CN113735841A - 细胞外调节蛋白激酶探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种如式I所示的细胞外调节蛋白激酶探针，该结构上的A环能够专一靶向性地与ERK1/2激酶结构外侧的非活性位点第178位半胱胺酸共价结合，能够有效靶向ERK1/2；且该细胞外调节蛋白激酶探针不会抑制ERK1/2与ATP结合的能力与激酶活性，但通过其对ERK1/2具有靶向性，为靶向ERK激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团，提高抑制剂对细胞外调节蛋白激酶的药物敏感度，为细胞外调节蛋白激酶抑制剂提供探针，引导细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向作用于细胞外调节蛋白激酶位点，使抑制剂发挥作用，提高效果。

Description

细胞外调节蛋白激酶探针及其制备方法与应用

技术领域

本申请属于探针技术领域，尤其涉及一种细胞外调节蛋白激酶探针及其制备方法与应用。

背景技术

细胞具有极其复杂的生命活动，这些生命活动都必须受到严格的调控，作为一个开放系统，它不单单要与外界环境进行信息交流，还要在细胞间进行信息传递。于是在长期的进化发展和自然选择的过程中逐步建立起一个复杂的信号转导网络，它是由不同的信号传递通路通过相互联系和作用而形成的，即不同的信号转导通路间存在着“cross-talking”。在信号网络中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传递途径起着极为重要的作用，控制着细胞多种生理过程，如细胞生长、发育、分裂、死亡等。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一员。

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)包括ERK1和ERK2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导Elk-1，ATF，Ap-1，c-fos和c-Jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应。它的信号传递途径遵循MAPKs的三级酶促级联反应，即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAP-KK)→MAPK。

当机体出现癌症或者其他疾病时，MAPK通路上游组分发生激活突变，ERK1/2的活性相应发生上调，从而导致多种癌症的形成。而大量的临床研究表明，抑制MAPK通路可以抑制部分癌细胞系的生长，进而达到控制疾病的目的。但是，现有技术提供的MAPK通路的抑制剂往往无法较好与ERK1/2结合，进而无法起到较好地抑制作用，导致无法较好抑制MAPK通路的机制，导致作用效果不佳。

发明内容

本申请的目的在于提供一种细胞外调节蛋白激酶探针及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中细胞外调节蛋白激酶没有相应的探针，导致MAPK通路的抑制剂无法较好与ERK1/2结合的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种细胞外调节蛋白激酶探针，所述细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A及其衍生物，其中，所述细胞外调节蛋白激酶探针的结构通式如式I所示，

其中，R选自H、长链脂肪烃、芳基取代的长链脂肪烃的任意一种。

第二方面，本申请提供一种细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，包括如下步骤：

获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行浓缩分离，得到毛萼乙素；

将所述毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理后，进行淬灭反应得到第一混合物；

将所述第一混合物采用有机溶剂进行纯化处理，并进行浓缩分离得到细胞外调节蛋白激酶探针。

第三方面，本申请提供一种药物组合物，所述药物组合物包括细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂，其中，所述细胞外调节蛋白激酶探针为所述的细胞外调节蛋白激酶探针或由细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法制备得到的。

本申请第一方面提供的细胞外调节蛋白激酶探针，其中，细胞外调节蛋白激酶探针的结构式如式I所示，该结构上的A环能够专一靶向性地与ERK1/2激酶结构外侧的非活性位点第178位半胱胺酸共价结合，能够有效靶向ERK1/2；且该细胞外调节蛋白激酶探针不会抑制ERK1/2与ATP结合的能力与激酶活性，但通过其对ERK1/2具有靶向性，为靶向ERK激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团，提高抑制剂对细胞外调节蛋白激酶的药物敏感度，为细胞外调节蛋白激酶抑制剂提供探针，引导细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向作用于细胞外调节蛋白激酶位点，使抑制剂发挥作用，提高效果。

本申请第二方面提供的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，该制备方法从天然植物种提取得到的毛萼乙素为原料，采用半合成的方法制备得到细胞外调节蛋白激酶探针；该制备方法制备产量较高，安全高效，有利于实现工业化生产。

本申请第三方面提供的药物组合物，该药物组合物包括了细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂，通过协同细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂共同作用，细胞外调节蛋白激酶探针对细胞外调节蛋白激酶进行定位，使细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向专一与细胞外调节蛋白激酶的作用位点结合，提高了细胞外调节蛋白激酶抑制剂的作用效果。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的Laxiflorin A专一靶向结合ERK1/2的位点的蛋白下拉实验分析图。

图2是本申请实施例提供的Laxiflorin A与Laxiflorin B的肿瘤抑制分析图。

图3是本申请实施例提供的Laxiflorin A与Laxiflorin B联合使用的抑制作用图。

图4是本申请实施例提供的Laxiflorin A-Thalidomide(LA-A6-TH)分子抑制肿瘤细胞生长的分析图。

图5是本申请实施例2得到的Laxiflorin A-A9-Thalidomide(LA-A9-TH)分子能抑制肿瘤细胞生长的分析图。

图6是本申请实施例提供的Laxiflorin A-A19-Thalidomide(LA-A19-TH)分子抑制肿瘤细胞生长的分析图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本申请实施例第一方面提供一种细胞外调节蛋白激酶探针，细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A及其衍生物，其中，细胞外调节蛋白激酶探针的结构通式如式I所示，

