CN113735758A - 一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针，属于生物化学分析领域。通过利用吗啉基团作为靶向溶酶体靶向的基团，修饰改造的1,8‑萘内酰亚胺作为荧光发射母体，达到双态发光的目的并用于细胞溶酶体成像。本发明的荧光探针具有高效的双态发光、优异的光稳定性及精准的溶酶体靶向能力等优点。

Description

一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针
技术领域
本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针。
背景技术
溶酶体被描述为细胞的胃，分解从外界进入到细胞内的物质，消化细胞自身的局部细胞质或细胞器，当细胞衰老时，其溶酶体破裂，释放出水解酶，消化整个细胞而使其死亡。为了实现这些功能，溶酶体具有高度动态的性质，它们不断地改变它们的形态和空间分布。另外根据放射自显影证实所得，致癌物质进入细胞后，在与染色体整合之前会先贮存在溶酶体内。因此，对它们的运动和形态变化的实时跟踪将有助于理解它们遭到外部环境干扰后其工作状态。
荧光探针在生物成像中的应用不断加深，因为其分辨率高，反应迅速等优点。最近几年，在监测溶酶体荧光探针领域学术研究已经做了很多。但是大多数探针基于ACQ分子，即在稀溶液中表现出强荧光，而在固体或者高浓度时荧光十分微弱或者猝灭。这就导致在使用荧光探针时需要考虑溶解性，如果细胞局部水溶性差需要增大探针浓度，伴随着ACQ效应就会致使荧光猝灭；如果使用AIE分子，即在荧光探针在稀溶液中无荧光，浓度增大荧光增强，但是考虑到生物细胞毒性，浓度过大可能会造成细胞的凋亡。另外大多数荧光探针因其斯托克斯位移较小，导致自吸收现象严重，影响其发射波长的宽度，检测限降低。而作为许多合成荧光分子的前体物质——1,8-萘内酰亚胺，可以改造应用于各种双态荧光探针的设计，其具有高效的双态发光(DSE)弥补了ACQ与AIE的在细胞成像中的不足，以其为基体，可以进行化学修饰，连接各种靶向的物质应用于细胞中各种细胞器如线粒体，溶酶体，内质网，高尔基体的成像。
发明内容
为了解决目前在荧光探针中监测溶酶体所面临的问题和现状，本发明目的在于，通过利用吗啉基团作为靶向溶酶体靶向的基团，修饰改造的1,8-萘内酰亚胺作为荧光发射母体，达到双态发光的目的并用于细胞溶酶体成像，该探针具有高效的双态发光、光稳定性好，耐酸性强及优异的溶酶体靶向能力等优点。
一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针，包括以下合成步骤：
1)将1,8-萘内酰亚胺磁力搅拌下充分溶解于醋酸得到反应液，随后将液溴逐滴加入，滴加完毕25℃搅拌1小时，升温至125℃冷凝回流10小时，将反应液用水(50mL×3)经乙酸乙酯(50mL×2)萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化得到化合物1，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂由石油醚、乙酸乙酯按体积比20：1组成；
2)将化合物1和N,N-二甲基甲酰胺混合，0℃冰水浴条件下磁力搅拌使其溶解，然后将氢化钠分批加入，充分反应后置于冰水浴条件下逐滴加入碘乙烷反应3小时，加水淬灭反应，用乙酸乙酯和盐水萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化得到化合物2，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂由石油醚、乙酸乙酯按体积比15：1组成；
3)取化合物2和4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯，加入1,4-二氧六环和水，磁力搅拌充分溶解，然后加入碳酸铯和四(三苯基膦)钯，所得反应液90℃下搅拌过夜，用乙酸乙酯和盐水萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂由二氯甲烷、甲醇按体积比50：1组成，得到油状液体化合物Lyso-DSE，干燥得到黄绿色固体结晶化合物Lyso-DSE。
反应步骤如图所示：
Figure BDA0003210286480000031
进一步地，步骤1)所述1,8-萘内酰亚胺、液溴的质量比为1.69：3.2；所述液溴需在5分钟全部滴完。
进一步地，步骤2)所述化合物1、氢化钠、碘乙烷的质量比为1.635：0.6：1.56。
进一步地，步骤3)所述化合物2、4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯、碳酸铯、四(三苯基膦)钯的质量比为355：606：325.8：115.5；所述1,4-二氧六环与水的体积比为6：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明双态发光荧光探针的合成比较简便，并且随后的处理过程相对容易；
(2)本发明双态发光荧光探针对溶酶体的酸碱度变化表现出稳定的靶向能力；
(3)本发明双态发光荧光探针具有不随浓度变化，强光稳定性，精确靶向溶酶体的能力。该双态发光荧光探针通过减少探针自吸收效果提高荧光产率，提高光稳定性，提高耐酸碱性，荧光不随浓度变化等特点，以获得更精准及持续稳定的光信号及成像效果。因此本发明双态发光荧光探针在动态监测溶酶体具有广阔的应用前景，对了解溶酶体生理和病理过程的机制研究具有极其重要的作用。
