CN113720824A - 一种荧光探测系统及荧光光谱拼接方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种荧光探测系统及荧光光谱拼接方法，其中，荧光探测系统采用二向色片按波长进行分光，再通过组合多个荧光探测模块，既可提取感兴趣波段，又可以通过拼接在可见光全光谱范围内采集荧光信号，同时具有较高的光谱波长分辨率、高采样率、读出率，尤其适用于微弱荧光的采集和探测；而荧光光谱拼接方法，处理模块能够对各荧光探测模块光谱拼接处的光电倍增管的光谱辐照度进行修正，能够还原由于二向色片分光产生的光谱信息损耗，保证了系统采集光谱的准确性和连续性，尤其适用于二向色片的分光波长为感兴趣波段的情况。

Description

一种荧光探测系统及荧光光谱拼接方法

技术领域

本发明属于激光诱导荧光技术和光谱检测技术领域，尤其涉及一种荧光探测系统及荧光光谱拼接方法。

背景技术

荧光光谱仪由分光装置和光电探测器组成，主要用于荧光光信号的分光和光谱检测，是激光诱导荧光技术和光谱检测技术领域的基础仪器。荧光光谱仪常用的光电探测器为CCD阵列光探测器，特点是光谱波长分辨率极高。应用于微弱荧光信号的探测器常采用EMCCD、ICCD阵列光探测器和光电倍增管探测器。EMCCD的量子效率和空间分辨率教高，但是时间分辨率只有毫秒量级，与时间分辨率可达飞秒量级的ICCD放大增益相近，一般仅为104量级，两者无法有效探测单细胞荧光、痕量化学物质荧光等极微弱的荧光信号。并且CCD光谱读出速率低，一般小于30帧/秒，无法满足部分需求高采样率的应用。光电倍增管阵列主要分为线阵列和面阵列，分别用于光谱采集和光谱图像采集，线阵列又从8通道到32通道不等。光电倍增管阵列具有增益高（可达106量级）、光谱读出速率快（可达ns量级）等特点，弥补了CCD等光探测器在微弱荧光信号检测方面的不足，近年来在大气和水环境生物单粒子荧光光谱检测领域得到了广泛应用。单一阵列的光电倍增管所采集的信号没有足够的分辨率和充足的光谱信息，在荧光采集中同样不具有优势。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种荧光探测系统及荧光光谱拼接方法。

一种荧光探测系统，包括处理模块、二向色片以及至少两个荧光探测模块，其中，二向色片和荧光探测模块的数量分别用N和M表示，且M=N+1，同时，所述荧光探测模块包括狭缝、反射镜、聚焦镜、衍射光栅以及多通道光电倍增管阵列，其中，各衍射光栅的中心波长不同；

所述二向色片用于在其分光波长处将外部入射的荧光信号分成两束波段不同的出射光，其中，若二向色片的数量为一个，则二向色片的两路出射光分别入射到两个荧光探测模块；若二向色片为两个以上，则各二向色片排成一排，且仅有位于末尾的二向色片的两路出射光分别入射到两个荧光探测模块，其余二向色片的其中一路出射光入射到荧光探测模块，而另一路出射光入射到下一个二向色片；各二向色片的分光波长不同；

所述狭缝用于接收二向色片的出射光，并将出射光变换为点光源；所述点光源通过反射镜反射到衍射光栅进行分光后，再入射到聚焦镜进行聚焦；所述多通道光电倍增管阵列用于接收聚焦镜的出射光，并得到该出射光对应波段的荧光光谱；

所述处理模块用于接收各荧光探测模块输出的荧光光谱，然后按波长顺序拼接各荧光光谱，得到荧光信号的全光谱。

进一步地，一种荧光探测系统，还包括准直镜；

所述准直镜用于将外部入射的荧光信号进行准直形成平行光后，再入射到所述二向色片。

可选的，一种荧光探测系统， N=1，M=2。

一种基于荧光探测系统的荧光光谱拼接方法，相邻波段的两个荧光光谱拼接处的光谱辐照度确定方法具体包括以下步骤：

S1：确定该相邻波段的两个荧光光谱的多通道光电倍增管阵列中各通道对应的波长；

S2：将前波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的最后一个通道、后波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的第一个通道作为相邻波段的两个荧光光谱的衔接通道，并分别定义为通道A和通道B；

