CN113747903A - 胶质母细胞瘤干细胞的核心主调节子 - Google Patents

胶质母细胞瘤干细胞的核心主调节子 Download PDF

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Abstract

提供了抑制胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法、治疗患有胶质母细胞瘤的对象的方法，以及将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法。

Description

胶质母细胞瘤干细胞的核心主调节子
联邦政府资助的研究或开发
本发明是在国立卫生研究院(National Institute of Health，NIH)授予的政府支持K08CA160824下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
GBM是由星形胶质细胞(构成脑的“胶状(glue-like)”或支持性组织的星形细胞)产生的异质性肿瘤。胶质母细胞瘤通常含有多种细胞类型。对于这些肿瘤，并不罕见的是其含有囊性矿物、钙沉积物、血管或多种级别的细胞并由充足的供血滋养。治疗患有胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)患者的最新进展仅产生了不太多的存活益处，很少有长期存活者。迫切需要新的有效且安全的治疗来改善GBM患者的结局。
发明概述
提供了用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面中，癌症是胶质母细胞瘤(GBM)。
在一个实施方案中，通过将选自以下的至少一种主调节子(master regulator)引入到细胞中来将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(glioblastoma stem-like cell，GSC)的方法：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
在另一个实施方案中，通过施用抑制或降低选自以下的至少一种主调节子的表达的免疫治疗组合物来抑制胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
在另一方面中，通过施用抑制或降低选自以下的至少一种主调节子的表达的免疫治疗组合物来治疗对象的胶质母细胞瘤的方法：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN、或OTP。
在另一个实施方案中，用于治疗患有胶质母细胞瘤的对象的免疫治疗组合物，其包含NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP中至少一种的抑制剂。
附图简述
因此已经概括地描述了本发明，现在将参考附图，这些附图不一定按比例绘制。
图1示出了使用GeneRep-nSCORE鉴定的GSC的主调节子。
图2示出了与快周期(fast cycling)GSC相比，NKX6-2优选地在慢周期(slowcycling)GSC中表达。ASCL1在两种GSC群中均表达。我们使用快周期和慢周期GSC作为模型，探索了ASCL1和NKX6.2在GSC增殖和存活中的功能。
图3示出了NKX6.2对于慢周期GSC是必需的，但对于快周期GSC并不是。
图4示出了用ASCL1、BASP1、MYCN、SOX8(ABMNS)将星形胶质细胞部分重编程为GSC。
图5示出了将星形胶质细胞重编程为GSC的主调节子。
图6示出了GSC中主调节子的表达。
图7示出了主调节子的敲低导致GSC死亡。
图8示出了主调节子的敲低导致GSC死亡。
图9示出了主调节子的敲低导致GSC死亡。
图10示出了主调节子的双敲低(double knockdown)导致GSC死亡。
图11示出了主调节子的单敲低(single knockdown)和双敲低导致GSC死亡。
图12示出了在施用了具有主调节子的部分敲低的GSC细胞的小鼠中的存活曲线。
定义
“主调节子”或“癌症主调节子”是这样的基因或蛋白质：其在途径或网络中起驱动一种或更多种中间基因或蛋白质的作用、对于启动或维持癌性状态或者启动或维持一种或更多种有害癌性行为很重要。一些主调节子参与了向癌症状态转换中的途径。
“主调节子网络”是指主调节子和主调节子下游的转录水平依赖于主调节子或受主调节子影响的一个或更多个基因。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物形式，包括编码的和非编码的氨基酸以及化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸。该术语包括已被修饰的聚合物，例如具有经修饰肽骨架的多肽。
认为蛋白质具有“N端”和“C端”。术语“N端”涉及蛋白质或多肽的起始(start)，由具有游离胺基(-NH2)的氨基酸终止。术语“C端”涉及氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端(end)，由游离羧基(-COOH)终止。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合物形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或经修饰形式。其包括单链、双链和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