其中，R选自H、长链脂肪烃、芳基取代的长链脂肪烃的任意一种。

本申请第一方面提供的细胞外调节蛋白激酶探针，其中，细胞外调节蛋白激酶探针的结构式如式I所示，该结构上的A环能够专一靶向性地与ERK1/2激酶结构外侧的非活性位点第178位半胱胺酸共价结合，能够有效靶向ERK1/2；且该细胞外调节蛋白激酶探针不会抑制ERK1/2与ATP结合的能力与激酶活性，但通过其对ERK1/2具有靶向性，为靶向ERK激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团，提高抑制剂对细胞外调节蛋白激酶的药物敏感度，为细胞外调节蛋白激酶抑制剂提供探针，引导细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向作用于细胞外调节蛋白激酶位点，使抑制剂发挥作用，提高效果。

在一些实施例中，式I中R选自H，得到的细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A(简称LA)，如式I-1所示，

在一些实施例中，式I中R选自

得到的细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A-A9-TH(简称LA-A9-TH)，如式I-2所示，

在一些实施例中，在LA-A9-TH的C-15位羟基处链接磺酸盐，磷酸盐等基团，可提高LA-A9-TH的水溶性及细胞通透性，更有利于使用。

在一些实施例中，式I中R选自

得到的细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A-A6-TH(简称LA-A6-TH)，如式I-3所示，

在一些实施例中，式I中R选自

得到的细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A-A19-TH(简称LA-A19-TH)，如式I-4所示，

在一些实施例中，细胞外调节蛋白激酶探针与ERK1/2外侧的第178位半胱胺酸共价结合。其中，式I-1提供的Laxiflorin A以及式I-2～式I-4提供的Laxiflorin A的衍生物，均能够与ERK1/2外侧的第178位半胱胺酸共价结合。ERK1/2外侧的第178位半胱胺酸为ERK1/2激酶的非活性位点，，细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A及其衍生物仅具有与ERK1/2激酶靶向专一结合的作用，无法与ERK1/2激酶的活性位点结合，故Laxiflorin A及其衍生物不具有抑癌活性。

Laxiflorin A及其衍生物，同样能够专一靶向性地与ERK1/2激酶结构外侧的非活性位点第178位半胱胺酸共价结合，能够有效靶向ERK1/2；且不会抑制ERK1/2与ATP结合的能力与激酶活性，但通过其对ERK1/2具有靶向性，为靶向ERK激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团，提高抑制剂对细胞外调节蛋白激酶的药物敏感度，为细胞外调节蛋白激酶抑制剂提供探针，引导细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向作用于细胞外调节蛋白激酶位点，使抑制剂发挥作用，提高效果。

本申请实施例第二方面提供一种细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，包括如下步骤：

S01.获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行浓缩分离，得到毛萼乙素；

S02.将毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理后，进行淬灭反应得到第一混合物；

S03.将第一混合物采用有机溶剂进行纯化处理，并进行浓缩分离得到细胞外调节蛋白激酶探针。

本申请第二方面提供的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，该制备方法从天然植物种提取得到的毛萼乙素为原料，采用半合成的方法制备得到细胞外调节蛋白激酶探针；该制备方法制备产量较高，安全高效，有利于实现工业化生产。

步骤S01中，获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行浓缩分离，得到毛萼乙素。

在一些实施例中，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理的步骤包括：提供体积百分浓度为80％～85％的甲醇水溶液，对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理2小时；再减压回收甲醇，使浸膏溶剂浓缩至甲醇的体积百分浓度为40％～45％，得到回流提取产物。

在一些实施例中，进行浓缩分离的步骤包括依次ji呢行色谱分离、凝胶柱脱色、重结晶和制备液相分离的方法得到毛萼乙素。

步骤S02中，将毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理后，进行淬灭反应得到第一混合物。

在一些实施例中，将毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理的步骤中，将毛萼乙素与浓度为0.2～0.3mmol的戴斯-马丁试剂于40～45℃条件下进行混合处理30～40分钟。

在一些实施例中，进行淬灭反应的步骤中，提供饱和硫代硫酸钠溶液和氯化钠溶液进行混合处理，进行淬灭反应。

步骤S03中，将第一混合物采用有机溶剂进行纯化处理，并进行浓缩分离得到细胞外调节蛋白激酶探针。

在一些实施例中，纯化处理的步骤中，包括：将第一混合物采用有机溶剂进行第一萃取处理得到醛化合物粉末，再将醛化合物粉末进行溶解后进行第二萃取处理。

在一些实施例中，将第一混合物采用有机溶剂进行第一萃取处理的步骤中，将第一混合物采用乙酸乙酯进行第一萃取处理，采用乙酸乙酯进行反复三次萃取处理，合并有机相进行浓缩分离，得到白色固体粉末醛化合物。