S3：分别将通道A和通道B对应的光谱辐照度实际值除以各自对应波长处的二向色片透过率，所得商值为通道A和通道B的光谱辐照度参考值；

S4：分别将通道A和通道B的光谱辐照度实际值与各自的光谱辐照度参考值对应作差，所得差值的绝对值分别作为两个通道所属多通道光电倍增管阵列的最大补偿范围；

S5：分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的一阶导数，然后根据一阶导数分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的二阶导数，其中，所述设定邻域范围至少包括三个通道；

S6：将通道A和通道B各自的设定邻域范围内与自身最为接近的通道对应的一阶导数，分别与通道A和通道B设定邻域范围内的二阶导数的均值相乘，得到通道A和通道B对应的辐照度变化率；

S7：将通道A和通道B的光谱辐照度实际值分别乘以各自对应的辐照度变化率，得到通道A和通道B的光谱辐照度期望值；

S8：将通道A和通道B各自的光谱辐照度期望值与光谱辐照度参考值的均值分别作为两者的光谱辐照度输出值；

S9：判断通道A和通道B的光谱辐照度输出值与各自相邻通道的光谱辐照度实际值的差值绝对值是否大于步骤S4所述的最大补偿范围，若不大于，则将步骤S7得到的光谱辐照度输出值分别作为两个通道的最终输出，若大于，则将通道A和通道B的各自相邻通道的光谱辐照度实际值与对应的最大补偿范围求和，所得和值作为通道A和通道B的最终输出。

有益效果：

1、本发明提供一种荧光探测系统，采用二向色片按波长进行分光，再通过组合多个荧光探测模块，既可提取感兴趣波段，又可以通过拼接在可见光全光谱范围内采集荧光信号，同时具有较高的光谱波长分辨率、高采样率、读出率，尤其适用于微弱荧光的采集和探测。

2、本发明提供一种基于荧光探测系统的荧光光谱拼接方法，处理模块能够对各荧光探测模块光谱拼接处的光电倍增管的光谱辐照度进行修正，能够还原由于二向色片分光产生的光谱信息损耗，保证了系统采集光谱的准确性和连续性，尤其适用于二向色片的分光波长为感兴趣波段的情况。

附图说明

图1为本发明提供的一种荧光探测系统的结构原理图；

图2为本发明提供的另一种荧光探测系统的结构原理图；

图3为本发明提供的单个无标签L-02正常人肝细胞的360nm激光诱导荧光光谱；

1-准直镜、2-二向色片、3-第一狭缝、4-第二狭缝、5-第一反射镜、6-第二反射镜、7-第一聚焦镜、8-第二聚焦镜、9-第一衍射光栅、10-第二衍射光栅、11-第一32通道光电倍增管阵列、12-第二32通道光电倍增管阵列、13-第一二向色片、14-第二二向色片、15-第三二向色片。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本实施例以系统包括一个二向色片和两个荧光探测模块为例进行详细说明。参见图1，该图为本实施提供的一种荧光探测系统的结构原理图。一种荧光探测系统，包括处理模块、准直镜1、二向色片2以及两个荧光探测模块，其中，两个荧光探测模块分别为第一荧光探测模块和第二荧光探测模块；第一荧光探测模块包括第一狭缝3、第一反射镜5、第一聚焦镜7、第一衍射光栅9以及第一32通道光电倍增管阵列11；第二荧光探测模块包括第二狭缝4、第二反射镜6、第二聚焦镜8、第二衍射光栅10以及第二32通道光电倍增管阵列12；其中，第一衍射光栅9和第二衍射光栅10的中心波长不同，且二向色片在其分光波长处将外部荧光信号分成两个波段后，两个波段分别与两个衍射光栅的中心波长相对应。

外部荧光信号经光纤传输通过准直镜1准直后形成平行光，经45°放置的二向色片2分光后，长波段荧光信号透射，短波段荧光信号反射。透射光和反射光分别通过第一狭缝3和第二狭缝4后形成点光源。其中反射的短波段荧光信号经第二反射镜6传输到第二衍射光栅10分光、第二聚焦镜8聚焦后，由第二32通道光电倍增管阵列12采集短波段荧光光谱。透射的长波段荧光信号经第一反射镜5反射、第一衍射光栅9分光、第一聚焦镜7聚焦后，由第一32通道光电倍增管阵列11检测长波段荧光光谱。处理模块对短波段荧光光谱和长波段荧光光谱进行拼接，可得到全波段荧光光谱。