认为核酸具有“5’端”和“3’端”，因为单核苷酸以这样的方式反应生成寡核苷酸：使得一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸通过磷酸二酯键与与其方向相同的相邻的3’氧连接。如果寡核苷酸一端的5’磷酸未与单核苷酸戊糖环的3’氧连接，则寡核苷酸的该端称为“5’端”。如果寡核苷酸一端的3’氧未与另一单核苷酸戊糖环的5’磷酸连接，则寡核苷酸的该端称为“3’端”。即使核酸序列在更大的寡核苷酸内部，也认为该核酸序列具有5’和3’端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为“下游”或3’元件的“上游”或5’。
“密码子优化”是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在特定宿主细胞中增强表达的过程。例如，可以修饰编码融合多肽的多核苷酸以替换在给定宿主细胞中与天然存在的核酸序列相比具有更高使用频率的密码子。密码子使用表是容易获得的，例如在“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”中。单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)使用的每个氨基酸的最佳密码子示出在US 2007/0207170中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。这些表可以以多种方式进行调整。参见Nakamura et al.(2000)Nucleic Acids Research 28：292，其出于所有目的通过引用整体并入本文。用于特定序列的密码子优化以在特定宿主中表达的计算机算法也是可获得的(参见，例如GeneForge)。
两个多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗上进行比对以获得最大对应时在两个序列中相同的残基。当提及蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸替换而不同，在那里氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基替换，并因此不会改变分子的功能特性。当序列的保守替换不同时，可以向上调整序列同一性百分比以纠正替换的保守性质。因这样的保守替换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这样的调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及对作为部分错配而不是完全错配的保守替换进行评分，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸评分为1而非保守替换评分为0的情况下，保守替换的评分为0至1。计算保守替换的评分，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实现的那样。
“序列同一性百分比”是指通过在比较窗内比较两个最佳对齐的序列(最多数目的完美匹配残基)而确定的值，其中比较窗中的多核苷酸序列部分与用于两个序列的最佳对齐的参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。除非另有说明(例如，较短序列包含连接的异源性序列)，否则比较窗是被比较的两个序列中较短序列的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版使用以下参数获得的值：使用GAP Weight为50和Length Weight为3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列同一性％和相似性％；使用GAP Weight为8和Length Weight为2以及BLOSUM62评分矩阵的氨基酸序列同一性％和相似性％；或其任何等效程序。“等效程序”包括任何序列比较程序，所述比较程序当与GAP第10版生成的相应对齐进行比较时，对于所讨论的任何两个序列生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的对齐和相同的序列同一性百分比。
术语“保守氨基酸替换”是指通常存在于具有相似尺寸、电荷或极性的不同氨基酸的序列中的氨基酸替换。保守替换的一些实例包括用非极性(疏水性)残基(例如，异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸)替换另一个非极性残基。同样地，保守替换的一些实例包括用一个极性(亲水性)残基替换另一个，例如，精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间，或甘氨酸和丝氨酸之间。另外，用碱性残基(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)替换另一个，或者用一个酸性残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)替换另一个酸性残基是保守替换的另外的一些实例。非保守替换的一些实例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基(例如，异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸)替换极性(亲水性)残基(例如，半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)和/或用极性残基替换非极性残基。典型的氨基酸分类总结如下：
Figure BDA0003289523150000051
“同源”序列(例如核酸序列)是指与已知的参考序列相同或基本上相似的序列，使得其与已知的参考序列具有例如至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