在一些实施例中，浓缩分离的步骤中，采用蒸发浓缩、超滤浓缩、反渗透透析中的至少一种方法进行浓缩；再采用色谱分离处理、凝胶柱分离处理、重结晶分离处理和制备液相分离处理中的至少一种方法进行分离。

进一步，将醛化合物粉末进行溶解后进行第二萃取处理的步骤中，将醛化合物粉末与四氢呋喃溶剂、醋酸混合后，与硼氢化钠固体反应，再加入饱和碳酸氢钠水溶液进行溶解反应后，采用乙酸乙酯进行第二萃取处理。

在一些实施例中，将醛化合物粉末进行溶解后进行第二萃取处理的步骤中，将醛化合物粉末与四氢呋喃溶剂、醋酸混合后，与硼氢化钠固体反应，再加入饱和碳酸氢钠水溶液进行溶解反应后，采用乙酸乙酯进行第二萃取处理。

具体实施中，将醛化合物溶解在1mL四氢呋喃溶剂中，加入0.1mL醋酸，冷却至0℃，然后加入硼氢化钠固体(5mg，0.15mmol)，缓慢恢复至室温再反应1小时，至反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯进行反复三次萃取，合并有机相进行浓缩分离，得到细胞外调节蛋白激酶探针。

在一些实施例中，浓缩分离中，采用蒸发浓缩、超滤浓缩、反渗透透析中的至少一种方法进行浓缩；再采用色谱分离处理、凝胶柱分离处理、重结晶分离处理和制备液相分离处理中的至少一种方法进行分离。

本申请实施例第三方面提供一种药物组合物，药物组合物包括细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂，其中，细胞外调节蛋白激酶探针为的细胞外调节蛋白激酶探针或由细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法制备得到的。

本申请第三方面提供的药物组合物，该药物组合物包括了细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂，通过协同细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂共同作用，细胞外调节蛋白激酶探针对细胞外调节蛋白激酶进行定位，使细胞外调节蛋白激酶抑制剂能够靶向专一与细胞外调节蛋白激酶的作用位点结合，提高了细胞外调节蛋白激酶抑制剂的作用效果。

在一些实施例中，细胞外调节蛋白激酶抑制剂选自Laxiflorin B及其衍生物中的至少一种。Laxiflorin B及其衍生物结构上的D环不饱和双键，与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸通过Michael反应生成稳定的、不可逆的共价键，同时，与ERK1/2激酶区域口袋周围的氨基酸残基形成3-5个氢键结合位点，以及相匹配的疏水作用和分子形状，这些有利于提高该结构分子与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而阻遏ERK1/2蛋白质的活化，有效抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路激活的肿瘤中的信号转导进而有效抑制肿瘤的生长，达到抑癌的效果，具有应用于制备抗癌药物的潜力。

在一些实施例中，提供细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A及其衍生物和细胞外调节蛋白激酶抑制剂Laxiflorin B及其衍生物进行协同作用，能够增强肿瘤细胞对于Laxiflorin B的药物敏感性，提高Laxiflorin B及其衍生物的作用效果。

在一些实施例中，药物组合物中，细胞外调节蛋白激酶探针选自Laxiflorin A，细胞外调节蛋白激酶抑制剂选自Laxiflorin B，且Laxiflorin A和Laxiflorin B的浓度比为(1～20)：(0～1)。药物组合物包括Laxiflorin A及Laxiflorin B，确保二者联用更有利于抑制细胞外调节蛋白激酶的活性，控制Laxiflorin A和Laxiflorin B的浓度比为(1～20)：(0～1)，确保Laxiflorin B能够发挥双倍的抑制细胞外调节蛋白激酶的活性的效果，若Laxiflorin A的浓度过高，则会抑制Laxiflorin B的抑制作用。具体实施例中，LaxiflorinA和Laxiflorin B的浓度比选自(5：0.25)、(10：0.5)、(20：1)。

在一些实施例中，药物组合物还包括药学上可接受的辅料、佐剂和前药中的至少一种。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

制备结构式I-1的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A

结构式I-1的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A如下：

制备方法如下所示，详细流程如下：

(1)购买新鲜采摘的毛萼香茶菜药材，自然风干后，把枝叶混合的毛萼香茶菜干药材进行枝叶分离，经80％甲醇水回流提取2小时后制样，依次经色谱分离、凝胶柱脱色、重结晶和制备液相分离等方法，得到毛萼乙素(EB)。

(2)在室温条件下，向毛萼乙素(Eriocalyxin B)(34mg,0.1mmol)的DCM(10mL)溶液中加入DMP戴斯-马丁试剂(85mg,0.2mmol)。缓慢升温至40℃，搅拌30min后冷却至室温，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和硫代硫酸钠溶液(2ml)淬灭反应。加入饱和氯化钠溶液(10mL)，乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到白色固体粉末醛化合物。

