CN113736841A - 一种可溶性i型胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可溶性I型胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用，所述制备方法具体步骤如下：1)制备牛筋细粒；2)复合酶水解牛筋蛋白；3)制备牛筋蛋白酶水解液2；4)制备蛋白沉淀1；5)重悬蛋白沉淀1，搅拌重溶蛋白至蛋白完全溶解；6)进行牛筋蛋白1化学结构的第一次改造；7)制备蛋白沉淀2；8)采用步骤6、7、8相同的方法对蛋白沉淀2进行第二次改构，获得改构沉淀蛋白3；9)制备蛋白沉淀4；10)合计洗涤蛋白3次，获得终产品。本方法制得的可溶性I型胶原蛋白不仅完整保留大分子I型胶原蛋白的三维空间构象，还克服了传统牛筋胶原蛋白酶水解产物在中性水介质中不溶解的缺点，实现牛筋大分子胶原蛋白在化妆品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种可溶性I型胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
胶原蛋白系人及动物细胞合成的一类糖蛋白生物大分子，广泛存在于人及动物骨细胞、筋腱、皮肤、软骨细胞等结缔组织中，为皮肤、筋腱、关节滑膜组织的重要成份。迄今发现的胶原蛋白种类繁多、结构复杂，常见的有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白是成年脊椎动物皮、肌腱中的主要胶原蛋白形式，也是目前被广泛应用于临床医学的一类生物组织材料。
各种类型胶原蛋白的基本结构大同小异，在氨基酸序列上含有(甘氨酸-X-Y)n重复序列，这些重复序列是构成胶原蛋白三聚体(三股螺线)功能结构的基础，其中X常为脯氨酸，Y为羟脯氨酸或羟赖氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸是胶原蛋白区别其他蛋白的特征性质。大分子胶原蛋白由3条多肽链组成，这三条多肽相互作用形成三重超螺旋结构，研究证实只有这种保留大分子三股螺旋结构的胶原蛋白才具有刺激皮肤角质细胞增值的功效(活性)，胶原蛋白的降解产物，如明胶和小分子水解胶原，均不具备这种完整的三股螺旋结构，因此不具备增值皮肤角质细胞的功能。
现有的生产工艺是通过酸或酶水解工艺获得的大分子牛筋I型胶原蛋白，在中性pH条件下具有水不溶性质，这类产品主要用于一些医药的产品领域，如滴眼液、止血棉、医用填料等。作为化妆品生产用的原料，必须在中性pH可溶且性能稳定。因此目前市面上牛筋来源酶法制备的I型胶原蛋白不能用作化妆品的原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种可溶性I型胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用，其以牛跟筋为原料，采用机械法结合复合软化酶解法去除牛跟筋多余肉组织和脂肪组织、机械粉碎后采用低温复合酶法水解获得酸溶性天然I胶原蛋白溶液，然后再进行2次酰化反应，完成胶原蛋白分子结构的改构，由此获得水溶性更高、亲水性更强、蛋白稳定性更高的具有三股螺旋的大分子(100～300KDa)活性I型胶原蛋白。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种可溶性I型胶原蛋白制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)选用新鲜牛筋为材料，经过机械方法及0.01％～0.1％复合软化酶解法，在pH6.0～7.0室温处理2～5小时对牛筋进行去肉脂、去筋膜处理获得牛筋条；然后用去离子水漂洗3～6次，牛筋条经冷冻结块、机械粉碎获得牛筋细粒；