当提及蛋白质时，术语“片段”意指比全长蛋白质更短或具有更少氨基酸的蛋白质。当提及核酸时，术语“片段”意指比全长核酸更短或具有更少核苷酸的核酸。片段可以是，例如N端片段(即去除蛋白质的C末端的部分)、C端片段(即去除蛋白质的N末端的部分)或内部片段。片段还可以是例如功能片段或免疫原性片段。
术语“体外”是指人工环境以及在人工环境(例如试管)中发生的过程或反应。
术语“体内”是指天然环境(例如细胞或生物体或身体)以及在天然环境中发生的过程或反应。
“包含”或“包括”一种或更多种列举的要素的组合物或方法可包括未具体列举的其他要素。例如，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可以含有仅蛋白质或与其他成分组合的蛋白质。
值的范围的指定包括该范围内的或定义该范围的所有整数，以及由该范围内的整数定义的所有子范围。
除非上下文中另有明显说明，否则术语“约”涵盖在指定值的标准测量误差(例如SEM)范围内的值或与指定值相差±0.5％、1％、5％或10％的值。
除非上下文另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。例如，术语“抗原”或“至少一种抗原”可包括多种抗原，包括其混合物。
有统计学意义意指p＜0.05。
发明详述
现在将在下文中更全面地描述本发明的多种实施方案，其中示出了本发明的一些但不是所有实施方案。实际上，这些发明可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文中所阐述的一些实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。除非另有说明，否则术语“或/或者”在本文中以替代和连接意义使用。术语“说明性”和“示例性”被用作没有质量水平指示的示例。
胶质母细胞瘤(GBM)是最常见且致命的成人脑癌形式。GBM由GBM干细胞样细胞(GSC)形成，GBM干细胞样细胞(GSC)是肿瘤复发的主要促成因素和治疗剂开发的天然焦点。造成治疗失败的主要原因有两个：1)细胞异质性和分子异质性高；2)GSC具有需要同时靶向的多个冗余途径。
本文中描述了关于多种实施方案的细节。作为背景，GBM富含GBM干细胞样细胞(GSC)，其是肿瘤复发的主要促成因素。GSC和正常的神经前体细胞(neuronal precursorcell，NPC)在干细胞条件下培养时都具有形成神经球的能力。然而，当体内植入(例如体内致瘤)时，只有GSC可以再生肿瘤中的所有癌细胞。GSC也可以分化为脑的其他细胞，然而这些细胞与NPC产生的细胞相比通常没有功能。在GBM小鼠模型中，通过遗传方式消除自我更新导致GSC丢失和存活延长。然而，与其他癌症一样，靶向GSC一直是一个挑战，因为缺乏仅对GSC具有特异性而对NPC或正常脑细胞没有特异性的主调节子。GSC的细胞起源尚不清楚；NPC和正常星形胶质细胞(normal astrocyte，NA)均已显示出对GSC有贡献。因此，GSC中的数种存活和生长信号与NPC和NA中的享有相似性，从而提高了靶向这些途径的治疗的潜在毒性。这些靶标中的许多是具有重叠功能的下游信号传导节点，使它们能够补偿彼此的阻断。另一个挑战是GSC区室中的高肿瘤内和肿瘤间异质性，这需要开发可以靶向许多肿瘤内和许多肿瘤间的不同亚克隆的大多数(如果不是全部)级分的治疗。近期的基因组学研究表明，与其他癌症一样，GBM起源于始发(founding)GSC克隆，该克隆在维持一系列初始和协作改变之后出现，进行传递使得所有亚克隆都含有始发改变(即核心的共同主调节子)，并因此是可靶向的。由于潜在的始发改变的数目出奇地少，因此预期许多始发改变在相同类型或甚至不同类型的不同肿瘤中是共同的。
始发改变可能会在全局基因调控网络上产生“印记”，随着始发克隆转变为亚克隆，所述“印记”可持续存在，并且在亚克隆间是可追踪的。然而，了解这些基因组改变的生物学意义需要新的询问大规模基因表达谱的分析工具来提供关于由始发改变和肿瘤微环境之间相互作用导致的癌细胞行为的信息。然后可以使用基因表达谱来推断控制这样的行为的全局和局部网络。这可以使用旨在扩大到哺乳动物细胞复杂性的逆向工程工具(例如ARACNe(用于重建精确细胞网络的算法))来实现。ARACNe应用理论信息方法来使用基因表达数据通过计算互信息(Mutual Information，MI)来推断基因网络。
在一些实施方案中，两个计算引擎GeneRep和nSCORE分别用于优化ARACNe的使用和对任何网络中的主调节子进行定量排名。通过与多向(multi-pronged)的化合物筛选方案相结合，该策略得到了极大的增强。
基因网络的主调节子的鉴定
GeneRep和nSCORE解决了计算生物学中的两个困难：如何设置阈值截止水平以使灵敏度最大化同时使假发现率(false discovery rate，FDR)最小化，以及如何并入已知各自影响网络层级的多种排名参数。GeneRep采用引导法(bootstrapping)与来自真实数据的随机网络生成程序的创新性结合。GeneRep在基因水平生成的网络包含约20,000个节点，而在转录水平生成的网络包含约50,000个节点。边的数目范围为300,000至100万，远高于当前方法通常获得的数目。nSCORE创建了自动节点重要性评分框架，该框架并入了无限的现有参数集，并因此可以应用于任何类型的网络和节点统计输入。GeneRep-nSCORE在WO-2018/069891中进行了描述，其通过引用整体并入。
主调节子的鉴定和靶向工作流整合了优化成功的关键方面：在信号传导网络的顶点快速鉴定GSC特异性主调节子的GeneRep-nSCORE；识别GSC亚克隆中共同的主调节子的肿瘤内和肿瘤间异质性分析；捕获额外的相关主调节子的突变和存活分析；结合了计算机的(in silico)和超高通量功能性筛选的双向的化合物筛选平台；从手术到药物鉴定的临床时间框架的评价；以及用于GSC治疗响应的定量、基于网络的预测生物标志物的开发。
