CN113740304B - 一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光检测技术领域，公开了一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法。本发明中，铂纳米粒子可以催化氧化邻苯二胺生成的2,3‑二氨基吩嗪，DAP与硅量子点之间存在荧光共振能量转移作用，得到双发射荧光探针，并利用汞离子对PtNPs活性具有抑制作用的特性来实现汞离子检测。另外，通过调节OPD的量可以实现汞离子检测灵敏度的调节，我们选择可以达到最佳灵敏度的OPD量来实现实际样品中汞离子的灵敏检测。本发明提出的一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法对汞离子检测的线性范围为2.0×10‑8‑3.0×10‑6mol·L‑1，检测限为1.05×10‑ 8mol·L‑1，为测定实际样品中的汞离子提供了一种灵敏度可控的比率荧光检测方法。

Description

一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法。
背景技术
汞(Hg)被列为最有害的重金属之一，具有难降解并可在动植物及人体内富集等特性，对 人类中枢神经系统具有严重损害。为了监测环境水及土壤资源中Hg2+的污染情况，避免Hg2+中毒、保障人体健康，科学家们发展了各类分析检测技术，如电感耦合等离子体质谱、原子 吸收光谱、电化学和荧光检测法等。其中，荧光法由于其高灵敏度，反应速度快等优点被广 泛应用于汞离子的检测。近年来，利用汞离子对酶的催化活性的影响来实现汞离子检测的方 法引起了人们的特别关注。其中酶的种类包括生物酶和无机纳米酶。生物酶是指具有特定催 化活性的蛋白质，大多由氨基酸长链组成，具有高效的催化能力和专一性，但其易变性失活， 对于反应条件要求较高。近年来，科学家们研制出可以替代生物酶的无机纳米酶，其具有催 化效率高、稳定不易失活、价廉并可规模化制备等优点。
其中，铂纳米粒子(PtNPs)作为无机纳米酶得到了广泛的研究，其可以催化底物TMB及 OPD生成oxTMB及DAP，二者均会发生显色反应。其中催化OPD生成的DAP不仅可以显色，还具有显著的荧光发射峰。因此，被广泛应用于荧光传感器的构建。
发明内容
本发明旨在发展一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法。具体通过如下技术方案实 现：利用铂纳米粒子(PtNPs)可以催化氧化邻苯二胺(OPD)生成的2,3-二氨基吩嗪(DAP)， DAP与硅量子点(SiQDs)之间存在荧光共振能量转移(FRET)作用，得到双发射荧光探针， 并利用汞离子对PtNPs活性具有抑制作用的特性来实现汞离子检测。另外，通过调节OPD的 量可以实现汞离子检测灵敏度的调节，我们选择可以达到最佳灵敏度的OPD量来实现实际样 品中汞离子的灵敏检测。
一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法，包括如下步骤：
(1)合成SiQDs水溶液；
(2)Hg2+与PtNPs混合孵育，抑制PtNPs活性：
向PtNPs的水溶液中加入超纯水和已知浓度的Hg2+水溶液，在室温下孵育一定时间；
(3)向步骤(2)制备的混合溶液中加入OPD和H2O2水溶液，并将混合物溶液在室温下孵育一定时间后，PtNPs催化氧化OPD生成发光的DAP；
(4)向步骤(3)制备混合溶液中加入步骤(1)制得的SiQDs水溶液混合，然后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和576nm处的荧光强度，得出荧光强度I576/I414比值与汞离子浓度的标准曲线；
其中，所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为2nm，发射狭缝 宽度为2nm。
(5)按照步骤(2)～(4)的操作，将步骤(2)中已知浓度的Hg2+水溶液用待测的Hg2+溶液替换，用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和576nm处的荧光强度，计 算I576/I414比值代入步骤(4)中的标准曲线，得出待测溶液中汞离子的浓度。