(3)将醛化合物溶解在1mL 1:1THF/MeOH混合溶剂中，冷却至0℃，加入七水合氯化铈(37mg，0.1mmol)搅拌10分钟，然后加入硼氢化钠固体(4mg，0.1mmol)，缓慢恢复至室温再反应1小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到白色粉末化合物(29mg,0.085mmol，85％总产率)。

具体流程如下：

实施例2

制备结构式I-2的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A9-TH

结构式I-2的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A9-TH如下：

制备方法如下所示，详细流程如下：

取Laxiflorin A(17mg，0.05mmol)溶解在1mL二氯甲烷中，依次加入对应的反应物(0.05mmol)，EDCI(0.05mmol)和DMAP(cat.)，继续室温反应12小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离得到产品。

具体流程如下：

实施例3

制备结构式I-3的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A6-TH

结构式I-3的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A6-TH如下：

制备方法如下所示，详细流程如下：

取Laxiflorin A(17mg，0.05mmol)溶解在1mL二氯甲烷中，依次加入反应物(0.05mmol)，EDCI(0.05mmol)和DMAP(cat.)，继续室温反应12小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离得到产品。

具体流程如下：

实施例4

制备结构式I-4的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A19-TH

结构式I-4的细胞外调节蛋白激酶探针Laxiflorin A-A19-TH如下：

制备方法如下所示，详细流程如下：

取Laxiflorin A(17mg，0.05mmol)溶解在1mL二氯甲烷中，依次加入5-炔基戊酸模块(0.05mmol)，EDCI(0.05mmol)和DMAP(cat.)，继续室温反应12小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到末端炔基衍生物。将上述粗产品溶解在3mL混合溶剂(THF/H2O＝2:1)中，依次加入已知化合物N3-PEG₃-Thalidomide(0.05mmol)和羧甲基纤维素钠(0.005mmol)，超声脱气3次，氩气保护下加入五水硫酸铜(0.005mmol)，室温反应12小时至TLC检测反应原料完全消失。加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(MeOH/DCM＝1:10)得到产物。

具体流程如下：

性质测试及结果分析

(一)Laxiflorin A及其类似物的得率分析及NMR结果

实施例1性质测试：根据实施例1的制备方法，测定得到的Laxiflorin A的产率及进行NMR分析

实施例1结果分析：根据实施例1的制备方法，以天然产物为原料，通过提取及半合成的方法，得到的Laxiflorin A的产率为50％。

并且对Laxiflorin A进行NMR分析，¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.56(d,J＝10.1Hz,1H),5.84(d,J＝10.2Hz,1H),5.14(s,1H),5.10(s,1H),4.90(d,J＝10.9Hz,1H),4.52(s,2H),4.46(d,J＝10.9Hz,1H),4.00(dd,J＝12.3,3.8Hz,1H),3.92(dd,J＝12.3,3.8Hz,1H),3.43(s,1H),2.72(dd,J＝8.3,5.3Hz,1H),2.66(dd,J＝12.7,4.1Hz,1H),2.27(d,J＝12.4Hz,1H),2.15–2.01(m,3H),2.00(s,1H),1.55–1.44(m,1H),1.40(tt,J＝12.8,7.5Hz,2H),1.23(m,6H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ200.8,176.0,158.9,158.3,124.8,109.3,82.2,69.7,59.0,52.4,51.1,47.3,36.4,36.2,35.4,32.8,31.9,30.6,24.3,17.1.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.for C₂₀H₂₆NaO₅:369.1678,found 369.1675。

实施例2性质测试及结果分析：根据实施例2的制备方法，测定得到的LA-A9-TH的产率及NMR分析：得到的LA-A9-TH总产率为50％，且NMR分析为1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.58(m,1H),7.09(m,2H),6.75(m,1H),5.90–5.76(m,1H),5.22–4.98(m,3H),4.9(m,1H),4.57–4.46(m,1H),4.41(m,2H),3.41(m,2H),3.32(m,2H),2.93–2.81(m,2H),2.81–2.69(m,4H),2.68–2.62(m,1H),2.57(m,2H),2.18(m,2H),2.01(m,1H),1.86(m,2H),1.49(m,2H),1.38(m,1H),1.30(s,3H),1.27(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ201.1,176.9,173.4,172.6,170.3,169.3,168.0,159.7,158.8,146.7,135.9,132.6,123.9,123.7,116.7,110.5,108.5,81.7,70.0,69.5,60.8,52.4,51.0,44.5,39.6,36.6,36.2,36.1,35.6,34.8,32.8,31.7,30.9,30.2,29.9,29.4,29.1,28.8,22.5,16.4,13.1.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.for C₄₀H₄₆N₄NaO₁₁:781.3601,found 781.3658。