我们之前在WO2018/211409中阐明了BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1在将AST重编程为GSC中的作用，其整体并入本文。
在此，我们公开了在将AST重编程为GSC中发挥作用的另外的基因。图5示出了排名靠前的基因：ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、OLIG2、RXRG、ZNF248、KCNIP3、NMI、NKX2-2、ACTN2、DDN、PEG3、OTP、BHLHE40、HLF、ATP5J2、CEBPB、TBX2、SOX10、SOD2、HOXA13、HOXD3、POU4F1、ATOH7、VDR、IL31RA、ASCL1、HOXD13、ATP5B、BATF2、PARGC1B、HOXA11、RPH3A、ETV1、THRB和MNX1。
此外，我们仔细研究了参与将星形胶质细胞重编程为GSC的主调节子的子集，即MEOX2、PRKCB、DDN、ETV4、MLXIPL和OTP，与ASCL1、BASP1、MYCN、NKX6-2和SOX8组合(图6)。选择这些主调节子，因为它们在GSC和GBM分化细胞(GBM differentiating cell，GDC)之间具有最大的倍数变化，或者因为它们在多个样品和患者间在排名靠前的基因中出现的频率最高。
NKX2-2(NK2同源异形框2)编码含有同源异形框结构域的蛋白质，并且可参与中枢神经系统的形态发生。与NKX2-2相关的疾病包括青年成年型糖尿病(Maturity-OnsetDiabetes Of The Young)和脑神经恶性肿瘤。其相关途径包括发育生物学和胚胎和诱导多能干细胞分化途径和谱系特异性标志物。
MEOX2(Mesenchyme同源异形框2)是蛋白质编码基因。与MEOX2相关的疾病包括女性压力性尿失禁和低顺应性膀胱。与该基因相关的基因本体论(Gene Ontology，GO)注释包括DNA结合转录因子活性和RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合。
PRKCB(Protein Kinase C Beta，蛋白激酶Cβ)是丝氨酸和苏氨酸特异性蛋白激酶的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)家族的成员，其可通过钙和第二信使二酰甘油激活。PKC家族成员使广泛多种的蛋白质靶标磷酸化，并且已知参与多种细胞信号传导途径。PKC家族成员也充当佛波酯(一类促癌剂)的主要受体。PKC家族的每个成员都有特定的表达谱，并被认为在细胞中发挥着独特的作用。该基因编码的蛋白质是PKC家族成员之一。已经报道了这种蛋白激酶参与许多不同的细胞功能，如B细胞活化、细胞凋亡诱导、内皮细胞增殖和肠的糖吸收。小鼠中的研究还表明，这种激酶还可以调节神经元功能，并与应激后恐惧诱发的冲突行为相关联。
DDN(Dendrin)是蛋白质编码基因。DDN蛋白与促进肾血管球足细胞细胞凋亡相关。
ETV4(ETS变体转录因子4)是蛋白质编码基因。与ETV4相关的疾病包括尤因肉瘤(Ewing Sarcoma)和骨外尤文肉瘤(Extraosseous Ewing Sarcoma)。其相关通路包括癌症中的转录误调和RET信号传导。
MLXTPL(MLX相互作用蛋白质样)编码Myc/Max/Mad超家族的基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子。这种蛋白质形成异二聚体复合体，并以葡萄糖依赖性方式结合和激活甘油三酯合成基因启动子中的碳水化合物应答元件(carbohydrate response element，ChoRE)基序。该基因在Williams-Beuren综合征中缺失，该综合征是由染色体7ql1.23处的邻接基因缺失引起多系统发育障碍。
OTP(Orthopedia同源异形框)编码同源异形域(homeodomain，HD)家族的成员。HD家族蛋白质是螺旋-转角-螺旋转录因子，其在细胞命运特化中发挥关键作用。
在一些实施方案中，通过将选自以下的至少一种主调节子引入到细胞中来将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将选自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP，并且还包括将来自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。
在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将选自以下的至少两种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP，并且还包括将来自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：BASPl、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将选自以下的至少3、4、5、6或7种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP，并且还包括将来自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。
在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将选自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP，并且还包括将来自以下的至少两种主调节子引入到细胞中：BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将选自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP，并且还包括将来自以下的至少3、4、5、6、7或8种主调节子引入到细胞中：BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。
