照射3h；
(4)清水浸泡加通气
将种子浸泡于自身体积20倍以上的清水中，容器可以选用100ml三角瓶，瓶口敞开，使用12V 4500R加气泵链接30cm长、内径4mm粗的塑料通气管，塑料通气管管口直径小于三角瓶口直径，塑料通气管另一头通入浸泡种子的清水中，加气泵通电后给清水中持续加气，保证水中种子保持翻滚的状态(见图2)；水温4℃处理1天，水温10℃处理1天，之后保持水温15℃的条件处理，3天换一次清水，直至种子发芽；通气量范围5-15L/min，保证种子翻滚且不能将水吹溢出。
实施例3不同处理方法对打破梨种子休眠的影响
种子处理包括：
处理A：实施例1
处理B：实施例2
处理C：传统沙藏层积，参照《NYT2681-2015-梨苗木繁育技术规程》中“5.4砧木种子的层积处理”。
处理D：参照网络上水稻催芽的方法，浸种时不要将种子一直泡在水里，白天浸种、夜晚捞出摊开，如此反复。
种子发芽即表明已打破休眠。
表1不同处理方法对打破梨种子休眠的影响
实施例4不同处理方法对梨种子NAC65、NAC138基因表达量的影响种子处理方法同实施例3。
分别选用处理前和处理后15天的种子为试材，测定NAC65、NAC138基因表达量。处理D中处理后种子死亡，失去价值。基因特异性引物设计和表达量测定方法参照论文《NACs在豆梨种子发育和休眠解除过程中的作用研究及应用》(孙娅，2019)中PpNAC65、PpNAC138基因的引物序列和表达量测定方法。
表2不同处理方法对种子NAC65、NAC138基因表达量的影响
测定结果表明，与传统沙藏层积相比，实施例1和实施例2对梨种子的处理方法能够快速降低种子NAC65、NAC138基因表达量，进而加速打破种子休眠。
实施例5不同处理方法对梨幼苗根系生长的影响
种子处理方法同实施例3。
将处理后的种子胚根长约0.5cm时，播种到基质中(草炭土：蛭石＝3：1)，30天后，测量根系长度和茎(或胚轴)下端根粗度(平均值)。处理D种子死亡，失去价值。
表3不同处理方法对幼苗根系生长的影响
根系长度和茎(或胚轴)下端根粗度测量结果表明：与传统沙藏层积相比，实施例1和2的种子处理对种播的实生苗根系发育具有明显的促进作用，实生苗根系发育情况是幼苗质量的重要指标，因此，实施例1和2种子处理方法有助于提高种播实生苗的幼苗质量。
本发明的原理：
梨NAC转录因子(基因NAC65、NAC138)的高表达是保持梨种子处于休眠状态的主要内在原因之一，本方法针对现实存在的打破梨种子休眠耗时较长、不易精准掌握的这一问题，提出一种能够快速抑制梨NAC65、NAC138基因表达、打破梨种子休眠、促进播种实生苗根系生长的方法，对于梨产业发展具有重大意义。
Claims (6)
1.一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）选种：选取饱满、无病虫害的梨种子；
（2）把种子与直径2 cm以下的碎玻璃渣混合放入封口容器中，50r/min轻微震荡30min；
（3）种子在波长为254nm紫外光下照射3 h；
（4）种子处理
将种子放入容器中，加入清水，并使种子在水中处于持续翻滚状态；水温4℃处理1 d，水温10℃处理1 d，之后保持水温15℃，共处理5-15 d。
2.根据权利要求1所述的一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是：所述步骤（4）中使水中种子处于持续翻滚状态的方法包括流水冲浸法和浸泡通气法任一种；
所述流水冲浸法为：对种子进行流水冲浸，水流速度为1.5-1.8 m/s，冲浸过程中种子始终能够浸泡在水中、并处于持续翻滚的状态；
所述浸泡通气法为：对清水进行持续通气，通气量为5-15 L/min，通气过程中种子始终能够浸泡在水中、并处于持续翻滚的状态。
3.根据权利要求1所述的一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是：所述快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法用于快速解除梨种子休眠。
4.根据权利要求1所述的一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是：所述快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法用于促进播种后实生苗的根系发育。
5.根据权利要求2所述的一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是：所述流水冲浸的方法为：把种子置于三角瓶中，将三角瓶瓶口用两层纱布封口，所述三角瓶上方设有水管，所述水管出水口紧贴三角瓶瓶口纱布上方，所述水管出水口小于三角瓶瓶口。
6.根据权利要求2所述的一种快速抑制梨种子NAC转录因子表达的方法，其特征是：所述浸泡通气法为：将种子置于三角瓶中，加入大于种子体积20倍的清水中，使用加气泵连接通气管，通气管另一端插入浸泡种子的清水中，通气管管口直径小于三角瓶瓶口直径，3d换一次清水，直至种子发芽。
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