其中，步骤(1)中，合成SiQDs水溶液的具体方法为：将6.665mL 60mM的还原剂 L-谷胱甘肽(L-GSH)和13.135mL离子加入100mL烧杯中，通入氮气10min后，加入0.2 mL硅源(N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO))，继续通氮气10min，得到混合溶 液。将装有混合溶液的烧杯放入美的家用微波炉中，在微波功率为700W的条件下，微波反 应8min，得到棕黄色固体。向烧杯中加10mL去离子水溶解得到的固体物质，接着将溶液 转移到离心管中放入离心机离心10min，离心过程的离心速率为10000rpm，取上清液，转 移到透析袋透析处理24h。提纯后的量子点溶液经冷冻干燥、研磨得到略带黄色的硅量子点 粉末，配制成1mg/mL的SiQDs水溶液置于4℃下保存。所述透析袋的截留分子量为1000。
步骤(2)中，合成PtNPs水溶液的具体方法为：将2mL 16mM的H2PtCl6与2mL 40mM 的柠檬酸钠加入装有76mL超纯水的圆底烧瓶中，室温搅拌30min。随后将400μL,50mM 的NaBH4逐滴加入上述混合液中，混合液迅速变为棕黄色。最后，混合液继续在室温下搅拌 反应1h。所得PtNPs水溶液在4℃下保存。
步骤(2)中，将Hg2+水溶液的浓度范围2.0×10-8-3.0×10-6mol·L-1；PtNPs的水溶液、 超纯水与Hg2+水溶液体积比为5:24:7；室温下孵育5min。
步骤(3)中，PtNPs的水溶液、OPD的水溶液及H2O2水溶液体积比为5:12:12；OPD水溶液与H2O2水溶液的浓度均为20mM；室温下孵育60min。
步骤(4)中，SiQDs水溶液与PtNPs水溶液的体积比为2:1。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计了一种灵敏度可控的比率荧光检测方法；
(2)本发明提出了一种基于荧光共振能量转移的比率荧光检测方法；
(3)所提出的SiQDs/PtNPs/OPD/H2O2传感系统对Hg2+表现出令人满意的分析性能，检测限为1.05×10-8mol·L-1，线性范围2.0×10-8-3.0×10-6mol·L-1。
附图说明
图1是本发明荧光方法用于检测汞离子的原理示意图。
图2是本发明荧光方法可行性分析中不同溶液的荧光光谱图。
图3A是不同量的OPD下I576，I414和I576/I414的荧光强度；B是不同体积OPD对SiQDs的荧光强度的影响；C是不同体积的OPD条件下SiQDs和DAP的荧光光谱图；D是不同体 积OPD条件下I576/I414与Hg2+浓度之间的线性关系。
图4A是Hg2+与PtNPs不同反应时间下I576/I414的荧光强度比值；B是PtNPs催化OPD不同反应时间下I576/I414的荧光强度比值。
图5A是不同浓度Hg2+标准溶液存在时溶液的荧光光谱图；B是Hg2+浓度与I576/I414荧 光强度比值间的线性关系图。
图6是各种干扰物存在时溶液的荧光比值变化图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法。具体通过如下方案实现：利用铂纳米粒子 (PtNPs)可以催化氧化邻苯二胺(OPD)生成的2,3-二氨基吩嗪(DAP)，DAP与硅量子点 (SiQDs)之间存在荧光共振能量转移(FRET)作用，得到双发射荧光探针，并利用汞离子对PtNPs活性具有抑制作用的特性来实现汞离子检测。另外，通过调节OPD的量可以实现汞离子检测灵敏度的调节，我们选择可以达到最佳灵敏度的OPD量来实现实际样品中汞离子的 灵敏检测。
该检测方法的可行性分析如下：
该检测方法的检测过程如图1所示，基本原理是：
PtNPs可以催化氧化OPD生成的DAP，DAP与SiQDs之间存在荧光共振能量转移，因而DAP可以猝灭SiQDs的荧光；当体系中加入Hg2+后，Hg2+可以抑制PtNPs的催化活性， 从而导致OPD生成DAP的量减少，由于DAP量的减少，DAP的荧光发射峰降低，而SiQDs 的荧光发射峰得到恢复。因此，通过监控DAP与SiQDs的荧光信号比值变化可以实现Hg2+的灵敏检测。