在一些实施方案中，将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法：其通过将NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP引入到细胞中，并且还包括将BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1引入到细胞中。
治疗方法
当前公开的主题提供了主调节子，例如NKX2-2、MEOX2、PRKCB、DDN、ETV4、MLXIPL和OTP，这些调节子在被抑制时可以降低或抑制GSC。在一些实施方案中，对这些主调节子中的至少一种的抑制可用于抑制GSC。在一些实施方案中，对这些主调节子中的至少两种的组合的抑制可用于抑制GSC。在一些实施方案中，对这些主调节子中的至少一种的抑制可用于治疗患有胶质母细胞瘤的对象。在一些实施方案中，对这些主调节子中至少两种的组合的抑制可用于治疗患有胶质母细胞瘤的对象。在一些实施方案中，当前公开的主题提供了通过将本文中公开的主调节子的组合引入到细胞中来将正常的人星形胶质细胞重编程为GSC的方法。在一些实施方案中，对主调节子NKX2-2、MEOX2、PRKCB、DDN、ETV4、MLXIPL和OTP的组合的抑制可用于抑制GSC或用于治疗胶质母细胞瘤的治疗方法中。
在一些实施方案中，抑制GSC或治疗胶质母细胞瘤的方法包括使用或施用针对本文中公开的主调节子中的单个或组合的免疫治疗组合物。还提供了靶向本文中公开的至少一种主调节子的免疫治疗组合物。在一个实施方案中，免疫治疗组合物包含来源于本文中公开的至少一种主调节子的肽制剂。在一个实施方案中，免疫治疗组合物包含含有来源于本文中公开的至少一种主调节子的肽的纳米粒或树突细胞。在一个实施方案中，免疫治疗组合物包含编码本文中公开的至少一种主调节子的RNA。在一个实施方案中，免疫治疗组合物包含含有编码本文中公开的至少一种主调节子的RNA的纳米粒或树突细胞。在一个实施方案中，编码主调节子的RNA被电穿孔到树突细胞中。
还提供了抑制本文中公开的至少一种主调节子的药物组合物。在一个实施方案中，抑制剂是RNA干扰剂或小分子。
在一个实施方案中，组合物的递送是通过直接注射到大脑中。在一个实施方案中，递送是通过基因治疗，例如通过腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)或逆转录病毒复制载体(retroviral replication vector，RRV)载体。在一个实施方案中，递送是通过全身性静脉递送。
在一些实施方案中，我们描述了治疗癌症的方法，其包括抑制一种或更多种主调节子。抑制一种或更多种主调节子可包括使用或施用一种或更多种主调节子拮抗剂或抑制剂。可以在基因水平抑制主调节子，例如通过使用或施用RNA干扰剂或反义寡核苷酸来抑制基因的表达。可以在蛋白质水平抑制主调节子，例如通过使用或施用与主调节子蛋白质结合并抑制蛋白质活性的免疫治疗组合物或者通过使用或施用已知抑制主调节子蛋白质活性的小分子药物。在一些实施方案中，我们描述了治疗癌症的方法，其包括使用或施用针对主调节子蛋白质或主调节子蛋白质组合的免疫治疗组合物。免疫治疗组合物可包含对一种或更多种主调节子具有亲和力的一种或更多种抗体。抗体可以是但不限于免疫球蛋白、对主调节子具有亲和力的免疫球蛋白片段、嵌合抗体、双特异性抗体、抗体缀合物等。
在一些实施方案中，免疫治疗组合物包含来源于主调节子的肽制剂。肽可以是主调节子蛋白质的免疫原性片段。肽可以与免疫刺激佐剂组合。免疫治疗组合物可以在存在或不存在佐剂的情况下局部(例如皮下)或全身性(例如静脉内)施用。免疫治疗组合物可用于刺激免疫系统以产生特异性针对主调节子的免疫反应。免疫反应的产生可以消除或帮助消除表达主调节子的癌细胞。
在一些实施方案中，我们描述了治疗癌症的方法，其包括使用或施用一种或更多种小分子药物来抑制主调节子蛋白质或主调节子蛋白质组合的活性。在一些实施方案中，该方法包括施用靶向与癌症相关的一种或更多种主调节子的免疫治疗组合物、小分子、RNA干扰剂、反义寡核苷酸或其组合。
在一些实施方案中，我们描述了治疗癌症的方法，其包括使用或施用一种或更多种反义寡核苷酸或RNA干扰剂来敲低主调节子基因或主调节子基因组合的表达。反义寡核苷酸是具有允许与靶标核酸的相应区域或片段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。RNA干扰剂是寡核苷酸，其通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)途径以序列特异性方式介导RNA转录物的靶向切割。
在一些实施方案中，我们描述了治疗癌症的方法，其包括使用或施用一种或更多种主调节子拮抗剂或抑制剂的组合。
在一个实施方案中，主调节子是NKX2-2。在一个实施方案中，NKX2-2具有SEQ IDNo：2或NG_042186.1的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用NKX2-2的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向NKX2-2的抑制剂靶向SEQ ID No：2或NG_042186.1或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是MLXIPL。在一个实施方案中，MLXIPL具有SEQ IDNo：4、6、8、10或NG_009307.1的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用MLXIPL的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向MLXIPL的抑制剂靶向SEQ ID No：4、6、8、10、NG 009307.1或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是ETV4。