可选的，处理模块可以为DSP、CPU或单片机等；准直径1为可见光波段通用双胶合镜，引入光纤输入并将光线整合为平行光；二向色片2为488nm半透半反镜，尺寸为25.2mm×35.6mm×1.1mm，其中350nm~490nm范围的光反射率约为90%，500nm~700nm范围的光透射率约为94%；第一狭缝3和第二狭缝4宽度均为50μm；第一反色镜5和第二反射镜6调整狭缝出光入射光栅面的角度和光程；第一聚焦透镜7为口径50.7mm、半径200mm的定制凹面聚焦透镜；第二聚焦镜8为旋转半径15.5mm的柱透镜；第一衍射光栅9尺寸为25mm×25mm×6mm，1200/mm刻线，闪耀波长为570nm；第二衍射光栅10尺寸为25 mm×25 mm×6mm，1800/mm刻线，最高效率波长为450nm；第一波长32通道光电倍增管阵列11最大增益为10⁶量级，光接收面尺寸为31.8 mm×7mm，探测响应区间为300nm~800nm；第二32通道光电倍增管阵列12参数与第一32通道光电倍增管阵列11相同，均以45°角接收来自各自对应的聚焦镜的光谱。

二向色片2的反射光和透射光分别由两个32通道光电倍增管阵列探测并组成连续光谱，这两个32通道光电倍增管可以分别组成不同波段的荧光光谱仪，一般将线色散倒数（nm/mm）作为该类光谱仪的主要参数。

本实施例中，第二荧光探测模块对应的短波段反射光探测光谱波段为380-500nm，光栅刻线为1800刻线/mm，中心波长为440nm。光栅的色散方程：

，其中

，取

，计算得反射角

；角色散：

；线色散

由角色散关系式：

计算，其中为探测器光敏面倾角，

，得

。

第一荧光探测模块对应的长波段透射光光谱仪探测波段为490nm-650nm，光栅刻线为1200/mm，中心波长为570nm。同样由光栅色散方程

，其中

，计算得

。角色散：

，线色散：

，其中

计算得

。

进一步地，本实施例的微弱荧光探测系统可扩展荧光探测模块的数量以获取更高分辨率和特定波长范围内的更多信息。做法是在二向色片2后继续添加分光装置，包括不同波段的滤光片和多组不同通带的二向色片等，具体结构如附图2所示，扩展的微弱荧光探测系统包括第一二向色片13、第二二向色片14、第三二向色片15、四个荧光探测模块，其中，三个二向色片的通带，即分光波长不同。模块A、模块B、模块C、模块D为可扩展为荧光探测模块的结构插槽，在信噪比允许的情况下可以继续扩展。这些模块放置的荧光探测模块中的各光学元件，可以选择结构类似的单缝光栅光谱仪，或单通道光电倍增管，每一个模块中的器件需单独设计；其中，各荧光探测模块中的衍射光栅的中心波长，分别对应由各二向色片分割而成的不同波段；需要说明的是，如果后续波段为非感兴趣波段或者前面波段已经基本覆盖全波段范围，则模块D处也可以扩展为空插槽，即不放置荧光探测模块。

需要说明的是，扩展的微弱荧光探测系统在进行具体的参数设计时，其中的荧光探测模块应以上述方法设计，并以得到相同线色散值为标准。

需要说明的是，多通道光电倍增管阵列探测到的光谱理论上没有重叠部分，但是需要通过标准光源对多通道光电倍增管阵列探测到的光谱进行波长和辐射度校准。此外，通常二向色片在其分光波长附近约10nm处有大量光信息损耗，则需在光谱分割处进行边缘波长补偿。对光谱分割处进行边缘波长补偿，就是要在多通道光电倍增管阵列确定光谱分割处对应通道的光谱辐照度。因此，本实施例提供一种基于上述荧光探测系统的荧光光谱拼接方法，在该拼接方法中，需要对相邻波段的两个荧光光谱拼接处的光谱辐照度进行修正，具体的，光谱辐照度确定方法包括以下步骤：

S1：确定该相邻波段的两个荧光光谱的多通道光电倍增管阵列中各通道对应的波长，即对多通道光电倍增管阵列探测到的光谱进行波长校准。

下面以的微弱荧光探测系统包括两个32通道光电倍增管阵列为例，给出确定多通道光电倍增管阵列中各通道对应的波长的方法，具体为：

采集已知汞灯光源光谱，以波长为404.608nm、435.902nm、546.145nm、576.899nm的特征峰谱线，对比32通道光电倍增管阵列采集的特征峰，得到4个波长对应的通道数；