实施例3性质测试及结果分析：根据实施例2的制备方法，测定得到的LA-A6-TH的产率及NMR分析：LA-A6-TH:19mg,0.025mmol,总产率50％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.75(dd,J＝7.4,2.8Hz,1H),7.67(t,J＝7.5Hz,1H),7.58–7.51(m,1H),6.59(dd,J＝10.1,3.1Hz,1H),5.91(d,J＝10.2Hz,1H),5.18–4.97(m,3H),4.87(dd,J＝14.3,10.6Hz,1H),4.52(tt,J＝11.0,4.4Hz,2H),4.47–4.27(m,2H),3.21–2.96(m,2H),2.96–2.76(m,3H),2.74(d,J＝7.1Hz,1H),2.57(m,1H),2.44–2.27(m,4H),2.24(d,J＝2.3Hz,1H),2.18(m,1H),2.08(m,3H),1.70(m,5H),1.49(m,2H),1.32(s,3H),1.21(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ200.3,175.5,173.5,171.4,168.9,168.3,167.3,158.5,157.4,143.4,136.2,134.4,132.3,128.1,125.0,121.8,109.5,82.1,69.3,60.7,52.4,51.2,50.9,49.2,44.7,36.0,34.2,33.0,31.9,31.4,30.5,29.7,28.8,24.1,22.8,16.9,14.2.HRMS(ESI/[M+Na]⁺)calcd.for C₃₉H₄₄N₂NaO₁₀:723.2894,found 723.2890.

实施例4性质测试及结果分析：根据实施例4的制备方法，测定得到的LA-A19-TH的NMR分析：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.85(s,1H),7.79–7.71(m,2H),7.74–7.64(m,1H),6.76(d,J＝10.1Hz,1H),5.86(d,J＝10.1Hz,1H),5.22–5.03(m,3H),4.60–4.50(m,3H),4.43–4.35(m,3H),3.91(t,J＝5.1Hz,2H),3.62(s,6H),3.72–3.56(m,5H),3.60–3.50(m,3H),3.23–3.15(m,2H),2.99–2.85(m,1H),2.84–2.66(m,4H),2.71(s,3H),2.49–2.37(m,3H),2.19(d,J＝12.0Hz,1H),2.19–2.03(m,1H),1.98(dt,J＝18.7,6.5Hz,6H),1.44(td,J＝10.8,6.0Hz,4H),1.30(s,6H),1.22(s,2H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ201.1,176.8,173.3,172.9,170.1,167.9,167.5,159.3,158.8,146.7,142.6,136.0,134.1,132.4,128.1,124.0,122.9,121.0,108.5,81.6,70.2,70.1,70.0,69.8,69.5,69.1,60.7,52.3,51.0,50.0,49.1,44.5,36.2,36.0,34.8,33.2,32.8,30.9,30.7,30.3,30.2,29.4,27.6,24.3,24.3,22.6,22.3,16.4.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.for C₄₈H₅₇N₅NaO₁₃:934.3851,found 934.3848。

(二)利用蛋白下拉实验分析Laxiflorin A专一靶向结合ERK1/2的位点试验过程：

1.将生物素标记的Laxiflorin B,Laxiflorin A,Eriocalyxin B,Laxiflorin J,Laxiflorin B-Di所示与链霉素偶联的磁珠在4℃结合16小时后备用；各物质的结构式如下所示，

2.在HEK293T细胞内过表达重组蛋白Flag-ERK1WT,Flag-ERK1C178A(第178位半胱胺酸突变成丙胺酸),Flag-ERK1C183A(第183位半胱胺酸突变成丙胺酸),Flag-ERK1C178A/C183A(第178与183位半胱胺酸突变成丙胺酸),48小时后提取细胞总蛋白。

3.将四种重组蛋白分别与五种化合物的磁珠复合物在4℃孵育16小时后,以含有2％SDS的PBS涡旋20秒,重复清洗三次。

4.以Western blot检测被五种化合物的磁珠复合所下拉的重组蛋白Flag标签,来判读Laxiflorin B上结构的重要位置。

结果分析

结果如图1所示，若是将ERK1/2的178位半胱胺酸突变成丙胺酸后，只剩下ATP口袋位置中的183半胱胺酸，则Laxiflorin B是最强的，其次是Eriocalyxin B与Laxiflorin J,说明D环与化合物的立体结构，对于Laxiflorin B结合ERK1是重要的，相较于只有A环的Laxiflorin A结合能力与A环D环都缺乏的Laxiflorin B-DI相当。

若是将ERK1/2ATP口袋位置中的第183位半胱胺酸酸突变成丙胺酸后,可以发现只具有A环的Laxiflorin A结合能力最强，说明远离ERK1活性口袋位置的第178位半胱胺酸与A环的结合概率较大，也因为第178位半胱胺酸远离ERK1的活性口袋位置，因此结合上ERK1也没有肿瘤抑制活性，而Laxiflorin B也具有完整的A环，因此约有一半的Laxiflorin B会与第178位半胱胺酸结合,造成Laxiflorin B药效的损失，而不论是Eriocalyxin B，或是只含有D环的Laxiflorin J，或是A环D环都缺少的Laxiflorin B-DI都无法与第178位半胱胺酸结合。