在一个实施方案中，ETV4具有SEQ ID No：12、14、16、18、20或NC_000017.11的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用ETV4的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向ETV4的抑制剂靶向SEQID No：12、14、16、18、20、NC_000017.11或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是MEOX2。在一个实施方案中，MEOX2具有SEQ ID No：22或NG_032988.1的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用MEOX2的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向MEOX2的抑制剂靶向SEQ ID No：22或NG_032988.1或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是PRKCB。在一个实施方案中，PRKCB具有SEQ ID No：24或26或NG_029003.2的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用PRKCB的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向PRKCB的抑制剂靶向SEQ ID No：24或26或NG_029003.2或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是DDN。在一个实施方案中，DDN具有SEQ ID No：28或NC_000012.12的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用DDN的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向DDN的抑制剂靶向SEQ ID No：28或NC_000012.12或其片段。
在一个实施方案中，主调节子是OTP。在一个实施方案中，OTP具有SEQ ID No：30或NC_000005.10的序列。在一个实施方案中，通过向有此需要的对象施用OTP的抑制剂来治疗癌症或肿瘤的方法。在一个实施方案中，靶向OTP的抑制剂靶向SEQ ID No：30或NC_000005.10或其片段。
在一个实施方案中，治疗患有癌症或肿瘤的对象的方法包括施用包含本文中公开的至少一种主调节子的抑制剂的组合物。在一个实施方案中，主调节子选自：NKX2-2、MEOX2、PRKCB、DDN、ETV4、MLXIPL和OTP。
在一个实施方案中，治疗患有癌症或肿瘤的对象的方法。在一个实施方案中，癌症或肿瘤是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，肿瘤是神经胶质瘤。在一个实施方案中，肿瘤来自脑。在一个实施方案中，癌症或肿瘤是非小细胞肺癌或其中细胞类型来自神经外胚层(neurodectoderm)的癌症。
实施例
实施例1：慢周期GSC与快周期GSC的主调节子的鉴定
有两种不同的GSC群，慢周期和快周期。慢周期GSC是缓慢分裂的，但其会产生快速分裂的快周期GSC。快周期GSC更容易受到治疗剂的影响，因为其是靶标快速分裂的。因此，靶向慢周期GSC会破坏肿瘤，因为慢周期GSC会补充因癌症治疗剂而相继死亡的快速分裂的GSC。
在此，我们探索GSC主调节子NKX6.2和ASCL1，以及表达对于调节慢周期GSC或快周期GSC或两者是否是特异性的。我们显示NKX6.2优先表达并且是慢周期GSC所必需的，但不是快周期GSC所必需的(图2和3)。由于慢周期GSC会产生快周期GSC，并且是肿瘤生长和维持所必需的，因此NKX6.2是通过特异性靶向慢周期GSC来治疗GBM的有前景的靶标。例如，抑制NKX6.2的表达(例如通过遗传手段(si/shRNA)或小分子抑制剂)可具有作为特异性靶向慢周期GSC的GBM治疗的显著治疗潜力，并且对于干细胞享有相似调节途径的其他癌症也可能具有显著治疗潜力。
主调节子是位于基因网络前端的基因，其可以改变网络中下游基因的表达。应用了串联计算平台GeneRep-nSCORE，其整合了大规模基因表达谱与基因组变化整合以鉴定跨越大多数(如果不是全部)GSC克隆的GSC的共同始发主调节子，我们在GCS中发现了一组共同的主调节子，其对于临床开发是出色靶标。
实施例2：体外单敲低和双敲低实验
我们将GeneRep-nSCORE平台应用于GSC和GBM分化细胞(GDC)、正常的神经前体细胞(NPC)和正常的人星形胶质细胞(normal human astrocyte，NHA)的基因表达谱，并预测了参与这些细胞类型之间命运转换的靠前基因。
在此，我们仔细研究了主调节子的一个子集：MEOX2、PRKCB、ETV4以及NKX6-2。
我们使用了编码对一种或两种主调节子有特异性的shRNA的慢病毒，并转导了3个独立的患者来源的GSC系。这些结果证实，无论通过遗传手段(si/shRNA)还是或许小分子抑制剂，对一种或两种主调节子的有效抑制具有作为GBM的GSC特异性治疗的显著治疗潜力，并且对于干细胞享有相似调节途径的其他癌症也可能具有显著治疗潜力。
图8至11示出了体外敲低实验的结果。图8和图9示出了MEOX2、PRKCB或ETV4的单敲低导致了GSC死亡。图10和11示出了MEOX/PRKCB、MEOX/ETV4或MEOX/NKX6-2的双敲低导致了GSC死亡。