2)采用去离子水按照牛筋颗粒重量的1～5％W/V投量，依据反应液体积加入0.1～0.5％W/V复合蛋白水解酶，酶活力大于10万IU/g，用盐酸或醋酸调酶解反应液的pH2.0～4.0，于6～15℃、转速50～200rpm搅拌下酶水解2～4天，完成牛筋蛋白的复合酶水解；
3)采用8000～14000rpm,10℃低温离心10～30min分离，获得浓稠、透明的牛筋蛋白酶水解液；
4)按照牛筋蛋白酶水解液体积加入2.0～5.0％W/V NaCL，缓慢搅拌下沉淀出牛筋蛋白，后在3000～6000rpm 10℃离心20分钟收集获得蛋白沉淀1；
5)采用2～5％W/V去离子水重悬蛋白沉淀1，用醋酸或盐酸调pH2.0～4.0，6～12℃下50～150rpm搅拌重溶蛋白至蛋白完全溶解；
6)采用饱和NaOH溶液在搅拌下调蛋白溶解液的pH9.0～12.0，加入0.2～2.0％W/V丁二酸酐或戊二酸酐或己二酸酐溶液的其中一种溶液，50～150rpm搅拌下反应3～6小时进行牛筋蛋白1分子结构的第一次改造；
7)改构结束后在搅拌下缓慢用醋酸或盐酸溶液调pH4.0～5.0，静置1～3小时产生大量絮状蛋白沉淀；然后在3000～6000rpm 10℃离心20分钟收集蛋白沉淀2；
8)采用步骤6、7、8相同的方法对蛋白沉淀2进行第二次化学改构，获得改构沉淀蛋白3；
9)蛋白分子结构改造后，按照湿重蛋白2％W/V用无菌去离子水在洁净区重悬蛋白沉淀3，醋酸或盐酸调pH 2.0～4.0，在50～150rpm搅拌下溶解蛋白3，再用2～5％W/V NaCL沉淀出蛋白；4000rpm、10℃离心20分钟收集蛋白沉淀4；
10)重复2次步骤9，最后在4000rpm、10℃离心20分钟收集蛋白沉淀，合计洗涤蛋白3次，获得终产品。
本发明的可溶性I型胶原蛋白可添加到化妆品中，应用在化妆水、柔肤水、爽肤水、面膜、精华液、乳液、按摩膏、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、洗面奶、身体乳或沐浴露。
化妆品生产中的使用：根据不同化妆品产品的配方，首先采用pH5.5～6.5无菌去离子水在化妆品洁净区，10℃搅拌下溶解牛筋胶原蛋白生物材料，获得透明的化妆品用蛋白储存原液。储存液的蛋白浓度控制在1.0～3.0％，作为配置各种牛筋胶原蛋白化妆品的生产原料。
本发明的有益效果在于：以天然牛筋为起始原料，采用本发明制备方法获得中性pH下水介质中可完全溶解的大分子I型胶原蛋白生物材料，产品95％组份为分子量在100～300KDa且具有胶原蛋白大分子螺旋特性结构的化妆品活性生物原料，该产品不仅完整保留大分子I型胶原蛋白的三维空间构象，还克服了传统牛筋胶原蛋白酶水解产物在中性水介质中不溶解的缺点，实现牛筋大分子胶原蛋白在化妆品中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例10中可溶性I型胶原蛋白终产品的SDS-PAGE电泳结果图；
图2为本发明实施例11中可溶性I型胶原蛋白终产品样品①蛋白特征光吸收峰检测曲线图；
图3为本发明实施例11中可溶性I型胶原蛋白终产品样品②蛋白特征光吸收峰检测曲线图；
图4为本发明实施例12中不同浓度的对照品在218nm处的浓度吸收曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：牛筋颗粒制备