因此，Laxiflorin A能专一性的靶向ERK1/2结构外侧的第178位半胱胺酸；Laxiflorin A可以利用A环选择性的与ERK1/2非活性位点结合，可成为靶向ERK1/2的新型小分子探针，为靶向ERK1/2激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团。

(三)分析Laxiflorin A与Laxiflorin B的肿瘤抑制效果

试验一试验过程：

(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同Laxiflorin B浓度(0、0.25、0.5、1、2、4μM)与不同Laxilforin A浓度(0、25、50、100μM)处理的组别皆作5个复孔，以利后续统计分析。

(2)待细胞贴壁后加入不同浓度的Laxiflorin A与Laxiflorin B，Laxiflorin B处理组在不同时间点(24、48、72小时)加入CCK-8呈色试剂，Laxiflorin A处理组在48小时加入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。

(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以excel作出抑制曲线图。

试验一结果分析：

试验结果如图2所示，图2(A)为Laxiflorin A对PC9细胞的抑制作用图，可以看出，随着Laxiflorin A的剂量增加，对于PC9没有抑制生长的效果。图2(B)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对PC9细胞的抑制作用图，X轴为Laxiflorin B浓度(μM)，Y轴为不同细胞活力(％)，可以看出，当药物浓度抑制50％的细胞活力时，称之为药物对细胞的“半抑制剂量”(IC50)，PC9细胞对于Laxiflorin B的IC50在1μM左右，说明Laxiflorin B只需较低浓度就能够对于非小细胞肺癌细胞系产生较好的抑制效果,而Laxiflorin A则没有抑制效果。

试验二试验过程：

(1)在6孔板中以5×10⁵颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同Laxiflorin B浓度(0、1、2μM)与不同Laxilforin A浓度(0、50、100μM)处理。

(2)待细胞贴壁后，加入不同浓度的Laxiflorin A与Laxiflorin B处理24小时。

(3)以裂解液收取总蛋白,定量后,使用西方点墨法检测磷酸化ERK,RSK与总ERK,RSK与GAPDH的表达量。

试验二结果分析：

试验结果如图2中图2(C)所示，透过Western Blot分析，Laxiflorin A处理后，ERK相关通路并不受Laxiflorin A处理的影响；如图2(D)所示，Laxiflorin B处理后，ERK相关的信号通路蛋白的磷酸化水平，随着Laxiflorin B剂量增加而下调，说明Laxiflorin B能有效的抑制ERK相关的信号通路。

(四)分析Laxiflorin A与Laxiflorin B联合使用能够增强肿瘤细胞对于Laxiflorin B的药物敏感性的作用

试验一试验过程：

(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同Laxiflorin B浓度(0、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μM)与不同LaxilforinA浓度(0、20、40、80μM)混合联用,每个组别皆作6个复孔，以利后续统计分析。

(2)待细胞贴壁后,加入不同浓度的Laxiflorin A与Laxiflorin B混合溶液,处理48小时后,入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。

(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以excel作出抑制曲线图。

试验一结果分析：

如图3所示，图3(A)为Laxiflorin A与Laxiflorin B联用后，对PC9细胞的抑制作用图，Laxiflorin A(5-20μM)与Laxiflorin B联用较Laxilforin B单用有更好的抑制效果，但若Laxiflorin A浓度过高(超过40μM)则会干扰Laxiflorin B的抑制效果，说明Laxiflorin A与Laxiflorin B联用的浓度的比例控制在20:1以下，方能有更好的效果。这是由于Laxiflorin A占据了ERK1上第178位半胱胺酸后，而Laxiflorin B与第178位半胱胺酸结合的概率降低，减少Laxiflorin B的消耗，使得Laxiflorin B能专一的结合在ERK1/2ATP口袋位置的第183位半胱胺酸，达到更低剂量就能抑制ERK1活性的缘故。

试验二试验过程：

(1)在6孔板中以5×10⁵颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同Laxiflorin B浓度(0、0.25、0.5、1μM)与不同Laxilforin A浓度(0、5、10、20μM)处理。

(2)待细胞贴壁后，加入不同浓度的Laxiflorin A与Laxiflorin B处理24小时。

(3)以裂解液收取总蛋白,定量后,使用西方点墨法检测磷酸化ERK,RSK与总ERK与RSK的表达量。

试验二结果分析：

试验结果如图3(B)所示，透过Western Blot分析,Laxiflorin A与Laxiflorin B联用处理后,更能够有效促进RSK磷酸化水平的下降。

(五)分析实施例2得到的Laxiflorin A-A6-Thalidomide(LA-A6-TH)分子能抑制肿瘤细胞生长

试验一试验过程：

(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同LA-A6-TH[图4(A)]浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM)与不同Laxilforin A浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM),每个组别皆作6个复孔，以利后续统计分析。

(2)待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的Laxiflorin A与LA-A6-TH,处理48小时后,入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。