为了进一步验证方案的可行性，对SiQDs中加入各种物质前后的荧光变化情况进行考察。 如图2所示，SiQDs在414nm处有强荧光信号(曲线1)；当向SiQDs中分别加入Hg2+(曲线 2),PtNPs(曲线3),OPD(曲线4),H2O2(曲线5),OPD和H2O2(曲线6)时,SiQDs在414nm处 的荧光信号基本不发生改变，说明单独的这些物质不会影响SiQDs的荧光信号强度；当PtNPs与OPD和H2O2同时存在时，生成DAP，使得在576nm处产生强的荧光信号，因而SiQDs 在414nm处的荧光信号被猝灭(曲线7)；当Hg2+存在时，抑制PtNPs催化活性，使生成的 DAP量减少，DAP荧光信号强度降低，SiQDs荧光信号强度恢复(曲线8)。该实验可以有效 证明构建的比率荧光传感体系能够用于测定目标物Hg2+的含量。
下面结合具体实施例，对本发明的内容作更细致地阐述：
(1)该比率荧光传感体系灵敏度的调节：
步骤2～4中，OPD的体积分别为20、50、80、100、120、150、180、200、220、250μL， 探究不同OPD体积变化与荧光强度I576、I419和I576/I419比值的关系。由图3A可以看出，随 OPD体积的增加，I576/I419比值逐步增加，I414的值逐渐降低，而I576的值先增加后趋于平稳。 因此，我们可以看出当OPD的体积增加到150μL以后，I576/I419比值的变化主要由I414的值 的变化所致。我们推断OPD量过多会对SiQDs本身荧光信号强度有影响。通过图3B可以看 出SiQDs荧光信号强度随OPD量的增加而缓慢下降，当OPD的体积增加到150μL时，SiQDs 荧光信号强度已下降到初始值的90％以下，此时OPD对SiQDs荧光信号强度影响较大。因 此我们选择OPD的体积为80、100和120μL时，考察了该比率传感体系对Hg2+检测的灵敏 度。图3C为OPD的体积为80、100和120μL时，该比率传感体系的荧光光谱图。图3D是 当OPD的体积为80、100和120μL时，分别加入不同浓度Hg2+(0.02、0.8、2和3μM)，I576/I419比值与Hg2+浓度呈线性关系，并且可以看出当OPD的体积为120μL时，该比率荧光传感体 系的灵敏度最高。为了达到最高的灵敏度，所以选择OPD的体积为120μL进行后续实验。 所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为2nm，发射狭缝宽度为2nm。
(2)Hg2+与PtNPs最佳反应时间的确定：
将Hg2+与PtNPs混合液分别孵育0min、2min、5min、8min、10min、15min、20min， 测溶液在414nm和576nm处的荧光强度。从图4A可知，Hg2+与PtNPs混合液在5min内反 应达到稳定，因此5min选为Hg2+与PtNPs最佳反应时间。
(3)PtNPs催化OPD最佳反应时间的确定：
将PtNPs与OPD和H2O2混合液分别孵育5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min，测溶液在414nm和576 nm处的荧光强度。从图4B可知，PtNPs在60min内将OPD完全催化生成DAP，60min后荧 光强度I576/I414比值不再改变，因此60min选为PtNPs催化OPD的最佳反应时间。
实施例1
(1)在若干份50μL PtNPs溶液中加入240μL超纯水后，分别再加入70μL浓度为0.02, 0.2,0.5,0.8,1.2,1.5,1.8,2.2,2.5,2.8,3μM的Hg2+标准溶液，在室温下孵育5min。
(2)向步骤(1)制备的混合溶液中加入120μL OPD水溶液和120μL H2O2水溶液(OPD和H2O2的浓度均为20mM)，并将混合物溶液在室温下孵育60min后，PtNPs催化氧化OPD 生成发光的DAP；