这些实验在3种个体患者来源的GSC细胞系(CA7、R24-03或R24-01)中进行且结果相同。总之，这些发现表明这些主调节子可以充当重要的药理学靶标，并且可以降低致瘤性(即降低肿瘤尺寸或肿瘤数目)。
实施例3：小鼠中的体内实验
在小鼠中在体内测试了MEOX2和PRKCB、MEOX2和ETV4、MEOX2和NKX6.2以及ASCL1和NKX6.2的组合。
我们在小鼠的异种移植肿瘤中使用慢病毒shRNA耗竭了主调节子的不同组合。对照shRNA含有杂乱序列(scrambled sequence)。这些异种移植物来源于数个已用生物发光标记的GSC系。
实验小鼠中的复发性肿瘤是从未耗竭主调节子的细胞生长的。这表明有效耗竭是至关重要的。
结果示于图12中。MEOX2和PRKCB显示存活提高。R24-01是持续存在的，其中所有存活的小鼠直到第450天都没有显示出疾病的迹象。
序列简述
随附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示。核苷酸序列遵循从序列的5’端开始并行进(即每行从左到右)至3’端的标准惯例。每个核苷酸序列仅显示一条链，但互补链被理解为包括在对示出链的任何引用中。氨基酸序列遵循从序列的氨基端开始并行进(即在每行中从左到右)到羧基端的标准惯例。
NKX2-2 RNA(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0003289523150000161
Figure BDA0003289523150000171
NKX2-2蛋白质(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003289523150000172
MLXIPL RNA异形体α(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0003289523150000173
Figure BDA0003289523150000181
MLXIPL蛋白质异形体α(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0003289523150000182
MLXIPL RNA异形体β(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0003289523150000183
Figure BDA0003289523150000191
MLXIPL蛋白质异形体β(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0003289523150000192
MLXIPL RNA异形体γ(SEQ ID NO：7)
Figure BDA0003289523150000201
Figure BDA0003289523150000211
MTXTPL蛋白质异形体γ(SEQ ID NO：8)
Figure BDA0003289523150000212
MLXIPL RNA异形体δ(SEQ ID NO：9)
Figure BDA0003289523150000213
Figure BDA0003289523150000221
MLXIPL蛋白质异形体δ(SEQ ID NO：10)
Figure BDA0003289523150000222
ETV4 RNA异形体1(SEQ ID NO：11)
Figure BDA0003289523150000223
Figure BDA0003289523150000231
ETV4蛋白质异形体1(SEQ ID NO：12)
Figure BDA0003289523150000232
ETV4 RNA异形体2(SEQ ID NO：13)
Figure BDA0003289523150000233
Figure BDA0003289523150000241
ETV4蛋白质异形体2(SEQ ID NO：14)
Figure BDA0003289523150000242
ETV4 RNA 异形体3(SEQ ID NO：15)
Figure BDA0003289523150000243
Figure BDA0003289523150000251
ETV4蛋白质异形体3(SEQ ID NO：16)
Figure BDA0003289523150000252
ETV4 RNA异形体4(SEQ ID NO：17)
Figure BDA0003289523150000253
Figure BDA0003289523150000261
ETV4蛋白质异形体4(SEQ ID NO：18)
Figure BDA0003289523150000262
ETV4 RNA异形体5(SEQ ID NO：19)
Figure BDA0003289523150000263
Figure BDA0003289523150000271
ETV4蛋白质异形体5(SEQ ID NO：20)
Figure BDA0003289523150000272
MEOX2 RNA( SEQ ID NO：21)
Figure BDA0003289523150000273
Figure BDA0003289523150000281
MEOx2蛋白质(SEQ ID NO：22)
Figure BDA0003289523150000282
PRKCB RNA异形体1(SEQ ID NO：23)
Figure BDA0003289523150000283
Figure BDA0003289523150000291
PRKCB蛋白质异形体1(SEQ ID NO：24)
Figure BDA0003289523150000292
PRKCB RNA异形体2(SEQ ID NO：25)
Figure BDA0003289523150000293
Figure BDA0003289523150000301
Figure BDA0003289523150000311
Figure BDA0003289523150000321