(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以Prism 6.0作出抑制曲线图。

试验一结果分析：

如图4所示，图4(B)为Laxiflorin A与LA-A6-TH处理后，对PC9细胞的抑制作用图，Laxiflorin A无抑制细胞生长的活性，而LA-A6-TH有更好的抑制效果。

试验二试验过程：

(1)在6孔板中以5×10⁵颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排10μM的Laxiflorin A与LA-A6-TH,分别处理细胞,并固定药物浓度(1微摩),处理不同时间(0,1,3,6,12,24小时)或是固定时间(6小时)处理不同药物浓度(0,0.1,0.3,1,3,10微摩),最后收取细胞总蛋白。

(2)蛋白定量后,使用西方点墨法检测ERK,pRSK,RSK与Tubulin的表达量。

试验二结果分析：

试验结果如4图(C)所示，透过Western Blot分析,1微摩的LA-A6-TH处理12小时后,能有效的促使ERK表达水平降低。而固定6小时处理时间,处理不同浓度的LA-A6-TH,能发现1～10微摩的LA-A6-TH皆能使ERK1/2蛋白表达量降低,其中10微摩效果最好。由于Thalidomide分子能招募E3酶CRBN(cereblon),LA-A6-TH分子能够使E3酶与ERK靠近,并使得ERK泛素化后,进行蛋白酶体降解,让ERK蛋白水平降低。说明LA-A6-TH分子具有成为ERKPROTAC药物的潜力。

(六)分析实施例2得到的Laxiflorin A-A9-Thalidomide(LA-A9-TH)分子能抑制肿瘤细胞生长

试验一试验过程：

(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同LA-A9-TH[图5(A))]浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM)与不同Laxilforin A浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM),每个组别皆作6个复孔，以利后续统计分析。

(2)待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的Laxiflorin A与LA-A9-TH,处理48小时后,入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。

(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以Prism 6.0作出抑制曲线图。

试验一结果分析：

如图5所示，图5(B)为Laxiflorin A与LA-A9-TH处理后，对PC9细胞的抑制作用图，Laxiflorin A无抑制细胞生长的活性，而LA-A9-TH有更好的抑制效果。

试验二试验过程：

(1)在6孔板中以5×10⁵颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排10μM的Laxiflorin A与LA-A9-TH,分别处理细胞,并固定药物浓度(1微摩),处理不同时间(0,1,3,6,12,24小时)或是固定时间(6小时)处理不同药物浓度(0,0.1,0.3,1,3,10微摩),最后收取细胞总蛋白。

(2)蛋白定量后,使用西方点墨法检测ERK,pRSK,RSK与Tubulin的表达量。

试验二结果分析：

试验结果如5图(C)所示，透过Western Blot分析,1微摩的LA-A9-TH处理6小时后,能有效的促使ERK表达水平降低。而固定6小时处理时间,处理不同浓度的LA-A9-TH,能发现不同浓度的LA-A9-TH皆能使ERK1/2蛋白表达量降低,其中10微摩效果最好。由于Thalidomide分子能招募E3酶CRBN(cereblon),LA-A9-TH分子能够使E3酶与ERK靠近,并使得ERK泛素化后,进行蛋白酶体降解,让ERK蛋白水平降低。说明LA-A9-TH分子具有成为ERKPROTAC药物的潜力。

(七)分析实施例2得到的Laxiflorin A-A19-Thalidomide(LA-A19-TH)分子能抑制肿瘤细胞生长

试验一试验过程：

(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排不同LA-A19-TH[图6(A)]浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM)与不同Laxilforin A浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM),每个组别皆作6个复孔，以利后续统计分析。

(2)待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的Laxiflorin A与LA-A19-TH,处理48小时后,入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。

(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以Prism 6.0作出抑制曲线图。

试验一结果分析：

如图6所示，图6(B)为Laxiflorin A与LA-A19-TH处理后，对PC9细胞的抑制作用图，Laxiflorin A无抑制细胞生长的活性，而LA-A19-TH抑制效果也不明显。

试验二试验过程：

(1)在6孔板中以5×10⁵颗细胞/孔的密度分别种入PC9非小细胞肺癌细胞系，安排10μM的Laxiflorin A与LA-A19-TH,分别处理细胞,并固定药物浓度(1微摩),处理不同时间(0,1,3,6,12,24小时)或是固定时间(6小时)处理不同药物浓度(0,0.1,0.3,1,3,10微摩),最后收取细胞总蛋白。

(2)蛋白定量后,使用西方点墨法检测ERK,pRSK,RSK与Tubulin的表达量。

试验二结果分析：

试验结果如6图(C)所示，透过Western Blot分析,1微摩的LA-A19-TH处理12小时后,能些微使ERK表达水平降低。而固定6小时处理时间,处理不同浓度的LA-A19-TH,发现不同浓度的LA-A19-TH对于ERK1/2蛋白表达量影响不明显。说明LA-A19-TH分子不具有成为ERK PROTAC药物的潜力。