附图说明
图1是荧光探针Lyso-DSE的合成路线。
图2是荧光探针Lyso-DSE在不同有机溶剂条件下的荧光光谱图。
图3是荧光探针Lyso-DSE的固态荧光光谱图。
图4是荧光探针Lyso-DSE在不同有机溶剂条件下紫外可见吸收光谱的测定。
图5是荧光探针Lyso-DSE的不同pH条件下的荧光光谱图。
图6是荧光探针Lyso-DSE的离子选择性测定。
图7是荧光探针Lyso-DSE的光稳定检测。
图8是荧光探针Lyso-DSE用于人脐静脉内皮细胞内溶酶体共定位成像实验图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)如图1所示，荧光探针化合物Lyso-DSE的合成：首先，于100mL圆底烧瓶中，将1.69g 1,8-萘内酰亚胺溶于40mL醋酸，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，随后将3.2g液溴逐滴加入至反应液中，需在5分钟全部滴完，滴加完毕后于25℃搅拌1小时，再在圆底烧瓶上方接入冷凝管，升温至125℃，回流10小时，并将反应液用水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到化合物1，得到2.71g，产率82.9％；接下来1.635g化合物1和20mL N,N-二甲基甲酰胺加入至100mL圆底烧瓶中，将圆底烧瓶至于0℃的冰水浴中，磁力搅拌5分钟使其溶解，然后将600mg氢化钠分批次加入到圆底烧瓶中，充分反应后，将圆底烧瓶从冰水浴取出，至于室温下逐滴加入1560mg碘乙烷反应3小时，加2mL水猝灭反应，用乙酸乙酯，盐水萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到化合物2，得到1.53g，产率86.3％；最后在100mL圆底烧瓶中，先加入355mg化合物2和606mg 4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯，之后加入30mL 1,4-二氧六环和5mL水，磁力搅拌3分钟充分溶解，然后加入325.8mg碳酸铯和115.5mg四(三苯基膦)钯，将反应液在90℃搅拌过夜，用乙酸乙酯，盐水萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸发去除溶剂得到粗产品，利用柱色谱法用硅胶柱纯化得到油状液体化合物Lyso-DSE，放入真空干燥箱干燥一晚得黄绿色的固体结晶化合物，得到345mg，产率63.0％。
(2)荧光探针Lyso-DSE在不同有机溶剂条件下的荧光光谱图，荧光光谱的测量在不同有机溶剂中测定。将Lyso-DSE荧光探针溶于二氯甲烷(DCM)中，制成2mM储备液。测试溶液Lyso-DSE(10μM)由2mM储备液配制而成。不同的有机溶剂由5mL移液管移取获得。测试溶液在避光条件下进行测量。在激发波长为375nm下测定其荧光光谱。荧光发射光谱发射范围在450nm-600nm，激发狭缝宽度为2nm，发射狭缝宽度为2nm。荧光光谱如图2所示(峰值从高到低依次为He,ToL,THF,Me,DCM,DMF,DMSO)。随着溶液极性不断增强因荧光强度不断减弱，即如图中所示极性顺序正己烷<甲苯<四氢呋喃<甲醇<二甲基甲酰胺<二甲基亚砜，在500nm处出现了显著的荧光信号，并且荧光强度依次呈现递减的趋。这是因为荧光探针分子在不同溶剂中显著的ICT效应，致使荧光强度减弱。所用的荧光测定仪器为Horiba FluoroMax-4-luminescence spectrometer。
(3)荧光探针Lyso-DSE的固态荧光光谱图，荧光探针Lyso-DSE固态荧光测定仪器Horiba FluoroMax-4luminescence spectrometer。利用激光光源375nm激发，激发狭缝宽度2nm，发射狭缝宽度为2nm。其光谱图如图3所示。发射峰位置在530nm，峰宽100nm以内。
(4)荧光探针化合物Lyso-DSE在不同有机溶剂条件下的紫外可见吸收光谱测定，图4为紫外可见吸收光谱在不同有机溶剂中测定(250nm峰值从高到低依次为He,Me,DMF,DMSO,THF,DCM)。随着极性不断增强，吸收峰强度出现轻微下降。由于苯环的基本结构，共出现两个吸收峰，分别在250nm和390nm。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为Lambda750spectrophotometer。
(5)荧光探针Lyso-DSE的不同pH条件下的荧光光谱图，如图5为荧光探针Lyso-DSE的pH滴定曲线。由图5中所示，随着pH减小(pH 7.46-pH 3.61)，该探针在570nm处的荧光强度没有明显的下降。大多数目前的溶酶体示踪剂对酸碱度敏感，他们的靶向能力基于碱化效应，此探针Lyso-DSE对酸碱度变化表现出稳定的靶向能力。这种不依赖于溶酶体酸碱度变化的稳定的荧光强度对于客观指示溶酶体的位置和形态都很重要。荧光强度出现的轻微变化可能是因为溶酶体位置的迁移。