将已知4个通道以及其对应的波长作为已知量，对可见光波段波长做线性拟合，得到两个32通道光电倍增管阵列包含的64个通道分别对应的波长。

进一步的，如果需要对多通道光电倍增管阵列探测到的光谱进行幅度校准，则可以执行以下步骤：

用已标定的光谱仪设备和64通道光电倍增管阵列分别测量同一光源的光谱；

将两者得到的光谱数据信息做比，得到一个数据矩阵，将此数据矩阵作为转化矩阵；

使用64通道光电倍增管阵列获取未知光谱信号后，将光谱数据和转化矩阵相乘，得到辐照度经过校准后的光谱信息。

由此可见，可以将获取两个荧光光谱的多通道光电倍增管阵列中各通道对应的波长、光谱辐照度进行校准后，再执行后续步骤。

S2：将前波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的最后一个通道、后波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的第一个通道作为相邻波段的两个荧光光谱的衔接通道，并分别定义为通道A和通道B。

例如，参见图1，假设二向色片2的分光波长为300nm，则小于300nm的波段进入第二荧光探测模块，大于300nm的波段进入第一荧光探测模块；又由于多通道光电倍增管阵列中的各光电倍增管探测到的光谱理论上没有重叠部分，且两个多通道光电倍增管阵列均为32通道光电倍增管阵列，则第一32通道光电倍增管阵列11中的最后一个通道与第二32通道光电倍增管阵列12中的第一个通道分别为小于300nm和大于300nm这两个相邻波段的两个荧光光谱的衔接通道，也就是说，通道A为第一32通道光电倍增管阵列11中的32号光电倍增管，通道B为第二32通道光电倍增管阵列12中的1号光电倍增管。

同理，参见图2，若第一二向色片13、第二二向色片14、第三二向色片15的分光波长分别为300nm、400nm、500nm，则模块A、B、C上放置的荧光探测模块分别探测到的波段范围为小于300nm、300nm~400nm、400nm~500nm，同时，将三个荧光探测模块按序排列下来一共包括96个通道，则32号和33号通道对应分光波长300nm，64号和65号通道对应分光波长400nm。

S3：分别将通道A和通道B对应的光谱辐照度实际值除以各自对应波长处的二向色片透过率，所得商值为通道A和通道B的光谱辐照度参考值。

例如，参见图2，通道A和通道B对应的二向色片为同一个；参见图3，32号和33号通道分别为通道A和通道B，此时通道A对应的二向色片为第一二向色片13，通道B对应的二向色片为第二二向色片14。

需要说明的是，二向色片透过率可以通过实验测量得到，或者从二向色片的使用说明书直接获取。

S4：分别将通道A和通道B的光谱辐照度实际值与各自的光谱辐照度参考值对应作差，所得差值的绝对值分别作为两个通道所属多通道光电倍增管阵列的最大补偿范围。

S5：分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的一阶导数，然后根据一阶导数分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的二阶导数，其中，所述设定邻域范围至少包括三个通道。

例如，假设通道A为第一32通道光电倍增管阵列11中的32号光电倍增管，设定邻域范围为三个通道，则该三个通道为29号、30号、31号，则需要通过28~31号光电倍增管的光谱辐照度来确定29~31号光电倍增管的光谱辐照度的一阶导数，此时得到的一阶导数有三个，与29~31号光电倍增管一一对应，用于表征设定邻域范围内各光电倍增管的光谱辐照度的变化率；然后，根据29~31号光电倍增管的光谱辐照度的一阶导数，可以得到30~31号光电倍增管的光谱辐照度的二阶导数，此时二阶导数有两个，用于表征设定邻域范围内各光电倍增管的光谱辐照度变化率的变化率。

需要说明的是，设定邻域范围内的通道数作为可调参数，可以根据具体情况赋予不同数值，其中，数值越大，拼接处对应通道光谱辐照度读数的连续性越好。

S6：将通道A和通道B各自的设定邻域范围内与自身最为接近的通道对应的一阶导数，分别与通道A和通道B设定邻域范围内的二阶导数的均值相乘，得到通道A和通道B对应的辐照度变化率。

例如，还是以通道A为第一32通道光电倍增管阵列11中的32号光电倍增管为例，与32号光电倍增管最为接近的通道为31号光电倍增管，将上述得到的两个二阶导数的均值，与31号光电倍增管对应的一阶导数相乘，即可得到通道A的辐照度变化率；同理可以得到通道B的辐照度变化率，本实施例对此不作赘述；