综上，本申请以天然提取EB，再利用化学的方式加工，通过化学半合成的策略得到Laxiflorin A，能够大幅度的提高得率，比直接从植物中提取Laxiflorin A更有效率；进一步，鉴定得到Laxiflorin A与ERK1/2结构外侧的第178位半胱胺酸专一性靶向结合，且Laxiflorin A不具有抑癌的活性。当Laxiflorin A与LaxiflorinB联用较Laxiflorin B单用效果更加,肿瘤细胞对Laxilforin B的敏感度,因Laxiflorin A联用而确保效果提高两倍。并且，靶向CRBN E3酶的分子Thalidomide与Laxiflorin A连接之后能够得到靶向ERK1/2的PROTAC分子，Laxiflorin A-Thalidomide能够透过PROTAC技术原理降解ERK1/2蛋白,达到抑制肿瘤生长的目的。

并且改变PROTAC分子中Linker的长度对于PROTAC分子的活性有影响,如LA-A6-TH与LA-A9-TH具有抑制肿瘤与促进ERK降解的活性,但若把Linker长度增加,分子活性就会消失,因此根据靶蛋白的3D结构来改变Linker长度,能够提高或降低PROTAC分子对于靶蛋白的专一性,未来除了考虑探头分子对于靶蛋白的专一性外,Linker的长度也是一个重要的考虑的因素,这提供我们针对特定蛋白分子开发PROTAC药物一个重要的思路。

由于Erk1/2是与肿瘤密切相关的激酶，根据研究报导，32％的人类肿瘤与Erk1/2通路激活有关，临床上缺少一款有效的Erk1/2抑制剂，而同一条MAPK信号通路上游的RAF，MEK抑制剂在临床上又面临肿瘤细胞产生新的突变与耐药的问题。Laxiflorin A虽不具有抑癌的生物活性，但凭借其优异的ERK1/2靶向性，有巨大的潜力能够开发成为第一个ERK1/2的PROTAC药物，有利于提高对细胞外调节蛋白激酶的抑制效果。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞外调节蛋白激酶探针，其特征在于，所述细胞外调节蛋白激酶探针为Laxiflorin A及其衍生物，其中，所述细胞外调节蛋白激酶探针的结构通式如式I所示，

其中，R选自H、长链脂肪烃、芳基取代的长链脂肪烃的任意一种。

2.根据权利要求1所述的细胞外调节蛋白激酶探针，其特征在于，所述R选自以下取代基的任意一种：

3.根据权利要求1所述的细胞外调节蛋白激酶探针，其特征在于，所述细胞外调节蛋白激酶探针与ERK1/2外侧的第178位半胱胺酸共价结合。

4.一种细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行浓缩分离，得到毛萼乙素；

将所述毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理后，进行淬灭反应得到第一混合物；

将所述第一混合物采用有机溶剂进行纯化处理，并进行浓缩分离得到细胞外调节蛋白激酶探针。

5.根据权利要求4所述的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，其特征在于，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理的步骤包括：提供体积百分浓度为80％～85％的甲醇水溶液，对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理2小时；再减压回收甲醇，使浸膏溶剂浓缩至甲醇的体积百分浓度为40％～45％，得到回流提取产物；和/或，

将所述毛萼乙素与氧化剂进行加热混合处理的步骤中，将所述毛萼乙素与浓度为0.2～0.3mmol的戴斯-马丁试剂于40～45℃条件下进行混合处理30～40分钟。

6.根据权利要求4所述的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，其特征在于，进行淬灭反应的步骤中，提供饱和硫代硫酸钠溶液和氯化钠溶液进行混合处理，进行淬灭反应。

7.根据权利要求4所述的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法，其特征在于，纯化处理的步骤中，包括：将所述第一混合物采用有机溶剂进行第一萃取处理得到醛化合物粉末，再将醛化合物粉末进行溶解后进行第二萃取处理；

其中，将所述第一混合物采用有机溶剂进行第一萃取处理的步骤中，将所述第一混合物采用乙酸乙酯进行第一萃取处理，和/或，

将所述醛化合物粉末进行溶解后进行第二萃取处理的步骤中，将所述醛化合物粉末与四氢呋喃溶剂、醋酸混合后，与硼氢化钠固体反应，再加入饱和碳酸氢钠水溶液进行溶解反应后，采用乙酸乙酯进行第二萃取处理。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括细胞外调节蛋白激酶探针和细胞外调节蛋白激酶抑制剂，其中，所述细胞外调节蛋白激酶探针为权利要求1～3任一所述的细胞外调节蛋白激酶探针或由权利要求4～7任一所述的细胞外调节蛋白激酶探针的制备方法制备得到的。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞外调节蛋白激酶抑制剂选自Laxiflorin B及其衍生物中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，细胞外调节蛋白激酶探针选自Laxiflorin A，细胞外调节蛋白激酶抑制剂选自Laxiflorin B，且所述Laxiflorin A和所述Laxiflorin B的浓度比为(1～20)：(0～1)。

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