(6)荧光探针Lyso-DSE的选择性测定，对于荧光探针来说，选择性的高低也是其一个重要的监测指标。如图6，Lyso-DSE(10μM)在pH＝5.72时的荧光强度指示。向其中加入10倍当量的常见阴阳离子。常见阳离子(Fe3+，Mg2+，Al3+，Na+，K+)，常见阴离子(CO3 2－，SO4 2－，I－，Cl－，Br－)，荧光强度波动幅度甚微可忽略不计。之后再加入谷胱甘肽和100当量的各种氨基酸(色氨酸，半胱氨酸，缬氨酸)，对于荧光强度的影响也可忽略不计。种种实验结果显示，荧光探针Lyso-DSE在一定酸碱度中对于其他分析物来说，无明显干扰，因此其可以满足该探针应于生物样品中，监测溶酶体位置以及形态。
(7)荧光探针Lyso-DSE的光稳定性检测，市面上常用的商业化溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red，与其进行对比，我们检测了荧光探针Lyso-DSE的光稳定性。如图7所示，经过8000s的持续激发，商业化溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red呈现明显的下降，而对于荧光探针Lyso-DSE荧光强度基本没有发生任何变化。此结果显示出Lyso-DSE具有很好的光稳定性，可以在激光光源下长时间成像，依旧可以获得稳定的荧光信号，激发波长为365nm。
(8)荧光探针Lyso-DSE用于人脐静脉内皮细胞内溶酶体共定位成像实验，为了验证荧光探针Lyso-DSE在生物活细胞中的对溶酶体的成像靶向能力。我们将荧光探针Lyso-DSE(10uM)与商业化溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red(500nM)进行了共定位实验。首先，我们对人脐静脉内皮细胞进行了共定位实验。如图8所示，利用红色通道可以接收到红色荧光(600nm-650nm)，这是由Lyso-Tracker Red所发射的光，而用绿色通道可以观察到有绿色荧光(500nm-550nm)发射出，此为荧光探针Lyso-DSE发射出的红光。对两者定位效果图进行共定位处理，其共定位系数可达0.89(图8a)。另外，两者的荧光线性分布呈现明显的同步性(图8b)。因此此项实验可以验证荧光探针Lyso-DSE对溶酶体具有较好的靶向能力。
以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针，其特征在于，该双态发光荧光探针的结构式如下：
Figure FDA0003210286470000011
2.根据权利要求1所述一种用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针，其特征在于，所述探针具有高效的双态发光、光稳定性好，耐酸性好及优异的溶酶体靶向能力。
3.如权利要求1或2所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将1,8-萘内酰亚胺在室温下剧烈搅拌充分溶解于醋酸得到反应液，随后将液溴逐滴加入，滴加完毕后于25℃再搅拌1小时，升温至125℃冷凝回流10小时，将反应液用水经乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化得到化合物1，其结构式如下：
Figure FDA0003210286470000012
2)将化合物1和N,N-二甲基甲酰胺混合，0℃冰水浴条件下磁力搅拌使其溶解，然后将氢化钠分批加入，充分反应后置于室温下逐滴加入碘乙烷反应3小时，加水淬灭反应，用乙酸乙酯和盐水萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化得到化合物2，其结构式如下：
Figure FDA0003210286470000021
3)取化合物2和4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯，加入1,4-二氧六环和水磁力搅拌充分溶解，然后加入碳酸铯和四(三苯基膦)钯，所得反应液室温下搅拌过夜，用乙酸乙酯和盐水萃取、无水硫酸钠干燥、减压旋转蒸发溶剂得到粗产品，粗产品用硅胶柱纯化得到油状液体化合物Lyso-DSE，干燥得到黄绿色固体结晶化合物，其结构式如下：
Figure FDA0003210286470000022
4.根据权利要求3所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤1)所述1,8-萘内酰亚胺、液溴的质量比为1.69：3.2。
5.根据权利要求3所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤1)所述液溴需在5分钟全部滴完。
6.根据权利要求3所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤2)所述化合物1、氢化钠、碘乙烷的质量比为1.635：0.6：1.56。
7.根据权利要求3所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤3)所述化合物2、4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯、碳酸铯、四(三苯基膦)钯的质量比为355：606：325.8：115.5。
8.根据权利要求3所述用于动态溶酶体成像的高效双态发光荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤3)所述1,4-二氧六环与水的体积比为6：1。
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