S7：将通道A和通道B的光谱辐照度实际值分别乘以各自对应的辐照度变化率，得到通道A和通道B的光谱辐照度期望值。

S8：将通道A和通道B各自的光谱辐照度期望值与光谱辐照度参考值的均值分别作为两者的光谱辐照度输出值。

S9：判断通道A和通道B的光谱辐照度输出值与各自相邻通道的光谱辐照度实际值的差值绝对值是否大于步骤S4所述的最大补偿范围，若不大于，则将步骤S7得到的光谱辐照度输出值分别作为两个通道的最终输出，若大于，则将通道A和通道B的各自相邻通道的光谱辐照度实际值与对应的最大补偿范围求和，所得和值作为通道A和通道B的最终输出。

采用本实施例的微弱荧光探测系统检测粒径大小为5μm的单个聚苯乙烯微球的360nm激光诱导荧光光谱，结果如附图3所示，表明基于多通道光电倍增管阵列的微弱荧光探测系统能够检测微弱的单粒子荧光信号，且平均光谱分辨率为4.69nm。

当然，本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当然可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种荧光探测系统，其特征在于，包括处理模块、二向色片以及至少两个荧光探测模块，其中，二向色片和荧光探测模块的数量分别用N和M表示，且M=N+1，同时，所述荧光探测模块包括狭缝、反射镜、聚焦镜、衍射光栅以及多通道光电倍增管阵列，其中，各衍射光栅的中心波长不同；

所述二向色片用于在其分光波长处将外部入射的荧光信号分成两束波段不同的出射光，其中，若二向色片的数量为一个，则二向色片的两路出射光分别入射到两个荧光探测模块；若二向色片为两个以上，则各二向色片排成一排，且仅有位于末尾的二向色片的两路出射光分别入射到两个荧光探测模块，其余二向色片的其中一路出射光入射到荧光探测模块，而另一路出射光入射到下一个二向色片；各二向色片的分光波长不同；

所述狭缝用于接收二向色片的出射光，并将出射光变换为点光源；所述点光源通过反射镜反射到衍射光栅进行分光后，再入射到聚焦镜进行聚焦；所述多通道光电倍增管阵列用于接收聚焦镜的出射光，并得到该出射光对应波段的荧光光谱；

所述处理模块用于接收各荧光探测模块输出的荧光光谱，然后按波长顺序拼接各荧光光谱，得到荧光信号的全光谱。

2.如权利要求1所述的一种荧光探测系统，其特征在于，还包括准直镜；

所述准直镜用于将外部入射的荧光信号进行准直形成平行光后，再入射到所述二向色片。

3.如权利要求1所述的一种荧光探测系统，其特征在于，N=1，M=2。

4.一种基于权利要求1所述的荧光探测系统的荧光光谱拼接方法，其特征在于，相邻波段的两个荧光光谱拼接处的光谱辐照度确定方法具体包括以下步骤：

S1：确定该相邻波段的两个荧光光谱的多通道光电倍增管阵列中各通道对应的波长；

S2：将前波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的最后一个通道、后波段荧光光谱对应的多通道光电倍增管阵列中的第一个通道作为相邻波段的两个荧光光谱的衔接通道，并分别定义为通道A和通道B；

S3：分别将通道A和通道B对应的光谱辐照度实际值除以各自对应波长处的二向色片透过率，所得商值为通道A和通道B的光谱辐照度参考值；

S4：分别将通道A和通道B的光谱辐照度实际值与各自的光谱辐照度参考值对应作差，所得差值的绝对值分别作为两个通道所属多通道光电倍增管阵列的最大补偿范围；

S5：分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的一阶导数，然后根据一阶导数分别获取通道A和通道B设定邻域范围内的光谱辐照度的二阶导数，其中，所述设定邻域范围至少包括三个通道；

S6：将通道A和通道B各自的设定邻域范围内与自身最为接近的通道对应的一阶导数，分别与通道A和通道B设定邻域范围内的二阶导数的均值相乘，得到通道A和通道B对应的辐照度变化率；

S7：将通道A和通道B的光谱辐照度实际值分别乘以各自对应的辐照度变化率，得到通道A和通道B的光谱辐照度期望值；

S8：将通道A和通道B各自的光谱辐照度期望值与光谱辐照度参考值的均值分别作为两者的光谱辐照度输出值；

S9：判断通道A和通道B的光谱辐照度输出值与各自相邻通道的光谱辐照度实际值的差值绝对值是否大于步骤S4所述的最大补偿范围，若不大于，则将步骤S7得到的光谱辐照度输出值分别作为两个通道的最终输出，若大于，则将通道A和通道B的各自相邻通道的光谱辐照度实际值与对应的最大补偿范围求和，所得和值作为通道A和通道B的最终输出。

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