PRKCB蛋白质异形体2(SEQ ID NO：26)
Figure BDA0003289523150000322
DDN RNA(SEQ ID NO：27)
Figure BDA0003289523150000323
Figure BDA0003289523150000331
DDN蛋白质(SEQ ID NO：28)
Figure BDA0003289523150000332
OTP mRNA(SEQ ID NO：29)
Figure BDA0003289523150000341
OTP蛋白质(SEQ ID NO：30)
Figure BDA0003289523150000342
Figure BDA0003289523150000351
受益于前述说明和相关附图中呈现的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本文中所阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应理解，本发明不限于所公开的具体实施方案并且旨在将修改和其他实施方案包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文中采用了特定术语，但是其仅以一般和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。

Claims (21)

1.将星形胶质细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法，其通过将选自以下的至少一种主调节子引入到细胞中：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
2.权利要求1所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2、PRKCB或ETV4。
3.权利要求1所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2，并且还包括引入NKX6-2。
4.权利要求1所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2和PRKCB、MEOX2和ETV4。
5.权利要求1所述的方法，其中所述主调节子是NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN和OTP。
6.权利要求1所述的方法，其还包括引入选自以下的至少一种主调节子：BASP1、NKX6.2、STOX2、MYCN、SOX8、OLIG2、HES6和ASCL1。
7.抑制胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的方法，其通过施用抑制或降低选自以下的至少一种主调节子的表达的免疫治疗组合物：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
8.治疗对象的胶质母细胞瘤的方法，其通过施用抑制或降低选自以下的至少一种主调节子的表达的免疫治疗组合物：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
9.权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2、PRKCB或ETV4。
10.权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗组合物靶向至少两种主调节子。
11.权利要求10所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2和PRKCB或MEOX2和ETV4。
12.权利要求9所述的方法，其中所述主调节子是MEOX2并且所述免疫治疗组合物还包含NKX6-2的抑制剂。
13.权利要求10中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗组合物靶向NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN和OTP。
14.权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗组合物包含：来源于至少一种主调节子的肽制剂、含有来源于至少一种主调节子的肽的纳米粒、含有来源于至少一种主调节子的肽的树突细胞、编码至少一种主调节子的RNA、含有编码至少一种主调节子的RNA的纳米粒或含有编码至少一种主调节子的RNA的树突细胞。
15.权利要求7至8中任一项所述的方法，其中抑制剂为RNA干扰剂或小分子。
16.用于治疗患有胶质母细胞瘤的对象的免疫治疗组合物，其包含NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP中至少一种的抑制剂。
17.权利要求16所述的免疫治疗组合物，其中所述组合物包含MEOX2、PRKCB或ETV4的抑制剂。
18.权利要求17所述的免疫治疗组合物，其中所述组合物包含MEOX2的抑制剂，并且还包含NKX6-2的抑制剂。
19.权利要求18所述的免疫治疗组合物，其中所述组合物包含MEOX2和PRKCB、MEOX2和ETV4或MEOX2和NKX6-2的抑制剂。
20.权利要求18所述的免疫治疗组合物，其中所述组合物包含NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN和OTP的抑制剂。
21.药盒，其包含第一容器和第二容器，其中所述第一容器包含至少一个剂量的组合物，所述组合物包含选自以下的至少一种主调节子的抑制剂：NKX2-2、ETV4、MLXIPL、MEOX2、PRKCB、DDN或OTP。
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