市购食品级黄牛或牦牛后腿筋腱组织10斤，机械法剔除多余的肉类和脂肪组织，保留完整的后腿筋腱粗条。用自来水洗涤筋条至无血水，按照浸泡筋条液体的体积向浸泡液中加入0.05％的食品级复合软化酶(如筋膜软化专用的复配蛋白酶，酶活力单位1万～9万U/g)，调pH7.0室温预处理2小时。再采用机械法去除残留的筋膜。将处理好的筋条用去离子水室温漂洗3次，获得外观粉白色的牛筋条。将筋条置于-20℃冰柜冷冻结块，再采用切片机或粉碎机获得牛筋细粒1，将颗粒置于-20℃冰柜保存备用。
实施例2：牛筋颗粒制备
市购食品级黄牛或牦牛后退筋腱组织10斤，机械法剔除多余的肉类和脂肪，保留完整的后退筋腱粗条。用自来水洗涤筋条至无血水，按照浸泡筋条液体的体积向浸泡液中加入0.1％的食品级复合软化酶(如筋膜软化专用的复配蛋白酶，酶活力单位1万～9万U/g)，调pH6.0室温处理5小时。再采用机械法去除残留的筋膜。将处理好的筋条用去离子水室温漂洗6次，获得外观类白色的牛筋条见图1。将筋条置于-20℃冰柜冷冻结块，再采用切片机或粉碎机获得牛筋细粒2，将颗粒置于-20℃冰柜保存备用。
实施例3：酶法制备初级蛋白水解液
冰柜取出500g牛筋颗粒2，用去离子水按照牛筋颗粒重量的1.0％W/V投料，加入0.1％W/V复合蛋白水解酶(酶活力大于10万IU/g)，盐酸调酶解反应液pH 2.0～2.5，在6℃～8.0℃、转速50～100rpm搅拌下酶水解2天，获得牛筋蛋白水解液。采用8000rpm,10℃低温离心20min分离，再用14000rpm、10℃低温离心10min分离获得稠、透明的牛筋蛋白酶水解液。按照牛筋蛋白酶水解体积加入2.0％W/V NaCL，搅拌下沉淀出牛筋蛋白，后在3000rpm10℃离心20分钟收集蛋白沉淀1的湿重为270g。
实施例4：酶法制备初级蛋白水解液
冰柜取出500g牛筋颗粒2，用去离子水按照牛筋颗粒重量的5.0％W/V投料，加入0.5％W/V复合蛋白水解酶(酶活力大于10万IU/g)，醋酸调酶解反应液pH 3.5～4.0，在14℃～15℃、转速150rpm搅拌下酶水解1天,200rpm搅拌下酶水解3天，获得牛筋蛋白水解液。采用14000rpm,10℃低温离心30min分离，获得很浓稠、透明但少许蛋白絮状的牛筋蛋白酶水解液。按照牛筋蛋白酶水解体积加入5.0％W/V NaCL，搅拌下沉淀出牛筋蛋白，后在6000rpm10℃离心20分钟收集蛋白沉淀1的湿重为380g。
实施例5：酶法制备初级蛋白水解液
冰柜取出500g牛筋颗粒2，用去离子水按照牛筋颗粒重量的2.0％W/V投料，加入0.35％W/V复合蛋白水解酶(酶活力大于10万IU/g)，醋酸调酶解反应液pH 2.5～3.0，在8℃～10℃、转速100rpm搅拌下酶水解1天，改为150rpm搅拌2天，获得牛筋酶水解液。采用12000rpm,10℃低温离心20min分离，获得浓稠、透明的牛筋蛋白酶水解液,见图2。按照牛筋蛋白酶水解体积加入3.0％W/V NaCL，搅拌下沉淀出牛筋蛋白，后在5000rpm 10℃离心20分钟收集蛋白沉淀1的湿重为445g，湿蛋白收率约90％。
实施例6：牛筋酶水解蛋白的化学结构改造
用去离子水按照2.0％W/V重悬450g蛋白沉淀1，用醋酸调pH3.5～4.0，10℃～12℃下50～100rpm搅拌重溶蛋白1至蛋白1完全溶解。采用饱和NaOH溶液在搅拌下调pH9.0，加入0.2％W/V戊二酸酐溶液，200rpm搅拌下反应2小时，100rpm反应3小时进行蛋白结构的第一次化学改造。改构反应结束后在50rpm搅拌下缓慢用醋酸溶液调pH4.0～4.5，静置1小时产生絮状蛋白沉淀。后在4000rpm 10℃离心10分钟收集湿蛋白沉淀2为394g。重复本方法对蛋白沉淀2进行第二次改构，获得湿蛋白3样品356g。