(3)向步骤(2)制备的混合溶液中加入100μL SiQDs水溶液；用荧光分光光度计在室 温下分别检测溶液在414nm和576nm处的荧光强度，所得的谱图如图5A所示；同时获得荧光强度I576/I419比值与Hg2+浓度的标准曲线如图5B所示；线性方程为：I576/I414＝1.6699-0.3936 CHg2+，相关系数R2＝0.9986，检测限为1.05×10-8mol·L-1，线性范围2.0×10-8-3.0×10-6mol ·L-1。
(4)按照步骤(1)～(3)的操作，将上述已知浓度的汞离子溶液用待测溶液替换，用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和576nm处的荧光强度，计算I576/I419比值为1.47245，代入步骤(3)中的标准曲线，得出待测溶液中汞离子的浓度为5.017×10-7M。
Hg2+检测选择性的考察：
为了研究本发明检测Hg2+的特异性，对Hg2+和其它金属离子进行检测。具体步骤如下： 在1.5mL离心管中，将50μL的PtNPs中加入240μL超纯水后分别和70μL 10μM的K+、 Ca2+、Na+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+和2.5μM的Hg2+在室温 下孵育5min；然后加入120μL 20mM OPD水溶液和120μL 20mM H2O2水溶液，室温下孵 育60min，最后加入100μLSiQDs水溶液，室温下检测溶液在414nm和576nm处的荧光强 度。如图6所示，10μM的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、 Zn2+、Cu2+对荧光强度I576/I414比值基本无影响，只有加入Hg2+会使荧光强度I576/I414比值明显 降低。以上结果说明该荧光传感方法可以实现Hg2+的特异性检测。

Claims (3)

1.一种灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法，其特征在于，利用铂纳米粒子PtNPs催化氧化邻苯二胺OPD生成的2,3-二氨基吩嗪DAP，DAP与硅量子点SiQDs之间存在荧光共振能量转移FRET作用，得到双发射荧光探针，并利用汞离子对PtNPs活性具有抑制作用的特性来实现汞离子检测；通过调节OPD的量可以实现汞离子检测灵敏度的调节，包括如下步骤：
（1）合成SiQDs水溶液；
（2）向PtNPs的水溶液中加入超纯水和已知浓度的Hg2+水溶液，在室温下孵育一定时间；
（3）向步骤（2）制备的混合溶液中加入OPD和H2O2水溶液，并将混合物溶液在室温下孵育一定时间后，PtNPs催化氧化OPD生成发光的DAP；
其中，PtNPs的水溶液、OPD的水溶液及H2O2水溶液体积比为5:12:12；OPD水溶液与H2O2水溶液的浓度均为20 mM；室温下孵育60 min；
（4）向步骤（3）制备混合溶液中加入步骤（1）制得的SiQDs水溶液混合，然后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414 nm和576 nm处的荧光强度，得出荧光强度I576/I414比值与汞离子浓度的标准曲线；
其中，所述荧光分光光度计的激发波长设置为350 nm，激发狭缝宽度为2 nm，发射狭缝宽度为2 nm；
（5）按照步骤（2）~（4）的操作，将步骤（2）中已知浓度的Hg2+水溶液用待测的Hg2+溶液替换，用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414 nm和576 nm处的荧光强度，计算I576/I414比值代入步骤（4）中的标准曲线，得出待测溶液中汞离子的浓度。
2.如权利要求1所述的灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法，其特征在于，步骤（2）中，Hg2+水溶液的浓度范围2.0×10-8- 3.0×10-6 mol•L-1； PtNPs的水溶液、超纯水与Hg2+水溶液体积比为5:24:7；室温下孵育5 min。
3.如权利要求1所述的灵敏度可控的汞离子比率荧光检测方法，其特征在于，步骤（4）中，SiQDs水溶液与PtNPs水溶液的体积比为2:1。
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