实施例7：牛筋酶水解蛋白的化学结构改造
用去离子水按照5.0％W/V重悬450g蛋白沉淀1，用盐酸调pH2.4～3.0，8℃～10℃下100～150rpm搅拌重溶蛋白1至蛋白1完全溶解。采用饱和NaOH溶液在搅拌下调pH11，加入0.7％W/V丁二酸酐溶液，150rpm搅拌下反应6小时。然后在搅拌下缓慢用盐酸溶液调pH5.0，静置3小时产生大量絮状蛋白沉淀。后在6000rpm 10℃离心20分钟收集湿蛋白沉淀2为412g。重复本方法对蛋白沉淀2进行第二次改构，获得湿蛋白3样品378g。
实施例8：终产品制备
按照2.0％W/V用无菌去离子水在洁净区重悬蛋白沉淀3湿重350g，盐酸调pH2.5～3.0溶解蛋白3，用3.0％W/V NaCL搅拌下沉淀出蛋白，4000rpm、10℃离心20分钟收集蛋白沉淀4。采用相同的方法重复2次洗涤蛋白沉淀,合计3次洗涤获得终产品325g。无菌条件下收集，-20℃存储可溶性大分子牛筋胶原蛋白生物材料。终产品理化性质检查见表1。
实施例9：化妆品可溶性胶原蛋白原液配制
根据不同化妆品产品的配方，可以配置1.0～3.0％的可溶性大分子胶原蛋白储存液。首先采用pH5.5～6.5的无菌去离子水在化妆品洁净区，10℃搅拌下溶解上述终产品，获得透明的化妆品用蛋白储存原液。该储存液可以用pH5.0～7.0，最佳pH5.5～6.5的化妆品生产用水或含有化妆品其他成份的液体在10℃搅拌下混合制备所需产品。可以制成可溶性大分子牛筋胶原蛋白精华液、可溶性大分子牛筋胶原蛋白日霜、可溶性大分子牛筋胶原蛋白面膜等化妆品产品。
实施例10：终产品SDS-PAGE法检测其分子量
胶配制：4.5％浓缩胶，7.5％分离胶；
待检样品为1％储存胶原蛋白原液，用SDS-PAGE非还原Buffer在94℃处理5分钟后，上样10ug进行SDS-PAGE电泳检测，浓缩胶电压120V，分离胶电压180V，M为标准蛋白分子Marker，1、2、3道为I型胶原蛋白对照(Advanced biomatrix 5008)，浓度为0.1％、0.3％和0.5％，4和5道为终产品样品，浓度为0.3％和0.5％，电泳结果如图1。
结果显示：终产品的分子量主要为分子量大于260KDa的大分子蛋白且与I型胶原蛋白对照品组份一致。证明采用本技术生产出的可溶性牛筋胶原蛋白为大分子I型胶原蛋白。
实施例11：终产品蛋白特征吸收峰检测
一、以去离子水为对照，进行190nm～300nm波长扫描
样品①：对照Collage Type I；
样品②：牛筋胶原蛋白储备液；
样品①：最大吸收峰约为218nm；
样品②：最大吸收峰约为218nm；
结果显示：终产品的最大紫外吸收峰与I型胶原蛋白对照品一致。
采用蛋白质氨基酸组份分析仪进行终产品成份成份的分析，结果如下：
表1 终产品氨基酸组成成份分析
| 天门冬氨酸 | 1.39％ |
| 苏氨酸 | 0.43％ |
| 丝氨酸 | 0.73％ |
| 谷氨酸 | 2.49％ |
| 甘氨酸 | 5.71％ |
| 丙氨酸 | 2.30％ |
| 胱氨酸 | 0.14％ |
| 缬氨酸 | 0.52％ |
| 蛋氨酸 | 0.25％ |
| 异亮氨酸 | 0.31％ |
| 亮氨酸 | 0.66％ |
| 酪氨酸 | 0.075％ |
| 苯丙氨酸 | 0.51％ |
| 赖氨酸 | 0.68％ |
| 组氨酸 | 0.30％ |
| 精氨酸 | 1.91％ |
| 脯氨酸 | 3.25％ |
| 羟脯氨酸 | 2.46％ |
| 氨基酸总量 | 21.7％ |
| 氨 | 0.17％ |
结果显示：终产品中甘氨酸为5.71％、脯氨酸为3.25％、羟脯氨酸为2.46％，且为该蛋白的主要氨基酸，符合胶原蛋白特征氨基酸：(甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸)n重复序列的特性。
实例12：终产品蛋白含量检测
采用不同浓度的Collage Type I样品为对照，在218nm建立标准曲线，将终产品储备液，根据待测样品的吸光值，从标准曲线获得样品的UV法浓度。
1、Collage Type I样品原浓度为0.5mg/ml，将其等倍稀释至5个浓度梯度，测定其在218nm处的吸光值，如下表2所示：
不同浓度的对照品在218nm处的浓度吸收曲线如图4所示。
2、根据标准曲线测定牛筋胶原蛋白终产品的浓度为：1.13mg/ml。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (2)
1.一种可溶性I型胶原蛋白制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)选用新鲜牛筋为材料，经过机械方法及0.01％～0.1％复合软化酶解法，在pH6.0～～7.0室温处理2～5小时对牛筋进行去肉脂、去筋膜处理获得牛筋条；然后用去离子水漂洗3～6次，牛筋条经冷冻结块、机械粉碎获得牛筋细粒；
2)采用去离子水按照牛筋颗粒重量的1～5％W/V投量，依据反应液体积加入0.1～0.5％W/V复合蛋白水解酶，酶活力大于10万IU/g，用盐酸或醋酸调酶解反应液的pH2.0～4.0，于6～15℃、转速50～200rpm搅拌下酶水解2～4天，完成牛筋蛋白的复合酶水解；
3)采用8000～14000rpm,10℃低温离心10～30min分离，获得浓稠、透明的牛筋蛋白酶水解液；
4)按照牛筋蛋白酶水解液体积加入2.0～5.0％W/V NaCL，缓慢搅拌下沉淀出牛筋蛋白，后在3000～6000rpm 10℃离心20分钟收集获得蛋白沉淀1；
5)采用2～5％W/V去离子水重悬蛋白沉淀1，用醋酸或盐酸调pH2.0～4.0，6～12℃下50～150rpm搅拌重溶蛋白至蛋白完全溶解；
6)采用饱和NaOH溶液在搅拌下调蛋白溶解液的pH9.0～12.0，加入0.2～2.0％W/V丁二酸酐或戊二酸酐或己二酸酐溶液的其中一种溶液，50～150rpm搅拌下反应3～6小时进行牛筋蛋白1分子结构的第一次改造；
7)改构结束后在搅拌下缓慢用醋酸或盐酸溶液调pH4.0～5.0，静置1～3小时产生大量絮状蛋白沉淀；然后在3000～6000rpm 10℃离心20分钟收集蛋白沉淀2；
8)采用步骤6、7、8相同的方法对蛋白沉淀2进行第二次化学改构，获得改构沉淀蛋白3；
9)蛋白分子结构改造后，按照湿重蛋白2％W/V用无菌去离子水在洁净区重悬蛋白沉淀3，醋酸或盐酸调pH 2.0～4.0，在50～150rpm搅拌下溶解蛋白3，再用2～5％W/V NaCL沉淀出蛋白；4000rpm、10℃离心20分钟收集蛋白沉淀4；
10)重复2次步骤9，最后在4000rpm、10℃离心20分钟收集蛋白沉淀，合计洗涤蛋白3次，获得终产品。
2.如权利要求1一种可溶性I型胶原蛋白制备方法制得的可溶性I型胶原蛋白，其特征在于应用在化妆水、柔肤水、爽肤水、面膜、精华液、乳液、按摩膏、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、洗面奶、身体乳或沐浴露。
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